Modul PC-MPR-1 Praktikum Physikalische Chemie V Versuch 3: Rasterkraftmikroskopie

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1 Modul PC-MPR-1 Praktikum Physikalische Chemie V Versuch 3: Rasterkraftmikroskopie Betreuer: Michael Schranz AG Prof Dr. N. Hampp Version vom

2 Inhaltsverzeichnis Einführung 3 A. Theorie 3 1. Physikalische Grundlagen Zwischenmolekulare Kräfte VAN-DER-WAALS-Kräfte Abstoßungskräfte Das LENNARD-JONES-Potential Der quantenmechanische Tunneleffekt 6 2. Technische Aspekte - Aufbau von SXM Positionierung Der piezoelektrische Effekt Feinsteuerung Grobsteuerung Schwingungsdämpfung Externe Einflüsse Interne Einflüsse Steuerung Arbeitsweise verschiedener Rastersondenmikroskope Rasterkraftmikroskop Auflagemodus Mode konstanter Kraft Mode konstanter Höhe Non-contact -AFM Rastertunnelmikroskop Mode konstanten Tunnelstromes Mode konstanter Höhe Weitere SXM Kraftspektroskopie Allgemeines Prinzip der Kraftspektroskopie Durchbiegungsempfindlichkeit und Kraftkonstante WLC-Fit 16 1

3 B. Aufgaben 17 C. Versuchsdurchführung TopoMetrix Vorbereitung von Probe und Sonde Messung Datenauswertung Wechsel des Scanners NanoScope Vorbereitung von Probe und Sonde Messung Datenauswertung 21 D. Literatur 21 E. Anhang 22 2

4 Einführung Rasterkraft- (atomic oder scanning force microscope - AFM, SFM) wie auch das zuerst entwickelte Rastertunnelmikroskop (scanning tunneling microscope - STM) sind Instrumente, mit denen eine hochaufgelöste Abbildung einer Oberfläche - ähnlich einem Lichtmikroskop, jedoch mit viel höherer Vergrößerung - möglich ist. AFM und STM bedienen sich jedoch nichtoptischer Effekte. Eine Verallgemeinerung dieser Messmethoden stellt der Begriff Rastersondenmikroskop dar (SXM). Wie der Name schon andeutet, wird bei diesen Verfahren eine Sonde, ähnlich dem Elektronenstrahl eines Fernsehgerätes oder Rasterelektronenmikroskopes, zweidimensional über eine Oberfläche bewegt. Je nach Beschaffenheit der Sonde lassen sich in der dritten Dimension Eigenschaften der Oberfläche im Realraum abbilden. Die Auflösung optischer Mikroskope wird durch Lichtbeugungseffekte und die Wellenlänge des verwendeten Lichtes begrenzt. Es werden nur Punkte mit einem Abstand d /2 aufgelöst. Mit heutigen Rasterelektronenmikroskopen erreicht man hingegen Auflösungen bis in den nm-bereich, mit höchstauflösenden Transmissionselektronenmikroskopen wird sogar der Bereich atomarer Abstände (bei regelmäßiger Anordnung der Atome im Kristallverband) zugänglich. Dies wird jedoch mit größerem apparativem Aufwand erkauft. Mit AFM und STM aber lassen sich einzelne Atome oft recht schnell und einfach abbilden, dies sogar unter atmosphärischen Bedingungen oder auch in Lösung. Die Auflösung beträgt typischerweise 1 Å lateral und 0,1 Å vertikal. Die der Rastertunnelmikroskopie zugrundeliegenden Effekte sind schon seit der Entwicklung der Quantentheorie bekannt (> 60 Jahre). Erste Versuche, mittels einer Spitze die Topographie von Metalloberflächen zu erkunden, wurden 1971 von YOUNG und Mitarbeitern [1] unternommen. Die erzielte Auflösung betrug 3 nm vertikal und 400 nm horizontal. Die Hauptursache für diese geringe Auflösung bestand in dem relativ großen Abstand zwischen Spitze und Probe ( 20 nm). Kleinere Abstände, wie sie für Tunnelprozesse notwendig sind (einige Å), ließen sich damals aufgrund von Schwingungseinflüssen nicht realisieren. Eine erfolgreiche Kombination von Vakuumtunneln und piezoelektrischem Antrieb zu einem STM wurde 1981 von G. BINNIG, H. ROHRER und Mitarbeitern [2] im IBM-Forschungslabor in Rüschlikon (Schweiz) demonstriert. BINNIG und ROHRER erhielten dafür im Jahr 1986 zusammen mit E. RUSKA (Entwicklung des Elektronenmikroskops) den Nobelpreis für Physik. In demselben Jahr bauten beide auch das erste AFM, mit dem - im Gegensatz zum STM - auch Oberflächen nicht- oder nur schlecht-leitender Materialien mit hoher Auflösung untersucht werden können. A. Theorie 1. Physikalische Grundlagen 1.1. Zwischenmolekulare Kräfte Mit dem AFM ist es möglich, auf einer Längenskala von bis 10-7 m elektromagnetische Kräfte zwischen Oberflächen zu messen bzw. zur Untersuchung von Oberflächen zu nutzen. Einige der am häufigsten herangezogenen Kräfte sind van-der-waals-, Abstoßungs-, elektrostatische-, magnetische-, Reibungs- und Adhäsionskräfte. Sie alle können mit einem einfachen Aufbau, der sich ursprünglich vom STM ableitet, gemessen und/oder genutzt werden. Die Auflösung hängt beim AFM stark von diesen Kräften ab. Sie liegen typischerweise zwischen 10-8 und N. Das AFM ist aufgrund seiner vielfältigen Möglichkeiten heute 3

5 sehr weit verbreitet, insbesondere in den Bereichen industrielle Materialcharakterisierung und universitärer Forschung. Gerade in der biologischen Forschung hat die Verbreitung von Rasterkraftmikroskopen in den letzten Jahren aufgrund der Möglichkeit, auch in Lösungen zu messen, enorm zugenommen. Im Folgenden sollen die wichtigsten Kräfte kurz besprochen werden. Eine vollständige Darstellung ist hier nicht möglich, der interessierte Leser sei auf die am Ende des Manuskriptes zusammengestellte Literaturliste verwiesen VAN-DER-WAALS-Kräfte VAN-DER-WAALS-Kräfte entstehen durch Wechselwirkungen zwischen: a) zwei permanenten Dipolen, b) Molekülen mit permanentem Dipolmoment mit solchen ohne (Dipol-induzierter Dipol, Induktionseffekt)), c) dipolfreien Atomen und Molekülen (Dispersionswechselwirkung). Sind zwei permanente Dipole in schneller thermischer Bewegung, so können sie sich verschieden zueinander orientieren. Gegeneinander orientierte Dipole ziehen sich an. Diese Anziehung wird durch beschrieben. Bei U 0 handelt es sich um das Potential, μ 1 und μ 2 sind die Dipolmomente der Moleküle und r ihr Abstand. Die DEBYE-Theorie berücksichtigt auch den Induktionseffekt, den ein permanenter Dipol auf ein dipolfreies Atom oder Molekül ausübt. Unter Berücksichtigung der Polarisierbarkeit 2 des Teilchens, in dem das Dipolmoment induziert wird, ergibt sich eine zu r -6 proportionale potentielle Energie U I : Im zeitlichen Mittel dipolfreie Teilchen haben kurzfristig durch asymmetrische Elektronenverteilungen kleine Dipolmomente (z.b. Argonatome). Durch trägheitsfreie Verschiebungspolarisation wird in benachbarten Teilchen ein gleichgerichtetes Dipolmoment induziert. Die entstehende kurzzeitige Anziehungskraft ist die Dispersionskraft. Für diese Wechselwirkung ergibt sich ein ähnlicher Zusammenhang: (1) (2) Dieser konnte experimentell bestätigt werden (z.b. [3]). Das gesamte Anziehungspotential U an setzt sich aus den Anteilen von Orientierung, Induktionseffekt und Dispersion zusammen: (3) Im Fall makroskopischer anziehender Wechselwirkungen, wie sie für eine Probenoberfläche und eine AFM- Spitze als Wechselwirkung zwischen einer Ebene und einer Kugel näherungsweise angenommen werden kann, darf nicht überraschen, dass dieses Potential nicht mehr in seiner ursprünglichen Form gilt. Vielmehr (4) 4

6 muss über die betrachtete Geometrie integriert werden. Als Ergebnis für den betrachteten Modellfall Kugel- Ebene erhält man so für das anziehende VAN-DER-WAALS Potential [4] mit dem Kugelradius R, dem Abstand r zwischen Kugel und Ebene, ihren Teilchendichten 1 und 2, der LONDONschen Dispersionskonstanten C als Koeffizienten des Atom-Atom-Paarpotentials (im einfachen VAN-DER-WAALS Potential) und der HAMAKER-Konstanten A. Die anziehende Wechselwirkung ist somit nur noch umgekehrt proportional zum einfachen Abstand der makroskopischen Körper. (5) Abstoßungskräfte Bei sehr kleinen Abständen zwischen den Teilchen kommt es aufgrund der Wechselwirkungen zwischen positiven Atomkernen und der Überlappung der Elektronenhüllen (PAULI-Verbot) zu einer Abstoßung. Derzeit existiert allerdings keine exakte mikroskopische Beschreibung dieser Kräfte, welche zu einer analytischen Lösung führen könnte. Verschiedene Beziehungen wurden postuliert, und alle haben zwei Charakteristika gemeinsam: die kurze Reichweite und die starke Abstandsabhängigkeit. So gilt z.b. für das Harte-Kugel-Potential mit n=. Ist r<, so ist das Potential unendlich groß, für r> wird es Null. Bei handelt es sich um den Harte-Kugel-Radius der Atome (z.b. 0,188 nm für Argon), r ist der Teilchenabstand. In VAN-DER-WAALS-Systemen wird häufig ein Potenzgesetz der Form für die abstoßenden Wechselwirkungen angenommen. Aber auch eine exponentielle Form kann zur Beschreibung herangezogen werden: c, und 0 sind anpassbare Konstanten, 0 beträgt typischerweise um 0,02 nm. Potenz- und eher sogar noch das Exponentialgesetz beschreiben das abstoßende Potential realistischer als das Harte-Kugel-Potential, da sie eine Kompressibilität der Atome berücksichtigen. (6) (7) (8) Das LENNARD-JONES-Potential Anziehendes und abstoßendes Potential kann man zu einem Gesamtwechselwirkungspotential zusammenfassen. Nimmt man dazu das Potenzgesetz für die abstoßende Wechselwirkung und setzt den Exponenten gleich 12, erhält man mit den Gleichungen (4) und (7) mit dem (12,6)-Potential einen Spezialfall des LENNARD-JONES-Potentials: (9) Dabei beträgt das Potential dann den Wert Null, wenn r= 0 ist. Bei r=2 1/6 0 wird das Potential minimal, das System befindet sich im Gleichgewicht. Für den Fall der Wechselwirkung zwischen Edelgasatomen lässt sich mit diesem Potential gut rechnen. 5

7 Abb. 1: AFM-Aufnahme von MoS 2. Um die Wechselwirkung zwischen einer AFM-Spitze und einer Probenoberfläche zu beschreiben, muss man jedoch die Gleichungen (5) und (7) zusammenfassen, man erhält Betrachtet man diese Beziehung etwas genauer, so fällt auf, dass im Auflagemodus (s. Kap ) die vordersten Spitzenatome eine abstoßende Kraft erfahren, während die Atome in den nächsten Atomlagen hingegen angezogen werden können. Der sehr starke Anstieg der Abstoßungskräfte hat zur Folge, dass eine extrem hohe laterale Auflösung im AFM erreicht werden kann, und bei einer Vielzahl von kristallinen Verbindungen konnte die Gitterstruktur der Oberfläche aufgelöst werden (z.b. auf MoS 2, s. Abb. 1). (10) Allerdings handelt es sich bei dieser hohen Auflösung nicht um echte atomare Auflösung. Kristallgitter weisen aus thermodynamischen Gründen eine Vielzahl von Defekten auf. Mit einem AFM im Auflagemodus konnten diese Defekte bisher nicht nachgewiesen werden. Dies liegt daran, dass bei der Wechselwirkung zwischen Spitze und Probe auch die zweite, dritte, usw. Atomlage zu der Gesamtwechselwirkung beitragen. Dadurch wird der Einfluss eines atomaren Defektes auf der Oberfläche einfach herausgemittelt Der quantenmechanische Tunneleffekt Ganz anders verhält sich dies im Rastertunnelmikroskop. Dies liegt an der etwas anderen Abstandsabhängigkeit der ihm zugrunde liegenden Messgröße, des Tunnelstroms. Dieser soll zunächst kurz erläutert werden. Ein Teilchen, welches durch eine Potentialbarriere endlicher Höhe und Breite eingeschlossen ist, kann nach den Vorstellungen der klassischen Mechanik den Potentialtopf nicht verlassen. Aus quantenmechanischer Sicht wird der Aufenthaltsort eines Teilchens zu einem bestimmten Zeitpunkt durch eine Wahrscheinlichkeitsverteilung beschrieben. Das bedeutet, dass ein Teilchen, welches sich nach klassischer Betrachtungsweise im Potentialkasten befindet, auch mit einer - wenn auch geringen - von Null verschiedenen Wahrscheinlichkeit auf der anderen Seite der Potentialbarriere anzutreffen ist (Abb. 2). Dieses nichtklassische Verhalten nennt man quantenmechanischen Tunneleffekt. Tunneln Elektronen durch eine Potentialbarriere, entsteht ein messbarer Strom. 6

8 Abb. 2: Der Unterschied zwischen klassischer (oben) und Quantentheorie (unten), illustriert durch das Tunneln eines Teilchens durch eine Potentialbarriere. Bei der Rastertunnelmikroskopie tunneln Elektronen durch einen schmalen Spalt (i.a. durch Luft oder im Vakuum) zwischen Spitze und Probe. Die äußere Spannung, mit der üblicherweise gearbeitet wird, beträgt bei Metallen zwischen 0,01 und 0,1 V, bei Halbleitern bis etwa 2 V. Der daraus resultierende Tunnelstrom beträgt etwa 1 na. Die Wahrscheinlichkeit für einen Übergang der Elektronen kann man aus dem Grad der Überlappung der Wellenfunktionen der beteiligten Energieniveaus und deren Besetzungswahrscheinlichkeiten berechnen. Daraus ergibt sich für kleine Spannungen U in erster Näherung eine lineare Abhängigkeit zwischen Stromstärke I und angelegter Spannung sowie eine eponentielle Abhängigkeit des Tunnelstromes vom Abstand d zwischen Spitze und Probenoberfläche: Die Konstante k hängt vom mittleren Potential zwischen Spitze und Probe ab. Der exponentielle Zusammenhang zwischen Tunnelstrom und Abstand d hat zur Folge, dass in erster Näherung 90% des Tunnelstromes über das vorderste Spitzenatom fließen, die restlichen 10% verteilen sich auf tiefer liegende Atomlagen. Daher ist es leicht einsichtig, dass atomare Fehlstellen mit einem STM entdeckt werden können und somit echte atomare Auflösung mit diesem Gerät erreicht werden kann, wie auch Abb. 3 am Beispiel Si (111) zeigt. Abb. 3: STM-Aufnahme von Si (111). Deutlich sind mehrere atomare Fehlstellen zu erkennen. (11) 2. Technische Aspekte - Aufbau von SXM Der allgemeine Aufbau eines SXM ist in Abb. 4 dargestellt. Es besteht aus Probe, Probenhalterung und Probenpositionierung Sonde, Sondenhalterung (-positionierung), einer Schwingungsdämpfung sowie einer Steuerungs- und Auswerteeinheit. Sonde und Probe werden relativ zueinander bewegt und die Oberflächeneigenschaften durch die Sonde gemessen. Die Positionierung wird oft mit Hilfe eines optischen Mikroskops oder einer am AFM angebrachten Videokamera überwacht. 7

9 Abb. 4: Schematischer Aufbau eines SXM Positionierung Die genaue Steuerung der Relativbewegung von Probe und Sonde wird i.a. durch zwei getrennte Systeme für Grob- und Feinsteuerung realisiert Der piezoelektrische Effekt Verschiedene Festkörper besitzen eine permanente Polarisation, welche auch ohne äußeres elektrisches Feld existiert. Die ist z.b. bei Wachs der Fall. Schmilzt man Wachs auf und legt an die Schmelze ein starkes elektrisches Feld an, so richten sich die Moleküle aufgrund ihrer Dipolmomente im Feld teilweise aus. Diese Ausrichtung wird beim Abkühlen beibehalten, so dass sie auch im Festkörper auftritt. Auch wenn man das elektrische Feld dann abschaltet, bleibt eine permanente Polarisation zurück. Ein Festkörper mit solchen Eigenschaften nennt man Elektret. Ein Elektret besitzt Polarisationsladungen an seiner Oberfläche. Diese werden aber i.a. von freien Ladungen aus der umgebenden Luft mit der Zeit ausgeglichen, das Material wird entladen und es existiert kein sichtbares elektrisches Feld mehr. Die interne Polarisation bleibt aber noch erhalten. Auch einige kristalline Festkörper besitzen diese Polarisation. In diesen Kristallen besitzt jede Elementarzelle ein identisches permanentes Dipolmoment (s. Abb. 5). Alle Dipolmomente weisen in dieselbe Richtung, auch dann, wenn kein äußeres elektrisches Feld angelegt ist. In solchen sog. ferroelektrischen Materialien fällt der Schwerpunkt der positiven Ladungen des Kristalls nicht mit dem der negativen Ladungen zusammen. Abb. 5: Komplexe Kristallgitter können eine permanente intrinsische Polarisation P besitzen (Ferroelektrizität). 8

10 Abb. 6: Ein mechanisch nicht beanspruchter Kristall habe eine dreizählige Symmetrieachse (links). Die Pfeile stehen für die Dipolmomente, deren Summe in jedem Schnittpunkt Null beträgt. Wird der Kristall einer mechanischen Spannung ausgesetzt, entsteht in der angegebenen Richtung eine Polarisation P (rechts). Die Summe der Dipolmomente verschwindet jetzt nicht mehr. Diese permanenten Dipolmomente können von außen beeinflusst werden. So können sie sich z.b. beim Erhitzen eines Kristalls durch thermische Expansion verändern. Diesen Effekt nennt man Pyroelektrizität. Ähnlich kann es sich verhalten, wenn man mechanischen Druck oder Zug auf den Kristall ausübt. Das elektrische Feld ändert sich, diese Änderung ist messbar. Die Änderung der Polarisation durch mechanischen Druck oder Zug nennt man Piezoelektrizität. Dieser Effekt ist umkehrbar, d.h. durch Anlegen eines elektrischen Feldes an einen piezoelektrischen Kristall kann dieser zu Längenänderungen gezwungen werden (inverser piezoelektrischer Effekt). Alle ferroelektrischen Materialien sind gleichzeitig auch piezoelektrisch, umgekehrt gilt dies nicht. Ein schematisches Beispiel zeigt Abb. 6. Quarz ist piezoelektrisch, aber nicht ferroelektrisch, Bariumtitanat hingegen ist beides. Die Feinsteuerung erfolgt durch Ausnutzung des piezoelektrischen Effektes. Als Piezomaterialien werden Einkristalle (Quarz, BaTiO 3 ) oder spezielle Keramiken (PZT: Pb(Zr 1-x Ti x )O 3 ) eingesetzt. Unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes kommt es zu einer Längenänderung der Piezoelemente. Man unterscheidet Längs- und Quereffekt: Quereffekt (12) Längseffekt (13) Die Komponenten des Piezomoduls haben Werte von d zzx m/v und d zzz -(1...3) m/v Feinsteuerung Durch orthogonale Kombination von drei stabförmigen Piezobauelementen entsteht ein sog. Dreibein (s. a. Abb. 4), welches von BINNIG und ROHRER für ihren Prototyp des STM nutzten. Ein experimentell sehr attraktiver, weil einfacher Aufbau, lässt sich mit dem sog. Rohrscanner (Abb. 7) verwirklichen. Er ermöglicht die Bewegung in drei Freiheitsgrade durch Anlegen einer unsymmetrischen Spannungsverteilung. Rohrscanner zeichnen sich außerdem durch gute mechanische Steifigkeit aus. Ein Röhrchen aus in radialer Richtung polarisierter Keramik trägt auf der gesamten Innenfläche eine und auf der Außenseite vier voneinander isolierte Elektroden. Eine Auslenkung in z- Richtung erfolgt bei Anlegen einer Potentialdifferenz zwischen der inneren und allen äußeren Elektroden. Verschiebungen in x- und y-richtung erreicht man, indem die jeweiligen gegenüberliegenden äußeren Elektrodenpaare bezüglich der inneren Elektrode auf entgegengesetzte Potentiale gebracht werden (s. a. [5], S. 53). Abb. 7: Rohrscanner. 9

11 Grobsteuerung Die Grobsteuerung kann über rein mechanische Systeme wie z.b. Hebel, Mikrometerschrauben o.ä. erfolgen. Eine andere Möglichkeit, welche insbesondere unter UHV-Bedingungen eingesetzt wird, besteht in der Verwendung piezoelektrischer Stellelemente auch hier Schwingungsdämpfung Für den Betrieb von Rastersondenmikroskopen ist es notwendig, die Messsonde auf wenige Å Abstand (bis hin zum leichten Kontakt im Falle des AFM) zur Probe zu bringen und dort zu stabilisieren. Das Messsignal zeigt eine starke Abhängigkeit (beim STM exponentiell, beim AFM mit ca. 1/r (im non-contact mode)) von der vertikalen und lateralen Position und ist somit ausschlaggebend für die hohe Auflösung der Instrumente. Dies bedeutet aber auch, dass interne oder externe Einflüsse, die die relative Position der Sonde zur Probe verändern können, für den hochauflösenden Betrieb vermieden werden müssen Externe Einflüsse Trittschall, sonstiger Schall und Vibrationen (z.b. durch Kompressoren oder Fahrzeuge) werden durch Wände, Fußböden und Luft auf das SXM übertragen. Die anregenden Frequenzen liegen im Bereich von etwa 1 20 Hz. Zusätzlich besitzen die Gebäude Eigenschwingungen in diesem Frequenzbereich, abhängig von Aufstellungsort und Etage. Diese störenden niederfrequenten Schwingungen müssen gedämpft werden. Dabei muss das Dämpfungssystem so gewählt werden, dass die Eigenfrequenz des Systems unter der Frequenz der zu dämpfenden Schwingung liegt. Gute Dämpfung wird durch Halterungen der Geräte an von der Decke herabreichenden Gummiseilen, Aufstellung auf schweren Tischen, welche auf luftgefederten Füßen stehen, Wirbelstrombremsen, Isolation mittels Viton-O-Ringen oder Kombinationen hiervon erzielt. Die Dämpfungssysteme haben Eigenfrequenzen von unter 1 bis 5 Hz. Eine Isolierung gegen Luftschall kann durch Ummantelung des Gerätes z.b. mit einer Kunststoff- oder Metallhaube erfolgen Interne Einflüsse Bedingt durch die Bewegung der Sonde auf der Probe können Teile der Sonden- und Probenhalterung und insbesondere der Positionierungseinheit zu Schwingungen angeregt werden. Die Resonanzfrequenzen dieser Elemente lassen sich durch die Konstruktion und die verwendeten Materialien beeinflussen. Durch einen kompakten Aufbau erreicht man hohe Resonanzfrequenzen ( 100 khz). Liegt die Abtastfrequenz unter den Resonanzfrequenzen, so erfolgt keine Anregung der Schwingungen. Desweiteren können Instabilitäten durch unterschiedliche thermische Ausdehnung und Wärmekapazität der verwendeten Bauteile auftreten. Eine sorgfältige Auswahl der Materialien, ein kompakter Aufbau sowie eine genügend lange Equilibrierungszeit des Systems zur Verringerung thermischer Drift vermindern solche Störungen Steuerung Rastersondenmikroskope werden i.a. von A/D-, D/A-Wand lern und Computern entsprechend untenstehendem Schema (Abb. 8) gesteuert. Für die Sonde wichtige Parameter (Auflagekraft, 10

12 Tunnelspannung, Vergrößerung) können direkt während des Scannens modifiziert werden. Die Ergebnisse werden in Echtzeit auf dem Monitor dargestellt. Abb. 8: Schematische Darstellung der Steuerung eines AFM. Besonders bei starken Vergrößerungen machen sich verschiedene Störungen trotz Dämpfung durch Rauschen auf der graphischen Darstellung bemerkbar. Mittels der Software lässt sich eine Filterung z.b. durch einoder zweidimensionale FOURIER-Transformationsverfahren durchführen, die besonders bei periodischen Strukturen eine Verbesserung der Bildqualität liefert. Außerdem stellt die Software weitere Methoden zur Bildverarbeitung und Bildauswertung zur Verfügung. Insbesondere bei Verwendung von Filtern darf man jedoch nicht vergessen, dass durch deren Anwendung auch Information verloren gehen oder auch vorgetäuscht werden kann. 3. Arbeitsweisen verschiedener Rastersondenmikroskope 3.1. Rasterkraftmikroskop Mit dem AFM kann in verschiedenen Modi gearbeitet werden. Zunächst lassen sich zwei Typen entsprechend den wirkenden Kräften unterscheiden. Die bei Kontakt auftretenden Kräfte folgen einem Abstoßungsgesetz, weiter entfernt von der Oberfläche wirken schwache Anziehungskräfte (s. LENNARD- JONES-Potential). Abb. 9: Schematische Darstellung der Funktionsweise eines AFM. 11

13 Auflagemodus Beim AFM im Auflagemodus wird eine scharfe Spitze (Krümmungsradius 100 nm) auf die Probe gedrückt. Diese Spitze besteht typischerweise aus Si oder Si 3 N 4. Sie befindet sich am Ende eines Federbalkens (s. Abb. 9). Mit Hilfe dieses Balkens, welcher an einem Substrat befestigt ist (die Herstellung des gesamten sog. Cantilevers erfolgt mit Ätztechniken aus der Elektronikindustrie), kann die Spitze auf die Oberfläche gedrückt werden. Bei den heute kommerziell erhältlichen Geräten hat sich eine optische Nachweismethode zur Bestimmung der Auflagekraft durchgesetzt. Der Licht strahl eines Lasers wird von der mit Gold bedampften Rückseite der mikroskopischen Blattfeder reflektiert und von einer viergeteilten Photodiode detektiert. Die Bewegung der Spitze und somit der Feder führt zu einer Veränderung des Reflektionswinkels und somit zu einer Wanderung des Laserlichtfleckes auf der Diode. Dadurch liefern die beiden oberen Felder der Diode einen anderen Photostromwert als die unteren beiden, das Differenzsignal stellt das Messsignal dar. Wie im Falle des STM (s. Kap ) kann ein AFM dann in zwei unterschiedlichen Modi betrieben werden Mode konstanter Kraft In der Mode konstanter Kraft wird über den Rückkopplungskreis beim Abtasten der Probenoberfläche das Differenzsignal der Photodiode durch Nachregeln des z-piezo konstant gehalten (s. Abb. 10). Dies entspricht einem Konstanthalten der auf die Probe wirkenden Kraft. Die Steuerspannung des z-piezo wird vom Regelsystem dann in Höheninformation umgerechnet und entspricht (in erster Näherung) der Topographie der untersuchten Probe Mode konstanter Höhe Die Rückkopplung wird in diesem Arbeitsmodus abgestellt, der z-piezo steht damit unter einer konstanten Spannung. Beim Abtasten der Oberfläche wird nun die Blattfeder unterschiedlich - je nach Topographie der Oberfläche - durchgebogen. Dadurch ändert sich der Reflektionswinkel und somit das gemessene Differenzsignal (also die Kraft zwischen Spitze und Oberfläche). Messergebnis ist nun das Differenzsignal der Photodiode, welche mit der Topographie näherungsweise übereinstimmt. Quantitative Aussagen über Höhenprofile sind in diesem Modus jedoch nicht ohne weiteres möglich und bedürfen weiterer Messungen (z.b. der Federkonstanten des Cantilevers). Dieser Modus eignet sich gut für glatte Ober flächen und hochaufgelöste Aufnahmen, bei denen eine schnelle Abtastfrequenz vonnöten ist. Zur Untersuchung von Höhenprofilen jedoch ist der Modus konstanter Kraft vorzuziehen. Abb. 10: AFM in der Mode konstanter Kraft. Abb. 11: AFM im Modus konstanter Höhe. 12

14 Non-contact -AFM Im non-contact -Modus eines AFM bei einem Abstand Spitze- Probe von nm sind die durch die anziehenden Wechselwirkungen hervorgerufenen Auslenkungen sehr klein und können schlecht gemessen werden. Deshalb bedient man sich eines anderen Verfahrens, um die wirksamen Kräfte zu messen. Durch ein kleines Piezoelement (s. Abb. 12) wird die Feder in Schwingungen nahe ihrer Resonanzfrequenz versetzt. Eine dann auf die Feder wirkende äußere Kraft F z ändert die effektive Federkonstante k der Sonde: (14) Wegen (15) (m: Masse der Feder, : Resonanzfrequenz) ändert sich daher auch die Resonanzfrequenz der Feder und damit die Amplitude, welche über die Auslenkung des Laserlichtpunktes über die Photodiode gemessen wird. Alternativ dazu kann jedoch auch die beim Annähern der Spitze an die Probe durch die Anziehungskräfte Abb. 12: Schematische Darstellung eines "non-contact" AFM. verursachte Phasenverschiebung zwischen Anregungsschwingung und gemessener Schwingung als Signal gemessen werden. Messergebnis ist letztlich wieder die Topographie der Probe, welche durch Nachregeln des z-piezos bei Messung des Rückkoppelparameters konstante Amplitudendämpfung oder konstante Phasenverschiebung aus der an diesen Piezo angelegten Spannung erhalten wird Rastertunnelmikroskop Mode konstanten Tunnelstromes Diese Betriebsweise entspricht in etwa der Mode konstanter Kraft beim AFM. Die Spitze wird so über die Probe bewegt, dass ein konstanter Tunnelstrom zwischen beiden fließt. Dies bedeutet (in erster Näherung) gleichzeitig, dass der Abstand Spitze-Probe konstant gehalten wird. Die Elektronik benutzt einen Regelkreis, um den Strom konstant zu halten. Nimmt der Strom zu, so wird die Spitze zurückgezogen; nimmt er ab, wird sie angenähert. Die Messdaten, die in diesem Modus aufgezeichnet werden, entsprechen der Regelspannung, die an den z-piezo angelegt werden muss, um den Tunnelstrom konstant zu halten. Diese Spannung wird dann in eine Höheninformation umgerechnet Mode konstanter Höhe Auch hier ist die Analogie zum AFM leicht herzustellen; denn in diesem Betriebsmodus wird die Tunnelspitze während des Rastervorgangs auf einer konstanten Höhe (d.h. die an den z-piezo angelegte Spannung bleibt konstant) über der Probenoberfläche gehalten. Die Messdaten ergeben sich aus der Änderung des Tunnelstromes als Funktion der Abtastposition. Wie im Falle des AFM eignet sich die Mode konstanter Höhe sehr gut für eine hohe Datenerfassungsrate, da während des Abtastvorgangs kein elektronischer Regelkreis notwendig ist, der an jedem Abtastpunkt die 13

15 Höhe der Spitze nachregeln muss. Bei sehr unebenen Oberflächen ist dieser Betriebsmodus von Nachteil, da es hierbei sehr schnell passieren kann, dass die Spitze in die Oberfläche hineingefahren wird. Hierfür eignet sich dann besonders der Modus des konstanten Tunnelstromes. Für glatte Oberflächen und insbesondere Auflösung im atomaren Bereich hingegen ist die Mode konstanter Höhe i.a. vorzuziehen Weitere SXM In den letzten Jahren gab es eine Fülle von Folgeentwicklungen aus dem Rastertunnelmikroskop; STM und AFM sind nur die gebräuchlichsten Typen. Grundsätzlich kann jede Art der Wechselwirkung im sog. Nahfeld (d.h. im Bereich einiger nm von der Probe entfernt) in einem SXM als Messgröße ausgenutzt werden. Von daher kann die große Zahl an Neuentwicklungen nicht überraschen. Einige Beispiele sind das optische Rasternahfeldmikroskop (SNOM, Auflösung derzeit <10 nm), das Raster-Wärme-Mikroskop (SThM, ca. 30 nm Auflösung), Magnetkraftmikroskop (MFM), elektrostatisches AFM (EFM), akustisches Nahfeldmikroskop (SNAM) oder das Raster-Ionenleitfähigkeits-Mikroskop (SICM, ca. 200 nm Auflösung). Zur Funktionsweise sei auf die Literatur verwiesen [5]. 4. Kraftspektroskopie 4.1. Allgemeines Die geringen Kräfte, die zwischen einzelnen Molekülen auftreten, sind nur mit großem apparativem Aufwand messbar. In den 70er Jahren konnten erstmals mit dem Oberflächenkraftapparat (SFA, surfaces forces apparatus) Kräfte zwischen sehr glatten Oberflächen mit einer Auflösung von 10 pn bestimmt werden. Die Entwicklung des AFM und seine Nutzung als Kraftspektroskop ist ein großer Fortschritt auf diesem Gebiet. Mit dem AFM können Oberflächen mit hoher Auflösung abgebildet werden und gezielt bestimmte Moleküle manipuliert werden. Bereits 1994 gelang es E.L. Florin et al. die Bindungskraft eines einzelnen Liganden-Rezeptor-Paares zu bestimmen. In der Folgezeit konnten auch andere intermolekulare Kräfte wie z.b. die Wechselwirkungen zwischen komplementären DNA-Strängen und Protein-DNA- Komplexen analysiert werden. Intramolekulare Kräfte wurden 1997 von M. Rief et.al. an dem linearen Polysaccharids Dextran bestimmt. Dabei wurde an mehreren hintereinandergeschalteten Glukoseeinheiten das Umklappen einer einzelnen Bindung des Polymerrückgrates von einer gauch- in eine trans-konformation beobachtet. Mit der Technik der Kraftspektroskopie wurde nun auch die Entfaltung von Proteinen möglich. Dies gelang erstmals an dem modular aufgebauten Muskelprotein Titin (Abb. 13A). 14

16 A B Abb. 13: A) Kraft-Abstands Kurve vom modular aufgebauten Muskelprotein Titin. Jeder Peak entspricht der Entfaltung einer Domäne. [aus M. Rief und H. Grubmüller, Physikalische Blätter 2001, 57(2), 55-61] B) Kraft-Abstands Kurve des Membranproteins Bakteriorhodopsin (Mitte), unten ist zu erkennen, dass ein Monomer extrahiert wurde. [aus F. Oesterhelt et al., Science 2000, 288, ] F. Oesterhelt et al. gelang es im Jahr 2000, das deutlich kleinere und nicht modular aufgebaute Protein Bakteriorhodopsin kraftspektroskopisch zu untersuchen (Abb. 13B). Aktuelle Arbeiten beschäftigen sich auch mit der Rückfaltung von Proteinen. M. Kessler et al. war es möglich, teilweise entfaltete Bakteriorhodopsinmoleküle wieder in die Membran zurückzufalten und dabei die Faltungskräfte zu bestimmen. 4.2 Prinzip der Kraftspektroskopie Um ein Molekül kraftspektroskopisch untersuchen zu können, muss man es auf dem Probenträger befestigen. Dies geschieht im Falle des Bakteriorhodopsins meist durch unspezifische Wechselwirkungen zwischen Purpurmembranen und frisch gespaltenem Glimmer. Wird die AFM-Spitze nun auf das Substrat gedrückt, beobachtet man bei einem Teil der Versuche eine unspezifische Ankopplung des Proteins an die Spitze. Beim Zurückziehen der Spitze wird eine so genannte Kraft-Abstands Kurve (kurz Kraftkurve) beobachtet. Die Kraftkurven zeigen folgenden Verlauf (Abb. 14): Die Spitze wird angenähert (1) und mit einer bestimmten Kraft eine kurze Zeit auf das Substrat gedrückt (2). Kommt es zur Ankopplung, erhöht sich beim Zurückziehen die Durchbiegung der Spitze, die über ihre Kraftkonstante in eine Kraft umgerechnet werden kann (3). Erreicht man eine maximale Kraft (4), reißt das Substrat ab; die Durchbiegung entspricht nun wieder dem Ausgangswert (5). Abb. 14: Verlauf des Kraftspektroskopie-Zyklus (Erklärung im Text) 15

17 4.3. Durchbiegungsempfindlichkeit und Kraftkonstante Beim Annähern und Zurückziehen der Spitze von der Probe zeichnet die Software die Durchbiegung des Cantilevers in Volt auf. Um die Kräfte zu berechnen, die beim Annähern und Zurückziehen der Spitze wirken, benötigt man zwei Messgrößen: Die Durchbiegungsempfindlichkeit (englisch deflection sensitivity) und die Kraftkonstante der Spitze. Die Durchbiegungsempfindlichkeit sagt aus, wie weit sich der Cantilever bei einem bestimmten Vertikalsignal des Photodetektors durchbiegt. Sie hängt von mehreren Faktoren wie der Beschaffenheit und Lage des Cantilevers im Cantileverhalter und der Position des Laserstrahls auf der goldbedampften Rückseite des Cantilevers ab. Daher muss die Durchbiegungsempfindlichkeit nach jedem Einsetzen der Spitze und nach jeder Laserjustierung neu gemessen werden. Zur Bestimmung dieses Wertes wird die Spitze auf eine harte Probe gedrückt, ohne diese einzudrücken. Aus der Steigung der resultierenden Kraftkurve berechnet die Software automatisch die Durchbiegungsempfindlichkeit. Die Kraftkonstante des Cantilevers wird über das thermische Rauschen berechnet. Der Piezoweg gibt jedoch nicht den wahren Abstand zwischen Spitze und Probe wieder. Um die Kraft- Abstands-Kurve zu erhalten, muss die Durchbiegung der Spitze in jedem Punkt von den Rohdaten subtrahiert werden WLC-Fit Die Gesamtlänge einer gemessenen Kraftkurve gibt den Abstand wieder, in dem sich das an die Spitze angekoppelte Protein von der Spitze oder vom Probenträger löst. Es ist also aufgrund dieser Daten nicht möglich, auf die Lage eines Strukturmerkmals innerhalb der Polypeptidkette zu schließen. Deshalb ist es nötig, ein theoretisches Modell an die Messkurven anzupassen. Als besonders geeignet zur Beschreibung der Elastizität von Proteinen und DNA-Strängen hat sich das WLC-Modell (wormlike chain = wurmartige Kette) erwiesen: Dabei ist die Zugkraft, x die Ausdehnung des Polymers, die Persistenzlänge und L die Konturlänge. Die Persistenzlänge ist ein Maß für die Biegefestigkeit; sie ist ein empirischer Parameter und nicht mit realen Strukturgrößen wie der Monomerlänge gleichzusetzen. Die Konturlänge ist der Fitparameter; sie gibt die Länge an, auf die sich ein Polymer nach dem WLC-Modell maximal dehnen lässt. Daher entspricht die Konturlänge eines Kraftkurvenabschnitts der Länge des bis zu diesem Zeitpunkt gedehnten Polymerrückgrats. (14) 16

18 B. Aufgaben Messaufgaben Aufgabe 1: AFM Standard (TopoMetrix-AFM) Auf der ersten zur Verfügung gestellten Probe befinden sich acht Felder A bis G (s. Anhang), auf denen unterschiedliche Mikrostrukturen aufgebracht sind. Bestimmen Sie die Gitterkonstanten von zwei dieser Strukturen durch Messung im Contact-Modus. Wie groß sind die Abweichungen? Aufgabe 2: Atomare Auflösung (TopoMetrix-AFM) Nehmen Sie die dritte Probe in höchster (atomarer) Auflösung auf. Bestimmen Sie anhand der Ihnen zur Verfügung gestellten Gitterparameter von fünf verschiedenen Substanzen, welche Oberfläche Sie untersucht haben. Aufgabe 3: Purpurmembranen (NanoScope-AFM) Auf dem Probenträger wurden Purpurmembranen abgeschieden. Nehmen sie mehrere Übersichtsbilder auf und versuchen Sie molekulare Auflösung zu erreichen. Aufgabe 4: Kraftspektroskopie (NanoScope-AFM) a) Vergrößern sie eine der Purpurmembranen und nehmen sie mehrere Kraftkurven auf. Die Kurven, die Bindungsereignisse zeigen sollen aussortiert und ausgewertet werden. b) Zeichnen Sie die Maxima in ein Modell der Bakteriorhodopsinstruktur (siehe Anhang) ein. Warum liegen die Barrieren an diesen Stellen? Theoretische Aufgaben Aufgabe 5: Wirkende Kräfte a) Berechnen Sie die VAN-DER-WAALS-Kräfte zwischen zwei Argon-Atomen im LENNARD-JONES- Potentialmodell. Zeichnen Sie die Potentialkurve U(r) und die Kraftkurve F(r) als Funktion des Abstandes. b) Berechnen Sie die Kräfte einer typischen kovalenten Bindung (HCl) über das Morse Potential. Zeichnen Sie die Potentialkurve und die Kraftkurve als Funktion des Abstandes. c) Der Umrechnungsfaktor Sensorsignal-Auflagekraft für die Ihnen zur Verfügung gestellte AFM-Spitze (Messaufgaben 1 und 2) beträgt 0,1 nn/na. Bestimmen Sie mit diesem Wert die absolute Auflagekraft, nachdem Sie zum ersten Mal die Spitze ins Feedback gebracht haben. d) Vergleichen Sie die berechneten Kräfte mit der Auflagekraft. Welche Auswirkungen ergeben sich für die AFM-Messungen? 17

19 C. Versuchsdurchführung 5. TopoMetrix Das System TOPOMETRIX EXPLORER ist für verschiedene Anwendungen der Rastersondenmikroskopie konzipiert. Modularer Aufbau gestattet den Betrieb als STM, AFM u.a. In der ausgeführten Variante liegt ein Rasterkraftmikroskop vor. Die Auslenkung der Sondenspitze wird über Reflektion eines Laserstrahles (s.a. Abb. 8) und durch Auswertung des Signals eines Vierfeldsensors gemessen. Das AFM TOPOMETRIX EXPLORER besteht aus einer in x- und y-richtung manuell verschiebbaren Basisplatte, auf dem die Probe befestigt werden kann, einem kompakten Messkopf, in den Scanner, Laser, Photodetektor, CCD-Kamera zur Beobachtung des Scanvorgangs und Justierungsschrauben integriert sind, elektronischer Steuereinheit sowie einem PC für die Auswertung und Darstellung der Daten. Ein weiterer kleiner Monitor zeigt das Bild der CCD-Kamera Vorbereitung von Probe und Sonde Die Proben für das AFM werden auf ein Stahlplättchen (Kantenlänge bzw. Ø 10 mm) aufgeklebt. Dieses wird magnetisch auf dem Probenhalter gehalten. Das Auflegen der (vorbereiteten) Proben erfolgt bei abgenommenem Sondenkopf. Die Proben selber sind i.a. sogar in mikroskopischen Dimensionen eben. Programmaufruf Direkt nach Einschalten des Programms ist der Teil Datenauswertung bereits aktiviert). Nach dem Start des Teilprogrammes Image Acquire wird durch Anklicken des entsprechenden Feldes der verwendete Scanner eingestellt. Es ist wichtig festzustellen, welcher Scanner verwendet wird, da die für die Piezoelemente benötigten Spannungen verschieden sind, zu hohe Spannungen aber unbedingt vermieden werden müssen! Durch vorsichtiges Abheben des Sondenkopfes ist der Scannertyp erkennbar. Dabei muß beachtet werden, dass der Halbleiterlaser ausgeschaltet sein muss, um Schäden an Augen zu verhindern. Der 2-μm Scanner ist als Rohrscanner ausgeführt, vom 150-μm Scanner ist nur der z-piezo zu erkennen. Durch Betätigung der entsprechenden Fenster wird die richtige Steuerspannung für den eingebauten Piezo gewählt und das Programm aktiviert. Laserjustierung Der Laser wird auf die rechte der beiden Spitzen justiert und der Umlenkspiegel so eingestellt, dass das SUM-Signal (alle 4 Sektoren des Photodetektors addiert) möglichst hoch ist. Zur Vorbereitung der Messung wird das Signal auf T-B eingestellt und der Spiegel so verdreht, dass der Signalwert ca. -20 na beträgt. Bei Annäherung der Spitze an die Probe kann dieser Wert sich verändern, der Horizontalspiegel muss dann gegebenenfalls nachgestellt werden, solange die Oberfläche von der Spitze noch nicht berührt wird. Bewegen der Probe und automatische Annäherung Die Probe kann nur manuell durch die beiden Mikrometerschrauben in der Basisplatte gegenüber der Spitze 18

20 verschoben werden. Dabei muss der Abstand Spitze-Probe auf dem Monitor kontrolliert werden! Die automatische Annäherung (Feld Tip Approach ) kann erfolgen, wenn der Abstand zwischen Sondenspitze und Probenoberfläche gering ist (im Monitorbild verschmelzen die Spitze und ihr Schatten) Messung Scannen Für das Scannen wird der Menüpunkt Acquire im Menü Commands oder das entsprechende Ikon gewählt, wodurch der Scanvorgang gestartet wird. Es empfiehlt sich, zunächst bei ca. 1-2 Zeilen/s und maximalem Bildausschnitt zu arbeiten. Die optimale Größe der Scangeschwindigkeit sowie der Rückkopplungsparameter (Proportional, Integral) sind auszuprobieren. Ein Kriterium für deren Güte sind z.b. die Qualität des Bildes sowie der RMS-Wert (random mean square, möglichst klein) des Internal Feedback -Signals Ausschnittsvergrößerung Durch Verkleinerung des Parameters Scan Range kann ein Bildausschnitt vergrößert dargestellt werden. Dabei gibt es für jeden Scanner sieben festeingestellte Scanbereiche, welche sich an der Mitte des Bildes orientieren. Durch Wahl von Zoom/Translate kann aber auch der zu vergrößernde Ausschnitt willkürlich festgelegt werden. Bei gedrückter linker Maustaste lässt sich dann im Scanbild die Größe des neuen Ausschnittes festlegen. Wird die linke Maustaste losgelassen, lässt sich dieser Ausschnitt auf dem Bild verschieben. Durch Betätigen der rechten Maustaste wird der gewählte Ausschnitt bestätigt. Auch bei den Scanfenstern liegt in der Version 4.01.b6 ein Programmfehler vor. Für den großen Scanner (150 μm) darf der Scanbereich 1 μm nicht gewählt werden, dies führt zum sofortigen Programmabsturz Datenauswertung Dieser Programmteil wird im Hauptmenü durch den Befehl Image Analysis im Menü Window oder das entsprechende Ikon aufgerufen. Es erlaubt Änderungen der graphischen Darstellung wie z.b. der Farbe, Schattierung, 3-d-Darstellung, Filterung (1- und 2-d-FFT), Glättung, Nivellierung, Anbringen von Beschriftungen u.v.a.m. Wie bereits erwähnt, kann weitergehende Bildbearbeitung wie z.b. FOURIER- Filterung zum Verlust oder auch Vortäuschen von Information führen! 5.4. Wechsel des Scanners Für verschiedene Auflösungsbereiche stehen unterschiedliche Scanner zur Verfügung. Das hier verwendete System enthält zwei Scanner, einen Dreibeinscanner für einen Ausschnitt von maximal (μm) 2 und einen Rohrscanner für 2,5 2,5 (μm) 2 maximale Scanfläche. Vor Durchführung von Aufgabe 6 muss der Scanner getauscht werden, denn für atomare Auflösung ist der Rohrscanner zu benutzen. Vor dem Auswechseln des Scanners ist zunächst die Spitze aus dem Feedback zurückzuziehen und der Laser auszuschalten. Nun kann die Spitze vorsichtig von dem Scanner entfernt werden. Im Menü Setup ist sodann der Befehl Scanner Select zu wählen. 19

21 Der Sondenkopf wird nun abgenommen. Der Scanner ist mit vier Schrauben an dem Sondenkopf befestigt. Diese Schrauben werden - ebenso wie die zugehörige Scannerverkabelung - vorsichtig gelöst und der Scanner entfernt. Der andere Scanner kann nun eingesetzt und vorsichtig befestigt werden. Die Verkabelung des Rohrscanners führt dabei zur Oberseite des Messkopfes, während der z-piezo des Dreibeinscanners mit den beiden (roten und orangen) Steckern an der Unterseite des Scanners verbunden ist. Wird der Rohrscanner (notwendig für atomare Auflösung) benutzt, muss zusätzlich noch die Befestigungsschraube an der Seite des Meßkopfes angezogen werden, um seitliche Bewegungen des Messsystems zu unterbinden. Achtung: diese Schraube muss bei Verwendung des großen Scanners unbedingt gelöst sein, gerade um die x- und y-bewegung des Lasersystem und der Spitze zu gewährleisten! Nach Einsetzen der AFM-Spitze muss der neue Scannertyp noch im entsprechenden Fenster der Software ausgewählt werden. Da beide Scanner leicht unterschiedliche Dimensionen besitzen, muss der Laserstrahlengang nun neu justiert werden. 6. NanoScope Das NanoScope-AFM (Abb. 15) besitzt einen ähnlichen Aufbau wie das TopoMetrix. Um noch rauschärmer messen zu können wird hier die Probe bewegt, während die Position der Spitze konstant bleibt Vorbereitung von Probe und Sonde Ein die Probe wird auf dem Scanner magnetisch fixiert und darauf geachtet, dass beim Einsetzen der Spitze diese nicht beschädigt werden kann. Dazu muss die Probe möglichst weit nach unten gefahren werden. Die Spitze wird je nach Anwendung in eine normale Halterung oder in die Flüssigzelle, die Messungen in Flüssigkeiten erlaubt, eingespannt. Nach dem Einsetzen der Halterung auf dem Scanner wird der Laser auf ein der beiden Spitzen justiert und mit dem Umlenkspiegel ein möglichst großes Summensignal eingestellt. Dabei die vertikal und horizontalwerte nicht maximal (±9,68V) sein. Abb. 15: NanoScope-AFM Bei Messung in Lösung muss die Beleuchtungslampe abgeschaltet werden, da die Probe sonst sehr schnell eintrocknet. Außerdem muss mit eingesetzter Spitze und justiertem Laser mindestens 30min gewartet werden, bis die Spitze thermisch equilibriert ist Messung Zuerst wählt man einen Setpoint, der ca. 0,5V über dem Vertikal-Signal liegt. Mit dem roten Pfeil nach unten (approach) startet man die automatische Annäherung der Spitze. Die Spitze wird soweit nach unten gefahren, bis das Vertikal-Signal dem gewählten Setpoint entspricht. Nun kann man den Setpoint langsam verringern um die Kraft mit der die Spitze auf die Probe drückt minimal zu halten. Die Scanparameter (Feedbackparamter Integral und Proportional, Scangeschwindigkeit, Bildgröße, Auflösung) müssen während der Messung optimiert werden. Da sich die Durchbiegung der Spitze auch nach dem thermischen Equilibrieren weiter ändert muss auch der Setpoint ständig nachreguliert werden um eine Beschädigung der Probe zu vermeiden. 20

22 6.3. Datenauswertung Die Bilder können über den Flatten-Befehl angepasst werden. Durch einen Rechtsklick auf ein Bild kann man diese über Export/Imagedata als Bilddatei exportieren. Kraftkurven können als ascii-file exportiert werden. Über andere Programme (Origin, Excel) muss nun die Kraft in pn aus den Rohdaten (Deflection in nm) berechnet werden. Der Abstand in nm muss noch korrigiert werden, indem die Durchbiegung des Cantilevers vom ausgegebenen Abstand abgezogen wird. Die erhaltenen Kraftkurven müssen nun wie folgt angepasst werden: I) Die Kraft nach dem Abriss des Moleküls von der Spitze muss durch Abzug eines festen Wertes auf Null gesetzt werden. II) Die Kurve muss auf der x-achse so verschoben werden, dass der 2. Peak auf den ersten WLC-fit (31,7nm, 88as) fällt D. Literatur a) zu Aufgabe 5 1. H. KUMAR WICKRAMASINGHE: Scanned-Probe Microscopes, Scientific American Oct. 1989, H. FUCHS, SXM-Methoden - nützliche Werkzeuge für die Praxis, Phys. Bl. 50, (1994). b) zu diesem Text 1. R. YOUNG, J. WARD, and F. SCIRE, Rev. Sci. Instrum. 43, 999 (1972) 2. G. BINNIG and H. ROHRER, Helv. Phys. Acta 55, 726 (1982) 3. z.b. W.J. MOORE, D.O. HUMMEL, Physikalische Chemie, Walter de Gruyter, Berlin 1986, S J. ISRAELACHVILI, Intermolecular and Surface Forces, 2nd ed., Academic Press 1992, pp C. HAMANN und M. HIETSCHOLD, Raster-Tunnel-Mikroskopie, Akademie-Verlag, Berlin 1991, S c) Kraftspektroskopie 1. M. RIEF und H. GRUBMÜLLER, Physikalische Blätter 57(2), 55 (2001) 2. F. OESTERHELT et al., Science 288, 143 (2000) d) Monographien 1. Scanning Tunneling Microscopy and Spectroscopy, D.A. BONNELL (ed.), VCH Publ., New York Scanning Force Microscopy, D. SARID, Oxford University Press, Oxford Scanning Probe Microscopy and Spectroscopy, R. WIESENDANGER, Cambridge University Press, Cambridge Raster-Tunnel-Mikroskopie, C. HAMANN und M. HIETSCHOLD, Akademie-Verlag, Berlin Scanning Tunneling Microscopy, Vols. 1-3, 2nd ed., R. WIESENDANGER and H.-J. GÜNTHERODT (eds.), Springer- Verlag, Berlin 1995 and Intermolecular and Surface Forces, J. ISRAELACHVILI, Academic Press, London

23 E. Anhang: AFM Standard 22

24 Kristallparameter 23

25 24

26 Purpur Membran (PM) und Bakteriorhodopsin (BR) BR-Sekundärstruktur (Schema): 7α-Helices durchspannen die Membran Purpurmembran: Hexagonaler 2D-Kristall 25