Themen 8. Vorlesung. TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy) Lichtscheibenmikroskopie (Abk.: LSFM oder SPIM)

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1 Themen 8. Vorlesung TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy) Lichtscheibenmikroskopie (Abk.: LSFM oder SPIM) Superresolution Microscopy: Photo-Activation Localization Microscopy (PALM) Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM) Ground State Depletion Imaging (GSDIM) 4Pi Microscopy Stimulated Emission Depletion Microscopy (STED) Structured Illumination (SIM) Link to teaching: 1

2 Fluoreszenzmikroskopie Methoden Lichtscheibenmikroskopie (Single Plane Illumination) 2

3 TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy) ideale Methode für gute z-auflösung für Objekte an der Oberfläche Prinzip: evaneszente Welle wir durch flach auftreffende Welle ausgelöst nur Fluorophore werden angeregt, die sich unmittelbar an der Glas/Wasser-Grenze (Brechungsindex- Unterschied) befinden. 3

4 Refraction by an Interface LMEM_WS2016_2017_0 4

5 Which Direction (1) LMEM_WS2016_2017_0 5

6 Which Direction (2) LMEM_WS2016_2017_0 6

7 LMEM_WS2016_2017_0 7

8 Refraction by an Interface Critical Angle: totale Reflektion 2 Coverslip: n 2 =1,518 1 Medium/Zelle: n 1 1,33-1,37 8

9 TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy) Anregungslaserbeam muss mit großem Winkel auf Deckglas treffen Quelle: Photonics.com bei Einfall in kritischem Winkel (Snell s Gesetz) totale Reflektion, anstatt Transmission Reflektion erzeugt <400 nm in z-achse dünnes elektromagnetisches (= evaneszentes) Feld in der wäßrigen Lösung mit identischer zum Anregungslicht Intensität des Feldes nimmt exponentiell mit dem Abstand zur Oberfäche ab (Eindringtiefe = Funktion von Winkel und ) selektive Anregung (fast) nur im Bereich des evaneszenten Feldes und nur von Fluorophoren mit entsprechender Anregungs-Wellenlänge 9

10 Light Sheet Microscopy, LS(F)M Abbilden von lebenden 3D Proben über längere Zeiträume mit reduzierter Phototoxizität und mit reduziertem Photobleaching lightsheets haben gleichförmige Dicke, FWHM fitting =14.6 µm 4D stage, x/y/z/rotation rechter Winkel markierte Kerne, Zebrafish Embryo 10

11 Modernes Light Sheet Mikroskop Widefield Mikroskop La, Laser Array Emission, Kopplung in einzelnen Strahl AOTF, acousto-optic tunable filter (AOTF) Auswahl von und Intensität BEO/CO, beam expanding/cylindrical optics erzeugen Lichtscheibe OL, Objektivlinse FW, filter wheel Bandfilter, um gestreutes anregungslicht und Hintergrundfluoreszenz zu blockieren TL, tube lens 11

12 Modernes Light Sheet Mikroskop 3D Cold Spring Harb Protoc. (2014);2014(1):

13 LSM Entwicklung Analyst (2014), 139,

14 LSM Varianten biologische Systeme Analyst (2014), 139,

15 MuVi-SPIM Drosophila Entwicklung A fruit fly embryo from when it was about two-and-a-half hours old until it walked away from the microscope as a larva, filmed by a new microscope (MuVi-SPIM) developed at EMBL Heidelberg Ernst Stelzer 15

16 MuVi-SPIM Pflanzenwurzelentwicklung 3D root hair tracking of Arabidopsis thaliana in a light sheet fluorescence microscope. Daniel von Wangenheim, Ernst Stelzer 16

17 Strategien um Auflösung zu erhöhen normale Abbe sche Auflösung Änderung der Point Spread Function (PSF) near field scanning optical microscopy (NSOM) 4Pi microscopy I n M microscopy targeting switching and readout (z.b. STED, SSIM) verschiedene Wellenlängen jedes Molekül müßte mit Fluorophor anderer markiert werden verschiedene Zeitpunkte stochastic switching and readout (z.b. PALM, STORM) 17

18 Spatial Resolution of Biological Imaging Techniques 18

19 Near field Scanning Optical Microscopy (NSOM) = Scanning Near-Field Optical Microscopy (SNOM) Technik entwickelt in den 1990ern: Eric Betzig et al., Science (1993), 262, 1422 Eric Betzig et al., Nature (1994), 2369, 40 (+) höchste Auflösung der Superresolution-Techniken bis zu einer Auflösung von 20 nm (lateral) und 2 bis 5 nm (axial) (-) nur für Oberflächenstrukturen geeignet 19

20 Scanning Probe Mikroskopie (SPM) Methoden Atomic Force Microscopy (AFM) Scanning Tunneling Microscopy (STM) Near-Field Scanning Optical Microscopy (NSOM, SNOM) Abtasten im Kontakt-oder Nicht-Kontaktmodus mit Tip auf biegsamem Cantilever elektrisch leitende Sonde wird rasterförmig über ebenfalls leitende Oberfläche gefahren; Messung des Tunnelstroms bei Überwindung der Potentialbarriere schneller Abfall der quantenmechanischen Elektronentunnelwahrscheinlichkeit mit dem Abstand rasterförmige Bewegung der Nahfeldsonde im Abstand nur weniger nm (Nahfeld/ Evaneszenz) über Probe Auflösung im wesentlichen durch die Geometrie der Sonde (Apertur- ) und nicht durch beschränkt 20

21 Near-Field Scanning Optical Microscopy (NSOM) Aperturdurchmesser << Nahfeld (near field) Mikroskopie: Probe wird in Region mit Radius << der Beleuchtungswellenlänge abgebildet Weitfeld (far field) Mikroskopie: positioniert die Probe im Abstand von mehreren Tausend Wellenlängen vom Objektiv limitiert in Auflösung durch Beugung der Wellenfront im Objektiv 21

22 NSOM Detektionsmodi a) Illumination mode: Beleuchtung im Nahfeld, Detektion im Weitfeld b) Collection mode: Detektion von Licht aus dem Nahfeld c) Reflection mode d) Evanescent Illumination (PSTM) e) Apertureless NSOM f) Plasmon Near-Field Microscope 22

23 I 5 M/4Pi Mikroskopie I 5 M: Fluoreszenz Emission wird durch 2 Objektive aufgenommen Information wird so kombiniert, dass die gesamte Wellenfront auf Detektorbildebene interferiert 4Pi: Fluoreszenz Emission wird ebenfalls durch 2 Objektive aufgenommen Information wird in gemeinsamen Fokuspunkt kombiniert (Pinhole Detektion) verbesserte axiale und auch etwas verbesserte laterale Auflösung TPE, two photon excitation 23

24 Funktionelle Superresolution Techniken 1. Deterministisch Reversible Saturable (or Switchable) Optical Fluorescence Transitions (RESOLFT) Fluorophore müssen REVERSIBEL schaltbar sein: ON" Status / inactive Status Stimulated Emission Depletion (STED) (-) hohe Intensitäten (Depletion Laser) benötigt um vom Excited Singlet ON State direkt zum Off Status zu gelangen Ground State Depletion (GSD), Ground State Depletion-Individual Molecule return microscopy (GSDIM) (+) Schalten zum metastabilen Triplet oder anderen Dark States vom ON State benötigt 10 3 bis 10 6 weniger Intensität als STED 2. Stochastisch = Single Molecule Detection Abbildung von nur wenigen Fluorophoren; individuelle Moleküle die durch Distanzen getrennt sind, die das Abbe Auflösungslimit überschreiten Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM) Photo Activated Localization Microscopy (PALM) Fluorescence Photo-Activation Localization Microscopy (FPALM) 24

25 Reversible Saturable (or Switchable) Optical Fluorescence Transitions (RESOLFT) STED und GSD STED: Schalten vom Grund Status (OFF) - in den excited singlet state (S 1 ) (ON) des Fluorophore und zurück zum OFF Status (depletion laser) GSD und GSDIM: Schalten vom excited singlet (ON) in den dark triplet Status (OFF) und zurück ON und OFF Status von reversibel photoswitchenden Fluorophoren (z.b. Cy5, kindling fluorescent protein, Dronpa) Saturation Intensity: Anregungsintensität um 50% der Fluorophore anzuschalten 25

26 Superresolution Prinzip der RESOLFT Techniken FWHM full width at half maximum λ Anregungswellenlänge η sin(α) numerische Apertur des Objektivs a Parameter, der die Form des räumlich modulierten Laserbeames berücksichtigt I max Peakintensität des Depletionslasers Sättigungsintensität des jeweiligen Fluorophores I s Einstellungen des Depletionslasers: I max = 0 I max >> I S Beispiel: I max /I s = 100 Abbe-Beugungs-limitiert PSF wird sehr klein superresolution 10x höhere Auflösung wiederholtes Scanning nach Rotation des Belechtungs-/Detektionspattern mit anschließender mathematischer Dekonvolution notwendig um laterale sub-diffraction Auflösung zu erreichen Fluorophore müssen mehrmals reversibel schaltbar sein 26

27 STED Probe wird durch 2 synchronisierte, ultraschnelle, kolineare Quellen beleuchtet: Anregungs-Laserpuls, gefolgt von zum längerwelligen geshifteten Depletions-Laser-Puls (STED beam) Anregungs-Laserpuls kürzer als STED-Puls (aber beide im <nsec Bereich) STED Puls wird durch Phasenmodulator so moduliert, dass im Fokuspunkt keine Intensität vorliegt, wohingegen die Intensität nach allen Seiten weg vom Fokuspunkt exponentiell zunimmt Donut Form des STED Beams: nur exakt im Zentrum des Fokus (=Knotenpunkt) ist die Intensität des STED Beam =0 idealerweise liegen nur hier die Fluorophore im aktiven Zustand vor, da im sonstigen Fokusvolumen die Fluorophore durch den STED Beam inaktiviert sind hohe Intensität des Depletionslasers (oft >250 Megawatt pro cm 2 ), bringt Fluorophore sehr schnell in den Grundzustand (OFF Status) 27

28 STED (+) bis 20 nm laterale Auflösung; verbesserte Version: iso-sted, 2 STED Depletionslaser mit gegenüberliegenden Objektiven (wie beim 4Pi) verbesserte axiale Auflösung (isotrop) (-) intensiver STED Beam Photobleaching und Zerstörung der Probe 28

29 Eigenschaften von Fluorophoren für STED Anregung STED 29

30 Ground State Depletion (GSD) wie bei STED erfolgt Photoswitch des Fluorophors zum OFF Status durch Laser mit zentralem 0-Knotenpunkt Photoswitching Mechanismus beinhaltet hier aber Anschalten des Fluorophors aus dem metastabilen dark triplet state (T 1 ) OFF T 1 OFF wird erreicht durch mehrmaliges Anregen des Fluorophors zum first excited singlet state (S 1 ) ON um die Wahrscheinlichkeit eines nicht-radiativen Intersystemüberganges vom S 1 ON zum T 1 OFF Zustand zu erhöhen Elektronen bleiben im metastabilen OFF Status im Bereich von µsec-msec (+) Depletionslaserpower um Fluorophore in den T 1 zu bringen nur im Bereich von (kw/cm 2 ) STED: >250 MW/cm 2. 30

31 GSD GSD laser power Auflösung S 0 ground state S 1 first excited singlet state T 1 forbidden triplet state Laser starker Anstieg der T1 Population Mikrotubuli widefield Mikrotubuli GSD fluorescent beads widefield fluorescent beads GSD 31

32 High Resolution Structured Illumination (HR-SIM) wie RESOLFT Methoden theoretisch unabhängig von Dichte der gelabelten Moleküle wie bei Structured Illumination wird Grid benutzt und mehrfach aufgenommen, hier aber nicht nur 3 Bilder, sondern Pattern der die vollen 360 Grad gedreht wird, Grid wird durch mehrere Laser erzeugt Moire Streifen Fourier Transform des Bildes HR-SIM erhält hochfrequente Informationen Auflösung HR-SIM: 300 nm axial, 100 nm lateral; in Kombination mit 4Pi: 100 nm istotrop 32

33 Superresolution Stochastische Techniken Abbildung von nur wenigen Fluorophoren; individuelle Moleküle die durch Distanzen getrennt sind, die das Abbe Auflösungslimit überschreiten Position eines Einzelmoleküls kann mit einer Genauigkeit von wenigen nm bestimmt werden, wenn genügend Photonen aufgenommen werden und keine anderen ähnlich emittierenden Moleküle im Abstand von etwa 200 nm sind in Proteinen schwer zu erreichen, daher: nacheinander Anschalten in ON Status in nur limitierten Subpopulationen und erst dann Koordinatenbestimmung widefield 33

34 Ablauf eines Superresolution Experimentes mit stochastischen Techniken (1) Fluorophore fast ausschließlich im inaktiven Status (2) <1% der Fluorophore werden durch kurzen kurzwelligen (UV oder violett) Laserpuls aktiviert (3) Detektion der Fluoreszenzemission dieser Moleküle (4) genaue Lokalisation dieser Moleküle, um Subnanometer-Präzision zu erreichen (6) Inaktivierung der angeregten Population durch Photobleaching (7) 2. bis >> Zyklus der Schritte 2-6 bis idealerweise stochastisch molekulare Koordinaten aller Fluorophore erfasst sind PALM/STORM Bild ist zusammengesetzte Information von allen Einzelmolekül-Koordinaten 34

35 Ablauf eines Superresolution Experimentes mit stochastischen Techniken 35

36 Prinzipieller STORM/PALM Mikroskop Aufbau 36

37 Genaue Lokalisation der Fluorophore Ziel: Bestimmung des Zentrums/Mittelwertes der Photonenverteilung (μ = x 0,y 0 ), und der Unschärfe (Standardfehler des Mittelwertes) σ: N a b s i Photonen- endliche Hintergrund- Rauschen Pixelgröße Rauschen Detektor Anzahl aufgenommener Photonen Pixelgröße des Detektors Standardabweichung des Hintergrundes (Hintergrundfluoreszenz und Detektorrauschen) Standardabweichung oder Breite der Verteilung (in Richtung i) entweder x oder y Richtung) Lokalisierungsgenauigkeit von ca. 10 nm kann erreicht werden bei 1000 Photonen und vernachlässigbarem Hintergrund; Photonen <2 nm; 400 Photonen > 20 nm (-) aktivierter Zustand der photoswitchable Moleküle muss zu einer fortlaufenden Emission von genügend Photonen führen, bevor das Fluorophor einen dark state erreicht oder durch Photobleaching inaktiviert wird 37

38 Gewünschte PALM und STORM Fluorophor - Eigenschaften PALM mit photo-aktivierbaren/-konvertierbaren Fluoreszenzproteinen entwickelt (tandem dimer Eos, photoactivatable GFP) STORM mit synthetischen Farbstoffen (Cy3, Cy5) sehr hohe Helligkeit und hoher Kontrastlevel bevor dark state oder Photobleaching auftritt: Helligkeit =Produkt aus [molar extinction coefficient (ε abs ) * fluorescence quantum yield (φ)] quantum dots, dyes (z.b. Cy5, ATTO 650, Alexa Fluor 488): ε abs ~ 100,000, φ ~ > 0.90 fluoreszente Proteine: ε abs ~ , φ ~ spektrale Profile genügend getrennt und thermisch stabil spontane Interkonversions- Energien sehr gering im Vergleich zur lichtkontrollierten Aktivierungsenergie hohe Photoswitching-Zuverlässigkeit geringe Ermüdungserscheinungen = hohe Überlebensrate in der Anzahl der Switching-Zyklen Inaktivierung kann mit der Aktivierungsrate ausbalanciert werden, um sicherzustellen, dass nur eine kleine Population von Molekülen aktiviert wird und dass diese Moleküle durch einen Abstand getrennt sind, der größer ist als das Auflösungslimit des Detektors jedes photoaktivierte Fluorophor sollte im aktiven Zustand genügend Photonen emittieren, um centroid fit ausführen zu können 38

39 Eigenschaften fluoreszenter Moleküle für die Superresolution Mikroskopie Ex, peak excitation Em, peak emission EC, molar extinction coefficient QY, quantum yield N Photons, relative brightness, Anzahl emittierter Photonen pro Molekül C-Rhodamine, C-Fluorescein = caged Derivate 39

40 PALM/TIRF Imaging widefield PALM/TIRF (a) + (b): Aktin-tandem-dimer-Eos Aktin-Zytoskelett in Fibroblasten Photokonversion: 405-nm diode laser Readout: 561-nm diode-pumped solid state laser (c) + (d): Cytochrom-C-Oxidase-dimeres-Eos Mitochondrium (einzelnes in PALM) (e) + (f): Cytokeratin-mEos2 (Monomer) intermediate filament network in HeLa Zellen 40

41 3D Auflösung bei Einzelmolekül-Lokalisierung ipalm: Interferometrie kombiniert mit PALM Auflösung: 10 nm axial 20 nm lateral Interferometrie: allgemein = Positionsmessung, nachdem Licht, das 2 verschiedene positionsabhängige Pfade genommen hat, miteinander interferiert hat und in einem Beamsplitter rekombiniert wird. (-) Essentiell: hohe Kohärenz, exakte Kalibrierung, Korrektur der Instabilitäten der Fluoreszenz ipalm: gegenüberliegende Objektive (ähnlich 4Pi); Photon nimmt abhängig von axialer Position verschiedenen Pfad unterschiedlicher Länge single-photon self-interference simultaneous multiphase interferometry durch spezialisierten Beamsplitter gleicht Fluktuationen der Fluoreszenz aus 41

42 Übersicht Superresolution Techniken 42

43 Weblinks Lichtmikroskopie Firmen: Olympus: Nikon Zeiss

44 Nächste Vorlesung 12. Januar 2017, 14:15: Prof. Frangakis 44