Biophysikalische Grundlagen der Kollagenvernetzung

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1 Übersicht 131 Biophysikalische Grundlagen der Kollagenvernetzung Biophysical Principles of Collagen Cross-Linking Autoren Institut E. Spçrl, F. Raiskup-Wolf, L. E. Pillunat Augenklinik, Universitätsklinikum Dresden Schlüsselwçrter l " Kornea l " Keratokonus l " Biomechanik l " Vernetzung l " ultraviolette Strahlung Riboflavin l " Key words l " cornea l " keratoconus l " biomechanics l " cross-linking l " ultraviolet irradiation riboflavin l " eingereicht akzeptiert Bibliografie DOI /s Klin Monatsbl Augenheilkd 2008; 225: Georg Thieme Verlag KG Stuttgart New York ISSN Korrespondenzadresse Prof. Eberhard Spçrl Augenklinik, Universitätsklinikum Dresden Fetscherstr Dresden Tel.: ++ 49/3 51/ Fax: ++ 49/3 51/ eberhard.spoerl@uniklinikumdresden.de Zusammenfassung Hintergrund: Die verringerte mechanische Stabilität der Hornhaut beim Keratokonus oder bei der iatrogenen Keratektasie nach Lasik kann durch photooxidative Vernetzung des Kollagens kompensiert werden. Für die sichere und effektive Anwendung dieser neuen Therapiemethode sollen die biophysikalischen Grundlagen zusammengestellt werden. Methode: Die Wahl der Therapieparameter soll anhand der Absorptionsverhältnisse in der Hornhaut erläutert werden. Die Sicherheit der Methode wird für das Endothel und für die Linse diskutiert. Die erzeugten Vernetzungen werden indirekt am Beispiel der dadurch veränderten physikochemischen Eigenschaften der Hornhaut aufgezeigt. Ergebnisse: Um eine hohe Absorption der Strahlungsenergie in der Hornhaut zu erreichen, wurden Riboflavin mit einer Konzentration von 0,1% und UV-Licht der Wellenlänge von 370 nm entsprechend dem relativen Maximum der Absorption von Riboflavin gewählt. Eine Bestrahlungsstärke von 3 mw/cm 2 und eine Bestrahlungszeit von 30 min führen zu einer signifikanten Verfestigung. Durch die hohe Absorption innerhalb der Hornhaut wird das Endothel geschützt, d. h., bei einer Stromadicke grçßer 400 m wird die Schädigungsschwelle des Endothels nicht erreicht. Als Nachweis der Vernetzungen gelten die Erhçhung der mechanischen Festigkeit, die Erhçhung der Resistenz gegen enzymatische Abbauprozesse, die geringere Quellungsneigung, eine erhçhte Schrumpfungstemperatur und ein vergrçßerter Durchmesser der Kollagenfasern. Schlussfolgerung: Die Therapieparameter wurden experimentell getestet und haben sich klinisch bei der Kollagenvernetzung bewährt. Zum Erreichen eines sicheren Vernetzungseffektes ohne Schädigung umgebender Gewebe sollten diese Parameter eingehalten werden. Abstract Background: The reduced mechanical stability of the cornea in keratoconus or in keratectasia after Lasik may be increased by photooxidative cross-linking of corneal collagen. The biophysical principles are compiled for the safe and effective application of this new treatment method. Methods: The setting of the therapy parameters should be elucidated from the absorption behaviour of the cornea. The safety of the method for the endothelium cells and the lense will be discussed. The induced cross-links are shown to be the result of changes in the physico-chemical properties of the cornea. Results: To reach a high absorption of the irradiation energy in the cornea, riboflavin of a concentration of 0.1% and UV light of a wavelength of 370 nm, corresponding to the relative maximum of absorption of riboflavin, were used. An irradiance of 3 mw/cm 2 and an irradiation time of 30 min lead to an increase of the mechanical stiffness. The endothelium cells will be protected due to the high absorption within the cornea, that means the damaging threshold of the endothelium cells will not be reached in a 400 m thick stroma. As evidence for cross-links we can consider the increase of the biomechanical stiffness, the increased resistance against enzymatic degradation, a higher shrinkage temperature, a lower swelling rate and an increased diameter of collagen fibres. Conclusions: The therapy parameters were tested experimentally and have been proven clincally in the corneal collagen cross-linking. These parameters should be respected to reach a safe cross-linking effect without damage of the adjacent tissues.

2 132 Übersicht Einleitung Beim Keratokonus kommt es zur Sehverschlechterung infolge einer zunehmenden Irregularität der Hornhautoberfläche verbunden mit einer Verschlechterung der optischen Abbildungseigenschaften. Obwohl sich der Gesamtkollagengehalt der Hornhaut bei Keratokonus nicht signifikant von der normalen Hornhaut unterscheidet [19], ist die Festigkeit etwa um den Faktor 0,7 geringer [5]. Des Weiteren lässt sich aus der Hornhaut beim Keratokonus mit Pepsin doppelt so viel Hydroxyprolin, welches wesentlich die Tripelhelix des Kollagens stabilisiert, herauslçsen im Vergleich zur normalen Hornhaut [5]. Diese beiden Fakten lassen vermuten, dass eine Stçrung der Vernetzung innerhalb (z B innerhalb von Tertiär- und Quartärstruktur) oder/und zwischen den Kollagenmolekülen vorliegen muss. Eine Reduzierung der Vernetzungen wurde unter anderem schon als Ursache beim Keratokonus diskutiert [7], aber keine Versuche zur Korrektur dieses pathologischen Zustandes unternommen. Eine ähnliche Festigkeitsabnahme der Hornhaut entsteht auch nach Laser-in-situ-Keratomileusis (Lasik), wobei sich in sehr seltenen Fällen aufgrund von multifaktoriellen Ursachen (unentdeckter präoperativer Keratokonus, zu starker Gewebeabtrag, Allergien u. a.) eine Keratektasie entwickeln kann. Dieser refraktiv-chirurgische Eingriff schwächt die biomechanische Festigkeit der Hornhaut, da die effektive Hornhautdicke aufgrund der Flapdicke plus der Ablationstiefe reduziert wird. Kann das Reststroma die entstehende hçhere mechanische Spannung (Kraft pro Querschnittsfläche) nicht mehr vollständig kompensieren, dann kommt es ebenfalls zum Hervorwçlben der Hornhaut mit einer Verschlechterung der optischen Abbildungseigenschaften. Das Ziel der Kollagenvernetzung mit Riboflavin/UVA-Licht besteht in der künstlichen Erhçhung des Grades der Vernetzungen im Hornhautstroma, um so eine ausreichende mechanische Stabilität wieder herzustellen. Im Folgenden sollen die biophysikalischen Grundlagen der photooxidativen Kollagenvernetzung mit Riboflavin und UV-Licht beschrieben werden. Mechanische Stabilität von kollagenhaltigen Geweben und Vernetzungen Die mechanische Stabilität der Hornhaut wird primär durch die Kollagenmolekülstruktur und deren räumliche Anordnung bestimmt, also durch die langen Kollagenfibrillen, die sich zwar verzweigen, aber trotzdem von Limbus zu Limbus ziehen. Die Quervernetzungen stabilisieren diesen mechanischen Zustand und verhindern auch ein Auseinandergleiten der Kollagenfibrillen in der gekrümmten Hornhaut. Durch Erhçhung des Vernetzungsgrades z. B. bei Diabetes mellitus oder bei Narben sowie durch Verringerung zum Beispiel Ehlers-Danlos-Syndrom treten pathophysiologische Veränderungen der Gewebe auf. Deshalb muss für die Gewährleistung der physiologischen Funktion der Grad der Vernetzung sehr eng reguliert werden. Allein schon mit dem Alter nimmt leider die Zahl der Vernetzung zu und damit auch die Rigidität der kollagenhaltigen Gewebe, wie es an der Hornhaut [14], der Haut, der Augenlinse, an den Gefäßen und im Knorpel der Gelenke beobachtet wird. Auch Sonnenlicht [22] und Rauchen [28] bewirken analoge Veränderungen. Diesen biochemischen Prozess der Vernetzung kann man sich aber auch zunutze machen für die Stabilisierung von kollagenhaltigen Membranen [49], Implantaten und Gewebekonstrukten auf der Basis von Kollagen im Rahmen des Tissue Engineering [8, 10] oder bei der Behandlung des Keratokonus [38, 53] oder der Keratektasie [17, 23]. Vernetzungsmçglichkeiten Unter physiologischen Bedingungen werden Kollagenmoleküle, nachdem sie die Zelle verlassen haben (post-translational), im Extrazellularraum durch das Enzym Lysyloxidase [20] enzymatisch vernetzt. Damit erreicht das Kollagen seine natürliche Festigkeit, Stabilität und die gewebespezifischen elastischen Eigenschaften [29]. Lysyloxidase wandelt im Kollagenmolekül Aminogruppen von bestimmten Aminosäuren in Aldehydgruppen um und diese kçnnen entweder spontan mit benachbarten Aldehydgruppen in einer Aldokondensation oder mit e-aminogruppen von Aminosäuren unter Aldiminbildung reagieren und kovalente Vernetzungen bilden. Beim Ehlers-Danlos-Syndrom besteht z. B. ein Mangel an Lysyloxidase, beim Keratokonus wird ein Defekt im Gen für Lysyloxidase vermutet [26] und bei Keloiden und Narben ist die Aktivität dieses Enzyms verstärkt [52]. Auch das Enzym Transglutaminase bewirkt eine Vernetzung der Extrazellulärmatrix [1] und von Kollagen [9, 32]. Zusätzlich kçnnen auch noch nichtenzymatische Vernetzungen entstehen durch [46]: E chemische Vernetzer (Glutaraldehyd, Formaldehyd, Diphenylphosphorylazid). Diese werden bevorzugt angewendet für die Modifizierung der Eigenschaften von kollagenhaltigen Geweben beim Tissue Engineering. E Zuckeraldehyde (Advanced Glycation Endproducts, AGEs). Mit dem Alter und besonders beim Diabetes mellitus nehmen diese Zuckervernetzungen zu. So haben diese AGEs-Vernetzungen einen protektiven Effekt auf die Entwicklung des Keratokonus (Verhinderung bzw. Verringerung des Schweregrades des Keratokonus) [25, 39]. E photooxidative Vernetzung (UV, ionisierende Strahlung). Photooxidative Vernetzung mit Riboflavin und UVA- Licht Die photooxidative Vernetzungsmethode mit Riboflavin und UVA-Licht wurde gewählt, weil sie lokal begrenzt wirkt, eine kurze Therapiezeit ausreicht und die Transparenz der Hornhaut unverändert lässt. Riboflavin ist ein Vitamin (Vitamin B 2 ), das auch als Farbstoff in der Lebensmitteltechnik (z. B. bei Vanillepudding) verwendet wird, nicht toxisch ist und als Medikament vorliegt. Der photochemische Vernetzungseffekt (Photopolymerisation) entsteht nur dort, wo Riboflavin vom UV-Licht aktiviert wird, da der entstehende Singulett-Sauerstoff nur eine Lebensdauer von 100 s hat und damit hçchstens eine Strecke von einigen Mikrometern diffundieren kann (r 2 = D t mit der Diffusionskonstanten D = 2, m 2 /s). Dies ist ein großer Vorteil gegenüber rein chemischen Vernetzungsmçglichkeiten mit entsprechenden Flüssigkeiten wie Diphenylphosphorylazid oder Carbodiimid, wo die Diffusion der Vernetzer und damit die Wirkung nicht so gut kontrollierbar sind. Riboflavin hat bei diesem Vernetzungsprozess zwei Funktionen (Photosensibilisator und UV-Absorber) zu erfüllen:

3 Übersicht 133 Photosensibilisator zur Erzeugung von reaktiven Sauerstoff-Spezies (Singulett-Sauerstoff) Bei dieser photochemischen Reaktion werden Sauerstoffradikale durch UV-Licht gebildet (l " Abb. 1). Um die Effektivität dieses Prozesses bei UV-Strahlung zu erhçhen, wird ein spezieller Photosensibilisator (Transfermolekül) Riboflavin verwendet. Dieser stellt einen der potentesten Erzeuger von Singulett-Sauerstoff dar [15], da er die hçchste Singulett- Sauerstoff-Quantenausbeute hat. Singulett-Sauerstoff ist die physikalisch angeregte Form des Sauerstoffmoleküls [15], bei der sich nicht die Elektronenanzahl ändert, sondern der Spin, d. h. die Drehrichtung eines Elektrons. Absorbiert Riboflavin Energie vom UV-Licht, dann wird es in einen angeregten Zustand versetzt (angeregtes Singulett-Riboflavin 1 RF*). In einem Austauschmechanismus geht das angeregte Singulett-Riboflavin in ein angeregtes Triplett-Riboflavin ( 3 RF*) über [18]. Durch Wechselwirkung mit Triplett-Sauerstoff ( 3 O 2 ) entsteht der sehr reaktionsfreudige Singulett-Sauerstoff ( 1 O 2 ), ein Sauerstoffradikal, welches weiter mit den Aminosäuren der Kollagene wechselwirkt (l " Abb. 1). Dieser photochemische Prozess modifiziert Aminosäuren des Kollagens. Dabei werden aktive Stellen entlang der Molekülkette gebildet, die intermolekular oder intramolekular miteinander unter Aldiminbildung und Aldokondensation reagieren und kovalente Verbindungen zwischen den Aminosäuren ausbilden, die sogenannten Vernetzungen. Auch die Bildung von Dityrosin aus Tyrosin wurde beobachtet, wodurch die intermolekulare und intramolekulare Vernetzung der Kollagenmoleküle zustande kommen kann [6, 21]. Riboflavin wirkt nicht nur als Erzeuger von Singulett-Sauerstoff, sondern in hohen Konzentrationen auch als Radikalfänger und es stellt sich ein Gleichgewicht zwischen der Bildung und Vernichtung von Singulett-Sauerstoff ein [18]. Damit wird bei Erhçhung der Riboflavinkonzentration nicht zwangsweise die Rate für die Erzeugung von Singulett-Sauerstoff vergrçßert, sondern ein Sättigungsverhalten stellt sich ein. Absorption der UV-Strahlung in der Hornhaut Um den Vernetzungseffekt nur auf das Stroma der Hornhaut zu begrenzen, muss der grçßte Teil des UV-Lichtes auch dort absorbiert werden, da Strahlung nur an dem Ort eine Wirkung erzeugt, wo sie absorbiert wird und damit Energie an das Gewebe abgibt (1. Gesetz der Photochemie). Riboflavin besitzt zwei Absorptionsmaxima, bei 365 nm und 430 nm, wobei die Bestrahlung mit 365 nm aufgrund des hçheren Energiegehaltes (W = h f) eine grçßere Vernetzungswirkung erzielt [45]. Aufgrund des Absorptionsmaximums von Riboflavin bei 365 nm wurde speziell für die Behandlung UV-Licht dieser Wellenlänge ausgewählt. Damit wird erreicht, dass 94% des UV-Lichtes in einer 400 m dicken deepitelisierten Hornhaut absorbiert werden und keine Gefahr für die Linse oder die Netzhaut besteht. Applikationstechnik und Therapieparameter Die Vernetzungsbehandlung zur Hornhautstabilisierung mit Riboflavin/UVA-Licht wird ambulant unter lokaler Anästhesie durchgeführt. Die Behandlungsparameter und die Reihenfolge sind in l " Abb. 2 dargestellt. Vor der Bestrahlung muss das Epithel mechanisch entfernt werden, weil das intakte Epithel eine Diffusionsbarriere für Riboflavin (Molekulargewicht 376 g/mol) Abb. 1 Schematische Darstellung der einzelnen photochemischen Schritte von der UVA-Absorption, Riboflavinaktivierung und Bildung von Sauerstoffradikalen bis zur Ausbildung kovalenter Bindungen (Vernetzungen). Abb. 2 Zusammenstellung und Reihenfolge der Behandlungsparameter. darstellt und damit nicht ins Stroma diffundieren würde. Des Weiteren würde das mit Riboflavin beladene Epithel einen UV- Schutz bilden und einen Großteil der UV-Energie absorbieren, die jedoch ins Stroma gelangen soll [34]. Für die Diffusion von Riboflavin in die tieferen Schichten der Hornhaut bençtigt es eine bestimmte Zeit [51]. Deshalb ist es ganz wichtig, ca min vor der Bestrahlung Riboflavinlçsung auf die Hornhaut zu tropfen, um eine hohe Konzentration bzw. eine hohe Absorption zu erreichen und damit auch den Schutz des Endothels und der Linse zu garantieren. Die Riboflavinkonzentration von 0,1% wurde aus zwei Gründen für die Behandlung eines etwa 400 m dicken Stromas (dieser Wert entspricht etwa dem Mittelwert beim Keratokonus) [33] gewählt. 1. Da der biomechanische Effekt in einem großen Konzentrationsbereich (0,015 bis 0,5%) konzentrationsunabhängig ist [37], wurde die Konzentration nach dem Gesichtspunkt der UV-Schutzwirkung gewählt [47]. Diese Konzentration von 0,1% bewirkt einen großen Absorptionskoeffizienten, sodass 90% der UV-Strahlung im Stroma absorbiert und das Endothel, die Linse und die Netzhaut weitestgehend vor UV-Licht geschützt werden. Aufgrund des hohen Absorptionskoeffizienten ( = 50 cm 1 ) verringert sich die Bestrahlungsstärke des UV-Lichtes auf dem Weg durch die Hornhaut so stark, dass bei der Bestrahlungsstärke von 3 mw/cm 2 die Destrukti-

4 134 Übersicht onsschwelle für das Endothel nicht erreicht wird [53] (l " Abb. 2). 2. Der Absorptionskoeffizient und damit die Konzentration dürfen aber auch nicht zu hoch sein, um eine mçglichst dicke Stromaschicht zu vernetzen. Ist die Stromadicke kleiner als 400 m, dann muss mit hypoosmolarer Riboflavinlçsung die Hornhaut bis auf 400 m gequollen werden. Als UV-Strahlungsquelle wird das Bestrahlungssystem UV-X TM (Fa. Peschke, Nürnberg) verwendet, welches mit UV-Leuchtemissionsdioden (LEDs) arbeitet und eine homogene Bestrahlungsstärke von 3 mw/cm 2 auf einer Kreisfläche von 8 mm Durchmesser auf der Hornhaut liefert. Die Wahl der Bestrahlungsfläche von 8 mm Durchmesser garantiert die Vernetzung nur in der zentralen Hornhaut, ohne dass der Limbus, die Sklera oder die Goblet-Zellen mit UV-Licht bestrahlt werden. Die hohe Homogenität dieser Strahlung wird mit einem speziellen Strahlhomogenisator [40] erreicht und damit treten keine lokalen Bestrahlungsspitzen auf (sogenannte hot spots bei Einzeldioden), die eine lokale Schädigung des Endothels verursachen kçnnten. Aus den Untersuchungen der Abhängigkeit des biomechanischen Effektes von der Bestrahlungszeit im Bereich von 5 min bis 60 min bei einer Bestrahlungsstärke von 3 mw/cm 2 ergab sich ein optimaler Wert von 30 min [2, 37]. Eine signifikante biomechanische Festigkeitszunahme beginnt ab 15 min und eine Bestrahlung länger als 45 min bewirkt keine weitere Verfestigung. Während der Bestrahlungszeit von 30 min werden im Intervall von 5 min 2 3 Tropfen Riboflavinlçsung getropft, um ein Austrocknen der Hornhaut zu vermeiden und um die notwendige Absorption in der Hornhaut aufrechtzuerhalten. Alle Parameter (l " Abb. 2) (Bestrahlungsstärke, Bestrahlungszeit und Riboflavinkonzentration) sind experimentell [43, 45] und tierexperimentell [47] getestet und haben sich in der klinischen Praxis [23, 53] bewährt. Eine Verkürzung der Behandlungszeit wäre sowohl für den Patienten als auch für den Arzt wünschenswert. Eine Verringerung der Therapiezeit bei gleichzeitiger Erhçhung der Bestrahlungsstärke entsprechend dem Bunsen-Roscoe schen Reziprozitätsgesetz H = E t (Bestrahlungsdosis H ist gleich dem Produkt aus Bestrahlungsstärke E und Bestrahlungszeit t) liegt nahe, bringt aber nicht den gleichen biomechanischen Effekt. Dieser Zusammenhang gilt nur für photochemische Prozesse in leblosen Stoffen. Das photochemische Reziprozitätsgesetz gilt nicht für photobiologische Prozesse im Fall von kurzen Bestrahlungszeiten, weil das biologische Gewebe über eine bestimmte Schutzkapazität (Radikalfänger) gegen photochemische Reaktionen verfügt [4, 11]. Im Anfangszeitraum besteht ein Gleichgewicht zwischen der Radikalbildung und den biologischen Schutzmechanismen. Erst nach Überwindung dieser Schutzmechanismen führt die Radikalbildung zu einer Vernetzung. Nach der Vernetzungsbehandlung verändert sich die Hornhautkrümmung weiter durch zelluläre Vorgänge, deshalb sollte nicht sofort eine neue Brille oder Kontaktlinsen angepasst werden. Infolge der Riboflavin/UVA-Behandlung kommt es im anterioren Stroma zur Apoptose der Keratozyten [56]. Mit der Zeit wandern jedoch vom Limbus wieder neue Keratozyten in die Hornhaut ein. Dieser Repopulationsmechanismus bewirkt eine Abnahme der Hornhautkrümmung um etwa 2 Dioptrien. Die Kontraktionskräfte der einwandernden Keratozyten bzw. Myofibroblasten, wie sie auch bei Keratozyten im Kollagengel [3, 16, 35] oder Abb. 3 Darstellung der Abnahme der UVA-Intensität in einer 400 mdicken Hornhaut ohne (links) und mit (rechts) Riboflavin. auch nach PRK [31] beobachtet wurden, scheinen dafür verantwortlich zu sein [59]. Sicherheit der Methode für Endothel, Linse und Netzhaut Wenn mçglich, sollte UV-Licht am Auge vermieden werden. Aus Arbeitsschutzrichtlinien ist eine tägliche UVA-Bestrahlungsstärke von 1 mw/cm 2 ohne Photosensibilisator für das ungeschützte Auge zulässig [42]. Davon werden etwa 35% in der Hornhaut absorbiert und das Endothel wird mit 0,65 mw/cm 2 belastet. Tierexperimentell wurde für eine 30-minütige UVA-Bestrahlung ohne Photosensibilisator die Schädigungsschwelle der Endothelzellen bei 4 mw/cm 2 gefunden [54]. Bei der Kollagenvernetzung mit Riboflavin und UVA-Licht wird mit 3 mw/cm 2 nach Applikation von Riboflavin bestrahlt. Dabei werden in einer 400 m dicken Stromaschicht 94% der UV-Strahlung in der mit Riboflavin behandelten Hornhaut absorbiert, sodass das Endothel nur 0,18 mw/cm 2 erfährt [51]. Dieser Wert liegt unter der tierexperimentell bestimmten Schädigungsschwelle für das Endothel von 0,35 mw/cm 2 [54] und auch unter dem Wert aus den Arbeitsschutzrichtlinien von 0,65 mw/cm 2. Deshalb besteht auch keine Gefahr für die Linse oder Netzhaut (l " Abb. 3). Eine weitere Sicherheit für die Netzhaut bietet die Wahl der Bestrahlungsanordnung. Aufgrund des geringen Abstandes der Bestrahlungsquelle vom Auge und der divergenten Bestrahlung (Kçhlersches Beleuchtungsprinzip) wird die UV-Stahlung auf der Netzhaut nicht fokussiert. Damit werden auf der Netzhaut nur sehr geringe Bestrahlungsdichten erreicht, die weit unter der Schädigungsschwelle liegen. Dagegen entstehen beim direkten Blick in die Sonne sehr hohe Bestrahlungsdichten auf der Netzhaut infolge des Fokussierungseffektes. Kollagenvernetzung ist kein thermischer Prozess Wird Strahlung vom Gewebe absorbiert, dann kommt es zur Umwandlung in andere Energieformen, meistens in Wärme. Bei der Kombination von Riboflavin und UV-Licht erfolgt die Umwandlung der Strahlungsenergie in verschiedene Energieformen: in Fluoreszenzstrahlung, in chemische Energie (Bindungsenergie, Vernetzungen) und nur zu einem geringen Teil

5 Übersicht 135 in Wärme (l " Abb. 4). Der Vernetzungsprozess ist energetisch vergleichbar mit der Photosynthese, wo Strahlungsenergie auch mithilfe von Pigmenten (Chlorophyll) in chemische Energie (Glukose) umgewandelt wird. Bei der Vernetzung der Hornhaut führt die Lichtenergie zu einer chemischen Modifizierung des Kollagens. Deshalb kommt es bei der Riboflavin/UV-Vernetzung hçchstens zu einer Temperaturzunahme von 2 3 C [30] und ein thermischer Prozess ist ausgeschlossen. Diese Temperaturerhçhung liegt somit weit unterhalb der Schwelle für die thermische Schädigung des Kollagens. Vergleicht man die applizierte Bestrahlungsstärke von 630 W/cm 2 (Zeit = 200 ms; Durchmesser der Bestrahlungsfläche = 0,2 mm, Leistung = 200 mw) bei der Photokoagulation mit der mal geringeren Bestrahlungsstärke von 3 mw/cm 2 der UV-Vernetzung, so wird deutlich, dass bei der photochemischen Vernetzungsmethode der thermische Effekt vernachlässigbar ist. Wirkungen und Nachweis der Vernetzungen Gegenwärtig lassen sich die photochemisch induzierten Vernetzungen in der Hornhaut nicht direkt durch Färbemethoden oder andere mikroskopische Techniken sichtbar machen. Jedoch verursachen Vernetzungen Veränderungen von zahlreichen physikochemischen Eigenschaften des kollagenhaltigen Gewebes, woraus man indirekt auf Vernetzungen schließen kann. Im Folgenden werden einige vernetzungsbedingte Veränderungen des Hornhautstromas aufgezeigt (l " Abb. 5). Zunahme der Festigkeit und der Biegesteifigkeit, Erhçhung des Elastizitätsmoduls Die mit Riboflavin/UVA-vernetzte Hornhaut ist um den Faktor 1,8 fester als die normale Hornhaut, damit ist die Verfestigungswirkung ausreichend, um die verringerte Stabilität beim Keratokonus zu kompensieren [24, 45, 55]. Der Verfestigungseffekt ist bei hçherem Kollagengehalt bzw. bei älteren Hornhäuten stärker [2, 55]. Erhçhung der Schrumpfungstemperatur Die Schrumpfungstemperatur der Hornhaut erhçht sich nach Riboflavin/UVA-Behandlung von 63 C auf 70 C. Dies ist ebenfalls ein Beweis für die Induktion von Vernetzungen, da die Schrumpfungstemperatur mit dem Grad der Vernetzungen positiv korreliert [48]. Verringerung der Quellungsrate Vernetztes Kollagen zeigt eine geringere Tendenz für Quellung [44, 58], was bei der Behandlung der bullçsen Keratopathie und Fuchs schen Endotheldystrophie genutzt werden kçnnte [13]. Diese verringerte Quellungsneigung wirkt sich auch positiv auf das Tragen von Kontaktlinsen aus. Die Toleranz der Hornhaut für Kontaktlinsen nimmt somit nach Vernetzung zu. Dickenzunahme der Kollagenfasern Die Behandlung bewirkt auch eine Zunahme des Durchmessers der Kollagenfasern im anterioren Stroma um 12% und posterior um 4,5% [57]. Abb. 4 Umwandlung der Energie des eingestrahlten UV-Lichtes in verschiedene Energieformen, wobei der Anteil der Wärmeenergie vernachlässigbar ist. Abb. 5 Indirekter Nachweis der Vernetzungen anhand der Veränderung der physikochemischen Eigenschaften der Hornhaut. Erhçhung der Resistenz gegen enzymatische Abbauprozesse Beim Keratokonus ist in der Tränenflüssigkeit der Anteil von Kollagen abbauenden Enzymen erhçht, was auch zur Verdünnung des Hornhautstromas beitragen kann [27, 41]. Die mit Riboflavin/UVA behandelte Hornhaut lässt sich nicht so schnell enzymatisch in Kollagenase abbauen im Vergleich zur unbehandelten Hornhaut. [50]. Dieser verzçgerte Abbauprozess hat auch eine Verlängerung der Turn-over-Zeit des Kollagens zur Folge. Bildung von Molekülaggregaten mit einem grçßeren Molekulargewicht [12] Der Grad der Vernetzungen nimmt mit dem Alter zu und erhçht sich kumulativ bei langlebigen Proteinen (z. B. Kollagen). All diese Veränderungen der physikochemischen Eigenschaften weisen auf Vernetzungen hin, die durch die Riboflavin/UVA- Behandlung in der Hornhaut induziert wurden. Stärkere Vernetzung in der vorderen Hornhaut Mit der photoxidativen Methode erfolgt die Vernetzung nicht homogen über die gesamte Hornhautdicke. Aufgrund des starken Absorptionskoeffizienten wird die UV-Intensität mit zunehmender Tiefe geringer (l " Abb. 3), was auch eine Abnahme der Vernetzungen vermuten lässt. Eine geringere Zunahme des Fa-

6 136 Übersicht serdurchmessers posterior [57], ein stärkerer enzymatischer Abbau [50] und auch ein stärkerer Schrumpfungseffekt [48] der posterioren vernetzten Hornhaut weisen darauf hin. In einer experimentellen Untersuchung an enukleierten Schweineaugen konnte gezeigt werden, dass eine Verfestigungswirkung nur im ersten Drittel (ca. 200 m) des Hornhautstromas erfolgt [24]. In diesen Untersuchungen wurden jeweils von einem Auge zwei Flaps von 200 m Dicke geschnitten. Die Festigkeit der ersten behandelten Flaps war signifikant hçher im Vergleich zu den zweiten behandelten Flaps und zu den entsprechenden Kontrollflaps. Die zweiten behandelten Flaps sind nur minimal fester als die zweiten unbehandelten Flaps. Analoge Ergebnisse ergaben auch biochemische Untersuchungen der Vernetzungen in verschieden tiefen Stromaschichten [36]. Diese abnehmende Vernetzungswirkung mit zunehmender Tiefe lässt sich wie folgt erklären. Die Riboflavinkonzentration nimmt entsprechend dem Diffusionsgradienten mit der Hornhauttiefe linear ab. Viel stärker ist die exponentielle Abnahme der UV-Intensität entsprechend dem Lambert-Beer-Gesetz. Dadurch werden in den ersten 200 m 65% der UV-Stahlung absorbiert (l " Abb. 3). Da der Vernetzungseffekt vorwiegend von der UV-Bestrahlungsstärke abhängt und weniger von der Riboflavinkonzentration [37], ist der Verfestigungseffekt in den ersten m am stärksten. Zusammenfassung Das Prinzip der Riboflavin/UVA-Licht-Behandlung beruht auf der photooxidativen Vernetzung der Kollagenfasern der Hornhaut. Die Kenntnis und Beachtung der biophysikalischen Grundlagen der photooxidativen Kollagenvernetzung an der Hornhaut sollen zur sicheren Anwendung dieser Therapiemethode beitragen. Durch die Kollagenvernetzung werden die biomechanischen und biochemischen Eigenschaften der oberen m der Hornhaut modifiziert. Damit werden tiefer gelegene Strukturen nicht geschädigt. In erster Linie ist die neue Behandlungsmethode zur Hornhautstabilisierung geeignet, um die weitere Progression einer Keratektasie nach Lasik oder eines Keratokonus zu stoppen. Interessenkonflikt: Nein Literatur 1 Aeschlimann D, Paulsson M. Cross-linking of laminin-nidogen complexes by tissue transglutaminase. J Biol Chem 1991; 266: Ahearne M, Yang Y, Then KY et al. Non-destructive mechanical characterization of UVA/riboflavin crosslinked collagen hydrogels. Br J Ophthalmol 2008 (im Druck) 3 Asaga H, Kikuchi S, Yoshizato K. Collagen gel contraction by fibroblasts requires cellular fibronectin but not plasma fibronectin. Exp Cell Res 1991; 193: Ayala MN, Michael R, Sçderberg PG. Influence of exposure time for UV radiation induced cataract. Invest Ophthalmol Vis Sci 2000; 41: Andreassen TT, Simonsen AH, Oxlund H. Biomechanical properties of keratoconus and normal corneas. Exp Eye Res 1980; 31: Balasubramanian D, Kanwar R. 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