Etwa 1000 Kinder erleiden in

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1 3;98:Suppl I:x x, Urban & Vogel, München 1 Frühkindliche Hirnschäden von der Neuroprotektion zur Neuroregeneration mit Nabelschnurstammzellen Arne Jensen 1, Hans-Martin Vaihinger 1, Carola Meier 2 ZUSAMMENFASSUNG Während der Perinatalzeit erleiden in Deutschland jährlich ca. 1 Kinder einen Hirnschaden aufgrund eines hypoxisch-ischämischen Insults. Je nach Ausmaß und Lokalisation des Insults entwickeln diese Kinder spastische Paresen, Choreoathetosen, Ataxien und sensomotorische Integrationsstörungen. Die Belastungen, die hieraus für die Betroffenen und deren Angehörige entstehen, sind beträchtlich und erfordern eine enge Kooperation zwischen Geburtshelfern, Pädiatern, Neuropädiatern, Motopäden, Logopäden, Psychotherapeuten und sonstigen Spezialisten. Vorsichtige Schätzungen beziffern die Kosten, die hierbei pro Geburtenjahrgang für die Solidargemeinschaft entstehen, auf ca. Mio. Euro. Klinische Konzepte zur Senkung der zerebralen Morbidität in der Perinatologie haben sich in den letzten 1 Jahren bewährt. Da jedoch nicht bei allen Kindern Hirnschäden durch alleinige präventive Maßnahmen zu verhindern sind, ist die Entwicklung von therapeutischen Strategien, die auch nach eingetretenem Insult neuroprotektiv wirken, notwendig. Experimentelle Ansätze hierzu sind äußerst vielversprechend. In aktuellen Forschungsprojekten wird untersucht, inwieweit Stammzellen, die aus der Nabelschnur und Plazentarestblut gewonnen werden, zur Neuroregeneration eingesetzt werden können. Schlüsselwörter: Frühgeburt Perinataler Hirnschaden Neuroprotektion Nabelschnurstammzellen Neuroregeneration ABSTRACT (( Bitte englischen Titel einfügen)) Per year, approximately 1, children in Germany suffer from brain damage due to hypoxic-ischemic insults during the perinatal period. Based on the severity and localization of the insult, these children develop either spastic pareses, choreoathetosis, ataxia, or sensomotoric dysfunctions. A close cooperation between obstetricians, pediatricians, neuropediatricians, physical therapists, developmental psychologists, and other specialists is required, as the strain these disorders have on the children and their families is tremendous. The costs resulting per birthyear for the community are estimated on 1 million Euro. Clinical concepts to decrease the cerebral morbidity in perinatology departments have proven to be effective over the last decade. However, since brain damage cannot be prevented every time, it is essential that therapeutic measures, which have a neuroprotective effect after the insult, are being developed. Experimental pilots regarding these matters are promising. Current experiments are focused on the possible application of cord bloodderived stem cells for neuroregeneration. Key Words: Preterm delivery Perinatal brain damage Cerebral palsy Neuroprotection Cord blood stem cells Neuroregeneration Etwa 1 Kinder erleiden in Deutschland jährlich einen Hirnschaden aufgrund eines hypoxischischämischen Insults während der Perinatalzeit [42] (Peri-/Neonatalstatistiken der Bundesländer). Die Ursachen dafür sind vielfältig und reichen von Durchblutungsstörungen der Plazenta über während der Geburt abgeklemmte Gefäße bis hin zu Beatmungsfolgen bei sehr unreifen, zu früh geborenen Kindern. Betroffen sind vor allem frühgeborene Kinder mit einem Gewicht < 1 g. Je nach Ausmaß und Lokalisation des Insults entwickeln diese Kinder spastische Paresen, Choreoathetosen, Ataxien, aber auch leichtere Formen von sensomotorischen Integrationsstörungen. Nicht selten ist die kognitive Leistungsfähigkeit eingeschränkt. Auch psychopathologische Entwicklungsformen, wie beispielsweise das Auftreten einer Schizophrenie, scheinen gehäuft mit peripartalen Komplikationen assoziiert zu sein [11, 13, 44, 54, 55]. Zudem kann die Kontrolle emotionaler Impulse beeinträchtigt sein, was im Erwachsenenalter eine geringere geistige Leistungsfähigkeit, Beziehungsstörungen, Ängste, Depressionen oder Schwierigkeiten in der beruflichen Anpassung verursachen kann. Die Belastungen, die hieraus für die Betroffenen und deren Angehörige resultieren, sind von beträchtlichem Ausmaß und erfordern eine enge Kooperation zwischen Pädiatern, Neuropädiatern, Motopäden, Logopäden, Kinder- und Jugendpsychiatern sowie sonstigen Spezialisten. Die für die Solidargemeinschaft entstehenden Kosten pro Geburtenjahrgang werden in Deutschland auf mindestens Mio. Euro geschätzt. Klinische Konzepte, die zerebrale Morbidität in der Perinatologie zu senken, zeigten in den letzten Jahren bereits 1 Experimentelle Perinatologie, Universitätsfrauenklinik, und 2 Abteilung Neuroanatomie und Molekulare Hirnforschung, Institut für Anatomie, Ruhr-Universität Bochum.

2 2 Jensen A, et al reif unreif 6 16 unreif reif Schwangerschaftsalter (Wochen) Apgar-Wert Apgar-Wert Abbildung 1. Hirnblutungshäufigkeit in Abhängigkeit vom Schwangerschaftsalter [1, 31]. Abbildungen 2A und 2B. Inzidenz intra-/periventrikulärer Hirnblutungen in Abhängigkeit vom 1-min-Apgar-Wert und Schwangerschaftsalter. A) Frühgeburten, B) Reifgeburten [1, 31]. Zellschaden (Score) Kontrolle (n = 7) Flunarizin (n = 6) parasagittal temporal Abbildung 3. Neuronaler Zellschaden im Gehirn reifer Schaf-Feten 72 h nach -minütiger zerebraler Ischämie. Die Tiere der Versuchsgruppe erhielten 1 h vor Ischämie i.v. den Calciumantagonisten Flunarizin (1 mg/kg Körpergewicht). Der neuronale Zellschaden ist als Score dargestellt. 1 Punkt entspricht morphologisch intakten Neuronen, 5 Punkte einem kompletten Infarkt. Der neuronale Zellschaden nahm in der Kontrollgruppe von parasagittal nach temporal deutlich ab. Flunarizin reduzierte die ischämischen Zellläsionen erheblich. * p <,5; ** p <,1 (Flunarizin vs. Kontrolle; Mann-Whitney-U-Test) [6]. Erfolge [31 33]. Geburtshilfliche Maßnahmen, die auf eine Senkung der zerebralen Früh- und Spätmorbidiät zielen, liegen in der Reduktion der Frühgeburtenrate und in der Frühintervention bei fetaler Hypoxie bzw. aszendierender intrauteriner Infektion. Da jedoch nicht bei allen Kindern Hirnschäden durch alleinige präventive Maßnahmen zu verhindern sind, ist es dringend geboten, therapeutische Strategien zu entwickeln, die auch nach eingetretenem Insult noch eine Neuroprotektion bewirken [4, 27, ]. Experimentelle Ansätze hierzu sind äußerst vielversprechend [3]. Typische Formen perinataler Hirnläsionen und Inzidenz Typische Läsionsformen des unreifen Gehirns infolge hypoxisch-ischämischer Insulte während der Perinatalzeit sind die periventrikuläre Leukomalazie und die intra- bzw. periventrikuläre Hirnblutung. Die periventrikuläre Leukomalazie ist eine Schädigung der weißen Hirnsubstanz dorsal und lateral der Seitenventrikel. Sie hat vaskuläre Ursachen. Während der Genese und Ausreifung des zerebralen Gefäßbetts entstehen in diesen Bereichen Grenzversorgungsgebiete. Die Fähigkeit zur Vasodilatation und damit zur Steigerung der Durchblutung während und nach einer arteriellen Hypotonie scheint in diesen Hirnarealen sehr eingeschränkt zu sein [52]. Die intra- bzw. periventrikuläre Hirnblutung hingegen hat ihren Ursprung im Gefäßbett der germinalen Matrix, einer Hirnregion, die sich mit zunehmender Reife der Feten nahezu vollständig zurückbildet [23, 33, 39, 51]. Blutgefäße dieser Hirnregion sind durch eine geringe Ausreifung gekennzeichnet [34]. Da zudem die Autoregulation der zerebralen Durchblutung bei unreifen Feten deutlich eingeschränkt ist, können diese Gefäße leicht infolge rezidivierender Blutdruckschwankungen rupturieren [14, 18, 31, 33, 38]. Bei frühgeborenen Kindern mit einem Gewicht < 1 g beträgt die Inzidenz der periventrikulären Leukomalazie ca. 5%, die der schweren intra- bzw. periventrikulären Hirnblutung ca. 1% (Peri-/Neonatalstatistiken der Bundesländer). Im Gegensatz hierzu entwickeln reifgeborene Kinder nach einem hypoxisch-ischämischen Insult typischerweise Hirnschäden in der Parasagittalregion, einem Grenzversorgungsgebiet zwischen den großen Hirnarterien. Häufig treten in diesem Gestationsalter auch Läsionen am Thalamus und an den Basalganglien auf, die nach narbiger Abheilung marmoriert aussehen (Status marmoratus) [45]. Die Inzidenz schwerer hypoxisch-ischämischer Hirnläsionen sub partu beträgt beim reifgeborenen Kind etwa 2 4/1. Steigende Risiken mit zu früher Geburt Wie die Neonatalstatistiken der Bundesländer zeigen, steigt die zerebrale Frühmorbidität mit abnehmendem Schwangerschaftsalter extrem an. Hier kann das in den letzten Jahren deutlich erweiterte Wissen über die pathophysiologischen Mechanismen und Risikofaktoren der Frühgeburtlichkeit anset-

3 Jensen A, et al. 3 zen. Neben aszendierenden genitalen Infektionen scheinen fetomaternale Stresssituationen und deziduale Blutungen das Frühgeburtsrisiko deutlich zu steigern. Sorgfältige Anamneseerhebung, vaginale Untersuchung mit mikrobieller Diagnostik, Vaginalsonographie sowie biochemische Marker, insbesondere die Fibronectinkonzentration im Vaginalsekret, erscheinen geeignet, Risikopatienten zu selektionieren und präventiven Maßnahmen zuzuführen [24]. Intensive psychosoziale Zuwendung sowie der Einsatz von Tokolytika und Antibiotika unter entsprechender Indikation können bei der Senkung der Frühgeburtenrate hilfreich sein [2, 35]. Auch die betroffenen Patientinnen selbst können durch regelmäßige Selbstkontrolle des vaginalen ph-werts zur Senkung des Frühgeburtsrisiko beitragen, wie Saling in seinem Vorsorgeprogramm beschreibt [48]. Mit diesem Vorsorgeprogramm, das im Wesentlichen alle bereits genannten Maßnahmen zur Reduktion der Frühgeburtenrate umfasst, könnte eine Senkung des Frühgeburtsrisiko möglich werden [25]. Hirnsonographische Reihenuntersuchung Wie im Rahmen einer hirnsonographischen Reihenuntersuchung der eigenen Arbeitsgruppe an insgesamt (( 4)) Kindern gezeigt werden konnte, steigt die Rate der Hirnblutungen zunehmend mit abnehmendem Schwangerschaftsalter (Abbildung 1). Insbesondere bei frühgeborenen Kindern nimmt die Hirnblutungsrate in allen Schweregraden zudem mit abnehmendem 1-min- Apgar nahezu linear zu [1, 31] (Abbildungen 2A und 2B). Kreislaufphysiologisch ist der enge Bezug zwischen Apgar-Wert und Häufigkeit von Hirnblutungen bei Frühgeborenen nicht überraschend, weil ein niedriger Apgar- Wert einen Schockzustand widerspiegelt [26, 29]. Da die Möglichkeiten der Frühgeborenen, den Kreislauf wirkungsvoll zu zentralisieren, wegen der Unreife des sympathischen Nervensystems eingeschränkt sind, kommt es bei diesen Kindern im Sauerstoffmangel zu einer überproportional starken Abnahme des Sauerstofftransports zum Gehirn [26, 28]. Ferner ist die Durchblutung des Gehirns durch Aufhebung der Autoregulation druckpassiv [36], was bei hohen arteriellen Drücken zum Zerreißen der empfindlichen Gefäße führt oder bei niedrigen Drücken ischämische Läsionen hinterlässt. Es besteht also eine verminderte Asphyxietoleranz. Klinische Neuroprotektion Der perinatale Hirnschaden des Fetus ist in der Regel durch eine schwere zerebrale Ischämie bedingt. Aufgrund des akuten Sauerstoffmangels kommt die oxidative Phosphorylierung im Gehirn zum Erliegen. Der Na+/K+-Pumpe an der Zellmembran steht keine Energie mehr zur Verfügung, um die Ionengradienten aufrechtzuerhalten. Nach Verlust des Membranpotentials dringen über spannungsabhängige Ionenkanäle große Mengen Calcium als Folge des extremen extra-/intrazellulären Konzentrationsgradienten in die Zelle ein. Die derzeitige Forschung geht davon aus, dass der exzessive Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration, der sog. Calcium-Overload, eine Zellschädigung durch Aktivierung von Proteasen, Lipasen und Endonukleasen hervorruft [3]. Neben dem zellulären Calciumeinstrom über spannungsabhängige Calciumkanäle wird während der Ischämie auch Calcium über glutamatgesteuerte Ionenkanäle in die Zelle eingeschleust. Glutamat, der wichtigste exzitatorische Neurotransmitter, wird während der Ischämie im Zuge der anoxischen Zelldepolarisation aus präsynaptischen Vesikeln freigesetzt. Glutamat aktiviert postsynaptische, aus fünf Untereinheiten bestehende Rezeptoren, die kationendurchlässige Kanäle bilden. Aufgrund ihrer pharmakologischen Eigenschaften gegenüber spezifischen Agonisten können drei verschiedene ionotrope Glutamatrezeptoren unterschieden werden: AMPA-, KA- und NMDA-Rezeptoren. Jeder dieser Rezeptoren vermag die Calciumdurchlässigkeit der Zellmembran zu erhöhen. Nach einem ischämischen Insult wird in regenerationsfähigem Hirngewebe eine rasche Erholung des Energiestoffwechsels beobachtet. Wenige Stunden später tritt jedoch oft eine erneute Beeinträchtigung des energetischen Status ein. Gleichzeitig ist ein sekundäres Zellödem nachweisbar. In der Folge kann im Elektroenzephalogramm epileptogene Aktivität registriert werden. Es kommt zum sekundären neuronalen Zellschaden in der Reperfusionsphase. Dieser Zellschaden wird durch die postischämische Freisetzung von Sauer- Abbildungen 4A bis 4C. Expression neuraler Markerproteine nach In-vitro-Proliferation und Differenzierung humaner Nabelschnurstammzellen. A) Native mononukleäre Zellen mit humaner Kernfärbung (HNA); B) differenzierte Zelle mit astrozytärem Marker (GFAP); C) differenzierte Zelle mit neuronalem Marker (β3-tubulin).

4 4 Jensen A, et al. stoffradikalen, durch die Aktivierung des Stickstoffmonoxidsystems und ein Ungleichgewicht im exzitatorisch/inhibitorischen Neurotransmittersystem hervorgerufen. Möglicherweise ist ein Teil des sekundären neuronalen Zellschadens nach Ischämie durch die Induktion eines sog. zellulären Selbstmordprogramms (Apoptose) bedingt. Auch postischämische Entzündungsreaktionen, die zu erhöhten Gewebespiegeln von Zytokinen führen, können das Ausmaß des resultierenden Hirnschadens beeinflussen. Wie bereits erwähnt, spielen gerade diese pathophysiologischen Mechanismen in der Genese von Hirnschäden unreifer Feten im Rahmen einer aufsteigenden intrauterinen Infektion eine maßgebliche Rolle [3, 11]. Von den zahlreichen aus diesen pathophysiologischen Erkenntnissen abgeleiteten Therapieregimen, die bisher tierexperimentell überprüft wurden, erscheinen die Applikation von Magnesium [, 53], Calciumantagonisten [6, 15] und Sauerstoffradikalfängern [43] sowie die postischämisch induzierte zerebrale Hypothermie [5,, 21, ] für klinische Prüfungen am besten geeignet. Die maternale Applikation von Magnesium war in verschiedenen retrospektiven Analysen mit einer deutlichen Reduktion von Zerebralparesen bei frühgeborenen Kindern < 1 g assoziiert []. Darüber hinaus ist der neuroprotektive Effekt von Magnesium durch verschiedene experimentelle Studien belegt [16, 47, 53]. Der Calciumantagonist Flunarizin war in der Lage, den ischämischen Hirnschaden von Schaf-Feten signifikant zu reduzieren [4, 6, 27] (Abbildung 3). Eine Beeinträchtigung der fetalen Herz-Kreislauf- Regulation konnte dabei ausgeschlossen werden [27]. Eine antepartale Applikation dieses Calciumantagonisten in einem entsprechend ausgewählten Risikokollektiv erscheint unter klinischen Studienbedingungen deshalb gerechtfertigt. Sauerstoffradikalfänger sind durch ein geringes Nebenwirkungsprofil gekennzeichnet. Eine klinische Prüfung in der postischämischen Phase ist somit gut denkbar []. Die milde Hypothermie hat von allen experimentell überprüften Strategien wohl die höchste neuroprotektive Wirkung. Ihr Einsatz ist allerdings bisher nur in der postpartalen Phase vorstellbar. Das Nebenwirkungsprofil ist bei reifen Kinder, wie erste Pilotstudien gezeigt haben, beherrschbar []. Multizentrisch angelegte Interventionsstudien wurden deshalb bereits initiiert. Zellersatztherapie mit Nabelschnurstammzellen Bereits Ende der 8er Jahre wurde gezeigt, dass Nabelschnurblut reichlich unreife hämatopoetische Progenitorzellen enthält [8]. Im Jahr 1989 berichteten Gluckman et al. über die erste erfolgreiche Übertragung von Nabelschnurblutstammzellen von einer HLA-identischen Schwester auf einen an einer Fanconi-Anämie erkrankten 5- jährigen Jungen [17]. In der pädiatrischen Onkologie dienen Nabelschnurstammzellen bereits jetzt bei Hochdosistherapie und in der Graft-versus-Tumor-Reaktion als direkter Antitumoreffekt als Ersatz für die Knochenmark- oder periphere Stammzellspende [12]. Der Vorteil gegenüber adulten Stammzellen könnte darin bestehen, dass das Nabelschnurblut noch weitgehend unbelastet durch Viren und mögliche maligne transformierte Zellen sein könnte. Es scheint bei allogenen Transplantationen möglicherweise besser verträglich als allogene Spenderstammzellen aus Knochenmark oder strömendem Blut. Das Nabelschnurblut kann nach der Geburt ohne jegliche Beeinträchtigung des Geburtsvorgangs und vor allem ohne jegliche Beeinträchtigung des Neugeborenen und der Mutter gesammelt und konserviert werden. Nach Abnabelung des Neugeborenen und dessen gründlicher Versorgung können die Nabelschnur unter sterilen Bedingungen punktiert und das in der Nabelschnur und Plazenta enthaltene Blut gesammelt werden [12]. Es konnte gezeigt werden, dass Stammzellen aus Nabelschnurblut in unterschiedliche Gewebe wie Blut-, Herzmuskel-, Knochen-, Leber-, Bauchspeicheldrüsen- oder Nervenzellen differenzieren können [7, 9, 19, 22, 41, 46, 49]. Hieraus ergeben sich zahlreiche potentielle medizinische Anwendungen, beispielsweise für die Behandlung des Myokardinfarkts oder neurologischer Krankheitsbilder wie etwa des Morbus Parkinson. Das zentrale Nervensystem hat, im Gegensatz zu vielen anderen Geweben, nur ein limitiertes Regenerationspotential. Reife Nervenzellen die zugrunde gegangen sind, regenerieren nicht, und obwohl neuronale Stammzellen sogar im adulten Zentralnervensystem vorhanden sind, haben diese nur eine limitierte Kapazität, nach Verletzungen neue, funktionell aktive Nervenzellen zu generieren. Die Transplantation von Nabelschnurstammzellen könnte eine erfolgversprechende Therapieform darstellen. Aus Untersuchungen an adulten Ratten ist bekannt, dass Stammzellen aus humanem Nabelschnurblut nach Transplantation in hypoxisch-ischämisch geschädigte Hirnregionen migrieren. Interessanterweise wiesen die Auroren auch ein besseres Resultat in Verhaltenstests gegenüber Kontrollen nach dieser Intervention nach [1, 37]. Unsere Arbeitsgruppe arbeitet experimentell auf mehreren Ebenen an der Untersuchung des neurogenen Potentials von Stammzellen aus Nabelschnurblut. In der Zellkultur sind die Proliferation und neuronale Differenzierung der Nabelschnurstammzellen bereits erfolgreich gelungen (( 3)) (Abbildung 4). Die molekularbiologische und physiologische Charakterisierung der Zellen wird sich anschließen. Parallel dazu werden in verschiedenen Modellen hypoxisch-ischämischer Läsion das Migrationsverhalten transplantierter Stammzellen untersucht und Hinweise auf Invivo-Differenzierung erforscht. In diesen Tiermodellen kann auch die funktionale Regeneration durch Verhaltenstests quantitativ erfasst werden. Die Transplantation von Nabelschnurblut hat bei hämatopoetischen Erkrankungen eine rasante Entwicklung genommen. Dem Einsatz von Stammzellen aus Nabelschnurblut könnte somit zukünftig aufgrund der hohen Proliferations- und Differenzierungskapazität nicht nur in der Behandlung hämatopoetischer Systemerkrankungen, sondern auch anderer Erkrankungen große Bedeutung zukommen. Hierzu zählt insbesondere der klinische Einsatz von humanen Stammzellen aus Nabelschnurblut zur Regeneration von Schädigungen des Zentralnervensystems unter besonderer Berücksichtigung der Therapie perinataler Hirnschäden.

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Korrekturvorschlag: entweder erfolgreich streichen oder in erfolgreich durchgeführt worden ändern 4: Bitte prüfen, ob Differenz der hier genannten Zahl zu der Anzahl der in Abbildungen 1 [dort 5 267] und 2 [dort 5 292] aufgeführten Kinder ok.))