Technische Dokumentation P.I.A.² Barbiturate

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1 Seite 1 von 7 Technische Dokumentation P.I.A.² Barbiturate Zertifiziert nach DIN EN ISO 9001:2008 und EN ISO 13485:2012 Certifié selon DIN EN ISO 9001:2008 et EN ISO 13485:2012 Certified according to DIN EN ISO 9001:2008 and EN ISO 13485:2012 Schweiz Protzek Gesellschaft für Biomedizinische Technik GmbH Heulenlochweg 6 CH-4133 Pratteln Tel Fax: info@protzek.ch 1. GÄNGIGE BEZEICHNUNG Barbiturate bzw. BAR Zielsubstanz: Secobarbital 2. ANWENDUNGSGEBIET Deutschland Protzek Gesellschaft für Biomedizinische Technik mbh Tüllinger Str. 36 a D Lörrach Tel.: Fax: info@protzek.info Business partner of Protzek Group Der P.I.A.² Assay Barbiturate (BAR) ist ein Reagenziensystem zur Feststellung von Barbiturat- Ausscheidungen in Humanurinproben. Der P.I.A.² Assay ist ein semiquantitatives immunologisches Messverfahren mit Secobarbital als primäre Ziel- und Kalibratorsubstanz. Frankreich Protzek France Produits Médicaux SARL 24 avenue de Bâle F Saint- Louis Tél Fax: info@protzek-diagnostic.com Barbiturate wirken dämpfend auf das Zentralnervensystem und sind therapeutisch als Sedativa, Schlafmittel und Antikonvulsiva (krampflösende Mittel) einsetzbar. Barbiturate sind als Kapseln oder Tabletten im Handel erhältlich. Chronischer Gebrauch von Barbituraten kann zu Toleranz und Dosissteigerung sowie zu massiver Abhängigkeit führen. Bei Ausbleiben der Wirkstoffzufuhr können drastische Entzugserscheinungen auftreten. Seit Benzodiazepine verfügbar sind, werden Barbiturate wegen ihrer relativ hohen Toxizität bei Überdosierung heute nur noch selten therapeutisch eingesetzt. Ausnahme ist Phenobarbital als Antikonvulsivum. Die meisten Barbiturate werden zu weniger als 5 % unverändert im Urin ausgeschieden. Metabolite können im Urin je nach Eliminationsdauer 4-7 Tage lang nachgewiesen werden. Neben Secobarbital werden mit dem P.I.A.² Assay Barbiturate eine Vielzahl von gebräuchlichen Barbituraten miterfasst. Eine Liste finden Sie unter 23 SPEZIFISCHE LEISTUNGSDATEN. Da es verschiedene Barbituratvarianten gibt, sind auch deren Bindungsstärken an den Barbiturat-spezifischen Antikörper entsprechend unterschiedlich. Somit ist die Kenntnis der Kreuzreaktivität einzelner Barbiturate im P.I.A. 2 Assay Barbiturate für die Durchführung und Beurteilung der Analyse wichtig und verdient besondere Beachtung (siehe Abschnitt 23 SPEZIFISCHE LEISTUNGSDATEN ). Neben dem Kreuzreaktivitätsspektrum sind auch die pharmakodynamischen und pharmakokinetischen Eigenschaften der Barbiturate zu berücksichtigen. Wie bei allen Arten von Immunassays sind die Ergebnisse des P.I.A.² Assays Barbiturate vorläufig und müssen mit Hilfe eines das jeweilige Barbiturat sicher nachweisenden Verfahrens bestätigt werden. Bestätigungsverfahren der Wahl sind die Gaschromatographie oder Flüssigkeitschromatographie mit Massenspektrometrie (GC/MS oder LC/MS). Unter klinischen wie forensischen Gesichtspunkten sind Analysenergebnisse stets sorgfältig und sachverständig

2 Seite 2 von 7 zu bewerten. Dies gilt besonders, wenn sie mit einer immunologischen Methode erhalten wurden. 3. ERLÄUTERUNG DES ASSAYS Der P.I.A.² Assay Barbiturate beruht auf dem Prinzip des kompetitiven immunchromatographischen Tests. Einzelheiten dazu sind der Einführung in die P.I.A. 2 Drogen Assays bzw. unserer Medizinisch- Wissenschaftlichen Dokumentation zu entnehmen. Lesen Sie dazu auch die Bedienungsanleitung des P.I.A.² Analysegerätes. Beim P.I.A.² Assay Barbiturate wird eine im P.I.A.² Analysegerät vorab gespeicherte Sechspunkte- Kalibrationskurve verwendet, von der das Messergebnis abgeleitet wird. Der Schwellenwert (Cut-Off) für die positiv Anzeige ist der Kalibration entsprechend auf einen Wert von 300 ng/ml des Zielanalyten im Urin voreingestellt. Der Cut-Off kann bei besonderem Bedarf in Abstimmung mit uns (Protzek GfBT mbh) unter Beachtung der unteren Messbereichsgrenze entsprechend den Erfordernissen des jeweiligen Benutzers und dessen Probanden verändert werden. Zudem ist auch die Kreuzreaktivitätscharakteristik des Assays zu berücksichtigen. Mit einer Veränderung der Cut-Off-Einstellung ändern sich zugleich die Spezifität und Sensitivität des Analyseverfahrens. Siehe Abschnitt 25 ANALYTISCHE SENSITIVITÄT UND SPEZIFITÄT. Die Anwendung eines veränderten Cut-Offs und die Ermittlung der entsprechenden Spezifitätsdaten liegen in der Verantwortung des Anwenders. 4. QUALITATIVE MESSERGEBNISSE Die Ergebnisse werden qualitativ d.h. als positiv bzw. negativ angegeben, wenn sie über oder unter dem festgelegten Schwellenwert liegen. 5. SEMIQUANTITATIVE MESSERGEBNISSE Da Immunassays für relativ kleine Moleküle meist nicht nur auf eine Substanz sondern auch auf strukturverwandte Substanzen einer ganzen Substanzgruppe - in der Regel unterschiedlich stark letztlich aber in einer Summe reagieren, ist es nicht möglich Testergebnisse als quantitativ zu bezeichnen. Quantitative Ergebnisse beziehen sich stets auf eine bestimmte Substanz und deren Konzentration in der Probe. Semiquantitativ nennt man Ergebnisse, wenn sich eine Konzentration in Größenordnungen bzw. nur als Summe der Reaktion einer oft unbekannten Anzahl von Substanzen der betreffenden Stoffgruppe in einer Probe angeben lässt. Hier: Das im Urin ausgeschiedene Barbiturat. Der P.I.A.² Assay wurde mit geeigneten Kalibratoren der immunologischen Zielsubstanz kalibriert (Hier: Secobarbital). Daher kann die Summe der einzelnen Stoffreaktionen im Test nur als Konzentration in ng/ml dieser Kalibratorsubstanz ausgegeben werden. Da sie einander äquivalent sind, bedeutet das Messergebnis nicht eine Konzentration, sondern lediglich ein Konzentrationsäquivalent der Kalibratorsubstanz. 6. BESTÄTIGUNG VON TESTERGEBNISSEN Eigentlich wären alle, positive wie negative Testergebnisse, mit einem entsprechend nachweisstarken und substanzspezifischen physikalischchemischen Analysenverfahren (beweissicher) zu bestätigen. In der Praxis hat es sich aber vielfach eingebürgert, nur positive Befunde zu bestätigen. Mit negativen Befunden wird in der Regel kaum jemand belastet. Zur Bestätigung der Ergebnisse von Drogentests sind massenspektrometrische Verfahren mit deuterierten internen Standards zu empfehlen, wie die verschiedenen Varianten mit Gaschromatographie oder Flüssigkeitschromatographie (GC/MS bzw. LC/MS). 7. GRUNDLAGEN DES MESSVERFAHRENS Das P.I.A.² Analysesystem basiert auf der Methode des kompetitiven immunchromatographischen Assays, bei der das an ein Trägereiweiß konjugierte Antigen in Form einer schmalen Querbande (Testlinie) auf einem Membranstreifen aus Nitrozellulose (4 x 60 mm) gebunden ist. Die Testanordnung ist in einer geeignet dimensionierten Kassette mit Barcodemarkierung untergebracht, welche den Testparameter kennzeichnet

3 Seite 3 von 7 und enthält. Die Probenflüssigkeit wird im Probenfenster aufgebracht und löst anschließend einen mit kolloidalem Gold markierten Antikörper von einem Glasvlies. Die Kapillarkräfte transportieren ihn anschließend zur Testlinie, an der das Testlinienantigen mit dem Probenantigen um die Bindungsstellen an den Antikörpermolekülen konkurriert. Kann die vorhandene Menge des Antigens aus der Probe die Bindungsstellen schon während des Transports sättigen, wird sich keine Testlinie ausbilden und die Membran bleibt ungefärbt. Ist das Probenantigen nicht anwesend, oder reicht die Menge zur Sättigung nicht aus, binden die goldmarkierten Antikörpermoleküle an der Testlinie unter Ausbildung einer maximal bzw. minder intensiven roten Bande. Zwischen den Extremen gibt es einen kontinuierlichen und konzentrationsabhängigen Übergang, der von P.I.A. 2 gemessen wird. Je höher die Konzentration des Analyten ist, desto geringer ist die Farbintensität der Bande. Bei jeder Analyse wird diese mit dem P.I.A.² Analysegerät unter hoher Auflösung ausgemessen. Zur Kalibration der betreffenden Testcharge wird im P.I.A.² Analysegerät eine Kalibrationskurve hinterlegt, die per Barcode aufgerufen wird und mit der die entsprechende Testlinienintensität qualitativ bzw. semiquantitativ ausgewertet wird. Die zweite Bande auf dem immunchromatographischen Teststreifen dient der Durchlaufkontrolle der Probenflüssigkeit. Auf der Membran ist ein Sekundär- Antikörper aufgetragen, der den goldmarkierten Antikörper als Antigen bindet. Die intensive Bildung der sog. Kontrolllinie zeigt an, dass der Teststreifen vollständig durchlaufen wurde. Andernfalls wird keine bzw. keine ausreichende Färbung erhalten und der Test ist ungültig. 8. KALIBRATION DES P.I.A.² SYSTEMS Kalibrator: Secobarbital Level Konzentration (ng/ml) S1 0 S2 15 S3 75 S4 150 S5 225 S6 300 Beispiel einer Kalibrationskurve: 9. REAGENZIEN Artikel-Nr. Produkt PIA2 BAR P.I.A.² Assay Barbiturate 10. PRODUKTINHALT Reagenzien- P.I.A.² BAR-Kassette packung gebrauchsfertig Einwegpipette Puffer zur Proben-Verdünnung und semiquantitative Messung oberhalb des Schwellenwertes 11. KONTROLLEN Kontrollen* Secobarbital in Lösung mit 0,075 % Natriumazid *Im Moment nur als Multikontrollen erhältlich

4 Seite 4 von 7 Kontrollen Gehalt Ergebnis Negativkontrolle 0 ng/ml negativ Niedrig 150 ng/ml negativ Hoch 450 ng/ml positiv Alle Reagenzien enthalten 0,075 % Natriumazid als Konservierungsmittel. 12. VORSICHTSMASSNAHMEN Dies ist ein in vitro Diagnostikum. Die beim Umgang mit Laborreagenzien üblichen Vorsichtsmaßnahmen müssen beachtet werden. Beachten Sie die Hygienehinweise im Umgang mit Schnelltests. Ein Merkblatt kann bei uns angefordert werden. Die Kontrollen enthalten 0,075 % Natriumazid. Kontakt mit Haut und Schleimhäuten vermeiden. Benetzte Flächen mit reichlich Wasser abspülen. Sofortige Vorsichtsmaßnahmen sind notwendig bei Benetzung der Augen und beim Verschlucken. Suchen Sie ggf. einen Arzt auf und weisen Sie diese Gebrauchsinformation vor. Es besteht die Möglichkeit, dass sich in Kupfer- oder Bleileitungen explosive Metallazide bilden. Beim Entsorgen von Kalibratoren darum mit großen Mengen Wasser nachspülen, um Azidbildung vorzubeugen. Das Kontrollmaterial muss mit der gleichen Sorgfalt behandelt werden wie eine Patientenprobe, da nicht mit absoluter Sicherheit ausgeschlossen werden kann, dass eine potenzielle Infektionsgefahr besteht. Im Falle einer Exposition ist entsprechend den Anweisungen der zuständigen Gesundheitsbehörden vorzugehen. 13. LAGERUNG DER REAGENZIEN Die Reagenzien sind gemäß den Angaben auf den Etiketten zu lagern. Die P.I.A. Kontrollen sind nach dem Öffnen längstens drei Monate haltbar. Liegt das auf dem Etikett angegebene Verfallsdatum vor diesem Zeitpunkt, ist letzteres maßgebend. 14. HINWEISE ZU STABILITÄT UND HALTBARKEIT Die Tests sind nach Herstellungsdatum 18 Monate haltbar und sollen nicht nach Ablauf der Haltbarkeit verwendet werden, da die vorgesehene Funktionalität des Tests nicht mehr gewährleistet werden kann. Das P.I.A.² Analysesystem prüft bei jeder Messung auch die Haltbarkeitsdaten des Tests. Bezüglich korrekter Lagerung lesen Sie bitte die Packungsbeilage Ihres Tests. 15. BEDIENUNG DES GERÄTES Näheres zur Bedienung des Geräts ist den Kapiteln Inbetriebnahme und Sicherheitshinweise (Kapitel 3), Menüführung (Kapitel 5) und Wartung (Kapitel 8) des P.I.A.² Benutzerhandbuchs zu entnehmen. 16. TESTPARAMETER UND MESSMODUS Die P.I.A.² Testparameter sind in 2 verschiedenen Modi messbar: Qualitativ und semiquantitativ (in ng/ml). Das semiquantitative Verfahren ist für die Messung von positiven Proben nach Verdünnung gedacht. Lesen sie dazu unter Abschnitt 22 GRENZEN DES VERFAHRENS und in der Einführung in die P.I.A. 2 Drogen Assays. 17. PROBENENTNAHME UND VORBEREITUNG DER ANALYSE Für eine Einzelbestimmung von P.I.A. 2 Drogen Assays werden 100 µl Humanurin in die Probenaufgabe pipettiert. Die Urinproben sind nach Abgabe vom Probanden im Kühlschrank aufzubewahren, wenn der Test nicht unmittelbar durchgeführt werden kann. Können sie nicht innerhalb desselben Arbeitstages untersucht werden, sollten die Proben bei mindestens -20 C eingefroren werden. Urinkonservierungsmittel wie 0,075 % Natriumazid können verwendet werden und beeinträchtigen den Testverlauf nicht. Näheres zur Probengewinnung finden Sie in der Einführung in die P.I.A. 2 Drogen Assays bzw. in der Packungsbeilage Ihres Tests.

5 Seite 5 von STÖREINFLÜSSE UND INTERFERENZEN Folgende, im Urin natürlich vorkommende Substanzen haben in Konzentrationen unterhalb von 10 mg/dl keinen Einfluss auf den Test. Substanz Aceton Ascorbinsäure Bilirubin Creatinin Ethanol Glucose Oxalsäure Erythrozytenlysat (Hämoglobin) Enthalten die Proben Rückstände von Detergenzien, oder Oxidantien, bzw. Probenverfälschungszusätze, können die Ergebnisse von lmmunassays beeinträchtigt werden. Zu Probenverfälschungen lesen Sie bitte den entsprechenden Abschnitt in der Einführung in die P.I.A. 2 Drogen Assays. Es empfiehlt sich, im Zweifel zusätzliche Tests auf Probenverfälschung auszuführen. Zur Erkennung von vielen Verfälschungsversuchen können Sie bei Protzek geeignete Teststäbchen erwerben. Fragen Sie uns. Näheres zum Thema Probenverfälschung finden Sie auch in unserer Medizinisch-Wissenschaftlichen Dokumentation. Es können auch andere, an dieser Stelle nicht aufgeführte Substanzen und/oder Faktoren, wie zum Beispiel Geräte- oder Verfahrensfehler, mit dem Assay interferieren und zu falschen Testergebnissen führen. 19. MITGELIEFERTE MATERIALIEN Eine Liste aller mit dem P.I.A.² Analysesystem gelieferten Materialien findet sich im Kapitel 2 Lieferumfang des P.I.A.² Benutzerhandbuchs. Eine Liste aller sonst benötigten, jedoch nicht mitgelieferten Materialien finden Sie ebenfalls in der Arbeitsanleitung des verwendeten Tests. 20. KALIBRIERUNG DES GERÄTES Die Kalibrationsdaten für jede Testcharge sind auf der mitgelieferten SD-Karte hinterlegt und werden automatisch über den auf der Testkassette aufgedruckten Barcode erkannt. 21. QUALITÄTSKONTROLLE Bitte beachten Sie, dass Kontrollen wie Proben zu behandeln sind. Verwenden Sie nur frische, mit den Tests mitgelieferte Pipetten. Mehrfache Verwendung bringt die Gefahr von Verschleppung mit sich. Es sollen regelmäßig Qualitätskontrollen gemessen werden. Befolgen Sie dazu die Richtlinien die für Ihr Labor gelten. Die Werte der Kontrollbereiche befinden sich unter Punkt 11 KONTROLLEN. 22. GRENZEN DES VERFAHRENS Die Grenzen des immunchromatographischen Verfahrens werden in erster Linie bestimmt von der Spezifität und Affinität der Antigen- Antikörperreaktionen. Dabei hängt die Reproduzierbarkeit von Testergebnissen auch von probenbedingten, spezifischen Einflüssen in Verbindung mit unspezifischen Störfaktoren bzw. von allgemeinen zufallsbedingten Abweichungen ab. Lesen Sie hierzu unter Abschnitt 23 SPEZIFISCHE LEISTUNGSDATEN. Für den vorliegenden Test mit einem Cut-Off von 300 ng/ml liegt die testspezifische untere Messbereichsgrenze unter Berücksichtigung von Matrixeinflüssen bei ca. 100 ng/ml. Unterhalb dieser Grenze sind keine genügend sicheren Messergebnisse möglich. Messergebnisse oberhalb des Cut-Off-Wertes werden als positiv ausgegeben, unterhalb des Cut-Offs wird das Ergebnis als negativ bezeichnet. Verdünnung Soll nachgeprüft werden, ob ein positives Testergebnis nur wenig oder erheblich oberhalb des Cut-Offs liegt, so kann eine Messung unter Verdünnung von 1:10 im semiquantitativen Messmodus erfolgen. Dazu ist der vorgegebene Puffer erforderlich (siehe Abschnitt 10

6 Seite 6 von 7 PRODUKTINHALT ). Die Messung kann nur mit der angepassten Methode (anderer Barcode) ausgeführt werden. Zu Fragen der Verdünnung lesen Sie auch bitte den entsprechenden Abschnitt in der Einführung in die P.I.A. 2 Drogen Assays. 23. SPEZIFISCHE LEISTUNGSDATEN Analytische Spezifität Barbiturate, die mit dem P.I.A.² BAR Assay detektiert werden können, sind in nachstehender Tabelle aufgeführt. Die einzelnen Substanzen wurden in bekannter Menge Barbiturate-freiem Humanurin zugesetzt. Gelistet sind diejenigen Substanzen, die bei der angegebenen Konzentration einen positiven Testausfall bewirken. Substanz Konzentration (ng/ml) Secobarbital 300 Allobarbital Alphenal 625 Amobarbital 625 Aprobarbital 188 Butabarbital 94 Butalbital Butethal 200 Cyclopentobarbital 400 Pentobarbital Phenobarbital 300 Spezifitätsdaten getesteter und nicht kreuzreagierender Substanzen Die Kreuzreaktivität wurde ferner an Substanzen getestet, die nicht zur Substanzgruppe gehören bzw. keine ähnliche Struktur aufweisen oder möglicherweise einem Probanden verabreicht werden. Bei Untersuchung der folgenden Substanzen in einer Konzentration von 100 mg/l war die Kreuzreaktivität geringer als die Empfindlichkeit des Assays. Repräsentative Daten sind nachstehend aufgeführt. (-)-Ephedrin Ethanol (+)-Naproxen Furosemid (+/-)-Ephedrin Glucose 4-Dimethylaminoantiyrin Guajacolglyceryläther Acetaminophen Hämoglobin Aceton Ibuprofen Albumin Imipramin Amitriptylin Isoproterenol Ampicillin Lidocain Aspartam Methadon Aspirin Oxalsäure Benzocain Penicillin-G Bilirubin Pheniramin -Phenylethylamin Phenothiazin Coffein Procain Chinidin Protonix Chloroquin Pseudoephedrin Chlorpheniramin Ranitidin Creatin Sertralin Dextromethorphan Tyramin Dextrorphan Tartrat Vitamin C (Ascorbinsäure) Dopamin Trimeprazin Erythromycin Venlafaxin In der Praxis festgestellte Kreuzreaktionen: Keine Angaben, wird bei Bedarf laufend ergänzt. 24. EMPFINDLICHKEIT UND UNTERE MESSBEREICHSGRENZE Die untere Messbereichsgrenze liegt unter Matrixeinflüssen bei 100 ng/ml in Urin, bei Proben- Verdünnung und semiquantitativer Messung oberhalb des Cut-Offs liegt die untere Messbereichsgrenze bei 250 ng/ml. Die Empfindlichkeit gibt die niedrigste Konzentration an, die mit einer 95 %-igen Konfidenz von Null unterschieden werden kann. In der Praxis sind jedoch bei immunchromatographischen Tests zusätzlich unspezifische Einflüsse auf die Immunreaktion zu berücksichtigen. Ergebnisse unterhalb der unteren Messbereichsgrenze werden vom Gerät normalerweise nicht ausgegeben. Werden sie dennoch ermittelt dürfen sie keinesfalls bewertet oder weitergeleitet werden. 25. ANALYTISCHE SENSITIVITÄT UND SPEZIFITÄT

7 GC/MS Name Dokument: Seite 7 von 7 Zur Überprüfung der analytischen Spezifität und Sensitivität für Barbiturate wurden 292 Urinproben mit dem P.I.A.² Assay, bei einem eingestellten Cut-Off von 300 ng Secobarbital/ml im Urin und mit GC/MS untersucht. 132 Urinproben von diesen wurden mit GC/MS positiv getestet; in 160 Proben wurde mit GC/MS kein positiver Befund erhalten. Die Ergebnisse sind in nachfolgender Tabelle dargestellt. N = 292 negativ positiv P.I.A. 2 Assay negativ positiv richtig negativ falsch positiv falsch negativ richtig positiv ÜBEREINSTIMMUNG MIT REFERENZVERFAHREN In Arbeit. Sensitivität = 92 % Spezifität = 98 % Analytische Richtigkeit = 95% Zur Analytischen Richtigkeit wurde unterstellt, dass die GC/MS-Resultate alle ggf. immunologisch darstellbaren Barbituratrückstände vollständig erfassten. Die Genauigkeit für ein positives oder negatives Ergebnis wird mit den Begriffen Sensitivität und Spezifität angegeben. Hierzu stellt man die Ergebnisse des Referenzverfahrens den Ergebnissen des immunologischen Tests gegenüber. Unter Sensitivität versteht man den Prozentsatz richtiger positiver Ergebnisse des Testverfahrens bei Vorliegen der Drogeneinnahme (gesicherter Nachweis mit der Referenzmethode). Unter Spezifität eines solchen Verfahrens versteht man den Prozentsatz von richtigen negativen Ergebnissen, die man bei Nichtvorliegen der entsprechenden Drogeneinnahme erhält. 27. LITERATUR Aus der wissenschaftlichen Originalliteratur zusammengetragene Information über Einzelstoffe können Sie nachlesen, z.b. in: Clarke s Analysis of Drugs and Poisons - in pharmaceuticals, body fluids and post mortem material. Third edition. Eds.: A.C. Moffat, M.D. Osselton, B. Widdop, L.Y. Galichet. Pharmaceutical Press, London, 2004 Weitere Literaturbezüge und Einzelheiten zur Verwendung und Definition von Cut-Offs oder Weiterführendes zu Frage der Leistungsdaten entnehmen Sie bitte unserer Medizinisch- Wissenschaftliche Dokumentation.