UNIVERSITÄT LEIPZIG. Fakultät für Biowissenschaften, Pharmazie und Psychologie. Diplomarbeit. Bilanzierung der photosynthetischen Elektronenflüsse

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1 UNIVERSITÄT LEIPZIG Fakultät für Biowissenschaften, Pharmazie und Psychologie Diplomarbeit Bilanzierung der photosynthetischen Elektronenflüsse in Phaeodactylum tricornutum in Abhängigkeit von der Lichtintensität. Vorgelegt von Jörg Toepel Geb. am 11. April 1974 in Leipzig Student im Diplomstudiengang Biologie Leipzig, Oktober 2000

2 Die vorliegende Arbeit wurde im Zeitraum vom bis zum am Institut für Botanik/AG Pflanzenphysiologie der Fakultät Biowissenschaften, Pharmazie und Psychologie unter Anleitung von Prof. Dr. Christian Wilhelm angefertigt. ii

3 Danksagung Hiermit danke ich Herrn Professor Doktor Christian Wilhelm für die interessante Aufgabenstellung, für die Bereitstellung des Labors und für die Unterstützung beim Gelingen der Arbeit. Außerdem danke ich Ihm für die große Bereitschaft zur Diskussion der Ergebnisse. Ich danke der Arbeitsgruppe des Prof. Wilde (Chemisches Institut der Universität Leipzig) für die Durchführung der Verbrennungsanalyse meiner Proben, besonderen Dank gilt Herrn Wünsche. Weiterhin danke ich Herrn Diplom-Biologen Andre Domin für die tatkräftige Unterstützung während des gesamten Arbeit und für die Einführung in die Geheimnisse der PAM-Fluorometrie. Ich danke dem der gesamten Arbeitsgruppe für die geleistete Hilfe und die nette Arbeitsatmosphäre, besonderen Dank gilt Ruth Frommolt und Reimund Goss. Ich bedanke mich bei Manon Grube unter anderem für die Unterstützung bei der statistischen Auswertung der Ergebnisse Ich danke meiner Familie für die Unterstützung im gesamten Studium. Der größte Dank geht an meine Tochter Tamara, die mich mit großer Beharrlichkeit von der Arbeit abgehalten hat. iii

4 INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG EINFÜHRUNG AUFBAU UND WIRKUNGSWEISE DES PHOTOSYNTHESEAPPARATES Elektronentransportkette und Wasserspaltung ATP-Synthese Kohlenstoffassimilation ASSIMILATION DER NÄHRELEMENTE Nitratassimilation Sulfatassimilation Phosphataufnahme und Assimilation DER PHOTOSYNTHETISCHE QUOTIENT STOFFWECHSELÄNDERUNGEN IN ABHÄNGIGKEIT VON STARKEN LICHTINTENSITÄTEN Photorespiration Photoinhibition BESTIMMUNG DER PRIMÄRPRODUKTION UND DER ELEKTRONENBILANZ Mikrooptoden und Xe-PAM-Fluorometrie Bestimmung der Biomasseproduktion IR-Spekroskopie...22 ZIEL MATERIAL UND METHODEN ALGEN UND ANZUCHTSBEDINGUNGEN Algenmaterial Anzucht Nährmedium BEZUGSGRÖßEN Chlorophyllgehalt Absorptionspektrum Excitationsspektrum Photosynthetic Light Dispensation System (PLD-System) Bestimmung der Lichtintensitäten MESSUNG DER PRIMÄRPRODUKTION Versuchsaufbau für Vergleichsmessung Clark-Elektrode Sauerstoffmessung mit Mikrooptoden PAM-Fluorometrie Modellierung der Lichtsättigungskurven VERGLEICH DER BIOMASSEPRODUKTION MIT DER PRIMÄRPRODUKTION Bestimmung der Primärproduktion...42 iv

5 2.3.2 Trockengewichtsbestimmung Verbrennungsanalyse IR-Spekrometrie ERGEBNISSE XE-PAM-FLUOROMETRIE, MIKROOPTODEN UND CLARK-ELEKTRODE IM VERGLEICH DER PHOTOSYNTHETISCHE QUOTIENT IN ABHÄNGIGKEIT VON DER LICHTINTENSITÄT EFFEKT DER LICHTINTENSITÄT AUF DAS C:N ASSIMILATIONSVERHÄLTNIS ABHÄNGIGKEIT DER SAUERSTOFFPRODUKTION VON DER TROCKENGEWICHTSPRODUKTION BILANZIERUNG DER ELEKTRONENFLÜSSE TROCKENGEWICHTSPRODUKTION IN ABHÄNGIGKEIT VON DER LICHTINTENSITÄT PROTEINBERECHNUNG IR-SPEKTROSKOPIE DISKUSSION OPTODENMESSUNG, XE-PAM-FLUOROMETRIE UND CLARK-ELEKTRODE IM VERGLEICH BILANZIERUNG DER ELEKTRONENFLÜSSE DER PQ IN ABHÄNGIGKEIT VON DER LICHTINTENSITÄT ABHÄNGIGKEIT DER N-ASSIMILATION VON DER LICHTINTENSITÄT...84 Zusammensetzung von Phytoplanktonalgen ABHÄNGIGKEIT DER C-ASSIMILATION VON DER N-ASSIMILATION PROTEINBESTIMMUNG...93 Sauerstoffproduktion in Abhängigkeit von der Trockengewichtszunahme IR-SPEKTROSKOPIE...97 ZUSAMMENFASSUNG...99 AUSBLICK ANHANG... I LITERATURVERZEICHNIS... I ABBILDUNGSVERZEICHNIS...VIII ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS... IX ERKLÄRUNG... X v

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7 1 Einleitung 1.1 Einführung Die Untersuchung der Photosyntheseleistung bei Pflanzen gliedert sich in verschiedene Fragestellungen. Dabei geht es zum Einem um den Mechanismus der Energiegewinnung, oder es steht die Frage der Effizienz der Photosynthese im Mittelpunkt der Betrachtung. Das Hauptaugenmerk liegt dabei in der Bestimmung der Produktivität der Ökosysteme. Da diese in der Regel recht komplex aufgebaut sind, werden einfache Modellsysteme zur Untersuchung herangezogen. In dieser Arbeit wurde daher Phaeodactylum tricornutum als Repräsentant aquatischer Primärproduzenten unter Laborbedingungen untersucht. Phaeodactylum tricornutum ist ein gut geeigneter Modellorganismus, da die Diatomeen einen großen Anteil am natürlich vorkommenden Phytoplankton stellen. Die Produktivität terrestrischer Ökosysteme unterscheidet sich erheblich von der aquatischer. Während sich terrestrische Ökosysteme dadurch auszeichnen, dass eine große Menge an organischem Material in Form von unproduktiver Biomasse (Leit-, Stützgewebe) vorhanden ist, unterliegen aquatische Systeme oft einem hohen turn-over. Das Phytoplankton spielt in diesem Zusammenhang eine entscheidende Rolle als Anfangsglied verschiedener Nahrungsketten. Im Zuge der Industrialisierung kam und kommt es zu einer Erhöhung des Kohlendioxidgehaltes der Luft und des Wassers. Phytoplanktonalgen können eine Minderung dieses Effektes bewirken, indem sie den Kohlenstoff assimilieren und nach Absinken auf dem Meeresgrund diesen Kohlenstoff für geologische Zeiträume aus dem Stoffkreislauf entfernen (Raven J.A., 1997). Mit Phaeodactylum tricornutum, einer marinen Diatomee, wurde versucht, die Effektivität der Photosynthese und die Aktivität der Stoffwechselreaktionen, hauptsächlich der Nährstoffassimilationsreaktionen, unter verschiedenen Lichtintensitäten zu bestimmen. Die Primärproduktion der Photosynthese unter verschiedenen Lichtintensitäten wurde über Sauerstoff-und Fluoreszenzmessungen bestimmt und die unterschiedlichen Meßergebnisse miteinander verglichen. Weiterhin wurde die Assimilation der Nährelemente (C, N und S) dokumentiert und die sich daraus ergebenden Verschiebungen in der Makromolekülzusammensetzung bestimmt. 1

8 Aufbau und Wirkungsweise des Photosyntheseapparates Im Zuge der Photosynthese erfolgt ein Aufbau organischer Substanz aus anorganischen Elementen. Die in der Elektronentransportkette gebildeten Reduktions- und Energieäquivalente stellen dabei die Grundlage der Biosynthese der Makromoleküle dar. Für den Aufbau der Makromoleküle werden verschiedene Nährelemente benötigt, die durch die Pflanze aufgenommen und in eine für den Einbau geeignete Form gebracht werden müssen. Die Reduktion der Nährelemente C, N und S geschieht unter Elektronenverbrauch. Da die Synthese von Kohlenhydraten, Proteinen und Lipiden (als Hauptkomponenten organischer Substanz) kompliziert, und aufgrund der Heterogenität der Stoffgruppen sehr unterschiedlich ist, wurde versucht zu bilanzieren, wieviele aus der Wasserspaltung gewonnenen Elektronen für die neu gebildete Biomasse verbraucht werden. Im Folgenden wird kurz der Aufbau und die Wirkungsweise des Photosyntheseapparates, die Assimilation der Nährelemente und die Bilanzierung der Elektronenflüsse erläutert. 1.2 Aufbau und Wirkungsweise des Photosyntheseapparates Elektronentransportkette und Wasserspaltung In der Photosyntheseforschung kann die produzierte Menge an Sauerstoff als Maß für die Energiegewinnung dienen. Die Sauerstofffreisetzung findet am Water Oxidizing Complex (WOC) (Abb. 1.1) statt, einem integralen Bestandteil von PS II. In diesem Komplex läuft der, nach seinem Entdecker benannte Kok-Zyklus ab. Dabei wird Wasser nach der Grundgleichung 2 H 2 O O 2 + 4H + + 4e - gespalten. Die Sauerstofffreisetzung findet dabei erst nach Speicherung von 4 Oxidationsäquivalenten im WOC statt, dabei werden wahrscheinlich 5 Redoxzustände durchlaufen, die mit S 0 -S 4 bezeichnet werden. Protonen dagegen werden kontinuierlich und unabhängig von der Sauerstoffproduktion in 4 Teilschritten ins Innere des Thylakoidlumen abgegeben. Sie tragen zur Errichtung des für die ATP-Synthese benötigten Protonengradient bei. Als zentrale Liganden wirken 4 Manganatome, welche im Zuge der Wasserspaltung oxidiert werden. 2

9 Einleitung Diplomarbeit Jörg Toepel Abb. 1.1 Wasserspaltender Apparat des PSII aus Trebst (1999) Wahrscheinlich kommt es zur Bindung des H 2 O-Moleküls im S 1 -Zustand. Die Übergänge von S 0 nach S 1 und von S 1 nach S 2 sind möglicherweise metallzentrierte Übergänge. Es wird postuliert, dass in der ersten Reaktion Mn(II) zu Mn(III) oxidiert wird, und in der zweiten Reaktion Mn(III) zu Mn(IV). Ob es noch zu einer weiteren Oxidation kommt, ist noch nicht geklärt aber wahrscheinlich. Die Reaktionskette am WOC wird durch das stark oxidierende Kationenradikal P680 + angetrieben. Die Übertragung der Elektronen auf das P680 + erfolgt sehr wahrscheinlich über den Phenolring eines Tyrosins (Y z ) des D 1 -Proteins (Trebst,1999). Im P680 wird nach Anregung durch ein Lichtquant ein Exciton gebildet. Dieses Exciton bewirkt eine Anhebung des Chlorophyll-Dimers des Reaktionszentrums II (P680) auf ein höheres Energieniveau. Das entstandene P680 * überträgt ein Elektron auf den primären Akzeptor Phaeophytin und wird dadurch zu P Zur Stabilisierung der primären Ladungstrennung erfolgt ein schneller Elektronentransfer über das Phaeophytin auf das Plastochinon Q A, welches zum Semichinon reduziert wird. Dieses Semichinon seinerseits reduziert Q B. Nach zweimaliger Reduktion und Aufnahme von 2 H + aus dem Chloroplastenstroma liegt als erster stabiler Akzeptor das Plastohydrochinon vor. Die 3

10 Aufbau und Wirkungsweise des Photosyntheseapparates entstandene Elektronenlücke des oxidierten P680 + wird wie oben beschrieben durch den WOC aufgefüllt (Trebst A., 1999). Das Plastohydrochinon überträgt die Elektronen auf den Cytochrom b 6 /f Komplex, von dort gelangen sie zum an der Innenseite der Thylakoidmembran beweglichen Plastocyanin (Cytochrom C bei Phaeodactylum tricornutum). Dabei kommt es zu einem vektoriellen Transport von Protonen über die Thylakoidmembran. Da Plastocyanin nur ein Elektron aufnehmen kann, ist ein Wechsel von einem Zwei- auf einen Ein- Elektronentransport notwendig. Dabei wird ein Elektron des Plastohydrochinons über das Eisen-Schwefel-Zentrum des Rieske Proteins auf Plastocyanin übertragen. Im sogenannten Q-Zyklus gelangt das zweite Elektron über eine Häm-Gruppe des Cytochrom b 6 auf ein zweites Plastochinon- Molekül. Das entstandene Plastohydrochinon kann dann wieder an der ersten Andockstelle oxidiert werden. Dabei kommt es zu einem zusätzlichen Protonentransport über die Thylakoidmembran, der eine weitere Erhöhung der H + - Konzentration im Thylakoidlumen bewirkt. Das Plastocyanin wiederum deckt den Elektronenbedarf des PS I, dabei wird die Elektronenlücke des P700 + geschlossen, das ein Elektron an den primären Akzeptor A 0 weitergegeben hat. In der Elektronentransportkette erfolgt daraufhin die Reduktion eines Naphthochinons, welches nun seinerseits ein Eisen-Schwefel-Zentrum reduziert. Über zwei weitere Fe 4 S 4 -Zentren erfolgt die Reduktion des beweglichen Ferredoxins, welches letztlich NADP + reduziert (Abb. 1.2). Abb. 1.2 Photosynthetische Elektronentransportkette aus Trebst (1999). 4

11 Einleitung Diplomarbeit Jörg Toepel Es kann aber auch ein anderer Weg eingeschlagen werden, indem das Ferredoxin sein Elektron im zyklischen Elektronentransport auf den Cytochrom b 6 /f Komplex überträgt. Daraus resultierend kommt es zu einer Reduktion eines Plastochinons auf der Stromaseite der Thylakoidmembran, welches wieder am Cytochrom auf der Lumenseite der Thylakoidmembran oxidiert werden kann. Aufgrund des zusätzlichen Protonentransportes erfolgt eine verstärkte Bildung des ph-gradienten, welcher dann zur ATP-Synthese genutzt wird, da in der Dunkelreaktion mehr ATP als NADPH+H + benötigt wird, kann auf diesem Weg der zusätzliche Bedarf an ATP gedeckt werden. Das reduzierte NADPH+H + wird im Zuge der Kohlendioxidfixierung wieder oxidiert und steht erneut als Elektronenakzeptor in der Elektronentransportkette zur Verfügung. Unklar ist, ob der zyklische Elektronentransport in vito durchgeführt wird. Durch Ferredoxin können aber auch auf Sauerstoff Elektronen übertragen werden. Dabei kommt es zu einer Wasserstoffperoxidbildung. Das entstehende H 2 O 2, da es ein sehr reaktives Oxidationsmittel ist, muß dann durch die Ascorbat- Peroxidase abgebaut werden. Dieser pseudozyklische Elektronentransport (Mehler-Reaktion) tritt vor allem bei hohen Lichtintensitäten und den damit verbundenen hohen Sauerstoffkonzentrationen auf, wenn das entstehende Ferredoxin nicht schnell genug durch Ferredoxin-NADP + -Oxidoreduktase oxidiert werden kann (Asada, 1987; Trebst, 1999; Taiz, 2000) ATP-Synthese Die ATP-Synthetase bildet aus ADP durch Phosphorylierung ATP. Der im Zuge des Elektronentransports gebildete Protonengradient dient in diesem Zusammenhang als treibende Kraft. Die Protonen entstehen durch die Wasserspaltung am PS II, zusätzlich werden über das Plastohydrochinon Protonen von der Thylakoidmembranaußenseite auf die Innenseite transportiert. Im Zuge des linearen Elektronentransport kommt es bei dem Wechsel vom Zweizum Ein-Elektronentransport im Cytochrom b 6 /f Komplex zu einem weiteren Protonen-transport. Insgesamt werden pro Wassermolekül 4 Protonen über die Thylakoidmembran transloziert. Im Zuge der NADP + Reduktion erfolgt zusätzlich ein Protonenverbrauch auf der Thylakoidaußenseite (Schopfer P. and Brennicke A., 1999). 5

12 Aufbau und Wirkungsweise des Photosyntheseapparates Die ATP-Synthetase besteht aus einem hydrophoben Intermembranelement (F 0 ) und einem hydrophilen Teil (F 1 ), der die eigentliche Reaktion katalysiert. Dieser Protein-Komplex besteht aus den Proteinuntereinheiten α 3,β 3,γ,δ,ε. In dem beweglichen Kopfteil kommt es in einem der 3 taschenförmigen Reaktionsräume zur Anlagerung von ADP und P i. Es wird dabei angenommen, dass die protonenmotorische Kraft für die Bindung von ADP und P i und die Abspaltung des gebildeten ATP verantwortlich ist, während die eigentliche Reaktion spontan abläuft. Der energieaufwendigste Schritt ist Abspaltung und die Austreibung des gebildeten ATPs in die wässrige Phase. Dabei wird eine Rotation der γ-untereinheit zur α 3 β 3 Untereinheit postuliert. Die Bindungstaschen verändern dadurch ihre Eigenschaften (Binding-Change-Hypothese). Der Protonenfluß bewirkt diese Konformationsänderung. Dabei werden pro gebildeten ATP 4 Protonen über die Membran transportiert (Junge W., 1999) Kohlenstoffassimilation Die Kohlenstoffassimilation findet in der Dunkelreaktion der Photosynthese statt. Diese läßt sich in 3 Teilschritte unterteilen: 1. Carboxylierung, 2. Reduktion und 3. Regeneration. Die Carboxylierung erfolgt durch die Ribulose-1,5- bisphosphat-carboxylase/oxygenase (RUBISCO). Dabei wird Kohlendioxid mittels der RUBISCO auf Ribulose-1,5-bisphosphat übertragen (Carboxylierung). Es entstehen als erste Zwischenprodukte 2 Moleküle 3-Phosphoglycerat, welche unter ATP-Spaltung durch die 3-Phosphoglycerat-Kinase zu 1,3 Biphosphoglycerat umgewandelt werden. Dann erfolgt eine NADPH+H + abhängige Reduktion durch die Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase zu Glycerinaldehyd-3-phosphat. Die nächsten Schritte des Calvin-Zyklus dienen einerseits dem Aufbau der Kohlenhydrate und andererseits der Regeneration des primären Kohlendioxidakzeptors Ribulose-1,5-bisphosphat. Glycerinaldehyd-3-phoshat steht mit Dihydroxyacetonphosphat (als Triosephosphate bezeichnet) im Gleichgewicht; durch eine Aldolase kommt es zur Synthese eines Moleküls Fruktose-1,6-bisphosphat. Fruktose-1,6-bisphosphat kann jetzt einerseits zu Glukose-6-phosphat umgewandelt werden und in der Stärkesynthese eingesetzt werden, oder über eine komplexe Reaktionskette mit 3 Triosephosphaten der Regenerierung des primären Akzeptors dienen. Das Hauptprodukt der Kohlen- 6

13 Einleitung Diplomarbeit Jörg Toepel hydratsynthese stellt Stärke dar. Die Synthese findet im Chloroplasten statt, ein Export der Kohlenhydrate erfolgt über den Phosphat-Translokator, der Triosephosphat und Phosphat im Antiport austauscht. Dieser Translokator stellt eine wichtige Regulationseinheit dar. Je nach Konzentration von Phosphat im Cytosol kommt es zu einem Export der Kohlenhydrate oder zu einer Akkumulation von Stärke im Chloroplasten (Taiz, 2000). Phaeodactylum tricornutum als Vertreter der Heterokontophyta speichert Kohlenhydrate in Form von Chrysolaminarin, ein β-1,3-glucan (v.d.hoek, 1993). Die Nettobilanz des Calvin-Zyklus lautet. 6 CO H 2 O + 12 NADPH ATP Fruktose-6-phosphat + 12 NADP + +6 H ADP + 17 P i Es werden also für die Produktion einer Hexose 24 Elektronen benötigt, wofür theoretisch 48 Photonen photochemische Arbeit verrichten müssen. Die dadurch bedingte Wasserspaltung liefert 6 Moleküle Sauerstoff, die aus der Spaltung von 12 Molekülen H 2 O stammen. Daraus können nur 48 Protonen gewonnen werden, welche zur Bildung von 12 ATP führen. In der Lichtreaktion werden in etwa die gleichen Mengen an ATP und NADPH+H + produziert. Für die Bildung eines Mol Glucose ist aber ein Mehraufwand von 6 Mol ATP nötig, diese Differenz könnte durch den zyklischen Elektronentransport gedeckt werden. Im Zuge anderer Stoffwechselreaktionen kommt es zusätzlich zu einem Mehrverbrauch an NADPH+H +, wodurch das interne ATP/ NADPH+H + -Verhältnis reguliert werden kann. Die Reduktion der Nährelemente stellt in diesem Zusammenhang die Hauptsenke des NADPH+H + - Verbrauchs dar (Schopfer P. and Brennicke A., 1999). (1) 7

14 Assimilation der Nährelemente 1.3 Assimilation der Nährelemente Nitratassimilation Stickstoff kann in der Natur in unterschiedlichen Reduktionsformen vorliegen, die thermodynamisch stabilste Form stellt dabei das Nitrat dar. In der Pflanzenzelle liegt Stickstoff in gebundener Form hauptsächlich als Aminogruppe vor. Dafür muß das aufgenommene Nitrat reduziert werden. Die Aufnahme und Verwertung des Luftstickstoffes ist nur prokaryotischen Organismen möglich (u.a. Cyanobakterien). Durch aktiven Transport unter ATP-Verbrauch erfolgt die Aufnahme des Nitrats in die Pflanzenzelle. Die eigentliche Reduktion vollzieht sich über mehrere Teilschritte (Abb. 1.3), wobei zuerst Nitrit entsteht. Katalysiert wird diese Reaktion durch die Nitratreduktase welche im Cytosol lokalisiert ist. Diese Reaktion verbraucht 1 NADPH+H + oder 2 Elektronen. Die weitere Reduktion findet im Chloroplasten statt, dabei reduziert die Nitritreduktase Nitrit zu Ammonium. Die Reduktion des Nitrits kostet 6 Elektronen, welche durch Ferredoxin übertragen werden (Bothe H., 1999). Abb. 1.3 Nitratreduktionssystem aus Bothe (1999) 8

15 Einleitung Diplomarbeit Jörg Toepel Durch die Glutaminsynthetase (GS) erfolgt der Einbau von Ammonium in die Aminosäuren. Dabei wird das gebildete Ammonium auf Glutamat übertragen. Die Reaktion erfordert die Hydrolyse von einem ATP und die Beteiligung eines divalenten Kations (Taiz L. and Zeiger E., 2000). Das entstehende Glutamin wird dann mittels der Glutamat-Oxoglutarat-Aminotransferase (GOGAT) und einem Molekül 2-Oxo-glutarat zu zwei Molekülen Glutamat umgewandelt. Dieses Reaktion kostet zwei weitere Elektronen, die durch Ferredoxin bereitgestellt werden, so dass für die Reduktion eines N 10 Elektronen benötigt werden. Die Regulation der C-und N-Assimilation erfolgt zum einem durch Beeinflussung auf der Ebene der Transkription, zum anderen durch CO 2 und NO 3 direkt. So wirkt Nitrat auf die Phosphoenolpyruvatcarboxylase, einem Schlüsselenzym für die Bereitstellung von 2-Oxoglutarat, durch Förderung der Phosphorylierung aktivierend. CO 2 -Mangel bewirkt eine verminderte Aktivität der Nitratreduktase bei gleichzeitiger Senkung der Photosyntheseaktivität (Schopfer und Brennicke, 1999) Sulfatassimilation Schwefel wird hauptsächlich als Sulfat aufgenommen und auf die Stufe des Sulfids reduziert. Diese Reaktion benötigt 8 Elektronen, welche vom Ferredoxin oder NADPH+H + stammen können. Da Sulfat nicht direkt reduziert werden kann, wird es zuerst unter ATP-Verbrauch zu Adenosin-5 -phosphosulfat (APS) und zu 3 -Phosphoadenosin-5 -phosphosulfat (PAPS) aktiviert. Die Reduktion, welche wie die Aktivierung im Chloroplasten abläuft, wird durch die PAPS-Reduktase katalysiert. Das Reduktionsmittel ist Thioredoxin, welches selbst über Ferredoxin oder NADPH+H + reduziert wird. Dabei wird PAPS zu Sulfit reduziert. Die weitere Reduktion erfolgt über die Sulfitreduktase unter einem 6 Elektronenübergang zu Sulfid (Bothe H., 1999). Der Einbau in die Aminosäuren erfolgt über die O- Acetylserin(thio)lyase, die O-Acetylserin unter Acetatabspaltung zu Cystein umsetzt. Cystein stellt den Ausgangspunkt der Methioninsynthese dar. Allerdings ist die assimilierte Schwefelmenge recht gering; nur etwa 1% der produzierten Elektronen werden für die Sulfatassimilation genutzt (Falkowski, 1997). 9

16 Assimilation der Nährelemente Phosphataufnahme und Assimilation Als weiterer Nährstoff ist Phosphor zu nennen, der in anorganischer Form hauptsächlich als Phosphat vorkommt. Niedrige [P] führen in limnischen Systemen zu einer Limitierung des Wachstums, im Gegensatz zu marinen Systemen, die meist N- und Fe limitiert sind (Wilhelm, 1999). Phosphat kann in der Zelle direkt in organische Verbindungen eingebaut werden, zum Beispiel über die ATP- Synthese. Im Cytosol erfolgt der Einbau über die Substratkettenphosphorylierung in der Glycolyse. Nachdem Phosphat in ATP eingebaut ist, kann es über vielfältige Reaktionen in den Zellstoffwechsel einfließen. Dabei entstehen die phosphorylierten Verbindungen, die eine große Rolle in der Regulation der Stoffwechselprozesse spielen (Taiz, 2000). Die Aufnahme von Phosphat geschieht aktiv. Dabei kommt es in vielen Algen zu einer internen Akkumulation von Phosphat, welches erst sukzessive in organisches Material eingebaut wird. In der Zelle liegt Phosphat allerdings nicht frei sondern in Form von Polyphosphaten gebunden vor. Eine Limitierung durch Phosphat äußert sich daher erst, wenn der interne Pool an Phosphat aufgebraucht ist. Dieses Phänomen läßt sich gut an der Jahresdynamik von limnischen Gewässern ablesen (Kohl, 1988). Die Akkumulation von Phosphat geschieht außerordentlich schnell und effektiv; die Energie wird durch die Photosynthese oder Respiration bereitgestellt. Die Aufnahme von Phosphat wird durch einen CO 2 -Mangel begünstigt, was die Konkurrenz der beiden Stoffwechselreaktionen um die Energie der Photosynthese verdeutlicht. Im Zuge einer P-Limitierung kommt es wahrscheinlich zu einer Vergrößerung der Anzahl der Aufnahmesysteme in der Zellwand, um die niedrigen Ionenkonzentrationen nutzen zu können (Kohl, 1988). Licht bewirkt im Allgemeinen eine verstärkte Phosphataufnahme, die zu einer Akkumulation des Phosphats in Form von Polyphosphaten, Zuckerphosphaten und der rrna führt. Die Speicherung als RNA stellt eine direkte Verbindung zur Proteinsynthese her. Durch eine P-Limitierung kommt es zu einer verstärkten Bildung von Kohlenhydraten auf Kosten der Proteinsynthese. Auch die Funktion des Phosphat-Translokator im Chloroplasten wird durch Phosphatmangel eingeschränkt. Unter Mangelbedingungen erfolgt nur begrenzt 10

17 Einleitung Diplomarbeit Jörg Toepel ein Export der Triosephosphate, was zu einer Akkumulation von Stärke im Chloroplasten führt (Kohl, 1988). Die Kosten für die Assimilation des Phosphats sollten aufgrund der geringen zellinternen Phosphatkonzentrationen vernachlässigbar klein sein. 1.4 Der Photosynthetische Quotient Die allgemeine Photosynthesegleichung lautet, 6 CO H 2 O C 6 H 12 O O H 2 0 dabei wird deutlich, das pro freigesetzten Sauerstoff ein Kohlenstoffmolekül fixiert wurde. Diese Bilanz wird in der Praxis mit dem Photosynthetischen Quotienten (PQ), d.h. dem Quotient aus mol freigesetzten Sauerstoff und mol fixiertem Kohlendioxid, ausgedrückt (Falkowski and Raven J.A., 1997). Für die Grundgleichung der Photosynthese ist er gleich 1. Die praktische Bestimmung dieses Quotienten lieferte sehr unterschiedliche Ergebnisse. Die ermittelten Werte zeigen eine große Varianz. (Bender M. et al., 1987) ermittelten Werte um 1 für Planktonalgen, (Carignan R. et al., 2000) einen Wert von 1,25 mit 20%iger Varianz, und (Falkowski et al., 1985) einen Wert von 1,25-1,5. Raine (1983) ermittelte Werte für Phytoplankton-populationen von 2,25. Dies ist durch die unterschiedliche Assimilation der Nährelemente und der damit verbundenen Makromolekül-Synthese erklärbar. Außerdem weisen die O 2 - CO 2 Meßmethoden eine Fehlergröße auf. In der Grundgleichung der Photosynthese wird nur die Synthese der Kohlenhydrate dokumentiert. Die Synthese der anderen Makromoleküle erfolgt unter einem erheblichen Mehraufwand an Energie. Werden von einer Pflanze vermehrt Proteine und Lipide gebildet, verändert sich das Verhältnis zwischen Sauerstofffreisetzung und Kohlenstoffixierung. Es ist daher möglich, durch die Bestimmung des PQ, Aussagen über die Synthese der Makromoleküle zu treffen. Die Veränderungen des PQ sind zum einen auf den unterschiedlichen Reduktionsgrad des Kohlenstoffs zurückzuführen, zum anderen auf den zusätzlichen Einbau von S und N in die Makromoleküle. Proteine zeichnen sich durch einen hohen (2) 11

18 Der Photosynthetische Quotient Gehalt an N aus, die Synthese von Proteinen ist somit mit der Reduktion des Nitrats gekoppelt (Cuhel et al., 1984). Wie bereits beschrieben (1.3.1) werden dafür 10 Elektronen pro N Atom benötigt. Die hierfür benötigten Elektronen können nicht in die Kohlenstoffixierung einfließen. Aus diesem Grund sinkt die Menge an Kohlenstoff pro freigesetztem Sauerstoffmolekül. Der PQ steigt in diesem Fall an (Williams, 1991). Phaeodactylum ist fähig, wie andere Organismen auch, Ammonium direkt zu assimilieren. dadurch wird der Elektronenverbrauch vermindert, was sich in einer Verkleinerung des Photosynthetischen Quotienten (PQ) darstellt (Bothe H., 1999), da keine Elektronen für die Reduktion des Nitrats verwendet werden müssen. Die Synthese der Aminosäuren erfolgt im Chloroplasten der Pflanzenzellen, zusätzlich werden Kohlenstoffgerüste über den Citrat-Zyklus bereitgestellt. Die Synthese der einzelnen Aminosäuren erfordert eine große Menge an ATP und Elektronen, die durch NADPH+H + bereitgestellt werden. Die Proteinsynthese wird von Phytoplanktonalgen vorwiegend in der Dunkelphase durchgeführt (Cuhel R.L. et al., 1984). Die Synthese der Proteine erfolgt dabei auf Kosten der Assimilationsstärke (Holdsworth E.S. and Colbeck J., 1976). Die Biosynthese der Fettsäuren erfolgt im Chloroplasten und Cytosol. Dabei werden in einer Reaktionskette aus Acetyl-CoA Fettsäuren gebildet, die Reaktionsgleichung für die Synthese von Palmiat lautet wie folgt: Acetyl CoA + 7MalonylCoA + 14NADPH + H + Palmiat + 7CO 2 + NADP + 8CoA + 6H Es wird ersichtlich, dass große Mengen an Elektronen in die Fettsäurebiosynthese fließen. Die Aktivierung von Acetat und Malonat erfordert eine zusätzliche ATP-Spaltung. Die Lipidsynthese erfolgt deshalb nur dann, wenn eine ausreichende Energie- und Elektronenversorgung gewährleistet ist. Der PQ würde aufgrund des hohen Bedarfs an Reduktionsäquivalenten im Gegensatz zur Kohlenhydratproduktion ansteigen. Die Synthese der Makromoleküle hängt im entscheidenden Maße von Umweltfaktoren wie Licht, [CO 2 ], Nährstoffe usw. ab. In dieser Arbeit wurde die 2 + O (3) 12

19 Einleitung Diplomarbeit Jörg Toepel Lichtintensität als entscheidender Faktor im Hinblick auf die Elektronenbilanz und Makromolekül- Produktion untersucht. 1.5 Stoffwechseländerungen in Abhängigkeit von starken Lichtintensitäten Photorespiration Die physiologische Funktion der Sauerstoffübertragung des Enzyms RUBISCO auf Ribulose-1,5-bisphosphat wird kontrovers diskutiert. Oxygenierung und Carboxylierung sind Konkurrenzreaktionen, deren prozentuale Verteilung an der Gesamtreaktion von den Konzentrationen der Reaktionspartner abhängen. Die Photorespiration wird unter hohen Sauerstoffpartialdrücken und niedrigen Kohlendioxidkonzentrationen begünstigt. Diese Konstellation kann bei hohen Photosyntheseraten unter hohen Lichtintensitäten auftreten. Die zyklische Reaktionskette, die mit einer Oxygenierungsreaktion von Ribulose-1,5-bisphosphat mit Sauerstoff beginnt, findet in drei Zellkompartimenten statt und endet mit einer Regeneration von Ribulose-1,5-bisphosphat. Erste Intermediate sind Phosphoglycolat und 3-Phosphoglycerat. Während letzteres in den Calvin-Zyklus eingeht, kommt es zu einer Phosphatabspaltung vom Phosphoglycolat. Das entstehende Glycolat wird in den Peroxisomen unter Wasserstoffperoxidbildung zu Glyoxylat oxidiert. Weiterhin erfolgt eine Aminierung zu Glycin, welches in den Mitochondrien zu Serin umgebaut wird. Dabei kommt es zu einer CO 2 -Freisetzung. Das entstandene Serin kann in die Proteinsynthese einfließen oder über die Gluconeogenese wieder in den Zuckerstoffwechsel eingeschleust werden. Durch die Photorespiration kommt es zu einer Einbuße von bis zu einem 1/3 der Energieausbeute der Photosynthese (Tolbert N.E., 1997). Wie Versuche mit künstlichem Sauerstoffentzug gezeigt haben, können die Verluste durch Verschiebung des CO 2 / O 2 Verhältnisses zugunsten des Kohlendioxids erheblich gemindert werden. Pflanzen haben im Laufe der Evolution einige Strategien entwickelt, mit deren Hilfe sie die Oxidase-Funktion der RUBISCO unterdrücken können, wie zum Beispiel den C 4 -und CAM-Stoffwechsel. Da diese Arbeit mit Phaeodactylum tricornutum durchgeführt wurde, folgen hier einige Betrachtungen zum Thema Anpassungen bei algalen Zellen. Phaeodactylum tricornutum ist in der Lage 13

20 Stoffwechseländerungen in Abhängigkeit von starken Lichtintensitäten Kohlendioxid in der Zelle anzureichern, so dass eine Verschiebung des Verhältnisses zwischen Sauerstoff und Kohlendioxid erfolgt (Rotatore C. et al., 1995). Daher wird die Carboxylierung bevorzugt ablaufen. Die Kohlendioxidaufnahme erfolgt über einen aktiven Transport in die Zelle, der entgegen dem Konzentrations-und ph-gefälle verläuft. Es ist ein Na + abhängiger Transport-mechanismus, bei dem es gegenüber dem Außenmedium zu einer Anreicherung von gelösten anorganischen Kohlenstoff DIC (engl.: dissolved inorganic carbon) um das 2-3fache (Rotatore C. et al., 1995) kommt. Bicarbonat wird erst auf-genommen, wenn kein freies Kohlendioxid mehr vorhanden ist. Einige Algen besitzen eine externe Carboanhydrase (CA), welche die Umwandlung von Bicarbonat zu Kohlendioxid katalysiert. Diese Reaktion verläuft bei ph 8 (typischer ph-wert für Meerwasser) sehr langsam ab, so dass es für die Algen ein Vorteil sein kann, diese Reaktion zu beschleunigen, speziell wenn sie nur Kohlendioxid aufnehmen können. Bei Phaeodactylum ist im Gegensatz zu anderen Diatomeen keine externe Carboanhydrase (CA) zu finden, es wird ausschließlich Kohlen-dioxid aufgenommen (Colman B. and Rotatore C., 1995). Der beschriebene Zyklus der Photorespiration (C 2 -Zyklus) gilt nicht uneingeschränkt. Viele einzellige Algen wandeln das entstandene Glycolat nicht um, statt dessen erfolgt eine Exkretion in das Medium. Diese kann bis zu 100 nmol*10 6 Zellen -1 betragen, wie Untersuchungen an Dunaliella tertiolecta zeigen (Leboulanger C. et al., 1998). Dies hat zur Folge, dass der Algenzelle große Mengen an bereits organisch gebundenem Kohlenstoff verloren gehen. Die Abgabe großer C-Mengen erschwert die Quantifizierung der produzierten Biomasse und macht eindeutige Aussagen über die tatsächliche Kapazität der Photosynthese unmöglich, wenn nur der zellinterne C-Gehalt betrachtet wird. Leboulanger et al. (1998) errechneten einen 69%igen Verlust an niedermolekularem, organisch gebundenen Kohlenstoff (LMW-C). Allerdings wurde eine Aufnahme von Glycolat in der Dunkelphase festgestellt, mit gleichzeitiger Zunahme der Aminosäuren Glycin und Serin. Daher ist mit einer Refixierung des Kohlenstoffes nach Beendigung einer Starklichtphase zu rechnen. Um eine genaue Analyse der fixierten Kohlenstoffmenge zu erhalten, sollte zumindest die Menge an Glycolat im Medium bestimmt werden, da dies das Hauptexkretionsprodukt an LMW-C ist. (Kaplan and Berry J.A., 1981) beobachteten eine sinkende Glycolatexkretion mit steigender HCO 3-14

21 Einleitung Diplomarbeit Jörg Toepel Konzentration, in Verbindung mit einer gesteigerten Sauerstoff-produktion, ausgelöst durch eine verminderte Photorespiration. (Domin A., 1995) ermittelte mit der verwendeten Methodik nur geringe Anteile an Glycolatexkretion von Phaeodactylum unter Starklicht. Die Photorespiration wird heute im Allgemeinen als eine Reliktreaktion der Evolution angesehen. Die Oxygenierungsreaktion der RUBISCO hatte in ursprünglichen photosynthetischen Bakterien aufgrund der niedrigen Sauerstoffpartialdrücke der Umgebung keine Bedeutung. Mit Entwicklung der oxygenen Photosynthese und dem damit verbundenen Ansteigen des O 2 -Gehaltes der Atmosphäre geht unter heutigen Umweltbedingungen allerdings ein Großteil des organische gebundenen Kohlenstoffes wieder verloren, dies gilt vor allem bei hohen Sauerstoffpartialdrücken und einem hohen NADPH+H + /NADP + Verhältnis. Diese Bedingungen sind in besonderen Maße bei hohen Lichtintensitäten anzutreffen, die denen die Photorespiration auch in natürlichen Systemen am größten ist Photoinhibition Unter starken Lichtintensitäten kommt es zu einer Inhibition der Photosynthese und die Quantenausbeute sinkt (Kok 1956). Dieses ist oft bei Gewässerproben in der obersten Schicht der euphotischen Zone zu beobachten (Wilhelm, 1999). Unter photoinibitorischen Einflüssen kommt es zu einem erhöhten turn-over des D 1 -Proteins des PS II (Styring S. and Jegerschöld C., 1994). Dieses ist unter hohen Lichtintensitäten verstärkt toxischen Sauerstoffspezies ausgesetzt, welche eine Schädigung bewirken (Richter M. et al., 1990). Ausgelöst wird der Abbau vermutlich durch eine Konformationsänderung des D 1 -Proteins, die einer endogenen Protease den Abbau ermöglicht. Durch eine verstärkte Neusynthese kann eine Schädigung des PS II kompensiert werden (Trebst, 1999). Die anderen Komponenten des PS II werden größtenteils wiederverwendet. Weiterhin werden verschiedene Schutzmechanismen zur Entsorgung der entstehenden Sauerstoffradikale induziert. Am PS I kommt es durch Ferredoxin zu einer Bildung von Superoxid aus molekularem Sauerstoff (Mehler-Reaktion), das eine Schädigung des Reaktionszentrums bewirken kann. Das Superoxid wird mittels Superoxid- 15

22 Stoffwechseländerungen in Abhängigkeit von starken Lichtintensitäten dismutase und Ascorbat-Peroxidase entsorgt (Asada K and Takahashi M., 1987). Im Zuge der Belichtung mit hohen Lichtintensitäten kommt es zu einer Aktivierung des Xanthophyllzyklus. Diese Pigmentumwandlung überführt PS II in einen Zustand der nicht auf Energiegewinnung ausgerichtet ist, sondern einen Großteil der Anregungsenergie als Wärme wieder abstrahlt (Demming-Adams B., 1990). Die Hauptaufgabe des Xanthophyllzyklus ist wahrscheinlich eine schnelle Anpassung der Algen/höheren Pflanzen an wechselnde Lichtverhältnisse. Eine Deepoxidier-ung von Diadinoxanthin zu Diatoxanthin im DD-Zyklus der Diatomeen bedeutet unter starker Lichteinstrahlung eine Erhöhung der Lichtschutzpigmente auf Kosten der Lichtsammelpigmente. Vermutet wird zum Einen, dass Diatoxanthin vom S 1 -Zustand seine Energie nicht mehr auf Chlorophyll übertragen kann, da dieser unter dem S 1 -Zustand von Chl a liegt (Owens T.G. et al., 1992; Owens T.G., 1994; Frank H.A. and Cogdell R.J., 1993; Frank H.A. et al., 1994). Die Anregungsenergie von Chl a kann auch von Diatoxanthin übernommen und als Wärme dissipiert werden. Eine andere These vermutet eine Konformationsänderung des Lichtsammelkomplexes LHC (engl. Light Harvesting Complex) hinter der erhöhten Wärmedissipation (Horton P. et al., 1991). Dabei soll die geänderte Molekül-Konformation der deepoxidierten Xanthophylle eine Aggregation fördern. Es wird in diesem Zusammenhang auch eine thermische Schutzfunktion diskutiert, da Zeaxanthin die Fluidität der Thylakoidmembran durch seine planare Form herabsetzt (Havaux M. and Gruszecki W.I., 1993). Wichtig für diese Arbeit ist, dass eine vermutete Regenerierung des Endakzeptors NADPH+H + durch die Epoxidierungsreaktion des Xanthophyllzyklus nicht bestätigt werden konnte, da nur ein Bruchteil der produzierten NADPH+H + Moleküle auf diesem Weg entsorgt werden kann (Haber A., 1975). Aber die Neusynthese der Lichtschutzpigmente im HL benötigt erhebliche Energie- und Elektronenmengen. (Arsalane W. et al., 1994) beschreiben im Zusammenhang mit Starklichtanpassungen die lichtinduzierte Mengenver-änderung der Pigmente des Xanthophyllzyklus. Phaeodactylum zeigt bei Kultivierung unter Starklicht eine ganze Reihe von Anpassungen; hauptsächlich der Photosyntheseapparat unterliegt Veränderungen (Beardell J. and Morris I., 1976). Es kommt zu einer Verringerung der Antennengröße und der Anzahl an Antennenkomplexen pro Reaktionszentrum, da kein großer Aufwand mehr betrieben werden muß um ausreichend Photonen zu 16

23 Einleitung Diplomarbeit Jörg Toepel absorbieren. Durch die Verringerung der Antennengröße kommt es zu einer Vergrößerung des Chl a/chl c Verhältnisses. Unter Starklichtkultivierung sollte somit eine Ver-ringerung der Energiekosten für die Chlorophyllneusynthese zu erwarten sein. Die Produktion der Lichtschutzpigmente erhöht sich demgegenüber (Lohr and Wilhelm, 1999). Die Chlorophylle sind unter Starklicht verstärkt Sauerstoff-radikalen ausgesetzt, die Bindungen von Lipiden und Pigmenten angreifen (vor allem C=C-Bindungen) (Asada K and Takahashi M., 1987). Durch verschiedene Schutzmechanismen und einen hohen turn-over der Reaktionszentren lassen sich die Schadwirkungen auf die Zelle minimieren (Styring S. and Jegerschöld C., 1994). 1.6 Bestimmung der Primärproduktion und der Elektronenbilanz Die Bestimmung der Primärproduktion kann durch Messung verschiedener Parameter erfolgen. Zum einen kann sie durch die Bestimmung der freigesetzten Sauerstoffmenge erfolgen, und mit der Grundgleichung Rückschlüsse auf die produzierte Biomasse gezogen werden. Wie schon erläutert ist dies nicht trivial und je nach Bedingungsgefüge mit Fehlern behaftet. Eine Bestimmung der Biomasse mit der 14 C Methode, die eine Bilanzierung der gebildeten Biomasse darstellt, ist sehr aufwendig und oft mit einem großen Fehler behaftet (Carignan R. et al., 2000). Die Hauptfehlerquelle ist im Flascheneffekt (Verminderung der Drift, Gasabschluß u.ä.) zu sehen. Durch Trennung der einzelnen Fraktionen wird zusätzlich eine Charakterisierung der gebildeten Makromoleküle ermöglicht (Geider R.J. and Osborne B.A., 1992). Eine weitere Methode stellt die Fluoreszenz-messung dar, die die selektive Bestimmung des PS II- Elektronentransportes ermöglicht, daraus kann die Bruttobestimmung der Photosyntheserate erfolgen, allerdings ist nur im lichtlimitierten Bereich der Photosynthese eine Übereinstimmung zur Sauerstoffmessung, die eine Bestimmung des Gesamt-Gaswechsels der Zelle darstellt, nachgewiesen worden (Richter M., 1999; Geel C. et al., 1997). Die Sauerstoffmessung in dieser Arbeit wurde mit Mikrooptoden im Vergleich mit Clark-Elektrode und Fluoreszenzmessung durchgeführt. Eine Bilanzierung der Elektronenflüsse in Wachstumsversuchen ist durch eine Bestimmung der durch die Wasserspaltung freigesetzten Sauerstoffmoleküle möglich. Die produzierten Elektronen ergeben sich nach dem Z-Schema mit 4 17

24 Bestimmung der Primärproduktion und der Elektronenbilanz Elektronen pro freigesetzten O 2 -Molekül. Eine Bestimmung der verbrauchten Elektronen erfolgte in dieser Arbeit durch die Bestimmung der produzierten organischen Substanz (Trockengewichtsbestimmung) und ihrer Zusammensetzung (Verbrennungsanalyse). Die daraus ermittelten Zunahmen der Nährstoffmengen wurden nach folgendem Schema in Elektronenmengen umgerechnet. Die Menge der assimilierten N-Molmenge wurden mit 10 und die S-Molmenge mit 8 multipliziert. Zusätzlich wurde unter der Annahme, dass in organischen Molekülen die Summe aller Wertigkeiten gleich 0 ist, die assimilierte Mengen an Wasserstoff mit 1 multipliziert, um die für die Reduktion verbrauchten Elektronen zu bestimmen. Im folgenden Abschnitt erfolgt eine kurze Beschreibung der eingesetzten Meßtechniken Mikrooptoden und Xe-PAM-Fluorometrie Die Bestimmung der Photosyntheserate von Phaeodactylum tricornutum in den Wachstumsversuchen erfolgte durch Mikrooptoden. Die Standardverfahren der Photosynthese-Messung; O 2 -Messung mittels Clark-Elektrode und Xe-PAM- Fluorometrie dienten in Kurzzeitexperimenten als Referenzverfahren. In den Mikrooptoden wird zur Bestimmung der Sauerstoffkonzentration ein opto-chemisches Verfahren genutzt. Durch eine fluoreszenzlöschende Substanz, in diesem Fall Sauerstoff, wird eine Verminderung der Fluoreszenzintensität und Fluoreszenzlebenszeit eines Luminophors hervorgerufen (das Prinzip wird als dynamische Fluoreszenzlöschung bezeichnet). Die Sauerstoffabhängigkeit läßt sich mit der Stern-Vollmer Gleichung (2.2.3) charakterisieren. Diese zeigt auf, dass es sich dabei nicht um eine lineare Korrelation handelt, sondern um eine sigmoidale Abnahme, somit werden speziell bei niedrigen Sauerstoffkonzentrationen gute Meßergebnisse erzielt. Nach Erstellung einer Eichkurve lassen sich die absoluten Sauerstoffpartialdrücke bestimmen (genaues Meßprinzip siehe 2.2.3). Damit wird es in einem abgeschlossenen System möglich die Nettophotosyntheserate von Phytoplanktonalgen über einen längeren Zeitraum zu bestimmen. Gleichzeitig kann die Biomasseänderung ermittelt werden, indem das Trockengewicht vor und nach Kultivierung bestimmt wird. Durch Ermittluung der elementaren Zusammensetzung der organischen Masse von Phaeodactylum tricornutum durch eine Verbrennungsanalyse wird eine Bilanzierung der 18

25 Einleitung Diplomarbeit Jörg Toepel Elektronenflüsse möglich. Der Vorteil der Mikrooptoden liegt unter anderem darin, dass im Gegensatz zur Elektrodenmessung kein Eigenverbrauch an Sauerstoff stattfindet. Die Fluoreszenzmessung, inzwischen ein Standardverfahren in der Photosyntheseforschung, ermöglicht eine Berechnung der Elektronentransportraten (Brutto) durch Bestimmung der potentiellen Kapazität des Photosystem II. Büchel und Wilhelm (1993) beschrieben in diesem Zusammenhang die Problematik der Umsetzung des für höhere Pflanzen entwickelten Verfahrens für die Untersuchung von Mikroalgen. In vivo wird nur etwa 2-3 Prozent des absorbierten Lichtes als Fluoreszenz emittiert, diese Emission stammt zu 90% vom Photosystem II (PS II). Der Hauptteil der Lichtenergie wird zur Photosynthese genutzt oder als Wärme dissipiert (Büchel C. and Wilhelm, 1993). In einer dunkeladaptierten Probe kommt es zu einer unspezifischen Fluoreszenz F 0 (Nomenklatur siehe (van Kooten O. and Snel J.F.H, 1990)). Diese Fluoreszenz ist hauptsächlich auf die Fluoreszenzemission angeregter Chlorophyll a-moleküle im Antennensystem des PS II zurückzuführen. F 0 ist deshalb von photochemischen Vorgängen unabhängig. Die Grundfluoreszenz F 0 einer dunkeladaptierten Probe kennzeichnet den Zustand in dem alle PS II-Reaktionszentren offen sind, d. h. der erste stabile Akzeptor Q A liegt in oxidierter Form vor. Ein sättigender Lichtblitz schließt alle Reaktionszentren, indem eine vollständige Reduktion von Q A erfolgt. In diesem Zustand kann keine Weiterleitung der Elektronen von den Reaktionszentren erfolgen. Die Fluoreszenzabgabe steigt in diesem Fall auf einen Maximalwert an (F m ). Die Differenz aus maximaler und Grundfluoreszenz gibt die variable Fluoreszenz an (F v = F m F o ). F v ist ein Maß für das Elektronentransportpotential von PS II im dunkeladaptierten Zustand. Die maximale photochemische Quantenausbeute einer dunkeladaptierten Probe läßt sich anhand der Formel Φ= F v /F m (Genty B. et al., 1989) berechnen. Bei aktinischer Belichtung hingegen steigt die Anzahl der geschlossenen Reaktionszentren an. Aus diesem Grund steigt auch die Grundfluoreszenz an, welche in diesen Fall als F, oder als steady state Fluoreszenz bezeichnet wird. Die maximale Fluoreszenz, die erneut nach Zugabe eines sättigenden Lichtimpulses erreicht wird, wird F m genannt. Daraus läßt sich die aktuelle Quantenausbeute nach der Formel Φ=(F m -F)/F m ermitteln. 19

26 Bestimmung der Primärproduktion und der Elektronenbilanz Im Zuge der aktinischen Belichtung kommt es zu einer Verminderung der Fluoreszenzemission. Die Ursachen für diese Fluoreszenzlöschung können photochemischer und nicht-photochemischer Natur sein. Die photochemische Fluoreszenzlöschung (q p ) ist in erster Linier auf den Redoxzustand von Q A zurückzuführen. Die Bestimmung von q p ergibt sich aus der Differenz zwischen F m und F. Während die nicht-photochemische Fluoreszenzlöschung (q N ) durch mehrere Prozesse ausgelöst werden kann. Die high-energystate Fluoreszenzlöschung (q E ), die photoinhibitorische (q I ) und die Löschung mittels state transitions (q T ). Der Abfall von F m auf F m ist auf q N zurückzuführen. Die Bestimmung von q N erfolgt durch folgende Gleichung. q N = 1- (F m F)/(F m F 0 ) Die high-energy-state Fluoreszenzlöschung ist mit der Bildung des Protonengradienten verbunden. Im Zuge des Aufbaus kommt es zu einer Umschaltung von Fluoreszenzemission auf Wärmedissipation. Der Xanthophyllzyklus spielt in diesem Zusammenhang eine entscheidende Rolle in der Fluoreszenzlöschung. State I state II transitions führen zu einer veränderten Fluoreszenzemission der Reaktionszentren von PS I und PS II, während im ersten Zustand der Hauptteil der Fluoreszenz auf eine PS II Fluoreszenz zurückzuführen ist, kommt es durch Phosphorylierung der LHC II-Komplexe zu einer Ablösung vom PS II. Die Fluoreszenzlöschung (Quenching von F 0 ) wird durch die Übertragung der Energie auf PS I bewirkt. Aufgrund der schnellen Energieübertragung von P700 auf seine Primärakzeptoren und damit verbundenen schnellen Rückkehr des PS I Reaktionszentrums in den offenen Zustand kommt es hier nur zu einer geringen variablen Fluoreszenz (Schreiber U. and Bilger W., 1993; Schreiber U. et al., 1995). Es wird postuliert, dass eine reversible Phosphorylierung der LHC II Komplexe eine Verschiebung in den ungestapelten Bereich der Thylakoide, mit einer dadurch bedingten Antennenquerschnittsverkleinerung des PS II, verursacht (Büchel C. and Wilhelm, 1993). Der besondere Aufbau von Phaeodactylum (Thylakoide in Dreierstapeln ) läßt einen geringen Anteil dieser Löschung vermuten, bis jetzt wurden auch keine state I zu state II Transitions bei Phaeodactylum ermittelt. Auch bei höheren Pflanzen spielt diese Fluoreszenzlöschung unter normaler aktinischer Belichtung keine große Rolle. (4) 20

27 Einleitung Diplomarbeit Jörg Toepel Die photoinhibitorische Löschung resultiert aus einer photochemische Inaktivierung der Reaktionszentren, die auf ein erhöhtes turn-over des D 1 -Proteins zurückzuführen ist. F 0 steigt daraufhin an, während F 0 /F m sinkt. Vermutlich kommt es zu einer Inaktivierung von PS II- Reaktionszentren, die dann ausschließlich als Lichtfallen, unter erhöhter Wärmedissipation fungieren (Büchel C. and Wilhelm, 1993). Mit Hilfe dieser Daten und der Bestimmung der absorbierten bzw. photosynthetisch genutzten Strahlenmenge Q phar wird eine Bestimmung der Bruttophotosyntheserate möglich (Formeln siehe 2.2.4). Mit der Mikrooptode und der Sauerstoffelektrode lassen sich nur die Nettophotosyntheseraten bestimmen, die Bestimmung der respiratorischen Aktivität im Licht, die zu einer Verminderung der Bruttophotosyntheserate führt, ist Gegenstand zahlreicher Untersuchungen (Weger,1989). Im Allgemeinen wird die Respiration direkt nach der Lichtphase bestimmt, und als Respirationswert auch während der Lichtphase angesehen. Dadurch wird ein Vergleich der einzelnen Meßverfahren möglich Bestimmung der Biomasseproduktion Zahlreiche Autoren beschreiben die Bestimmung der Primärproduktion mit verschiedenen Meßmethoden (Bender M. et al., 1987; DiTullio G.R. and Laws E.A., 1983; Falkowski and Kolber Z., 1990; Geel C. et al., 1997; Beardell J. and Morris I., 1975). Die 14 C Meßmethode zur Bestimmung der Kohlenstoffixierung zeigt große Schwankungen in der Bestimmung der Biomasseproduktion. Auch die Bestimmung der Exkretion von organischen Stoffen durch Phytoplanktonalgen liefert stark differierende Daten (Geider (1992) und Domin (1995)). Deshalb wurde versucht, ein Verfahren zu entwickeln, das leicht zu handhaben ist, und eine genügend große Genauigkeit zur Bestimmung der Primärproduktion durch Bestimmung der Sauerstoffproduktion ermöglicht. Die Bestimmung der Biomassezusammensetzung erfolgte über Verbrennungsanalyse, die in Verbindung mit einer Bestimmung der Massenzunahme eine Quantifizierung der Nährelementsveränderungen C, N, H, O, und S in organischen Verbindungen ermöglicht. Durch diese Technik wird es möglich, eine Analyse der für die Assimilation der Nährelemente benötigten Energie durchzuführen. 21

28 Bestimmung der Primärproduktion und der Elektronenbilanz Die Quantifizierung der Makromoleküle konnte nur schematisch erfolgen. Die IR-Spektroskopie gewinnt in diesem Zusammenhang immer mehr an Bedeutung. Durch Absorption von Infrarotstrahlung werden Bindungen von Atomgruppen in Schwingung versetzt. Die Makromolekülen können damit anhand charakteristischer Bindungen ermittelt werden. Durch Bestimmung der Transmission kann eine qualitative Analyse der bestrahlten Probe erfolgen IR-Spekroskopie IR-Strahlung ist ein Teil der von der Sonne ausgesandten Strahlung, die auf der Haut als Wärmewirkung empfunden wird. Sie besitzt elektromagnetischen Charakter. Absorption der IR-Strahlung kann zu einer Veränderung der Lage der Atome, oder Atomgruppen zueinander, führen. Daraus resultiert eine Veränderung der Bindungslängen zwischen den Atomen. Die Veränderung der Bindungswinkel oder Bindungslängen verläuft schwingungsartig hin und her. Die IR-Strahlungsenergie wird demnach in Bewegungsenergie umgewandelt. Die Absorption der IR- Strahlung erfolgt in genau festgelegten Energieportionen, sogenannten Quanten. Durch Messung der Durchlässigkeit einer Probe für IR-Strahlung kann eine Charakterisierung einzelner Atome und Atomgruppen einer Probe anhand einer spezifischen Bandenbildung erfolgen. Mit einem FTIR Equinox 55 der Firma Bruker erfolgte die wellenlängenabhängige Charakterisierung von Phaeodactylum tricornutum. Dabei können verschiedene Atomgruppen charakterisiert und in Verbindung mit den Makromolekülen gesetzt werden (Gottwald W. and Wachter G., 1997). 22

29 Einleitung Diplomarbeit Jörg Toepel Ziel Ziel dieser Arbeit sollte es sein, eine Bilanzierung der Elektronenflüsse in Phaeodactylum tricornutum zu erstellen. Aus diesem Grund wurde mit den Mikrooptoden eine neue Technik zur Sauerstoffmessung eingesetzt, die dem neuem Anwendungsgebiet angepaßt werden mußte. Im Vergleich mit konventionellen Techniken sollte versucht werden, die Nutzbarkeit der Mikrooptoden für die Photosyntheseforschung zu überprüfen. Für die Bewertung von Experimentaldaten in der Photosyntheseforschung wurde geprüft, wie verläßlich Sauerstoffmessungen für die Biomasseproduktion sind. In diesem Zusammenhang wurde geprüft, inwieweit die Fluoreszenzmessung mit der Sauerstoffbestimmung korreliert. Die Bestimmung des PQ im Zusammenhang mit der Bilanzierung der Elektronenflüsse ist eine Möglichkeit zur Bestimmung der Effizienz der Photosynthese. Die Untersuchungen in dieser Arbeit wurden in Abhängigkeit von der Lichtintensität durchgeführt und mit Hilfe von Elementanalysen die Verschiebungen in der Makromolekülsynthese in Abhängigkeit von der eingestrahlten Lichtintensität analysiert. Abschließend wurde versucht, die Verschiebungen in der Makromolekülsynthese von Phaeodactylum tricornutum in Abhängigkeit von der Lichtintensität anhand von FT-MIR Spektroskopie nachzuweisen. 23

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31 2 Material und Methoden 2.1 Algen und Anzuchtsbedingungen Algenmaterial Für diese Untersuchung wurde die Diatomee Phaeodactylum tricornutum SAG (Sammlung Algenkulturen, Göttingen) eingesetzt. Die systematische Einteilung erfolgte nach (Hoek Ch.v.d. et al., 1993). Reich Abteilung Klasse Ordnung Familie Gattung Art Eukaryota Heterokontophyta Bacillariophyceae Pennales Phaeodactylaceae Phaeodactylum Phaeodactylum tricornutum Phaeodactylum tricornutum zeichnet sich dadurch aus, dass sie wie alle Heterokontophyta eine zusätzliche Doppelmembran um den Chloroplasten besitzt, die vom endoplasmatischen Retikulum gebildet wird. Die Thylakoide sind in Dreierstapeln angeordnet, somit kommt es nicht zu einer Stroma- und Granaanordnung, die für höhere Pflanzen typisch ist. Weiterhin ist eine Gürtellamelle vorhanden, die aus einem peripheren Thylakoidstapel gebildet wird. Neben Chlorophyll a kommt Chlorophyll c und als akzessorisches Pigment Fucoxanthin vor. Im Zuge des Xanthophyllzyklus wandelt die De-Epoxidase von Phaeodactylum tricornutum Diadinoxanthin in Diatoxanthin um. Auch der VAZ- Zyklus ist für Phaeodactylum tricornutum beschrieben Anzucht Die Anzucht erfolgte in einer semikontinuierlichen Kultur in einem 1 l Airlift- Gefäß bei einer Lichtintensität von 45 µmol m -2 s -1. Die Belichtung erfolgte durch ein über den Kulturen installiertes Leuchtfeld mit Leuchtstoffröhren mit einem 25

32 Algen und Anzuchtsbedingungen Licht / Dunkel-Rhythmus von 16/8h. Dabei wurde die Kultur mit filtergereinigter Luft (Millex-Filter, Porengröße 0,2 µm) durchsprudelt, um eine optimale Kohlendioxidversorgung zu gewährleisten. Der Chorophyllgehalt der Suspension wurde während der gesamten Anzucht manuell auf einen Chl a-gehalt von 2-4 mg Chl a/l eingestellt um die Algen in der gleichen Wachstumsphase zu halten. Da ein Vorratsgefäß mit sterilem Medium integriert war, konnte eine Entnahme von Algen bei gleichzeitiger steriler Weiterkultur der Stammkultur erfolgen. Weiterhin wurden für die Versuche sterile Batch-Kulturen angezogen. Diese wurden in autoklavierten 500 ml Erlmeyerkolben auf einem Schütteltisch kultiviert. Die Intensität des Anzuchtslichtes betrug etwa 60 µmol m -2 s -1. Die Kultivierung fand in einem klimatisierten Anzuchtsraum bei 20 C statt Nährmedium Für die Anzucht der Algen wurde ein leicht modifiziertes synthetisches Nährmedium nach (Provasoli L. et al., 1961) eingesetzt. Stammlösung [ad 100ml H 2 O bidest.] Menge Ad 1l H 2 O bidest Endkonzentration 1.K 2 HPO 4 1,0 g 10 ml 0,574 mm 2.H 3 BO 3 0,1 g 10 ml 97,035 µm 3.MgSO 4 * 7 H 2 O 20 g 10 ml 4,878 mm 4.KCl 16 g 10 ml 21,461 mm 5.NaNO 3 10 g 10 ml 11,765 mm 6.CaCl 2 * 2 H 2 O 4 g 10 ml 2,703 mm 7.FeCl 3 * 6 H 2 O 330 mg 1 ml 7,194 µm 8.Na 2 -EDTA 465 mg 1 ml 80,593 µm 9.TRIS 10 g 10 ml 8,255 mm Es wurden 5 g NaCl sowie 10 ml der Lösungen 1, 2, 3, 4, 5 und 9 unter ständigem Rühren in 1l Aqua bidest. gelöst und mit HCl auf einen ph-wert von 7,7 eingestellt. Danach wurden 10 ml der CaCl 3 * 6 H 2 O Lösung und je 1 ml der Lösungen 7 und 8 zu dem Medium gegeben. Als letztes kam 1 ml der Spurenlösung B hinzu. 26

33 Material und Methoden Diplomarbeit Jörg Toepel Spurenelementlösung B Titriplex III 600 mg ZnCl 2 6 mg MnCl 2 * 2 H 2 O 66 mg Spurenelementlösung A 1 ml Menge ad 19 ml H 2 O bidest und Einstellen auf ph 7 mittels KOH. Spurenelementlösung A CoCl 2 * 6 H 2 O CuCl 2 * 2 H 2 O Na 2 MoO 4 * 2 H 2 O 48 mg 12 mg 24 mg Ad 200 ml Aqua bidest. Zur Sterilisation wurde das Medium 20 min bei 120 C autoklaviert. 2.1 Bezugsgrößen Chlorophyllgehalt Die Bestimmung des Chlorophyllgehaltes erfolgte photometrisch mit Hilfe der Gleichungen von (Jeffrey S.W. and Humphrey G.F., 1975). Chl a [mg/l] = 11,47 * E 664 0,4 * E 630 Chl c [mg/l] = 24,36 * E 630 3,73 * E 664 (5) Dazu wurden die Pigmente in 90%igen Azeton extrahiert. 10 ml Algensuspension wurden mittels Vakuumpumpe auf einen Glasfilter Typ 6 (Schleicher & Schuell, Düsseldorf) gesaugt und anschließend mit einer Spatelspitze Calciumcarbonat versetzt, um eine Phaeophytinbildung durch zellinterne Säuren zu verhindern. Der Filter wurde dann zusammen mit 1 Teelöffel Glasperlen ( 0,25-0,3 und 1,0-1,05 mm im Gewichtsverhältnis 3:1) und 10 ml 90%igem Azeton in eine Schüttelflasche gegeben. Die Homogenisierung der Zellen erfolgte unter Kühlung für 20 s in einem Zellhomogenisator (MSK, Fa. Braun Melsungen). Das Homogenisat wurde für 2 min bei g (Hermle Zentrifuge Z 231, Gosheim) zentrifugiert. Der klare Überstand wurde in einem Spektralphotometer U-2000 (Hitachi) mit 90%igem Azeton als Referenz bei den Wellenlängen 664 und 27

34 Bezugsgrößen 630 vermessen. Zuvor erfolgte noch ein Nullabgleich (Streuwert) bei 750 nm. Die gemessenen Werte wurden in die Gleichung nach Jeffrey und Humphrey (1975) eingesetzt; der Gehalt an Chlorophyll a und c errechnet sich unter Berücksichtigung der eingesetzten Volumina an Suspension und Azeton Absorptionspektrum Das Absorptionsspektrum wurde mit dem Zweistrahlphotometer (Zeiss Specord M500) aufgenommen. Die Proben wurden in einem speziellen Probenhalter nahe vor dem Photomultiplier positioniert, um Streueffekte gering zu halten. Die Extinktionswerte wurden über den Wellenlängenbereich von nm aufgenommen. Die Spaltbreite betrug 2 nm. Als Referenz dienten mit 12%igen Natriumhypochlorid gebleichte Zellen von Phaeodactylum tricornutum. Dafür wurden 4 ml Algen mit 150 µl Natriumhypochlorid versetzt und für 10 min im Dunkeln inkubiert. In beide Strahlengänge wurden die mit gebleichten Zellen gefüllten Glasküvetten aus optischem Glas eingeführt und eine spezielle Korrektur durchgeführt. Die eigentliche Messung erfolgte dann mit dunkeladaptierten Phaeodactylum-Zellen im Probengang und gebleichten Zellen als Referenz. Ein Nullabgleich von Probe und Referenz wurde bei 750 nm durchgeführt. Der Chl a spezifische Absorptionskoeffizient [m²* mg Chl a -1 ] wurde mit der Gleichung: ( ) E d * λ a Phy λ = ( )* 2,303 * [ Chl a ] ermittelt, dabei ist E die Extinktion bei der Wellenlänge λ, d die Schichtdicke (0,01m) und [Chl a] die Chlorophyllkonzentration in [mg m -3 ]. 2,303 stellt die Umrechnung vom dekadischen in den natürlichen Logarithmus dar. (6) 28

35 Material und Methoden Diplomarbeit Jörg Toepel Excitationsspektrum Die Aufnahme des Excitationsspektrums erfolgte im Hitachi F 3000 Spektrophotometer. Vor der Meßzelle wurde ein LP-Filter RG715 eingesetzt, der Licht der Wellenlängen 715 nm transmittiert. Die Anregung erfolgte zwischen nm mit einer Bandweite von 3 nm. Die Detektion des emittierten Lichtes erfolgte bei 730 nm. Die Parametereinstellungen waren wie folgt: Ex-Bandpass Em-Bandpass Scan speed Response Startwellenlänge Endwellenlänge Ex-Meßwellenlänge 3 nm 5 nm 240 nm/min 2 Sec. 400 nm 700 nm 730 nm Für jede Messung war eine Korrektur des Lampenspektrums nötig. Der Lampenabgleich wurde mit BBL 3 (Basic Blue 3) gelöst in Ethylenglykol mit einer Konzentration von 4,1 mg/l durchgeführt (Kopf U. and Heinze J., 1984). Die Messung des Excitationsspektrums von Phaeodactylum wurde nach Zugabe von DCMU durchgeführt, um alle PS II-Reaktionszentren zu schließen und die maximale Fluoreszenzquantenausbeute zu messen (10 µm Endkonzentration). Das Excitationsspektrum bei Raumtemperatur gibt Aufschluß über die Weiterleitung des absorbierten Lichtes auf Chlorophyll a des PS II. Im Gegensatz zum Absorptionsspektrum werden in diesem Fall nur die absorbierten Lichtquanten sichtbar, die auch für die Photochemie nutzbar sind. Somit werden Aussagen über die Energieweiterleitung innerhalb des PS II möglich. Die Skalierung des Excitationsspektrums erfolgte nach der Korrektur des Lampenspektrums mit Hilfe des Chlorophyll a spezifischen Absorptionskoeffizient (a* Phy (λ)). Die Normierung von a* PS (λ) erfolgte im Maximum der absorbierten Anregungsenergie des PS II bei 674 nm. 29

36 Bezugsgrößen Photosynthetic Light Dispensation System (PLD-System) Als Lichtquelle für die Vergleichsmessungen der O 2 -Produktion diente das PLD-System der Firma Illuminova (Schweden). In dem photons-flux-densitydispenser ist als Lichtquelle eine Halogenlampe (150 W, Osram) eingesetzt (im folgenden als Lichtpipette bezeichnet). Der Vorteil dieses Gerätes ist die Möglichkeit der Variation der Lichtintensität ohne eine Veränderung des Lichtspektrums hervorzurufen. Der Vorteil ist dabei eine einfachere Berechnung der absorbierten Lichtquanten. Bei den Vergleichsversuchen wurde ein Probenhalter der Firma Walz eingesetzt (ED 101 US); das die Photosynthese anregende aktinische Licht der Lichtpipette wurde über einen Glasfaserleiter in den Probenraum eingestrahlt Bestimmung der Lichtintensitäten Für die Bestimmung der Lichtintensitäten wurde ein Quantenmessgerät (Licor 250), verbunden mit einem sphärischen Quantensensor 8 mm (Zemoko, Holland), eingesetzt. Die Messung erfolgte in dem Walz-Probenhalter (ED 101 US) in einer mit Wasser gefüllten Glasküvette. Für die Bestimmung der Lichtintensität (PAR) wurde ein Mittel aus 4 Meßpunkten gebildet. Die Bestimmung der Lichtintensitäten für die Algenanzucht und die Versuche der Biomassebestimmung erfolgte mit dem gleichen Meßgerät im mit Wasser gefüllten Versuchsgefäß. 30

37 Material und Methoden Diplomarbeit Jörg Toepel 2.2 Messung der Primärproduktion Versuchsaufbau für Vergleichsmessung Detektor Xe-PAM- Steuereinheit Blitzlampe Meßküvette Emitter PFD-D ispenser M ikrooptode Clark- Elektrode Abb. 2.1: Versuchsaufbau der Vergleichsmessung (nach Richter (1999) leicht verändert) Die Sauerstoffmessung erfolgte mit einer herkömmlichen Clark-Elektrode vom Typ MI-730. Die Kurzzeitexperimente wurden mit dem von Richter (1999) erarbeiteten Versuchsaufbau im Küvettenhalter (ED 101 US) der Firma Walz (Effeltrich) durchgeführt. Zusätzlich zur Elektroden-(2.2.2) und Fluoreszenzmessung (2.2.4) erfolgte eine Sauerstoffkonzentrationsbestimmung mittels Mikrooptoden (2.2.3). Die Lichtquelle stellte in diesem Fall die Lichtpipette dar (2.1.4). Durch den Glasfaserleiter konnten gleichzeitig sättigende Lichtpulse durch eine externe Blitzlampe vom Typ Walz FL 103 gegeben werden. Die Messung der gepulsten Fluoreszenzsignale erfolgte durch den Detektor (Hamamatsu S ) des Xe-PAM-Meßgerätes (Walz, Effeltrich). Der hier dargestellte Versuchsaufbau ermöglicht eine Fluoreszenzmessung unter aktinischer Belichtung. Der Detektor befindet sich um 90 versetzt zum Strahlengang. Die Algensuspension wurde in eine speziell präparierte Glasküvette (optisches Glas) eingefüllt. Die Küvette wurde so gekürzt, dass die Seitenfläche genau dem Durchmesser des Lichtleiters entsprach. In den Küvettendeckel wurden Clark-Elektrode und Mikrooptode durch Bohrungen ( 3 und 1,5 mm) eingeführt. Die Kalibrierung der beiden Meßgeräte erfolgte vor Versuchsbeginn in 31

38 Messung der Primärproduktion der Objekteinheit der Lichtpipette. Die Küvette mußte für die Messung absolut dicht verschlossen sein, um einen Sauerstoffaustausch zu vermeiden. Die Temperaturregulierung erfolgte über ein Kühlaggregat auf konstant 20±1 C. Die Durchmischung der Suspension erfolgte über einen Magnetrührer Clark-Elektrode Das Meßprinzip der Clark-Elektrode ist eine polarographische Bestimmung der Sauerstoffkonzentration. Durch eine negative Gleichspannung von zirka 0,85 Volt wird eine Reduktion von Sauerstoff zu H 2 O an der Kathode ausgelöst. Die gleichzeitig an der Anode stattfindende Reaktion liefert die dafür benötigten Elektronen. Der daraufhin fließende Polarisationsstrom ist dem Sauerstoffpartialdruck direkt proportional. Dieser Strom wird verstärkt und als zeitbezogene Sauerstoffproduktion registriert. Die Clark-Elektrode ist aus einer Platinkathode und einer Silberanode aufgebaut. Als Elektrolytlösung dient gesättigte KCl- Lösung. Gleichung der Reaktionen O H e - 2 H 2 O (Kathode) 4 Ag + 4 Cl - 4 AgCl + 4 e - (Anode) In dieser Arbeit wurde eine Clark-Elektrode vom Typ MI-730 (Microelectrodes, Ins., Bredford, USA) eingesetzt, die mit einer Steuereinheit des Photosynthetic Light Dispensation System (Lichtpipette, Fa. Illuminova, Schweden) verbunden war und eine direkte Verrechnung der Spannungsänderungen ermöglicht. Die Datenaufnahme erfolgte über die Software der Firma Illuminova. Die Berechnung der Sauerstoffproduktion erfolgt durch die Gleichung: O 2 -Nettoprod. = O 2 * 276 * 3600 /[Chl a] O 2 -Nettoproduktion in [µmol O 2 mg Chl a -1 h -1 ], Chlorophyllkonzentration in [mg Chl a l -1 ], O 2 = Änderung der O 2 -Konzentration in [% s -1 ]. Dabei ist 3600 die (7) 32

39 Material und Methoden Diplomarbeit Jörg Toepel Umrechnung zwischen s und h und 276 gibt die Sauerstoffsättigungskonzentration bei 20 C in µmol l -1 an. Vor jedem Versuch erfolgte eine Kalibrierung der Elektrode mit sauerstoffgesättigtem Wasser (für 15 min luftdurchsprudelt) und mit sauerstofffreiem Wasser (O 2 mit Natriumdithionit reduziert) Sauerstoffmessung mit Mikrooptoden Mikrooptoden (Microx 1, Fa. Presens, Regensburg, Germany) stellen eine neue Technik in der Photosyntheseforschung dar. Die Hauptkomponente bildet dabei der synthetisch produzierte Luminophor Tris-(4,7-diphenyl-1,10- phenanthrolin) ruthenium(ii)-perchlorat. In den Mikrooptoden werden zwei Eigenschaften des Luminophors ausgenutzt: 1. Die Fluoreszenzeigenschaften des Luminophors, der bei 450 nm ein Absorptionsmaximum besitzt und dieses Licht zwischen 600 und 650 nm wieder emittiert. Aufgrund der großen Wellenlängendifferenz zwischen Absorption und Emission kann eine einfache Messung ohne aufwendige optische Filterung der Meßsignale erfolgen. 2. Der Luminophor zeigt in Gegenwart von Sauerstoff eine Löschung der Fluoreszenz, dies wird als dynamische Fluoreszenzlöschung bezeichnet (Abb. 2.2). Die Intensität der Fluoreszenz des Luminophors ändert sich je nach O 2 -Konzentration. Dynamische Lumineszenzlöschung Lumineszenz ohne löschende Substanz Absorption von energiereichem Licht Emission von energierärmerem Licht keine Emission Anwesenheit einer löschenden Substanz z. B. Sauerstoff Abb. 2.2: Modell der dynamischen Fluoreszenzlöschung (aus Handbuch des Microx 1 (Fa. Presens)) 33

40 Messung der Primärproduktion Neben der Fluoreszenzintensität ändert sich auch die Fluoreszenzlebenszeit. Diese charakterisiert die Lebensdauer des Anregungsustandes eines Luminophors, welcher durch die quenchende Substanz beeinflußt wird. Im Microx 1 wird nicht die Lumineszenzintensität, sondern die Lumineszenzlebenszeit bestimmt. Dadurch wird eine Beeinflussung des Meßsignals durch die optischen Eigenschaften des Mediums (Reflexion und Absorption) vermieden. Weiterhin ist die Lumineszenzlebenszeit nicht von der absoluten Menge an Luminophor abhängig; unspezifische Ausbleichungen des Luminophors fallen deshalb nicht ins Gewicht. Meßparameter ist der Phasenwinkel. Wird ein Luminophor mit sinusförmigem frequenzmoduliertem Licht angeregt kommt es erst nach einer Verzögerung zu einer Emission des Lichtes. Diese Zeitverzögerung wird als Phasenwinkel (φ) bezeichnet. Er ist mit der Fluoreszenzlebenszeit durch folgende Gleichung verbunden (Schmidt W., 1994). Tan (φ)=2π* f opt + τ o Dabei ist f opt die optimale Modulationsfrequenz und τ o die Lumineszenzlebenszeit. Die Bestimmung des absoluten Sauerstoffgehaltes der Lösung läßt sich mit Hilfe einer Eichkurve mit den Eichwerten 0 und 100% Sauerstoffsättigung durchführen. Die Lumineszenzlebenszeit zeigt keine lineare Abhängigkeit, sondern folgt der Stern-Vollmer Gleichung (9), die eine exponentielle Abnahme charakterisiert. Dabei wird ein Vorteil der Mikrooptode sichtbar: Unter niedrigen Sauerstoffpartialdrücken ist eine deutlich bessere Auflösung möglich. (8) τ/τ o =0,85/(1-K sv *[O 2 ])+0,15 τ o und τ geben dabei die Lumineszenzlebenszeit mit und ohne Quenchsubstanz an, während K sv die Luminophor-abhängige Quenchkonstante darstellt. Um eine Beeinflussung des Luminophors und des Photomultiplier zu vermeiden, ist die Spitze des Lichtleiter mit einem schwarzen Silikonmantel versehen. Allerdings sollte die Messung der Sauerstoffkonzentration immer nur bei Dunkelheit erfolgen, um genauere Meßdaten zu erhalten. Die Ansprechzeit des (9) 34

41 Material und Methoden Diplomarbeit Jörg Toepel Luminophors auf Sauerstoffkonzentrationsänderungen wird durch die Ummantelung vergrößert. Weiterreichende Erläuterungen sind in (Holst G. et al., 1997; Wolfstein K. and Hartig P., 1998; Glud R.N. et al., 1996; Klimant I. et al., 1995; Holst G. et al., 2000) zu finden. ST Glasfaser-Koppler OF LED sig PMT Mikrooptode ST LED ref Abb. 2.3: Technischer Aufbau von Microx 1 Die Abb. 2.3 zeigt den Geräteaufbau des Microx 1. Der Luminophor ist auf der Spitze eines Glasfaserleiters aufgebracht, welcher in eine Mikrokanüle eingesetzt ist. Der Durchmesser der Glasfaserspitze beträgt 50 µm. Die Übertragung des Signals verläuft über ein Glasfaserbündel (100/140 µm). Im Microx 1 wird Licht einer blauen LED (HPLB 500, Nichia Chemical Europe, Germany) zur Fluoreszenzanregung verwendet. Durch einen Filter (BG12, Schott, Mainz, Germany) erfolgt eine Wellenlängentrennung. Die Anregung des Luminophors erfolgt mit gepulstem Licht der Frequenz 44,7 khz. Die Lumineszenz wird über den gleichen Lichtleiter zurück übertragen und von einem PMT (H , Hamamatsu Photonics, Herrsching, Germany) registriert. Vor dem PMT ist noch ein Langpassfilter zur Wellenlängenseparierung eingebaut (KV550, Schott, Mainz, Germany). Um die Phasenverschiebung zu dokumentieren, erfolgt eine Lichteinstrahlung über eine Referenz-LED (wie obige) mit einem Rotfilter. Das analoge Signal, die Phasenwinkelbestimmung erfolgt aus der Zeitdifferenz der beiden Meßsignale, wird in Spannungssignale konvertiert. Weiterhin erfolgt eine Verstärkung und Separierung des Signals. Das sinusförmige Signal wird in ein rectanguläres Signal umgewandelt. Die Pulsweite des austretenden Signals ist direkt proportional zum Phasenwinkel zwischen dem Licht der Referenz-LED und des Meßsignals. 35

42 Messung der Primärproduktion PAM-Fluorometrie In dieser Arbeit wurde ein Xe-PAM der Firma Walz (Effeltrich, Germany) eingesetzt. PAM steht in diesem Fall für Pulse-Amplituden-Modulation. Dabei wird eine Probe mit kurzen Lichtimpulsen (1µs) der Wellenlänge 400 bis 560 nm bestrahlt und die Emission bei nm bestimmt. Dabei wird letztlich eine Anregung des Chlorophyll a ermöglicht und eine Messung der Emission des Fluoreszenzmaximums von Chl a. Die Pulsfrequenz des Meßlichtes kann zwischen 2 und 64 Hz eingestellt werden, in dieser Arbeit wurde ausschließlich mit 2 Hz gearbeitet. Die Lichtemission der Xe-Lampe (Walz 102 L) wurde über einen Kurzpassfilter (Balzer DT Cyan special) und einen Grünfilter (BG 39 Schott) gefiltert. Außerdem wurde ein Lochfilter eingesetzt, so dass nur 0,4% der Lichtemission auf die Probe trafen und eine aktinische Wirkung des Meßlichtes ausgeschlossen werden konnte. Vor den Detektor wurde ein Grünfilter (GG10 Schott) und ein Rotfilter (RG 645 Schott) plaziert, um das Fluoreszenzlicht von dem Streulicht der Probe zu trennen. Aufgrund der verwendeten hohen Chlorophyllkonzentrationen wurde zum Schutz des Detektors zusätzlich ein neutraler Grauglasfilter (20% Transmission) eingesetzt. Die Möglichkeit gepulstes Meßlicht auf die Probe zu geben, ermöglicht die gleichzeitige Messung der Fluoreszenzsignale unter aktinischer Belichtung ohne dass es zu Störungen der Meßsignale kommt. Die sättigenden Lichtblitze wurden für ms mit einer Intensität von 2400 µmol m -2 s -1 auf die Probe gegeben (Hartig P. and Colijin F., 1996; Schreiber U. et al., 1993; Schreiber U. and Bilger W., 1993). Eine aktinische Belichtung wurde damit vermieden, obwohl (Schreiber U. et al., 1995) eine weitaus kürzere Blitzdauer bei der Fluoreszenzmessung von Phytoplanktonalgen empfehlen. Es kann aber bei einer Blitzverkürzung nicht mehr davon ausgegangen werden, dass eine vollständige Schließung aller Reaktionszentren gewährleistet wird. Meßparameter: Pulsfrequenz: 2Hz Verstärkung (Gain): 2-3fach Dämpfung (Damping) 2fach Blitzdauer: 800 ms Blitzintensität: 2400 µmol m -2 s -1 36

43 Material und Methoden Diplomarbeit Jörg Toepel Die Fluoreszenzdaten wurden immer 2 min nach Beginn jeder Lichtphase in einem Einzelwert bestimmt. Die Datenerfassung erfolgte graphisch über einen Meßschreiber der Firma Linseis (LM 23). Berechnung der Photosyntheseparameter durch Fluorometrie Die Bestimmung der einzelnen Photosyntheseparameter wurde durch folgende Gleichungen durchgeführt. Max Quantenausbeute: φ max PSII = Fm F Fm 0 Effektive Quantenausbeute: (10) φ epsii = Fm' F Fm' Relativer Elektronentransport (PS II): (11) Die Bestimmung der Elektronentransportraten des PS II [mol e - *Einst 1 ] wurden nach Genty (1989) ermittelt, die relative Elektronentransportrate ergibt sich durch Multiplikation der effektiven Quantenausbeute mit der photosynthetisch eingestrahlten Strahlung. e PSII = φ epsii * PAR Q phar -Berechnung Die Bestimmung der photosynthetisch absorbierten Strahlung wurde unter Berechnung des Chl a spezifischen Absorptionsspektrums und des Emissionsspektrums der Lichtquelle nach Lambert-Beer ermittelt. (12) Q phar 700 = 400 nm nm Q 0 ( λ ) Q 0 ( λ ) * e a * phy ( λ )* [ Chla ]* d ( )* d λ (13) 37

44 Messung der Primärproduktion Photosyntheserate (P) Die Bestimmung der Photosyntheserate mittels der PAM-Fluorometrie wurde durch Berechnung der absorbierten Strahlung und der effektiven Quantenausbeute des PSII durchgeführt. P = Q phar 8 * φ * epsii * 3600 [ Chl a ] Dabei wurde nach dem Z-Schema von einer Photonenmenge von 8 Photonen pro freigesetztem Sauerstoffmolekül ausgegangen (laut Osborne und Geider (1987) liegt die Photonenmenge wahrscheinlich eher bei 10-12). Durch den Bezug zum Chlorophyllgehalt wurde ein direkter Vergleich mit den durch die Sauerstoffmessung ermittelten Daten möglich. Die Dimension der Sauerstoffproduktion (Brutto) lautet in diesem Fall [µmol O 2 * mg Chl a -1 *h -1 ]. (14) Modellierung der Lichtsättigungskurven Die Photosyntheserate wurde unter verschiedenen Lichtintensitäten ermittelt und daraus eine P-I-Kurve erstellt. Lichtsättigungskurven zeigen eine Charakteristik, die sich mit Hilfe weniger Parameter darstellen läßt. Bei niedrigen Lichtintensitäten kommt es zu einem linearen Anstieg der Photosyntheserate in Abhängigkeit von der Lichtintensität. Dieser Anstieg wird als α-slope bezeichnet. Steigt die Lichtintensität nun weiter an, kommt es zu einer verminderten Steigerung der Photosyntheserate, bis schließlich ein Maximalwert erreicht ist. Dieser Punkt wird als Sättigungswert (P max ) der Photosynthese bezeichnet. Ist im Bereich des α-slope Licht der limitierende Faktor, kommt es im Bereich der Sättigung der Photosyntheseleistung zu einer Limitierung durch die Dunkelreaktionen. Dafür ist zum einem ein ungenügendes Angebot an Kohlendioxid verantwortlich, zum anderen sind die Enzyme der Carboxylierung gesättigt, so dass keine Steigerung mehr erfolgen kann. Daher kommt es zu einer internen Steigerung des Reduktionsgrades des NADP-Pools, der eine Blockierung der Elektronentransportkette bewirkt. Als weitere Kenngröße wurde die Lichtintensitätskonstante I k eingeführt, welche die Lichtintensität kennzeichnet, bei der 38

45 Material und Methoden Diplomarbeit Jörg Toepel eine Sättigung ohne Inhibierung der Photosynthese durch die Carboxylierungsreaktionen erfolgen würde. Modellierung Die Erstellung der Lichtsättigungskurven, sowohl der Sauerstoff-als auch der Fluoreszenzmessung, wurde in dieser Arbeit mit Hilfe des dafür entwickelten Modells nach (Eilers P.H.C. and Peeters J.C.H., 1988) durchgeführt. Dabei wird davon ausgegangen, dass die Photosynthetische Fabrik (PSF, Begriff von Eilers und Peeters eingeführt) in drei Zuständen vorliegen kann: dem offenen, dem geschlossenen und dem inhibierten. Das Photochemische Ereignis geschieht mit einer Wahrscheinlichkeit α, verbunden mit einer Sauerstofffreisetzung. Die geschlossene PSF kann unter der Wahrscheinlichkeit β wieder in den offenen Zustand übergehen, oder durch eine weitere Excitation in den inhibierten Zustand. Die Regenerierung des inhibierten Zustandes erfolgt wesentlich langsamer, als die des geschlossenen Zustandes. Es wird postuliert, dass die Photoinhibition sich langsamer als die Ladungstrennung entwickelt. Unter diesen Voraussetzungen lassen sich die Übergangswahrscheinlichkeiten bestimmen, mit α*i, β*i, γ und δ. Da eine PSF nur einen der drei Zustände einnehmen kann, gilt: x 1 +x 2 +x 3 =1. Daraus leiteten Eilers und Peeters drei Differentialgleichungen ab. dx1 = αix 1 + γx2 + δx3 dt dx dt 2 = αix1 ( βi + γ ) x 2 dx dt 3 = βix2 δx3 Dieses Differentialsystem kann für steady-state Bedingungen gelöst werden. Dabei ist P (Photosyntheserate) proportional zu N ( Anzahl der PSFs) und Anzahl der Übergänge von x 2 zu x 1 (p 2 ) P = k * N * p2 = 2 αβi KαβγNI + ( α + β ) δi + δγ die unter Vereinfachung der Thermen mit 39

46 Messung der Primärproduktion β a = KδγN α + β b = αkγn 1 c = KαN zu einer Berechnung der Photosyntheserate nach folgender Gleichung führt. P = 2 ai I + bi + c Die Ermittlung der Kenngrößen einer P-I-Kurve läßt sich leicht aus den drei Parametern der Gleichung durchführen. 1 α = c 1 P max = 2 b + ac c Ik = 2 b + ac Versuchsdurchführung Als Lichtquelle diente bei den Vergleichsmessungen die Lichtpipette. Der Versuchsaufbau entspricht dem oben beschriebenen (2.2.1). Die Bestimmung der Photosyntheseraten mit den Mikrooptoden verlangte besondere Versuchsbedingungen: es ist ein Chlorophyllgehalt größer als 1 mg/l bei diesen Kurzzeitexperimenten nötig, dies begründet sich in der Vergleichbarkeit der Ergebnisse zu denen der Clark-Elektrode, deren Auflösung im Bereich 1 mg Chl a/l liegt. Zum anderen ist dieser Chlorophyllgehalt notwendig, um eine signifikante Phasenwinkeländerung, sprich Sauerstoffproduktion, durch die Mikrooptoden zu registrieren. Die Genauigkeit der Mikrooptode beträgt 1% der maximalen Sauerstoffsättigung. Die Probe muß vor Versuchsbeginn mit Stickstoff durchsprudelt werden, da es bei Überschreitung der Sauerstoffsättigungskonzentration zu einem Ausgasen des Sauerstoffes kommt. Der Meßbereich beträgt somit 0-100% Sauerstoffsättigung. Um einen naturnahen Vergleich zu ermöglichen, wurde die Sauerstoffkonzentration auf 80% des Normalwertes gesenkt. Die Zugabe von 10 mm NaHCO 3 garantiert eine ausreichende Kohlendioxidversorgung. Vor (15) (16) 40

47 Material und Methoden Diplomarbeit Jörg Toepel Versuchsbeginn wurde jede Probe 10 min dunkeladaptiert und auf 20 C temperiert. Die Temperatur muß über den gesamten Versuchszeitraum konstant bleiben, da die Sauerstofflöslichkeit temperaturabhängig ist und der Luminophor seine Fluoreszenzeigenschaften mit der Temperatur ändert (durch die Auswertungssoftware der Firma Presens ist zusätzlich eine Bestimmung der Sauerstoffproduktion über einen Temperaturbereich hin möglich). Es erfolgte eine simultane Messung durch die Clark-Elektrode, die Mikrooptode und eine Aufnahme der Fluoreszenzdaten. Beziehungsweise wurden Elektroden- und Fluoreszenzmessung und Elektroden- und Optodenmessung simultan durchgeführt, da ein Austausch der Probe bei höheren Lichtintensitäten nötig war. Eine Übersättigung des Mediums mit Sauerstoff führte zum Ausgasen. Aus diesem Grund wurde bei Intensitäten ab 200 µmol*m -2 *s -1 beim Wechsel zur nächst höheren Lichtintensität jeweils eine neue dunkeladaptierte stickstoffdurchsprudelte Probe eingesetzt. Die Fluoreszenzmessungen ergaben aber unter diesen Voraussetzungen keine reproduzierbaren Daten. Die Erstellung der mit Fluoreszenz und Sauerstoffelektroden ermittelten P-I- Kurven erfolgte durch 5minütige Einstrahlung von Licht der Intensität 10, 20, 30, 50, 100, 200, 400, 600, 1500 µmol*m -2 *s -1. Nach jeder Lichtintensität wurden die Respirationswerte (für 5 min) bestimmt. Die Bruttoproduktionsraten für die Elektrodenmessung ergaben sich aus der Subtraktion der Respiration von der Nettoproduktion jeder Lichtphase (Standardprogramm). Die Optoden/Elektrodenmessung erfolgte unter längerer Belichtung (10 min) mit anschließender Dunkelphase (10 min). Die Respiration konnte aufgrund der geringen Änderung der Sauerstoffkonzentration durch die Mikrooptoden nur sehr ungenau bestimmt werden. Die Bruttoproduktionsraten wurden durch Subtraktion der Nettophotosyntheseraten mit der Respiration, die vor den Lichtphasen bestimmt und als konstant angesehen wurde, errechnet. 41

48 Vergleich der Biomasseproduktion mit der Primärproduktion 2.3 Vergleich der Biomasseproduktion mit der Primärproduktion Bestimmung der Primärproduktion Für die Bestimmung der Biomasseproduktion wurde das Trockengewicht vor und nach der Kultivierung unter verschiedenen Lichtintensitäten (50, 200 und 1000 µmol*m -2 *s -1 ) bestimmt. Dafür wurden jeweils gleiche Volumina der Stammsuspension von Phaeodactylum abgemessen, und sowohl für die Trockengewichtsbestimmung als auch für die Inkubation in 1 l Erlmeyerkolben unter den verschiedenen Lichtintensitäten eingesetzt. Die erforderliche Menge zur Bestimmung der organischen Substanz durch Verbrennungsanalyse beträgt 5 mg. Aus diesem Grund wurde für jeden Versuch aus einer Stammlösung (Chlorophyllgehalt zwischen 2-4 mg/l) eine Algenmenge von 150 µg Chl a entnommen, was einem Trockengewicht von 5-6 mg entsprach. Die Inkubation erfolgte in 1 l Erlmeyerkolben, die nach Einfüllen der Algensuspension randvoll mit sterilfiltriertem Medium (um eventuelle Schwebstoffe zu entfernen) aufgefüllt wurden. Die verdünnte Algensuspension mußte dann für 30 min vorsichtig mit Stickstoff durchsprudelt werden, um den Sauerstoffgehalt auf etwa 20% zu senken. Die Messung selbst erfolgte so lange, bis etwa 80-90% Sauerstoffsättigung erreicht wurden. Aufgrund der unterschiedlichen Sauerstoffproduktionsraten variierten diese Zeitspannen. Sie lagen zwischen 6-8 h für die Starklichtkultivierung und h für die Kultivierung unter 50 µmol*m -2 *s -1. Die Messung der Sauerstoffproduktion über diesen Zeitraum erfolgte mit Mikrooptoden (3 pro Kolben), die zu diesem Zweck in den Deckel jedes Kolben eingebaut waren. Vor jeder Messung erfolgte eine Kalibrierung der Mikrooptoden, mit für 15 min luftdurchsprudeltem H 2 O, welches auf 20 C temperiert war. Und 0% Sauerstoffsättigung wurde durch eine Zugabe von 1% Natriumdithionit ermittelt, welches durch eine Chemische Reaktion der Art Na 2 S 2 O 4 + O 2 + H 2 O NaHSO 3 + NaSO 4 der Lösung den Sauerstoff entzog. Die Durchmischung der Suspension erfolgte über einen Magnetrührer. Die Temperatur wurde mit einer Wasserkühlung (Kühlwendel) konstant bei 20±2 C gehalten. Vor Versuchsbeginn wurde der (17) 42

49 Material und Methoden Diplomarbeit Jörg Toepel Chlorophyllgehalt der verdünnten Algensuspension bestimmt und 10mM NaHCO 3 zugegeben. Weiterhin wurde das Licht der Halogenlampe durch eine 2%ige Kupfersulfatlösung (gekühlt auf 10 C) eingestrahlt, um eine Erhitzung der Proben durch die Lichtemission zu verhindern. Die Algensuspension wurde nach Versuchsende für die Bestimmung der TG-Zunahme auf einen Membranfilter (Schleicher & Schuell OE 66) gesaugt und anschließend quantitativ in Aqua dest. resuspendiert. Die Trockengewichtsbestimmung erfolgte wie unter beschrieben. Die Proben wurden anschließend durch Elementaranalyse (Verbrennungsanalyse siehe 2.3.3) auf auftretende Veränderungen in der chemischen Zusammensetzung untersucht. Die Bestimmung der Sauerstoffproduktion erfolgte durch Bestimmung der Differenz der Sauerstoffpartialdrücke unter Berücksichtigung der Temperatur, der Salinität und des Volumens Trockengewichtsbestimmung Die Bestimmung der Biomasseproduktion erfolgte über eine Trockengewichtsbestimmung. Dazu wurde eine Algensuspension mit 150 µg Chl a abgemessen. Die Trockengewichtsbestimmung erfolgte nach einer Zentrifugation der Suspension bei 3000 g (5000 rpm Zentrifuge Biofuge 28 RS, Heraeus, Germany, Rotor 3746) für 15 min. Das Pellet wurde mit 2 ml Aqua dest resuspendiert und in Eppendorfgefäße überführt (Gewichtsbestimmung erfolgte vorher). In einem weiteren Zentrifugationsschritt bei g für 5 min (Hermle Zentrifuge Z231 M, Gosheim, Germany) erfolgte die Separierung vom Medium, der Überstand wurde verworfen, und der Arbeitsschritt wiederholt, um eventuell an den Algen haftende Salzreste aus dem Medium zu entfernen. Die Proben in den Eppendorfgefäßen wurden in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und für 4 h gefriergetrocknet (Lyovac GT2, Amso/ Finn Aqua). Als Letztes erfolgte eine Gewichtsbestimmung auf einer Feinwaage. Das Trockengewicht ergibt sich aus der Differenz aus dem Leergewicht des Eppendorfgefäßes und dem Endgewicht. Zur Kontrolle wurde vor Versuchsbeginn eine identische Menge Suspension auf einen getrockneten Glasfilter gesaugt und für 4 h im Trockenschrank inkubiert, 43

50 Vergleich der Biomasseproduktion mit der Primärproduktion die identischen Meßergebnisse zeigen auf, dass unspezifische Verluste durch die Meßmethodik ausgeschlossen werden können Verbrennungsanalyse Die erhaltene Trockenmasse wurde mittels Verbrennungsanalyse auf die Inhaltsstoffe C, N, H und S untersucht. Weiterhin erfolgte eine Bestimmung des Sauerstoffgehaltes. Bei der Verbrennungsanalyse werden genau 2,5 mg Trockenmasse der Algen abgewogen und in einem Reaktionsraum durch einen Oxidationskatalysator vollständig verbrannt. Die dabei entstehenden Gase N 2, CO 2, H 2 O und SO 2 wurden über Katalysatoren gereinigt und gaschromatographisch quantitativ bestimmt. C, N, H, S CO 2 (g) + H 2 O(g) + N 2 (g) + SO 2 (g) + SO 3 (g) (95%SO 2 ) Die Verbrennung erfolgt bei 1050 C unter Sauerstoffzufuhr (Harris D.C., 1995) Die Sauerstoffbestimmung erfolgt separat über eine thermische Zersetzung (Proteolyse). Dabei wird die Probe ohne Sauerstoffzufuhr bei 1150 C thermisch zersetzt und die gasförmigen Produkte in einem Trägergas (90:10 Stickstoff- Wasserstoffgemisch) über ein Kohlenstoffgerüst geleitet. Das entstehende CO (Kohlenmonoxid) wird IR-Photometrisch bestimmt. Die Bestimmung der Elementarzusammen-setzung erfolgte in der AG von Prof. Wilde durch Herrn Wünsche im Chemischen Institut der Universität Leipzig. (18) IR-Spekrometrie Das FTIR Spektrometer IFS-55, der Firma Bruker besitzt einen Mercury- Cadmium-Tellurium(MCT)-Detektor. In diesem Quantensensor werden durch IR- Strahlung Ladungsträger erzeugt. Dieses elektronische Signal wird durch Wandler in digitale Signale umgewandelt (Dispersive Messung). Aufgrund der Sensitivität des Detektors muß eine Kühlung mit flüssigem Stickstoff erfolgen. Die IR- Strahlung wird von einem Plank schen Strahler, einem Silizium-Carbit-Stift, emittiert und durch ein Filtersystem geleitet. Die optische Einstrahlung der IR- Strahlung auf die Probe über ein IR-Mikroskop ermöglicht eine visuelle Justierung der Probe im Strahlengang. Das IFS-55 ist ein Fourier-Transformations-Infrarot- 44

51 Material und Methoden Diplomarbeit Jörg Toepel Spektrometer, welches gegenüber monochromatischen Spektrometern mehrere Vorteile besitzt: 1. Konstante Auflösung über den gesamten Spektralbereich. 2. Ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis. 3. Eine hohe Wellenzahlgenauigkeit. Durch gezielte Interferenz kommt es zu einer Verstärkung oder Löschung der Strahlung. Als Strahlenteiler fungiert ein KBr-Kristall. Bei Bestrahlung des Detektors mit polychromatischem Licht kommt es zu einem charakteristischen Bandenmuster, dieses bildet das Interferogramm. Das Interferogramm stellt die zeitliche Signalintensität dar, mittels Fourier-Transformation kann es in eine wellenlängenabhängige Darstellung umgewandelt werden (Gottwald, 1997). Die Probe befand sich auf einem KRS-5-Kristall (Thallium-Bromid-Iodid), da Glas im IR-Bereich durch Eigenabsorption untauglich ist. Probenvorbereitung Phaeodactylum-Kulturen wurden in identischer Art und Weise wie die Versuche zur Biomasseproduktion kultiviert. Zur IR-spektroskopischen Untersuchung wurden Proben vor und nach Kultivierung in einem 1 l Erlmeyerkolben für 12 h unter 50 µmol*m -2 *s -1 und für 8 h unter 200 µmol*m -2 *s -1 entnommen. Dafür wurden jeweils 40 ml der Algensuspension (Chlorophyllgehalt zwischen 0,05-0,15 mg/l) bei 3000 g (5000 rpm Heraeus Biofuge 28 RS, Germany, Rotor 3746) für 15 min bei 4 C zentrifugiert. Das Pellet wurde in 2 ml Aqua bidest resuspendiert und erneut abzentrifugiert (5 min bei g in Hermle-Z231-M-Zentrifuge) um Reste des Mediums zu entfernen. Nach Resuspendierung des Pellets in 500 µl Aqua bidest erfolgte mit einer Ultraschallsonde (Labsonic L, 40TL, Braun Diessel, Germany Melsungen) ein Aufbrechen der Zellen (4x15 s mit jeweils 15 s Pause). Das Aufbrechen erfolgte unter Eiskühlung. Die Proben wurden tiefgefroren und direkt vor der Messung aufgetaut. Für die Messung wurden 10 µl der Suspension auf den Kristall aufgebracht und mit einem Fön vorsichtig getrocknet. Die Probe muß für die Messung absolut trocken sein, da Wasser die Messung durch Eigenabsorption beeinträchtigt. Zur Charakterisierung der einzelnen Banden eines IR-Spektrums von Phaeodactylum tricornutum wurde eine Proteinanreicherung des Tylakoidlumens von Phaeodactylum zum Vergleich vermessen. Zusätzlich wurde noch mittels HPLC isoliertes Chlorophyll a spektroskopisch untersucht. 45

52 Vergleich der Biomasseproduktion mit der Primärproduktion Messung gewählt. Die Meßparameter für die Aufnahme eines IR-Spektrums wurden wie folgt Meßbereich cm -1 (Wellenzahlen) Auflösung 4 cm -1 Anzahl der Durchläufe pro Probe 128 Scans pro Probe Objektiv 36fach Blende 1,5 µm*1,5 µm Meßprinzip Transmission/Absorption Zuerst wurde als Referenz ein IR Spektrum des Trägerkristalls aufgenommen, dieses Spektrum wurde von allen Messungen abgezogen. Die Positionierung der Probe auf dem Objekttisch wurde so durchgeführt, dass die Blende einen mit Algenmaterial ausgefüllten Bereich umschloß. Für die Messung wurde vom visuellen Modus auf den Meßmodus umgeschaltet und die Messung mit 128 Durchläufen durchgeführt. Nach der Messung erfolgte eine Basislinienkorrektur, um die Spektren untereinander vergleichen zu können. Die Spektren wurden geglättet und auf die Wellenzahl 2930 cm -1 normiert. Die Absorption bei dieser Wellenzahl wird durch die Eigenabsorption des Trägermaterials und der C-H Gruppen gebildet. 46

53 3 Ergebnisse 3.1 Xe-PAM-Fluorometrie, Mikrooptoden und Clark-Elektrode im Vergleich Die Bestimmung der Photosyntheserate über Φ PSII, (2.2.4) und dem auf Chlorophyll a normierten spezifischen Absorptionskoeffizienten (a* Phy (λ)) und der daraus bestimmten absorbierten Lichtmenge Q phar, erlaubt einen direkten Vergleich mit den mit der Clark-Elektrode ermittelten Bruttosauerstoffproduktionsraten. (A) Φ PSII F F m 15 Fluoreszenz 10 5 φ PSII (B) PAR [µmol*m -2 *s -1 ] 0 rel. e - Transportrate PAR [µmol*m -2 *s -1 ] Abb. 3.1 Effizienz des Elektronentransports von PS II (A) und relative Elektronentransportraten (B) in Abhängigkeit von der Lichtintensität. Die Bestimmung erfolgte über Ermittlung von F und F m` mittels Xe-PAM Fluorometrie von Algensuspensionen von Phaeodactylum tricornutum bei 20 C (gestr. Linie Kurvenfit mit Eilers-Peeters-Simulation). Die Auswertung der Fluoreszenzmessungen ergab (Abb. 3.1), dass sowohl F als auch Fm`mit steigender Lichtintensität zunehmen, ehe ab 50 µmol*m -2 *s -1 ein Quenching der Fluoreszenz zu verzeichnen ist. Dagegen sinkt Φ PSII vom 47

54 Xe-PAM-Fluorometrie, Mikrooptoden und Clark-Elektrode im Vergleich Maximalwert 0,63 (dunkeladaptiert) mit steigender Lichtintensität auf 0,02 ab. In Abb. 3.1 sind die Mittelwerte von F, F m und Φ PSII aus 10 Messungen dargestellt. Die Proben wiesen jeweils einen Chlorophyllgehalt zwischen 1-2 mg Chl a/l auf. Die relative Elektronentransportrate dargestellt in Abb. 3.1(B) zeigt eine Lichtabhängigkeit, sie steigt bis 50 µmol*m -2 *s -1 linear an, danach geht sie in eine langsamere Kinetik über, eine Sättigung wurde bei Steigerung der Lichtintensität bis 1500 µmol*m -2 *s -1 nicht erreicht. Die Eilers-Peeters-Simulation charakterisiert sehr gut den Kurvenverlauf, im Sättigungsbereich unterschätzt sie die Elektronentransportrate leicht, da die Simulation eine Photoinhibitionskonstante beinhaltet, welche nicht in jeder Kurve berücksichtigt werden muß. In Abb. 3.2 ist der direkte Vergleich zwischen dem Chl a spezifischen Absorptionskoeffizienten (a* Phy (λ)) und dem auf Chl a (674) normierten Photosynthetischen Absorptionskoeffizient (a* PS (λ)) dargestellt. Die Differenz zwischen beiden Spektren entsteht durch die photoprotektiver Absorption, da a* PS (λ) die tatsächlich auf PS II Chlorophyll a übertragene Lichtmenge charakterisiert. Es ist dabei zu beachten, dass eine geringe Fluoreszenz des PS I nicht auszuschließen ist. Daraus wird ersichtlich, dass eine Bestimmung der Primärproduktion bzw. der absorbierten Lichtmenge problembehaftet ist a* phy (λ), a* ps (λ)[m²*mg Chl a -1 ] a* Phy (λ) a* PS (λ) λ[nm] Abb. 3.2 a* Phy (λ) und a* PS (λ) von Phaeodactylum tricornutum. Dargestellt sind die Mittelwerte aus 5 Messungen einer unter 50 µmol*m -2 *s -1 angezogenen Kultur. 48

55 Ergebnisse Diplomarbeit Jörg Toepel In Abb. 3.3 sind die P-I-Kurven von 4 unabhängigen simultan durchgeführten Elektroden-Fluoreszenzmessungen dargestellt. Sowohl im Bereich der Lichtlimitierung (α-slope) als auch im Sättigungsbereich kommt es zu erheblichen Abweichungen der Meßwerte für Photosyntheserate durch die Fluoreszenzmessung von der Clark-Elektrodenmessung. In Tab. 3.1 sind die Kenngrößen der P-I-Kurven dargestellt. Die Abweichungen von P max zwischen Elektroden und Fluoreszenzmessung beträgt in den einzelnen Versuchen zwischen 10 und 75%. Die Anstiege unterscheiden sich um mehr als 400%. Die Fluoreszenzdaten untereinander sind sehr konstant, die I k liegen im Mittel bei 61±10,23 µmol*m -2 *s -1, der Anstieg α bei 2,7±0,36 µmol O 2 *m²*s*(µmol Photonen*mg Chl a*h) -1. Die Maximalwerte differieren zwischen 144 und 189 µmol O 2 *mg Chl a -1 *h -1. Dargestellt sind die Bruttoproduktionsraten. 200 (A) 200 (B) P O2 (Brutto) [µmol O 2 *mg Chl a -1 *h -1 ] P O2 (Brutto) [µmol O 2 *mg Chl a -1 *h -1 ] (C) PAR [µmol*m -2 *s -1 ] (D) Fluoreszenz Elektrode PAR [µmol*m -2 *s -1 ] Abb. 3.3 P-I-Kurven von Phaeodactylum tricornutum ermittelt durch Sauerstoffmessung (Clark- Elektrode) und Xe-PAM-Fluorometrie. Dargestellt sind die Mittelwerte von jeweils 3 nacheinander durchgeführten Messungen gefittet mit Eilers-Peeters-Simulation. 49

56 Xe-PAM-Fluorometrie, Mikrooptoden und Clark-Elektrode im Vergleich Tab. 3.1 Kenngrößen von P-I-Kurven von Phaeodactylum tricornutum. Berechnet über die Eilers- Peeters Simulation von Fluoreszenzdaten und Sauerstoffmessungen, erstellt aus den Mittelwerten von jeweils 3 Messungen mit Standardprogramm (9 Lichtintensitäten (je 5min) mit anschließender Dunkelphase). Abb. 3.3 α IK Pmax Chl a in Elektr. PAM Elektr. PAM Elektr. PAM [mg/l] (A) 5,4 2,6 15,79 57,04 85,69 150,10 2,4 (B) 4,4 2,5 21,49 58,14 95,60 144,51 1,7 (C) 8,9 3,25 14,5 54,29 129,6 176,68 0,8 (D) 8,96 2,11 19,59 87,01 175,8 184,2 0,9 α = [µmol O 2 *m²*s*(µmol Photonen*mg Chl a*h) -1 ] I K = [µmol*m -2 *s -1 ] P max = [µmol O 2 *mg Chl a -1 *h -1 ] P O2 (Xe-PAM) [µmol O 2 *mg Chl a-1 *h -1 ] P O2 (Xe-PAM) [µmol O 2 *mg Chl a-1 *h -1 ] P O2 (Elektr.) [µmol O 2 *mg Chl a-1 *h -1 ] P O2 (Elektr.) [µmol O 2 *mg Chl a-1 *h -1 ] Abb. 3.4 Vergleich der Bruttoproduktionsraten ermittelt über PAM-Fluorometrie und Clark- Elektrode. Dargestellt sind die Mittel aus den 4 Messungen (siehe Abb. 3.3)(gestr.Linie stellt lineare Übereinstimmung dar) Die Bruttosauerstoffproduktionsraten, durch Xe-PAM-Fluorometrie und Clark-Elektrode bestimmt, werden bei niedrigen Lichtintensitäten durch die Fluoreszenzmessung unterbewertet. Im Bereich der Lichtsättigung steigt die Fluoreszenzmessung stärker als die Sauerstoffmessung, was zu einer Nichtlinearität führt. Die Sauerstoffmessungen zeigen eine viel größere Varianz zwischen den einzelnen Proben, die P-I-Kurven der Einzelversuche zeigen eine bessere Übereinstimmung im Bereich des linearen Anstieges. 50

57 Ergebnisse Diplomarbeit Jörg Toepel Der Vergleich der beiden direkten Sauerstoffmessungen dokumentiert eine sehr gute Übereinstimmung der Meßergebnisse untereinander. Wie die in Abb. 3.5 dargestellten P-I-Kurven demonstrieren, lieferten die Clark-Elektrode und die Mikrooptode fast identische Ergebnisse. Die durch die Eilers-Peeters Simulation berechneten P-I-Kurven zeigen eine gute Übereinstimmung im linearen Anstieg, im Sättigungsbereich ist die Sauerstoffproduktion bestimmt durch Mikrooptoden leicht höher, die Abweichungen der Maximalwerte betragen zwischen 1 und 10%. Die I k -Werte differieren um bis zu 40%. Wie schon im Vergleich mit der Fluoreszenzmessung sind die I k -Werte der Clark-Elektrodenmessung niedriger, in Verbindung mit hohen Anstiegswerten. Eine mögliche Erklärung wäre eine ungenügende Simulation der Meßdaten der Clark-Elektrodenmessung durch das Eilers-Peeters Modell, bzw. durch eine hohe Respiration im LL. Da eine Bestimmung der Respiration aufgrund des geringen Auflösungsvermögens der Mikrooptoden nicht möglich war, wurde die Bruttophotosyntheserate durch Subtraktion mit der vor Versuchsbeginn ermittelten Dunkelrespiration errechnet. P O2 (Brutto) [µmol O 2 *mg Chl a -1 *h -1 ] P O2 (Brutto) [µmol O 2 *mg Chl a -1 *h -1 ] (A) (C) PAR [µmol*m -2 *s -1 ] (B) (D) Mikrooptoden Clark-Elektrode PAR [µmol*m -2 *s -1 ] Abb. 3.5 P-I-Kurven von Phaeodactylum tricornutum erstellt aus simultanen Messungen mit Clark- Elektrode und Mikrooptoden. Die Einzelmessungen mit 10 min Belichtung für jede Lichtintensität wurden mit der Eilers-Peeters Simulation gefittet. Die Chlorophyllkonzentrationen lagen zwischen 1 und 4 mg Chl a/l. Für die Messungen ab 200 µmol*m -2 *s -1 wurden immer neue Proben eingesetzt, vor jeder dieser Messungen wurde die Probe mit N-Durchsprudelung auf etwa 80% Sauerstoffsättigung eingestellt. 51

58 Xe-PAM-Fluorometrie, Mikrooptoden und Clark-Elektrode im Vergleich Tab. 3.2 Kenngrößen von P-I-Kurven von Phaeodactylum tricornutum. Erstellt aus simultanen Sauerstoffmessungen mit Clark-Elektrode und Mikrooptoden, gefittet mit Eilers-Peeters Simulation. Dargestellt sind 4 Einzelmessungen mit jeweils 10 min Belichtung pro Lichtintensität(8 je Probe), Bestimmung der Bruttoproduktion durch Subtraktion der Nettophotosyntheserate mit Dunkelrespiration. Abb. 3.5 α I K P max Chl a in Elektr. Optode Elektr. Optode Elektr. Optode [mg/l] (A) 2,69 2,27 39,79 47,39 107,66 107,28 4,5 (B) 2,41 2,38 85,87 95,08 206,71 226,07 3,5 (C) 2,68 3,74 57,23 41,61 153,60 155,52 1,0 (D) 5,86 4,56 25,88 36,47 151,60 161,86 2,0 α in [µmol O 2 *m²*s*(µmol Photonen*mg Chl a*h) -1 ] I K in [µmol*m -2 *s -1 ] P max in [µmol O 2 *mg Chl a -1 *h -1 ] P O2 (Optode) (µmol O 2 *mg Chl a-1 *h -1 ] P [µmol O *mg Chl O2 (Elektr.) 2 a-1 *h -1 ] Abb. 3.6 Vergleich der Bruttoproduktionsraten ermittelt über Clark-Elektrode und Mikrooptoden (dargestellt sind die linear gefitteten Meßergebnisse der direkten Gegenüberstellung der Bruttoproduktionsraten aus Abb. 3.5). Die lineare Regression der Gegenüberstellung der beiden Sauerstoff- Meßtechniken (Abb. 3.6) zeigt einen stärkeren Anstieg als es die theoretische Übereinstimmung aufweisen würde. Die Mikrooptoden und die Clark-Elektrode weichen vor allem im Sättigungsbereich der Photosynthese voneinander ab. Die zum Teil erheblichen Unterschiede zwischen den einzelnen Versuchen sind durch das Alter der Kultur und Tagesrhythmik zu erklären, aus diesem Grund wurde auf eine Mittelwertbildung verzichtet. 52

59 Ergebnisse Diplomarbeit Jörg Toepel 3.2 Der Photosynthetische Quotient in Abhängigkeit von der Lichtintensität Die PQ, die anhand der Wachstumsversuche unter den verschiedenen Lichtintensitäten ermittelt wurden, zeigen keine Lichtabhängigkeit (Abb. 3.7)(A) Die Sauerstoffproduktion wurde durch die Bestimmung der Änderung der Sauerstoffkonzentration im abgeschlossenen Reaktionsgefäß durch Mikrooptoden ermittelt, die assimilierte Kohlenstoffmenge über die Verbrennungsanalyse in Verbindung mit einer Trockengewichtsbestimmung. Es erfolgt somit der Vergleich zwischen Nettosauerstoffproduktion und Nettoassimilation von Kohlenstoff. 3.0 (A) 3.0 (B) 2.5 ( ) PQ [mol O 2 / mol CO 2 ] PQ [mol O 2 /mol CO 2 ] ( ) PAR [µmol*m -2 *s -1 ] 0.0 Experimentaldaten PAR [µmol*m -2 *s -1 ] Abb. 3.7 Der Photosynthetische Quotient in Abhängigkeit von der Lichtintensität. Dargestellt sind die Experimentaldaten (A) und die Mittel aus jeweils acht (sechs bei 1000 µmol*m -2 *s -1 ) Versuchen (B) für die Lichtintensitäten 50, 200 und 1000 µmol*m -2 *s -1. Ermittelt wurden die PQ durch Wachstumsversuche von Phaeodactylum tricornutum in 1 l Erlmeyerkolben. C-Assimilation bestimmt über Trockengewichtszunahme und Elementanalyse, Sauerstoffproduktion durch Mikrooptoden durch kontinuierliche Sauerstoffkonzentrationsbestimmung. Die PQ differieren in den einzelnen Versuchen erheblich, in Abb. 3.7(B) sind die Mittel aus jeweils acht (sechs bei 1000 µmol*m -2 *s -1 ) Messungen für die drei Lichtintensitäten dargestellt. Die Standardabweichung beträgt zwischen 36% (50 µmol*m -2 *s -1 ) und 18% bei 1000 µmol*m -2 *s -1. Die PQ schwanken zwischen den Maximalwerten 0,66 mmol O 2 / mmol CO 2 und 2,66 mmol O 2 / mmol CO 2. Die Mittelwerte für die 53

60 Der Photosynthetische Quotient in Abhängigkeit von der Lichtintensität drei Lichtintensitäten sind 1,6 mmol O 2 / mmol CO 2 für 50 µmol*m -2 *s -1, 1,8 mmol O 2 / mmol CO 2 für 200 µmol*m -2 *s -1 und 1,5 mmol O 2 / mmol CO 2 für 1000 µmol*m -2 *s -1. Die statistische Auswertung der Experimentaldaten zeigte keine signifikanten Unterschiede (Ein-Wege-ANOVA) der PQ in Abhängigkeit von der Lichtintensität. In Tab. 3.3 sind die Mittelwerte der über die Wachstumsversuche bestimmten PQ dargestellt. Durch Ausschluß der zwei stark abweichenden Extremwerte (Meßpunkte in Klammern) wird eine erhebliche Verkleinerung der Streuung erreicht, zudem wird eine Verkleinerung der PQ mit steigender Lichtabhängigkeit durch die Mittelwerte augenscheinlich deutlich, die nur knapp unter dem Signifikanzniveau (Ein-Wege-ANOVA) liegt. Die große Streuung in Verbindung mit der zu geringen Versuchszahl verhindert eine klare Aussage in Bezug auf die Abhängigkeit der PQ von der Lichtintensität. Tab. 3.3 PQ [mol O 2 /mol CO 2 ] von Phaeodactylum tricornutum in Abhängigkeit von der Lichtintensität, Die C-Assimilationen sind berechnet aus Trockengewichtszunahme und Verbrennungsanalyse. Die Sauerstoffproduktionsraten wurden durch kontinuierliche Sauerstoffmessung mit Mikrooptoden über gesamten Wachstumsverlauf ermittelt. PAR PQ Experimentaldaten PQ Experimentaldaten (ohne Ausreißer) [µmol*m -2 *s -1 ] MW Stabw MW Stabw 50 1,61 0,58 1,75 0, ,81 0,40 1,69 0, ,50 0,27 1,50 0,27 Die Rechenmodelle von Falkowski (1985) und Williams (1991) stellen im Gegensatz zu den ermittelten PQ nicht nur die Kohlenstoffixierung der Sauerstofffreisetzung gegenüber, sondern bewerten den Elektronenverbrauch der C und N- Assimilation. Die PQ-Berechnung erfolgt über das zellinterne atomare C:N Verhältnis, unter Annahme das folgende Gleichung gilt: nco 2 + (n+1) H 2 O + NO 3 (CH 2 O)nNH 3 + (n+2) O 2 Dabei gibt n das atomare C:N-Verhältnis an. Die PQ-Berechnung erfolgt nach der Gleichung PQ=n+2/n. Williams (1991) berücksichtigte in seiner Berechnung noch die Schwefelassimilation, die jedoch mit der Verbrennungsanalyse nicht nachzuweisen war, aus diesem Grund sind die Ergebnisse beider Modelle identisch. 54

61 Ergebnisse Diplomarbeit Jörg Toepel Die Berechnung nach Williams (1991) erfolgt nach dem Schema: PQ=PQ C +PQ N +PQ S PQ C =(1+Y/4)-Z/2 für die Grundgleichung C(H) Y (O) Z mit z=1und y=2 für Glucose PQ N =2*(NO 3 /C) für Ammonium PQ N =0 PQ S =2*(SO 4 /C) Die Bestimmung des Photosynthetischen Quotienten durch die Rechenmodelle von Falkowski (1985) und Williams (1991) zeigt eine eindeutige Abhängigkeit des PQ von der Lichtintensität (Abb. 3.8). (A) (B) PQ [mol O 2 /mol CO 2 ] 0.5 PQ [mol O 2 /mol CO 2 ] Elektronen/N Elektronen/N PAR [µmol*m -2 *s -1 ] PAR [µmol*m -2 *s -1 ] Abb. 3.8 PQ von Phaeodactylum tricornutum nach Falkowski (1985) und Williams (1991), errechnet über das C:N-Assimilationsverhältis, in Abhängigkeit von der Lichtintensität. (A) mit einem Elektronenbedarf von 8 e - / N und (B) mit einem Elektronenbedarf von 10 e - / N. Die statistische Prüfung der Abhängigkeit ergibt einen höchst signifikanten Unterschied für die PQ bei 50 µmol*m -2 *s -1 im Vergleich zu den PQ bei 200 µmol*m -2 *s -1 bzw µmol*m -2 *s -1 (p<0,001; Ein-Wege-ANOVA), und keinen Unterschied für die PQ bei 200 µmol*m -2 *s -1 und 1000 µmol*m -2 *s -1. Da die Werte erheblich von den hier vorgestellten Experimentaldaten abweichen, wurde versucht eine Annäherung der PQ durch Modulierung der Rechenmodelle zu erreichen. So wurde statt eines Bedarfes von 8 Elektronen pro N ein Bedarf von 10 Elektronen angenommen (siehe 1.3.1)(Tab. 3.4). Die Modellierung führt zu 55

62 Effekt der Lichtintensität auf das C:N Assimilationsverhältnis einer Annäherung an die experimentell ermittelten Daten, ohne jedoch eine Übereinstimmung zu erzielen. Tab. 3.4 PQ [mmol O 2 /mmol CO 2 ] von Phaeodactylum tricornutum in Abhängigkeit von der Lichtintensität. Ermittelt nach Rechenmodellen von Williams (1991) und Falkowski (1985) über das C:N Assimilationsverhältnis (leicht modifiziert), im Vergleich dazu die Experimental PQ. PAR Rechenmodelle 8 e - /N Rechenmodelle 10 e - /N Experimental PQ [µmol*m -2 *s -1 ] MW Stabw MW Stabw MW Stabw 50 1,21 0,06 1,27 0,07 1,61 0, ,1 0,03 1,12 0,03 1,81 0, ,11 0,08 1,13 0,09 1,50 0,27 Die Experimentaldaten liegen bis zu 60% über den berechneten PQ. Die große Diskrepanz zwischen den PQ wird durch die Berücksichtigung des Mehrverbrauchs an Elektronen für die Nitratreduktion durch die Rechenmodelle ausgelöst. Die PQ der Berechnungsmodelle nähern sich dem theoretischen Wert von 1 an. Die verbleibende Differenz setzt sich aus internem Sauerstoffverbrauch und Kohlenstofffreisetzung (Citrat-Zyklus, Photorespiration u.a.) zusammen. Die PQ, über die Rechenmodelle ermittelt, weisen eine große Konstanz auf, die PQ schwanken für die jeweilige Lichtintensität nur zwischen 3-6%. Die geringen Differenzen der PQ werden auch durch die C:N-Assimilationsraten veranschaulicht, aus denen sie errechnet wurden. 3.3 Effekt der Lichtintensität auf das C:N Assimilationsverhältnis Die Bestimmung des C:N Assimilationsverhältnisses über die Verbrennungsanalyse zeigt eine lichtabhängige Erhöhung des C:N Verhältnisses (Abb. 3.9). Die statistische Auswertung weist eine höchstsignifikante Abhängigkeit des C:N Assimilationsverhältnisses von der Lichtintensität nach (p<0,001; Kruskal- Wallis rangbasierte Ein-Wege-Varianzanalyse). Die Untersuchung der einzelnen Lichtintensitäten bestätigte einen höchstsignifikanten Unterschied für die C:N Assimilationsverhältnisse für die Lichtintensitäten 50 zu 200 µmol*m -2 *s -1 (p<0,001). Beim Vergleich 50 zu 1000 µmol*m -2 *s -1 ergibt sich ein signifikanter Unterschied (p<0,05). Zwischen den Lichtintensitäten 200 und 1000 µmol*m -2 *s -1 läßt sich kein signifikanter Unterschied der C:N Assimilationsverhältnisse nachweisen. 56

63 Ergebnisse Diplomarbeit Jörg Toepel 4 0 C:N Assimilationsverhältnis [mmol/mmol] P A R [µ m o l * m - 2 * s - 1 ] Abb. 3.9 C:N Assimilationsverhältnis von Phaeodactylum tricornutum in Abhängigkeit von der Lichtintensität. Die manuell eingefügte Trennlinie veranschaulicht den Anstieg des C:N Assimilationsverhältnisses mit steigender Lichtintensität mit der unter hohen Lichtintensitäten eintretenden Stetigkeit. Tab. 3.5 C:N Assimilationsverhältnis von Phaeodactylum tricornutum in Abhängigkeit von der Lichtintensität errechnet aus Trockengewichtszunahme (siehe Tab. 3.8) beider Elemente im Zuge der Kultivierung unter den drei Lichtintensitäten. PAR C:N Assimilationsverhältnis MW Stabw [µmol*m -2 *s -1 ] [mmol C / mmol N] ,88 2, ,49 6, ,80 6,

64 Abhängigkeit der Sauerstoffproduktion von der Trockengewichtsproduktion Die Unterschiede in der Veränderung der Assimilationsraten von N und C wird noch deutlicher, wenn das Verhältnis aus den für die N-Assimilation (10e-/N) und denen der C-Assimilation gebildet wird (4e-/C) (Abb. 3.10). Das Verhältnis des Elektronenbedarfes für die N bzw. C Assimilation steht in gleicher Abhängigkeit von der Lichtintensität wie das C:N Assimilationsverhältnis. Aufgrund des unterschiedlichen Elektronenbedarfes für beide Assimilationen bestätigten sich die Unterschiede für die Lichtintensitäten 50 zu 200 µmol*m -2 *s -1 mit (p<0,001) und mit einer Signifikanz von p<0,01 für 50 zu 1000 µmol*m -2 *s -1. Die Verhältnisse des Elektronenbedarfes für die beiden hohen Lichtintensitäten unterscheiden sich nicht signifikant. Der Elektronenverbrauch für die Nitratreduktion unter HL nimmt damit im Vergleich zur C-Assimilation ab mmol e - N /mmol e - C PAR [µmol *m -2 *s -1 ] Abb Abhängigkeit des Elektronenbedarfes für die Assimilation von Stickstoff und Kohlenstoff durch Phaeodactylum tricornutum in Abhängigkeit von der Lichtintensität. 3.4 Abhängigkeit der Sauerstoffproduktion von der Trockengewichtsproduktion Für die Sauerstofffreisetzung pro produziertem mg Trockengewicht, bestimmt über die Sauerstoffmessung durch Mikrooptoden und die Trockengewichtsbestimmung in den Wachstumsversuchen, wurde keine Lichtabhängigkeit festgestellt. Die Gegenüberstellung ermöglicht Aussagen über die Kosten der Biomasseproduktion der gesamten Zelle, eingeschlossen die Makromolekülproduktion. 58

65 Ergebnisse Diplomarbeit Jörg Toepel In Abb. 3.11(A) sind die Experimentaldaten dargestellt. Sie zeigen für jede Lichtintensität die Ergebnisse von acht Versuchen (sechs Versuche bei 1000 µmol*m -2 *s -1 ). Die Standardabweichung für die Experimentaldaten liegt zwischen 7% (1000 µmol*m -2 *s -1 ) und 20% (200 µmol*m -2 *s -1 ). Die theoretische Sauerstofffreisetzung berechnet nach Osborne und Geider (1987), mit der Annahme, dass 125 µmol O 2 pro mg C freigesetzt werden, liefert eine gute Übereinstimmung mit den Experimentaldaten, lediglich für 200 µmol*m -2 *s -1 liegt der theoretische Wert um 15% niedriger und damit relativ weit unter dem Mittelwert der Experimente Abb. 3.11(B). (A) (B) µmol O 2 / mg TG 50 µmol O 2 /mg Tg PAR [µmol*m -2 *s -1 ] 0 nach Osborne und Geider Messung Elektronenverbrauch für C H N PAR [µmol*m -2 *s -1 ] Abb Sauerstofffreisetzung in Abhängigkeit von der Trockengewichtsproduktion dargestellt sind die Experimentaldaten (A) und (B).die Mittelwerte der Experimentaldaten, der Berechnung nach Osborne und Geider (1987) und nach Nährstoffassimilation ( theoretische Sauerstofffreisetzung nach Wilhelm et al.(1995) (siehe 4.6)) Der Vergleich mit dem in dieser Arbeit verwendeten Schema (siehe 1.6) für den Elektronenverbrauch für die Assimilation der Elemente (C; H; N) weist ebenfalls eine gute Übereinstimmung mit den Meßergebnissen auf, die Abweichung beträgt 10-20%. Die Mittelwerte der Messungen und Berechnungen sind in Tab. 3.6 dargestellt. Die Sauerstofffreisetzung der Messungen in Abhängigkeit von der TG-Produktion und die der Rechenmodelle liegen jeweils im Bereich der 59

66 Bilanzierung der Elektronenflüsse theoretischen Sauerstofffreisetzung nach Wilhelm et al. (1995). Die Abweichung betrug maximal 20%. Die Produktionskosten für ein mg TG bleiben damit unter allen Lichtintensitäten relativ konstant. Die nach Test auf Normalverteilung durchgeführte Varianzanalyse (Ein-Wege-ANOVA) brachte keinen Nachweis über eine signifikante Abhängigkeit der Sauerstofffreisetzung pro produziertem mg TG von der Lichtintensität. Somit sind unter allen Lichtintensitäten die Produktionskosten für die Biomasse nahezu gleich, unabhängig von der Zusammensetzung des produzierten TG. Tab. 3.6 Sauerstofffreisetzung von Phaeodactylum tricornutum pro produziertem mg Trockengewicht [µmol O 2 *mg TG -1 ], mit den Ergebnissen der Berechnung nach Osborne und Geider (1987) und über die C-H-N-Assimilation. PAR Experimentaldaten Berechnung nach Osborne und Geider Berechnung über C-H-N-Assimilation µmol*m -2 *s -1 MW Stabw MW Stabw MW Stabw 50 59,50 20,95 55,46 4,93 64,55 5, ,47 19,71 60,64 9,56 61,70 8, ,60 6,80 57,29 4,90 63,14 9,5 3.5 Bilanzierung der Elektronenflüsse Die Bilanzierung der Elektronenflüsse in Phaeodactylum tricornutum, d.h. die Gegenüberstellung der durch die Wasserspaltung produzierten Elektronen und der für die Nährelementassimilation genutzten Elektronen, in Abhängigkeit von der Lichtintensität dokumentiert 1.: Die durch die Berechnung (C, H, N) ermittelten Verbrauchsraten stimmen gut mit den durch die Sauerstoffmessung ermittelten Produktionsraten an Elektronen überein. 2.: Zeigt sich in den Wachstumsversuchen die Lichtabhängigkeit der Produktion bzw. des Verbrauchs der Elektronen. Die unter 200 bzw µmol*m -2 *s -1 bestimmten erhöhten Produktionsraten bei gleichzeitiger Erhöhung des Elektronenverbrauches zeigen eindeutig eine durch die Lichtmenge induzierte Steigerung der Photosynthese, wie sie durch die P-I- Kurven dargestellt wird (Abb. 3.12). Die Nettosauerstoffproduktionsraten zeigen eine gute Lichtabhängigkeit, liegen allerdings zum Teil weit über denen der Vergleichsmessungen. Die erheblichen Abweichungen in den Sauerstoffproduktionen von zwei Wachstumsversuchen unter 1000 µmol*m -2 *s -1 ist 60

67 Ergebnisse Diplomarbeit Jörg Toepel wahrscheinlich durch das Alter der Kultur zu erklären, trotzdem stimmt die Elektronenbilanz überein. 300 P O2 (Netto) [µmol O 2 *mg Chl a -1 *h -1 ] PAR [µmol*m -2 *s -1 ] Abb Nettosauerstoffproduktionsraten von Phaeodactylum tricornutum. Dargestellt sind die Meßwerte der Wachstumsversuche, ermittelt über Mikrooptodenmessung. Sowohl die Produktionsraten als auch die Verbrauchsraten weisen eine signifikante Abhängigkeit von der Lichtintensität auf (p<0,001 bzw. p<0,01; Ein- Wege-ANOVA) (Abb. 3.13). Die höchst signifikante Abhängigkeit der Produktionsraten von der Lichtintensität (p<0,001; Ein-Wege-ANOVA) konnte durch Einzelvergleiche zwischen den Versuchen bei 50 µmol*m -2 *s -1 und denen bei 200 bzw µmol*m -2 *s -1 bestätigen werden. Sie wiesen jeweils einen hoch signifikanten Unterschied (p<0,001 bzw. p<0,01; T-Test für unabhängige Stichproben) auf. Die Produktionsraten unter 200 µmol*m -2 *s -1 und 1000 µmol*m -2 *s -1 unterschieden sich dagegen nicht signifikant voneinander. Die Untersuchung der Verbrauchsraten mit der rangbasierten Kruskal- Wallis Ein-Wege-Varianzanalyse dokumentiert einen signifikanten Unterschied (p<0,01) der Verbrauchsraten zwischen 50 und 200 µmol*m -2 *s -1 bzw. 50 und 1000 µmol*m -2 *s -1 (p<0,01 Mann-Whitney-Rank-Sum-Test) und dagegen keinen signifikanten Unterschied der Verbrauchsraten zwischen den Versuchen unter 200 und 1000 µmol*m -2 *s

68 Bilanzierung der Elektronenflüsse Abb Bilanz der Elektronenflüsse in Phaeodactylum tricornutum in Abhängigkeit von der Lichtintensität. Produktionsraten ermittelt durch Multiplikation der Nettosauerstoffproduktion mit vier. Verbrauchsraten durch Addition der Elektronenmengen für C (Molmenge*4), N (Molmenge*10) und H (Molmenge) Assimilation. Der Vergleich zwischen den Mittelwerten aus der Produktion und des Verbrauchs (Tab. 3.7) zeigt auf, dass sich die Produktionsraten bei 50 µmol*m -2 *s -1 auf 93% ±34% der Verbrauchsraten belaufen, bei 200 µmol*m -2 *s -1 auf 120% ±28% und bei 1000 µmol*m -2 *s -1 auf 94%±19%. 62