Abteilung Gentherapie und molekulare Gentherapie UNIVERSITÄT ULM Abteilungsleiter: Prof. Dr. Stefan Kochanek

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1 Abteilung Gentherapie und molekulare Gentherapie UNIVERSITÄT ULM Abteilungsleiter: Prof. Dr. Stefan Kochanek Identifizierung und Charakterisierung molekularer Resistenzmechanismen in Tumorzellen Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Humanbiologie der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm vorgelegt von Susanne Josephin Braeuer aus Kempten 2006

2 Amtierender Dekan: Prof. Dr. Klaus-Michael Debatin 1. Berichterstatter: Prof. Dr. Thomas Wirth 2. Berichterstatter: PD Dr. Simone Fulda Tag der Promotion: 14. Juli 2006 ii

3 Teile dieser Arbeit werden veröffentlicht unter: Braeuer SJ, Büneker C, Mohr A und Zwacka RM. Constitutively activated NF-κB, but not induced NF-kB, leads to TRAIL-resistance by up-regulation of XIAP in human cancer cells. Molecular Cancer Research, iii

4 Inhaltsverzeichnis TI. Einleitung...T... 1 TI.1 Apoptose... T1 TI.2 Caspasen... T2 TI.3 Apoptotische SignalwegeT... 5 TI.4 Regulation der ApoptoseT... 9 TI.5 Der nukleare Faktor kappa B (NF-κB)T TI.6 Die TNF (Tumor Nekrosis Faktor)-FamilieT TI.7 TNF-Related Apoptosis-Inducing Factor Ligand (TRAIL)T TI.8 5-Fluorouracil (5-FU)T TI.9 ZielsetzungT TII. Material und Methoden T24 TII.1 Material... T24 TII.1.2 Chemikalien, Reagenzien und VerbrauchsmaterialienT TII.1.3 EnzymeT TII.1.4 AntikörperT TII.1.5 VektorenT TII.1.6 Zytotoxische Verbindungen und ZytokineT TII.1.7 Puffer, Nährmedien und ZellkulturzusätzeT TII.1.8 ZelllinienT TII.1.9 SoftwareT TII.2 MethodenT TII.2.1 Zellbiologische MethodenT TII Kultivierung eukaryontischer ZelllinienT TII Einfrieren und Auftauen von ZellenT TII Transfektion von eukaryontischen ZellenT TII Transfektion durch ElektroporationT TII Transfektion durch CaB3 B(P0B4B)B2B-PräzipitationT TII Transfektion durch Lipofektion mit FuGENE6T TII Herstellung stabiler KloneT TII Behandlung der Zellen mit zytotoxischen Verbindungen und ZytokinenT TII Durchflusszytometrie/ FACS (Fluorescence activated cell sorting)t TII Apoptosemessung (Nicoletti et al., 1991)T TII Analyse der Expression von Oberflächenproteinen (Rezeptoren)T TII Messung der EGFP ExpressionT TII Luziferase Reporter AssayT TII.2.2 Proteinbiochemische MethodenT TII Herstellung von ZellextraktenT TII Bestimmung des GesamtproteingehaltsT TII Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)T TII Membrantransfer (Western-Blotting) und Immunodetektion von Proteinen II Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) II.2.3 Molekularbiologische und mikrobiologische Methoden II Herstellung und Transformation kompetenter E. coli Bakterien II Präparation von Plasmid-DNA, Nukleinsäurefällung und Sequenzbestimmung II Bestimmung der Nukleinsäure-Konzentration II DNA Verdau mit Restriktionsendonukleasen und Ligation iv

5 II Agarose-Gelelektrophorese II Isolierung von Gesamt-RNA II cdna-synthese II Primer-Design für die Lightcycleranalyse II Real-Time quantitative RT-PCR II.2.4 RNA Interferenz II Herstellung adenoviraler shrna Expressionsvektoren II Herstellung der ds shrna Oligonukleotide II Klonierung der ds shrna Oligonukleotide in den pu6.entr-vektor II Funktionalitätstest der pu6.entr.shrna-konstrukte in Hek293 Zellen II Klonierung der shrna Expressionskasette in den adenoviralen Vektor.. 51 II.2.5 Produktion und Aufreinigung adenoviraler Vektoren II Herstellung des Crude Extracts in Hek293 Zellen II Large-scale Adenovirusproduktion in N52 Zellen und Aufreinigung der Adenoviruspräparation II.2.6 Statistik II t-test III. Ergebnisse III.1 Einfluss von NF- κb auf die Sensitivität gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose III.1.1 Sensitivität verschiedener Krebszelllinien und humaner Fibroblasten gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose III.1.2 Untersuchung des Zusammenhangs zwischen TRAIL Sensitivität und TRAIL-vermittelter NF-κB Aktivierung III TRAIL-vermittelte NF-κB Aktivierung III Einfluss einer Inhibierung der NF- κb Aktivierung auf TRAIL-induzierterApoptose III IκB-α-SR inhibiert konstitutiv aktiviertes NF-κB in Panc-1 Zellen III Preaktiviertes NF-κB vermittelt DLD-1 Zellen einen Schutz gegenüber TRAIL III.1.3 XIAP als NF-κB-abhängiger Resistenzfaktor in TRAIL-induzierter Apoptose III Herunterregulation des XIAP Proteins mittels RNAi III Konstitutiv aktiviertes NF-κB führt zu einer hohen XIAP Expression in Panc-1 Zellen III.2 Der Einfluss von NF-κB in 5-FU-induzierter Apoptose III FU-induzierte Aktivierung von NF-κB...80 III.2.2 Einfluss des NF-κΒ auf die Sensitivität gegenüber 5-FU III Einfluss einer Inhibition von NF-κΒ auf die 5-FU Sensitivität III Einfluss einer Aktivierung von NF-κΒ auf die 5-FU Sensitivität III.3 Untersuchung des Zusammenhangs zwischen TRAIL Sensitivität und Expression der TRAIL Rezeptoren III.3.1 Untersuchung der Expression der TRAIL Rezeptoren in verschiedenen Krebszelllinien III Expression der TRAIL Rezeptoren an der Zelloberfläche III Genexpression der TRAIL Rezeptoren in verschiedenen Krebszelllinien. 95 III TRAIL Rezeptor 1 stellt ein entscheidender Mediator der TRAIL Sensitivität in den TRAIL-resistenten Zelllinien Panc-1 und A549 dar III Überexpression des TR1 und TR3 in DLD-1 Zellen v

6 III Untersuchung der Expression der TRAIL Rezeptoren in einer Zelllinie mit erworbener TRAIL Resistenz und der Parentalzelllinie III Untersuchung der Expression der TRAIL Rezeptoren in normalen Zellen am Beispiel humaner primärer Fibroblasten III.3. Herstellung von shrna gegen die TRAIL Rezeptoren IV. Diskussion IV.1 Die Bedeutung von NF-κB in TRAIL-induzierter Apoptose IV.1.1 Der Einfluss von TRAIL-induziertem versus konstitutiv aktiviertem NF-κB auf die TRAIL Sensitivität IV.1.2 Die durch konstitutiv aktiviertes NF-κB-vermittelte Hochregulation von XIAP trägt zu dem TRAIL-resistenten Phänotyp in Panc-1 Zellen bei IV.2 Die Bedeutung von NF-κB in 5-FU-vermittelter Apoptose IV.3 Die Bedeutung der TRAIL Rezeptoren für die TRAIL Sensitivität IV.3.1 Expression der TRAIL Rezeptoren als Indikator für die TRAIL Sensitivität in Tumorzellen IV.3.2 Die Bedeutung der Apoptose-induzierenden Rezeptoren TR1 und TR2 für die TRAIL Sensitivität in Tumorzellen IV.3.3 Die Bedeutung der Apoptose-inhibierenden Rezeptoren TR3 und TR4 für die TRAIL Sensitivität in Tumorzellen IV.3.4 Expression der TRAIL Rezeptoren als Selektionsmechanismus in einer erworbenen TRAIL Resistenz IV.3.5 Die Resistenz normaler Zellen gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose am Beispiel kultivierter humaner Fibroblasten der Haut IV.3.6 Schlussfolgerung V. Zusammenfassung VI. Literaturverzeichnis Danksagung Lebenslauf vi

7 HB Abkürzungsverzeichnis A Adenin Abb. Abbildung Ad Adeno- AIF Apoptose Inducing Factor Amp Ampere Amp Ampicillin ANT Adenine Nucleotide Translocator Apaf-1 Apoptosis protein-activating factor-1 Aqua dest. Aqua destillata APS Ammoniumperoxidisulfat Asp Asparagin ATP Adenosintriphosphat Bcl B-cell Lymphoma BH Bcl-2 Homologie BIR Baculovirus IAP Repeat BSA bovines Serumalbumin bzw. beziehungsweise C Cytosin ca. circa CAD Caspase Activated DNase CAR Coxsackievirus/Adenovirus- Rezeptor CARD Caspase Activating Recruting Domain cdna complementary Desoxyribonucleinacid c-flip cellular FLICE-inhibitory protein ciap cellular Inhibitor of Apoptosis Protein cm Zentimeter CP Crossing Point CMV Cytomegalie-Virus cpm counts per minute CrmA Cytokine responsive modifier A Da Dalton DcR Decoy Receptor DD Death Domain DED Death Effector Domain d.h. das heißt DIABLO Direct IAP Binding protein with a low isoelectric point DISC Death Inducing Signaling Complex DMEM Dulbecco s Modified Eagle s Medium DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonucleinacid DR Death Receptor ds double strand DTT Dithiothreitol ECL Enhanced Chemoluminescenc EDTA EGFP EMSA ER et al. FACS FADD FCS FSC g h h HCl HEPES 2B O HPLC HRP IAP ICAD IFN IgG I-κB IKK IL IMM IMS JNK k kb Ktr l LB Lsg. LTR M m max. MEM min mind. MCS MOI MOMP mrna MPT Ethylen-bis(oxyethylennitrilo) tetraessigacid/säure Enhanced Green Fluorescent Protein Electromobility Shift Assay Endoplasmatischen Reticulum Et alii Fluorescence-activated cell sorter Fas-Associated Death Domain Fetal Calf Serum Forward Scatter Gramm human hora Salzsäure N-2-Hydroxyethylpipeazin-N` -ethansulfonsäure Wasser High Performance Lliquid Chromatography Horseradish Peroxidase Inhibitor of Apoptosis Protein Inhibitor of Caspase-Activated DNase Interferon Immunglobulin G I-kappa B Inhibitory κb Kinase Interleukin Innere Mitochondriale Membran Intermembrane Space c-jun N-terminale Kinase kilo Kilobasenpaare Kontrolle Liter Liquid Broth Lösung Long Terminal Repeat molar milli maximal Eagles Minimal Essential Minute mindestens Multiple Cloning Site Multiplicity Of Infection Mitochondrial Outer Membran Permeabilisation messenger RNA Mitochondrial Permeability Transition vii

8 MW Molekulargewicht N Amino-Terminus n nano NCI National Cancer Institute NF-κB Nuklearer Faktor kappa B NLS Nukleäre Lokalisationssequenz nt Nukleotid OPG Osteoprotegerin PARP Poly (ADP-ribose) Polymerase cparp cleaved Poly (ADP-ribose) Polymerase PBS Phosphate-Buffered Saline PCR Polymerase Chain Reaction PI Propidium Iodide PS Phosphatidylserine ori origin of replication p Protein p Plasmid PAGE Polyacrylamidgelelectrophorese PBGD Porphobilinogen Deaminase PCR Polymerase Chain Reaction Pen./Strep. Penicillin/Streptomycin R Rezeptor RHD Rel homology domain RIP Receptor Interacting Protein RNA Ribonukleinacid/säure RNase Ribonuklease rpm rounds per minute RPMI Roswell Park Memorial Institute RT Raumtemperatur RT-PCR Reverse Transkriptase Polymerase Chain Reaction s Sekunde s. siehe SDS Sodiumdodecylsulfat SE Standard Error Smac Second mitochondria-derived activator of caspases S-Phase Synthese-Phase SRP Small RNA Protein ss single strand/ Einzelstrang SSC Sideward Scatter T Thymin Tab. Tabelle TAE Tris-Azetat/EDTA tbid truncated BH3 interacting domain death agonist TBS Tris-buffered saline TE Tris-EDTA TEMED N, N, N, N tetramethylethylene diamine TNF-α Tumor Necrosis Factor TNF-R Tumornekrosefaktor Rezeptor TR TRAIL Rezeptor TRADD TRAIL-Associated Death Domain TRAF2 TNF-Receptor Associated Factor 2 TRAIL TNF-Receptor Associated Apoptosis Inducing Ligand TRID TRAIL Receptor without an Intracellular Domain Tris Trishydroxymethylaminomethan TS Thymidylat Synthase U unit/ Einheit u. a. unter anderem UV ultraviolett V Volt v.a. vor allem VDAC Voltage Dependent Anion Channel vgl. vergleiche v/v Volumen zu Volumen WB Western- Blot w/v Gewicht zu Volumen XIAP X-linked Inhibitor of Apoptosis Protein zvadfmk N-benzyloxycarbonyl-Val-Ala- Asp-fluoromethylketone z. T. zum Teil C Grad Celsius µ mikro 5-FU 5-Fluorouracil λ Lambda (Wellenlänge) viii

9 I. Einleitung I. Einleitung I.1 Apoptose Apoptose stellt neben Nekrose und Autophagie eine Form des (programmierten) Zelltods dar. Anfänglich wurde der durch ein definiertes molekulares Programm regulierte Prozess der Apoptose dem passiven Prozess der Nekrose gegenübergestellt, es zeigte sich aber, dass beide Prozesse nur die zwei Enden eines Spektrums darstellen, welches auch Mischformen beinhaltet. Tabelle 1 fasst die wichtigsten Charakteristika zusammen die Apoptose und Nekrose unterscheidet. Apoptose Energie abhängig die Membranintegrität bleibt erhalten (bis zu sehr späten Stadien) Kondensieren der Zelle geordnete DNA Degradation Zellreste werden durch Makrophagen oder Nachbarzellen eliminiert immunosupressiv Nekrose Energie unabhängig Zusammenbruch der Membranintegrität Anschwellen der Zelle und anschließendes Platzen ungeordnete DNA Degradation Zellreste werden nicht eliminiert und in das umgebene Gewebe freigesetzt stimuliert das Immunsystem Tabelle 1: Physiologische und morphologische Charakteristika der Apoptose und der Nekrose Autophagie beschreibt den partiellen Selbstverdau der Zelle, der ein Überlebensmechanismus bei kurzzeitiger Limitation an Nährstoffen oder Wachstumsfaktoren darstellen kann, oder beim vollständigen Ablauf zum Zelltod führt (Levine, 2005). Apoptose ist ein evolutiv hoch konservierter, genau definierter und strikt regulierter Prozess, der für mehrzellige Organismen unabdingbar ist. Untersuchungen an dem Nematoden Caenorhabditis elegans ermöglichten erste Einblicke in die molekularen Mechanismen der Apoptose (Ellis et al., 1986). Apoptotische Zellen zeigen eine Abfolge typischer morphologischer Veränderungen. Die Zelle schrumpft, ihre Oberfläche verformt sich und sie verliert den Kontakt zur extrazellulären Matrix und zu ihren Nachbarzellen. Zytoplasma und Chromatin kondensieren, der Zellkern löst sich auf und die DNA wird fragmentiert. Schließlich löst sich die Zelle auf, wobei sogenannte apoptotische Körperchen gebildet werden, welche die Zellbestandteile beinhalten und von einer intakten Membran umgeben sind. Die apoptotischen Körperchen werden dann von Nachbarzellen oder Makrophagen phagozytiert und verdaut. Phosphatidylserinreste, die 1

10 I. Einleitung bereits in einem frühen Stadium auf der Plasmamembran exponiert werden, dienen dabei als sogenannte eat me Signale für phagozytierende Zellen. Ein genetisch determiniertes Programm, welches zum Zelltod führt und jederzeit durch verschiedene Stimuli aktiviert werden kann, ist essentiell für einen vielzelligen Organismus. Schon während der Embryogenese spielt Apoptose für die Ausbildung und Entwicklung von Organen und Geweben eine wichtige Rolle und ist ebenso wichtig für die Homeostase eines adulten Organismus, in dem Zellproliferation und Zelltod ein delikates Gleichgewicht bilden. Dieses Gleichgewicht wird über ein komplexes und hoch reguliertes System von Wachstums und Überlebensfaktoren erhalten, die über Wachstumsinhibitorische und Zelltod-induzierende Signalwege wirken. Auch für die Funktion des Immunsystems ist Apoptose von großer Bedeutung. Zum einem für die selektive Proliferation der B und T Lymphozyten, und unter anderem auch für das Entfernen antigenspezifischer Lymphozyten deren Anzahl bei einer Immunreaktion stark erhöht wurde (Krammer, 2000; Bouillet et al., 2002; Zhang et al., 2005). Eine weitere wichtige Funktion der Apoptose ist die Entfernung von alten, defekten oder entarteten Zellen aber auch von virus-infizierten Zellen aus dem Gewebe. Bei der Entstehung von Tumoren und Metastasen ist die Fehlregulierung der Apoptose ein entscheidender Schritt, (da Costa et al., 1996; Zornig et al., 2001). Nicht nur die Fähigkeit, sich unkontrolliert zu teilen, sondern auch das Vermeiden von Apoptose bewirkt, dass ein transformierter Zellklon überleben kann und immortalisiert. Die meisten Tumore weisen daher eine Resistenz gegenüber apoptotische Stimuli auf (Hanahan et al., 2000; Jaattela, 2004). Aber nicht nur bei der Entstehung von Krebs sondern auch bei anderen Krankheiten spiel eine Deregulation der Apoptose eine Rolle z.b. bei Autoimmunkrankheiten, AIDS, Alzheimer und Huntington (Vila et al., 2003; Ethell et al., 2003; Huang et al., 2005; Zhang et al., 2004a). I.2 Caspasen Für die Ausführung des apoptotischen Programms sind Caspasen (cysteinyl aspartatespecific proteases) verantwortlich, Cysteinproteasen, die ihre Substrate spezifisch C-terminal nach einem Aspartat spalten (Alnemri et al., 1996). Caspasen werden als katalytisch inaktive Procaspasen synthetisiert, die 3 typische Domänen aufweisen, eine N-terminale Prodomäne gefolgt von einer großen (p20, kd) und einer kleinen (p10, kd) Untereinheit. Die Aktivierung erfolgt durch proteolytische Spaltung an spezifischen Asparaginresten, was zu einer Trennung der Prodomäne bzw. der großen und 2

11 I. Einleitung der kleinen Untereinheit führt. Die große Untereinheit enthält den katalytisch aktiven Cysteinrest innerhalb eines konservierten QACXG Motivs. Für die katalytische Aktivität werden die den Cysteinrest tragende Bereiche zweier Moleküle benötigt. In ihrer aktiven Form liegen Caspasen daher als Homodimere bzw. Tetramere aus zwei großen und zwei kleinen Untereinheiten vor (Abb. 1A). Bei Säugetieren sind 12 verschiedene Cysteinproteasen beschrieben (Launay et al., 2005). Caspasen können nach ihrer Strukturähnlichkeit und phylogenetischen Verwandtschaft unterteilt werden. Am geläufigsten ist aber eine Gruppierung in Interleukin-ß-converting enzyme (ICE)-ähnliche Caspasen (nach der als erstes beschriebenen Caspase-1 oder ICE), Initiatorcaspasen und Effektorcaspasen. Caspasen-1,- 4, -5, -11, -12, und -14 zählen zu der ersten Gruppe und sind hauptsächlich an der proteolytischen Zytokinprozessierung bei Entzündungsreaktionen beteiligt (Earnshaw et al., 1999;Denault und Salvesen, 2002), für Caspase-4 und -12 ist aber z.b. auch eine beteiligung an ER-Stress induzierten Zelltod beschrieben. Die Caspasen-2, -3, -6, -7, -8, -9 und -10 sind hauptsächlich (aber nicht ausschließlich) an der Apoptose beteiligt. Zusammen mit den Initiatorcaspasen zeichnen sich die Caspasen der ersten Gruppe durch den Besitz einer großen Prodomäne aus, welche homologe Strukturmotive enthält - die Death Effector Domain (DED) oder die Caspase Activating Recruting Domain (CARD) - und welche die Interaktion mit anderen Proteinen ermöglicht. Initiatorcaspasen (2, 8, 9, 10) und Effektorcaspasen (3, 6, 7) werden nach der Reihenfolge ihrer Aktivierung unterschieden (Abb. 1B). Initiatorcaspasen (2, 8, 9 und 10) stehen am Anfang der Signaltransduktion. Mittels der homologen Protein-Protein Interaktionsdomänen innerhalb ihrer Prodomäne erfolgt die Rekrutierung der Procaspase in einen Proteinkomplex, was dann zur Aktivierung der entsprechenden Caspase führt. Auf die Aktivierung der Initiatorcaspasen wird in Abschnitt I.3.1 und I.3.2 noch genauer eingegangen. Effektorcaspasen liegen sowohl in ihrer inaktiven als auch in ihrer aktiven Form als Homodimere vor. Proteolytische Spaltung der kleinen und großen Untereinheit durch Initiatorcaspasen führt zu ihrer Aktivierung. Die Intramolekulare Spaltung verändert die Konformation des katalytischen Zentrums und erhöht damit drastisch die katalytische Aktivität, in einem zweiten Prozessierungsschritt erfolgt die Trennung von der Prodomäne. 3

12 I. Einleitung A B Gruppe I Große katalytische NH 2 CARD COOH Caspase-1 Untereinheit NH 2 CARD COOH Caspase-4 Kleine katalytische NH CARD COOH Caspase-5 Untereinheit 2 NH 2 CARD COOH Caspase-12 Prodomäne NH 2 COOH Caspase-14 Gruppe II NH 2 CARD COOH Caspase-2 NH 2 DED DED COOH Caspase-8 NH2 CARD COOH Caspase-9 NH 2 DED DED COOH Caspase-10 Asp-x Asp-x Gruppe NH 2 Prodomäne p20 p10 COOH NH 2 COOH IIICaspase-3 SHG QACXG NH 2 COOH Caspase-6 p10 NH 2 COOH Prodomäne p20 Caspase-7 Tetramer/ aktive Caspase p20 p10 p10 p20 Abbildung 1 Unterteilung, Domänenstruktur und Aktivierung der humanen Caspasen A) Unterteilung der Familie der humanen Caspasen in drei Hauptgruppen. Caspasen die vorwiegend an Entzündungsprozessen beteiligt sind (Gruppe I), apoptotische Initiatorcaspasen (Gruppe II) und apoptotische Effektorcaspasen (Gruppe III). Das ursprünglich als Caspase-13 bezeichnete Protein stellte sich als bovines Homolog der Caspase-4 heraus und Caspase-11 stellt wahrscheinlich ein murines Homolog der Caspasen-4 und -5 dar. B) Aktivierung von Procaspasen mittels Proteolyse an spezifischen Asp-Resten. Der erste Prozessierungschritt trennt die große und kleine Untereinheit, die kleine Untereinheit bleibt an der großen Untereinheit gebunden. Der zweite Prozessierungsschritt führt zur Abtrennung der Prodomäne und Bildung des aktiven Tetramers. Die Motive QACXG und SHG bilden das katalytische Zentrum. Modifiziert nach Lavrik et al., 2005 Die Aktivität der Effektorcaspasen führt letztendlich zum Tod der Zelle, der mit den zuvor beschriebenen charakteristischen morphologischen Veränderungen einhergeht (Fischer et al., 2003). Bisher sind mehr als 100 verschiedene Substrate von Effektorcaspasen beschrieben (Enari et al., 1998; Kaufmann et al., 2001; Launay et al., 2005), die sich grob unterteilen lassen in Strukturproteine (z.b. Zytoskelettproteine), Zelladhäsionsmoleküle, nukleare Interfilamentproteine (z.b. Aktin, Gelsolin, LaminA), Inhibitorische Proteine (z.b. das Inhibitorproteins ICAD (Inhibitor of Caspase Activated DNase), dessen proteolytischen Spaltung die DNase CAD (Caspase Activated DNase) aktiviert, welche wiederum die charakteristische Degradation der genomischen DNA ausführt), Reparaturproteine (z.b. DNA-PKCS und PARP-1 (Poly(ADP-Ribose) Polymerase-1) und Apoptose-inhibierende Proteine (z.b. XIAP). Untersuchungen an Caspase-3 und -7 Knock-out bzw. Doppel-Knock-out Mäusen zeigten, dass Caspase-3 und -7 sowohl überlappende als unterschiedliche Funktionen in der 4

13 I. Einleitung Apoptose haben. Caspase-3 ist für die DNA Fragmentierung und anderen morphologischen Veränderungen verantwortlich, Caspase-7 spielt neben Caspase-3 haupsächlich bei dem Verlust der Zellviabilität eine Rolle (Lakhani et al., 2006). Die Effektorcaspase-6 ist hauptsächlich in neuronalen Geweben exprimiert (Guo et al., 2006). I.3 Apoptotische Signalwege Momentan werden drei apoptotische Signalwege unterschieden, die aber miteinander in Verbindung stehen. Der intrinsische oder mitochondriale Signalweg wird durch Signale innerhalb der Zelle aktiviert, durch oxidativen Stress, schweren DNA Schäden (z.b. durch Bestrahlung oder zytotoxischen Verbindungen, Zytokinentzug oder Verlust der Zelladhesion (Anoikis) (Kaufmann et al., 2000; Grossmann, 2002; Green et al., 2005; Bouchier-Hayes et al., 2005). Der extrinsische oder Rezeptor-vermittelte Signalweg wird durch Signale außerhalb der Zelle initiiert, z.b. wenn onkologisch oder virologisch transformierte Zellen von Effektorzellen des Immunsystems erkannt werden (Fas et al., 2006). Als drittes wird noch der Endoplasmatisches Reticulum-(ER)vermittelte Signalweg beschrieben, auf den hier aber nicht näher eingegangen werden soll (Boyce und Yuan, 2006). Das zentrale Ereignis im mitochondrialen Apoptoseweg ist die Permeabilisierung der äußeren Mitochondrienmembran (MOMP, Mitochondrial Outer Membran Ppermeabilisation), was zur Freisetzung pro-apoptotischer Proteine aus dem mitochondrialen Intermembranraum führt. Zu diesen Proteinen zählen Cytochrom c, AIF (Apoptosis-Inducing Factor), EndoG (Endonuclease G), Omi/HtrA2 (High temperature requirement A2) und Smac/DIABLO (Second mitochondria-derived activator of caspase/ Direkt IAP Binding Protein with a Low isoelectric point). Derzeit beschreiben zwei Modelle den Mechanismus der zum MOMP führt. Das Mitochondrial Permeability Transition (MPT) Modell beschreibt die Öffnung eines Porenkomplexes, der beide mitochondrialen Membranen umspannt und hauptsächlich aus dem Adenine Nucleotide Translocator (ANT) der inneren Membran, dem Voltage Dependent Anion Channel (VDAC) der äußeren Membran und dem Matrixprotein CyclophylinD besteht (Belzacq et 2+ al., 2003). Die CaP P-abhängige Öffnung der Pore führt zum HB2BO und Ionen Influx, Anschwellen des Mitochondriums und Ruptur der äußeren Membran. Man geht jetzt aber davon aus, dass die MPT nur bei einigen wenigen pro-apoptotischen Stimuli eine Rolle spielt und vielmehr für den nekrotischen Zelltod bedeutend ist (Baines et al., 2005; Nakagawa et al., 2005). Für die Apoptose bedeutender ist wahrscheinlich das zweite 5

14 I. Einleitung Modell, nach welchem Bax und Bak (pro-apoptotische Mitglieder der Bcl-2 Familie, siehe Abschnitt I.4) nach ihrer Aktivierung oligomerisieren und Diskontinuitäten oder Poren in der äußeren mitochondrialen Membran bilden (Green, 2005). Im mitochondrialen Apoptoseweg ist Caspase-9 die Initiatorcaspase, welche die Effektorcaspasen aktiviert. Ihre Aktivierung erfolgt durch Bindung über die CARD Domäne an einem Proteinkomplex, dem Apoptosom, welcher im wesentlichen aus Caspase-9, Apaf 1 (Apoptotic protease activating factor-1) und Cytochrom c besteht. Der essentielle Schritt zur Aktivierung der Caspase-9 ist nicht ihre Prozessierung, sondern vielmehr die Bindung und dadurch induzierte stabile Homodimerisierung an Apaf 1. Caspase-9 kann nur an oligomerisiertes Apaf 1 binden, die dazu notwendig Konformationsänderung wird durch datp bzw. ATP Hydrolyse induziert. Die Nukleotidbindungsstelle in Apaf 1 wird aber erst durch Bindung von Cytochrom c an monomerem Apaf 1 zugänglich. Daher ist die Freisetzung von Cytochrom c die Voraussetzung für die Bildung des Apoptosoms und Aktivierung von Caspase-9. Caspase-9 aktiviert dann die Effektorcaspasen-3 und -7 was schließlich zum Tod der Zelle führt. Caspase-abhängige p75 Proteolyse, einer Komponente des Atmungskettenkomplexes I, führt außerdem zum Zusammenbruch des Membranpotentials, ATP Mangel und der Produktion freier Radikale. Die mitochondrialen Endonukleasen AIF und EndoG translozieren in den Nucleus und sind an der Chromatin Kondensierung und DNA Fragmentierung beteiligt (Susin et al., 1999; Li et al., 2001). Neuere Erkenntnisse an Caspase-3 und -7 Doppel-Knock-out Mäusen zeigten außerdem, dass Caspase-3 und -7 entscheidend an dem Verlust des mitochondrialen Membranpotential und der der Tanslokation des AIF beteiligt sind (Lakhanil et al., 2006). Die Rezeptor-vermittelte Apoptose wird ausgelöst durch Bindung eines sogenannten Todesliganden (Death Ligand) an seinem entsprechenden Todesrezeptor (Death Receptor), am besten charakterisiert sind CD95/Fas und TRAIL Rezeptor 1 und 2. Die Bindung des spezifischen Liganden induziert eine Trimerisierung des Rezeptors, was die Interaktion der intrazellulären Rezeptordomäne mit dem zytoplasmatischen Protein FADD (FAS Associated Death Domain) begünstigt und dessen Oligomerisierung induziert. Die Proteininteraktion erfolgt über die konservierte homologe Todesdomäne (Death Domain, DD). Die Adapterproteine besitzen eine zweite konservierte Domäne, die Todeseffektordomäne (Death Effector Domain, DED) über welche die Initiatorcaspasen-8 und/oder -10 in den Rezeptorkomplex, dem sogenannten Death Inducing Signaling Complex (DISC), dem Tod-induzierenden Signalkomplex, rekrutiert werden. Die Bildung 6

15 I. Einleitung des DISC ermöglicht die Aktivierung der Initiatorcaspasen, der genaue Mechanismus ist noch nicht aufgeklärt. Das proximitiy induced dimerisation Modell geht davon aus, dass der DISC eine Plattform bietet, welche die Dimersierung und die räumliche Anordnung für die darauffolgende autokatalytische Prozessierung der Procaspasen ermöglicht (Shi, 2000a,b). Grundsätzlich sind zwei Prozessierungsschritte für die Aktivierung notwendig. Die stabile Oigomerisierung im DISC ermöglicht zunächst die Prozessierung zwischen der großen und der kleinen Untereinheit und anschließend die autokatalytische Prozessierung zur aktiven Caspase durch Abspaltung der Prodomäne. Anzumerken sei, dass Shin et al kürzlich für TRAIL-induzierte Apoptose ein Modell zeigten, in welchem Caspase-2 in unstimulierten Zellen den ersten Prozessierungsschritt der Caspase-8 vermittelt und die Rekrutierung der voraktivierten Caspase-8 in den DISC dann zu deren vollständigen Aktivierung führt. Procaspase-8 (FLICE, Mach) ist essentiell für Todesrezeptor-vermittelte Apoptose, und Caspase-8 Deletion in Mäusen führt zur embryonalen Letalität. Die genaue Rolle der Caspase-10 ist noch unklar. Obwohl sie eine hohe Homologie zu Caspase-8 und eine nahezu identische Aktivierungskinetik zeigt, scheint sie Caspase-8 funktionell nicht ersetzen zu können. Caspase-8/-10 aktivieren dann die Effektorcaspasen und den mitochondrialen Apoptoseweg. Die Verbindung zwischen extrinsischen und intrinsischen Signalweg besteht über Bid, ein Mitglied der Bcl-2 Familie und ein Caspase-8 Substrat. Bereits geringe Mengen des durch Caspase-8 prozessierten Bid induzieren die Translokation von Bax in die mitochondriale Membran und damit dessen Homo- und Heterooligomerisierung mit dem membranlokalisierten Bak, was zur Aktivierung des mitochondrialen Signalweges und damit zur Amplifikation des Rezeptor-vermittelten apoptotischen Signals führt. Bezüglich der Bedeutung des mitochondrialen Signalwegs für das Rezeptor-vermittelte apoptotische Signal unterscheidet man sogenannte Typ I und Typ II Zellen. In Typ I Zellen aktiviert das Ligand-Rezeptor-System über den DISC genügend Initiatorcaspasen um Caspase-3 vollständig zu aktivieren und Zelltod auszulösen. In Typ II Zellen ist die DISC Bildung und dementsprechend die Caspase-8 Aktivierung dafür nicht ausreichend. Zur Durchsetzung und Amplifikation des apoptotischen Signals bedarf es daher der Aktivierung des mitochondrialen Signalweges. In Typ II Zellen wird durch Inhibierung des mitochondrialen Weges (durch z.b Überexprssion von Bcl-2 und Bcl-xL) die Apoptose verhindert (Scaffidi et al., 1998). Der Rezeptor-vermittelte und der mitochondrialvermittelte Apoptosesignalweg sind in Abbildung 2 dargestellt. 7

16 I. Einleitung Aktive Caspase- 3/6/7 A Todesrezeptor B Todesligand DD Aktive Caspase-8 I DD DD DD p10 p18 p10 p18 II Bid tbid DD DD DD FADD DED Caspase-8 DD DED DD Caspase-8 DED DD DD DED DD DISC Puma? DED DED DD DD DED DD DED DD DD z.b irreperabler DNA Schaden p53 Bak/Bax Cytochrom C Procaspase-9 CARD Apaf-1 Procaspase-3/6/7 Aktive Caspase-9 Apoptosom Substrate Apoptose Abb. 2 Apoptotische Signalwege ämm Der extrinsische Signalweg wird ausgelöst durch die Bindung des Liganden an seine spezifische Rezeptoren. Die Rezeptoren liegen IMR als Monomere (Modell A) oder über eine Pre-Ligand-Assembly Domain assoziiert vor (Modell B). Die Rezeptortrimersierung imm induziert die Bildung des DISC was zur Aktivierung der Matrix Initiatorcaspase-8 führt, die Rezeptoren werden anschließend internalisiert. Typ I Zellen (Weg I) können ausreichend Caspase-8 aktivieren um die Effektorcaspasen direkt zu aktivieren, Typ II Zellen (Weg II) benötigen die Amplifikation über den mitochondrialen Signalweg, die Verbindung besteht über Bid. TBid aktiviert Bax, welches zusammen mit Bak Poren in der äußeren mitochondrialen Membran (ämm) bildet, wodurch Cytochrom c aus dem Intermembranraum (IMR) freigesetzt wird (kleines Kästchen) modifiziert nach Bouchier-Hayes et al., Cytochrom c ermöglicht die Bildung des Apoptosoms, was zur Aktivierung der Caspase-9 führt, die wiederum Effektorcaspasen aktiviert. Der mitochondriale Signalweg wird auch durch Signale innerhalb der Zelle aktiviert, z.b. durch irreperable DNA Schäden. Die molekularen Mechanismen, welche letztendlich zur Aktivierung von Bax/Bak führen sind noch nicht vollständig aufgeklärt. Es gibt Hinweise, dass z.b. das p53 regulierte Protein Puma, Bax direkt aktivieren kann. tbid Cytochrom C Bax/Bak Pore 8

17 I. Einleitung I.4 Regulation der Apoptose Die Apoptose ist ein komplexer, hoch regulierter Prozess an dem eine Vielzahl von Proteinen beteiligt ist. Die Apoptose unterliegt daher einer strengen inhibitorischen Kontrolle, welche an verschiedenen Stellen des Signalweges eingreift. Auf Stufe des DISC kann c-flip (cellular FLICE inibitory protein) die Aktivierung der Initiatorcaspasen-8 und -10 inhibieren (Irmler et al., 1997). C-Flip ist der Procaspase-8 und -10 homolog und in Säugetieren liegt es in zwei Splicevarianten vor, einer langen (L long) und einer kurzen (S short) Isoform (c-flipblb und c-flipbsb). C-Flip besitzt analog der Caspase-8 und -10 zwei DED. C-FlipBLB besitzt eine Caspase-ähnliche Domäne, aber aufgrund des Verlustes eines Cysteinrestes keine enzymatische Aktivität, c-flipbsb fehlt der größte Teil der Caspase-ähnlichen Domäne. Über die Tandem DED Domäne kann c-flip mit FADD oder Procaspase-8 interagieren und deren Aktivierung behindern (Krueger et al., 2001). Die Interaktion von c-flipblb führt zu einer proteolytischen Spaltung beider Proteine, allerdings bleibt c-flipbl Ban der Initiatorcaspase gebunden und verhindert so deren weitere Aktivität, c-flipbsb unterbindet die initiale Prozessierung der Procaspase. Caspase Inhibitoren wurden zuerst in Viren identifiziert, die so der apoptotischen Immunantwort des Wirtsorganismus entgehen. Neben vflip (viral Flip), Serpin CrmA (Cytokine response modifier A aus dem cowpox virus) gibt es noch p35 und die IAPs (Inhibitor of Apoptosis Proteins) aus Baculovirus (Zhou et al., 1998; Riedl et al., 2001). In Säugetieren sind 8 Vertreter der IAP Familie bekannt, u.a. XIAP, ciap-1+2, Survivin und NAIP. Nicht alle IAPs haben ihre primäre Funktion in der Inhibition von Caspasen. Für NAIP konnte keine Bindung an Caspasen gezeigt werden. Survivin ist vorwiegend in malignen Zellen exprimiert, ist aber ein relativer schwacher Caspase Inhibitor und die Aktivität von Survivin wurde eher mit der Regulation des Zellzyklus und Mitose in Zusammenhang gebracht (Earnshaw, 2005; Rosa et al., 2006). IAPs besitzen bis zu drei konservierte BIR-Domänen (Baculoviral IAP Repeat), die ein drei-cystein-ein-histidin Zinkbindungsmotiv, das BIR-Motiv, gemeinsam haben. Über diese BIR-Domänen erfolgt die Interaktion mit anderen Proteinen (Scott et al., 2005,Vaux und Silke, 2005). Neben den BIR-Domänen finden sich häufig noch weitere konservierte Domänen wie die CARD Domäne (Vgl I.2) oder die RING-(Really Interesting New Gene) Domäne. In Abbildung 3 ist die Domänenstruktur einiger humaner IAPs dargestellt. 9

18 I. Einleitung XIAP BIR BIR BIR RING 497 ciap1 BIR BIR BIR CARD RING 604 ciap2 BIR BIR BIR CARD RING 618 MLIAP BIR RING 298 Survivin BIR 142 Abbildung 3 Domänenstruktur einiger humaner IAPs. IAPs bestehen aus einer oder mehreren BIR Domänen (bacuoviral IAP repeat). Häufig weisen sie weitere Domänen auf, z.b eine CARD Domäne und/oder eine RING Domäne, welche zu E3-Ubiquitin Ligasen homolog ist. Die Länge (Anzahl der AS) ist daneben angegeben. Modifiziert nach Stennicke et al, Als stärkster Caspase-Inhibitor ist XIAP (X-linked IAP) beschrieben (Deveraux et al., 1997). Es sind zwei Mechanismen der XIAP Inhibition beschrieben. Zu einem bindet XIAP direkt an die aktive Zentren von Caspase-3 und Caspase-7 und inhibiert so die vollständige Aktivierung durch Autokatalyse der intermediären Form der Caspasen, die Interaktion findet über zwei Bereiche, der BIR 2 und einer angrenzenden Linker Region, statt (Scott et al., 2005). Die Caspase-9 Aktivierung wird blockiert durch Interaktion über die BIR 3 Domäne mit dem Proenzym wodurch die Bildung des Apoptosoms gestört ist (Deveraux et al., 1999; Shiozaki et al., 2003). XIAP weist zusätzlich eine RING Finger Domäne mit E3-Ligase Aktivität auf, die sowohl eine Autoubiquitinierung, als auch eine Ubiquitinierung von u.a. Caspase-3 als ersten Schritt für eine proteosomale Degradation vermitteln kann (Suzuki et al., 2001; Vaux und Silke, 2005). XIAP inhibiert daher nicht nur Caspase-3 Aktivität, sondern fördert auch deren Degradation. XIAP wiederum stellt ein Substrat für aktive Caspase-3 dar. Eine negative Regulation der XIAP Aktivität findet über Omi/HtrA2 und Smac /DIABLO statt (Liu et al., 2000; Srinivasula et al., 2000; Suzuki et al., 2004). Während Smac eine essentielle Rolle als XIAP Antagonist in der Apoptose hat, scheint Omi v.a. bei oxidativen Stress und Hypoxie wichtig zu sein (Lindholm et al., 2004; Liu et al., 2005). Nach der Freisetzung aus den Mitochondrien inhibiert Smac XIAP durch direkte Interaktion über die BIR 2 und 3 Domäne, und fördert so die Aktivierung von Caspasen (Srinivasula et al., 2001). Die Mitglieder der evolutiv konservierten Bcl-2 Familie regulieren die Apoptose auf der Ebenen der Mitochondrien und des ER. Als erstes Mitglied wurde das Onkogen Bcl-2 in B-Zell Lymphoma identifiziert (Tsujimoto et al., 1985). Die Bcl-2 Proteine sind durch den Besitz von 1-4 Bcl-2 Homologiedomänen (BH1-BH4) gekennzeichnet. Desweiteren besitzen die meisten Mitglieder eine N-terminale Transmembranregion, die ihnen die 10

19 I. Einleitung Lokalisation in die Membranen der Mitochondrien, des ER und des Nukleus ermöglicht (Petros et al., 2004; Letai, 2005). Die Kontrolle der mitochondrialen Apoptose durch die Bcl-2 Proteinfamilie ist komplex und noch nicht exakt aufgeklärt (Abb. 4). Bax und Bak (vgl. I.3) sind multi(bh3)domäre Mitglieder mit pro-apoptotischer Funktion. Bcl-2 und Bcl-xBL Bsind die am besten beschriebenen multidomären Mitglieder mit anti-apoptotischer Funktion. Ihre Überexpression kann die mitochondriale Apoptose inhibieren. Eine Untergruppe bilden die BH3-only Proteine, pro-apoptotische Proteine mit nur der BH3 Domäne (z.b. Bad, Bik, Bid, Noxa und Puma). Sie werden auf verschiedene Weise aktiviert. Puma und Noxa werden z.b. nach DNA Schädigung p53-abhängig hochreguliert, Entzug von Wachstumsfaktoren dephosphoryliert Bad und setzt es von seinem Interaktionspartner frei, Bid wird durch proteolytische Spaltung aktiviert (Harada et al., 1999; Luo et al., 1998; Villunger et al., 2003; Li et al., 2006). Zelltod-Signal i. ii Aktivierende BH3-only Sensitivierende BH3-only Bid Bim (Puma) Bad Bik (Noxa) Bmf Hrk (Puma) iii. iv. Pro-apoptotische Multidomäre Anti-apoptotische Multidomäre Bax Bak Bcl-2 Bcl- x L Bcl-1 Bcl-w MOMP Aktivierung von BH1 BH2 BH3 BH4 Caspase-9 Abbildung 4 Modell der Funktion der Mitglieder der Bcl-2 Familie in der Regulation der mitochondrialen Apoptose. Verschiedene Signale (u.a. DNA Schaden, oxidativer Stress) führen zur Aktivierung der BH3-only Mitglieder (i,ii). Aktivierende BH3-only Mitglieder (i) interagieren direkt mit den pro-apoptotischen Mitgliedern Bax und Bak und induzieren deren Oligomerisierung, was zur MOMP, Bildung des Apoptosoms und schließlich zur Aktivierung von Caspase-9 führt. Anti-apoptotische Mitglieder wie Bcl-2 und Bcl-xBLB (iv) antagonisieren das Todessignal dadurch, dass sie die aktivierenden BH3-only Mitglieder und eventuell auch Bax/Bak binden. Das Abfangen der anti-apoptotischen Mitglieder durch sensitivierende BH3-only Mitglieder (ii) verschiebt das Gleichgewicht wiederum zur Apoptose hin. Modifiziert nach Letai Abbildung 5 zeigt die Rolle inhibitorischer bzw. regulatorischer Proteine in den apoptotischen Signalwegen. 11

20 I. Einleitung Entzug von Wachstumsfaktoren Ca2+ UV Strahlung Anoikis DNA Schäden DED DED Pro- C-Flip caspase-8 Bim Bad Bmf Bcl-2 Bcl-x L p53 Noxa Puma Aktive Caspase-8 Bid tbid Bak/Bax Cytochrom c Procaspase-9 Apaf-1 Procaspase-3/6/7 XIAP Smac/Diabolo Apoptosom Aktive Caspase-3/6/7 Aktive Caspase-9 Substrate Abbildung 5 Inhibitorische bzw. regulatorische Proteine in den apoptotischen Signalwegen Inhibitorische Proteine sind rot, Apoptose-fördernde Proteine grün dargestellt. I.5 Der nukleare Faktor kappa B (NF-κB) Apoptose Nuklearer Faktor-kappaB (NF-κB) ist eine ubiquitinär exprimierte, induzierbare Familie von Transkriptionsfaktoren. In Säugetieren sind 5 Mitglieder beschrieben - p65(rela), c-rel, RelB, p50/p105, p52/p100 -, welche dimerisieren und eine Vielzahl verschiedener homodimerer und heterodimerer Transkriptionskomplexe bilden können. Die Untereinheiten p50 und p52 entstehen aus ihren Vorläuferproteinen p105 und p100 durch konstitutive Prozessierung bzw. induzierte proteasomale Prozessierung (p100). Die NF-κB Mitglieder sind durch den Besitz der N-terminalen 300 AS langen konservierten Rel-Homology-Domain (RHD) gekennzeichnet, die eine nukleare Import Sequenz enthält und über die DNA-Interaktionen, sowie Bindungen zu anderen Untereinheiten und Inhibitoren vermittelt wird. Obwohl alle Mitglieder an die DNA binden können, haben nur 12

21 I. Einleitung p65, c-rel, und RelB Transaktivierungsaktivität (Hayden et al., 2004; Aggarwal, 2004). Die verschiedenen Dimere binden spezifisch an Promotoren oder Enhancer Regionen und initiieren die Transkription einer Vielzahl von Genen. Eine besonders wichtige Rolle spielt NF-κB im Immunsystem. Die durch NF-κB regulierten Proteine sind v.a. an Entzündungsreaktionen, an Zelltod bzw. Überleben der Zellen und Gewebereparatur beteiligt (Hayden et al., 2004; Karin et al., 2002; Karin et al., 2005). Aktiviert werden kann NF-κB durch eine Vielzahl von Stimuli, beispielsweise Zytokine (TNF-α, IL-1), Radikale, UV-Strahlen sowie bakterielle oder virale Substanzen. Abbildung 6 gibt einen Überblick über die Genfamilien die durch NF-κB reguliert werden, sowie NF-κB induzierende Stimuli. Zytokine (TNF-Familie, IL1, IL17, IL18) Karzinogene Immortalität Apoptose Induziere r Chemotherapeutische Substanzen, Strahlung NF-κB Infektion viral/bakteriell Stress ph, Hypoxie ROS Induzierer H Entzündung e.g. Telomerase TNF, IL1, Chemokine Metastase e.g. ICAM1, VCAM1 Angiogenese e.g. VEGF, TNF, IL6, IL8 Tumor Promotion e.g. COX2, inos Proliferation Anti-Apoptose/ Überleben e.g. TNF, IL1, IL6, e.g. XIAP, Bcl-x L, cflip CyclinD1, CMyc Abbildung 6 Stimuli die zu einer NF-κB Aktivierung führen und Genfamilien die durch NF-κB reguliert werden. Modifiziert nach Aggarwal, In seiner inaktiven Form liegt NF-κB im Zytoplasma an Inhibitorproteinen (IκBs: IκBα, β, ε, γ, BCL3, p100, p105) gebunden vor. Die Aktivierung erfolgt über verschiedene Kinasekaskaden durch Inhibitor κb-kinasekomplex (IKK)-vermittelte Phosphorylierung der IκBs. Der IKK setzt sich aus zwei katalytischen Untereinheiten (IKKα und IKKβ) und einer regulatorischen Untereinheit (IKKγ/NEMO) zusammen (Karin et al., 2002). Abbildung 7 zeigt die Mitglieder der NF-κB-Familie, Inhibitor κb-familie und IKK-Familie. 13

22 I. Einleitung NF-κB/Rel Familie p65 (RelA) RelB c-rel p100/ p52 p105/ p50 IκB Familie IκB-α IκB-β IκB-ε IκB-γ Bcl-3 IΚΚ Untereinheiten IKK-α IKK-β NEMO (IKK-γ) Abbildung 7 Mitglieder der NF-κB, IκB und IKK Proteinfamilie RHD Rel Homology Domain; TAD Transactivation Domain; LZ Leucine Zipper domain; GRR Glycine-Rich Region; HLH Helix-Loop-Helix domain; Z Zinc finger domain; NBD NEMO-Binding Domain. Nach Hayden und Ghosh Es gibt zwei NF-κB Aktivierungswege (Abb. 8). Im klassischen Aktivierungsweg führt die Aktivierung der IKKβ Untereinheit zur Phosphorylierung der IκB Proteine an zwei spezifischen N-terminalen Serinresten (IκB-α an Serin 32 und Serin 36), was das Signal zur Ubiquitinierung darstellt und zur Degradation der IκBs durch das 26S-Proteasom führt (DiDonato et al., 1997; Chen, 2005). Die gebundenen IκBs maskieren die nukleare Importsequenz der p65/c-rel NF-κB-Untereinheit. Nach Degradation des IκB akkumuliert NF-κB im Nukleus und kann NF-κB-abhängige Gene induzieren. Der klassische Weg führt hauptsächlich zur Aktivierung von NF-κB Komplexen, die aus p65, crel, p50 Hetero-und Homodimeren bestehen. Der alternative NF-κB Aktivierungsweg spielt in der Immunfunktion für sekundäre Lymphoidorgane eine Rolle und wird durch eine Untergruppe von Signalen induziert (Bonizzi et al., 2004; Karin et al., 2005). IKK-α Homodimer-vermittelte Phosphorylierung führt zur proteasomalen Prozessierung der p100 Vorläufer Proteine und zur selektiven Aktivierung von RelB/p52 Dimeren (Senftleben et al., 2002; Karin et al., 2005). Die NF-κB Aktivität kann dann durch verschiedene Mechanismen wieder herunterreguliert werden, u.a. durch den gut beschrienen Rückkopplungsmechanismus, bei welchem NF-κB-induziertes und neu synthetisiertes IκB-α nukleares NF-κB bindet und in das Zytosol exportiert. Obwohl auch pro-apoptotische Funktionen von NF-κB beschrieben sind, ist die am besten beschriebene und wahrscheinlich auch dominante Funktion die des Inhibitors des programmierten Zelltods. So führt z.b. p65 Defizienz in Mäusen zur embryonalen Lethalität infolge massiver Apoptose in der Leber (Doi et al., 1999). NF-κB induziert eine 14

23 I. Einleitung Reihe von Genen, die für sogenannter anti-apoptotische Proteine kodieren, u.a. c-flip, Bcl-xBLB, ciap1 und 2, XIAP und TRAF1 und 2 (Roy et al., 1997; Krueger et al., 2001; Srinivasula et al., 2001; Suzuki et al., 2001; Dempsey et al., 2003; Shiozaki et al., 2003). Man geht davon aus, dass NF-κB entscheidend an der Onkogenese und Tumorprogression beteiligt ist (Chen, 2005; Li et al., 2005). Klassische Weg Pro-inflammatorische Zytokine (TNF-α, IL-1β), Virus, TLRs, Antigen-Rezeptoren etc. Alternative Weg Zytokine LTβR, BAFF, CD40L NEMO IKKα IKKβ P P IκBα p65 p50 p65 p50 P P Ub Ub IκBα Ub Proteasomale Degradation IKKα Proteasomale Degradation von p100 zu p52 NIK IKKα Ub P Ub Ub p100 RelB p52 RelB p65 p50 p52 RelB mrna Transkription von Zielgenen mrna Zytokine (TNF-α, IL-1β, IL6,GM-CSF), Chemokine (IL-8, RANTES, MCP-1) Adhesionsmoleküle (VCAM-1, ICAM-1, E-Selectin) En zy me (inos, COX-2) Anti-apoptotische Gene (XIAP, cflip, Bcl-x L ) Zytokine (BAFF), Chemokine (BLC, SLC, ELC) Gene der Lymphoidorganentwicklung Andere Gene Abbildung 8 Signalwege der NF-κB Aktivierung Der klassische Weg (links) führt zur Aktivierung des IKK und zur IKKβ-abhängigen spezifischen Phosphorylierung der IκB Proteine. Die Phosphorylierung stellt das Signal zur Ubiquitinierung dar, was das Protein zur proteasomalen Degradation kennzeichnet. Der NF-κB Komplex transloziert anschließend in den Nukleus. Eigentlich besteht ein dynamisches Gleichgewicht von IκB gebundenen NF-κB zwischen Kern und Zytoplasma, welches nach Freigabe der NLS in p65 zu Gunsten der Kernlokalisation verschoben wird. Der alternative Weg (rechts) führt über NIK (NF-κB inducing Kinase) zur Aktivierung von IKKα Homodimeren, welche spezifisch p100 aus p100/relb Komplexen phosphorylieren. Die Proteasom-vermittelte Degradierung des p100 zu p52 führt zur selektiven Aktivierung von p52/relb Komplexen. Modifiziert nach Karin und Greten, 2004 und Luo et al., I. 6 Die TNF (Tumor Nekrosis Faktor)-Familie Diese Zytokin-Familie wurde benannt nach TNF (Tumor Necrosis Factor), welches als erstes beschrieben wurde, als Serum Faktor, der Nekrosis in bestimmten Maustumoren verursacht (Carswell et al., 1975). Derzeit umfasst die TNF-Familie 18 Gene, die für 19 Transmembranproteine codieren. Die meisten Mitglieder der TNF-Familie spielen eine 15

24 I. Einleitung wichtige Rolle in der Regulation und Modulation der Immunantwort, als auch bei pro-inflammatorischen und pathophysiologischen Prozessen. Die Mitglieder der TNF-Ligandenfamilie besitzen im C-terminalen extrazellulären Bereich eine konservierte 150 Aminosäuren umfassende homologe Domäne, die TNF-Homology Domain (THD), welche die Rezeptorbindung vermittelt. Sie werden mit Ausnahme von Lymphotoxin (LT) als Typ II Membranproteine exprimiert, d.h. sie besitzen eine transmembrane Domäne und der extrazelluläre Bereich kann durch alternatives Splicen der mrna oder durch spezifische Proteolyse des Membran-gebundenen Proteins in eine lösliche Form prozessiert werden, wobei die Aktivität der löslichen Form oft verringert zu sein scheint. Die Liganden sind nur als Homotrimere, welche sich spontan bereits im Zytoplasma bilden, biologisch aktiv (Fesik, 2000; 2004; Kelley et al., 2004; Bouralexis et al., 2005). Ihre Wirkung vermitteln die Mitglieder der TNF-Familie durch Binden an eine komplementäre Familie von Rezeptoren, den Mitgliedern der TNF-Rezeptor-Familie, von denen in Menschen bisher 29 identifiziert wurden. Eine Übersicht der wichtigsten Mitglieder der TNF-Liganden-Familie und der dazugehörigen Rezeptoren findet sich in Tab.2. Ligand (synonyme Bezeichnungen) TNFSF1 (Lymphotoxin a, TNF-β) TNFSF2 (TNF-α) TNFSF3 (Lymphotoxin α) Rezeptor (synonyme Bezeichnungen) TNFRSF1A (TNF-R1, p55-r) TNFRSF1B (TNF-R2, p75-r) TNFRSF1A (TNF-R1, p55-r) TNFRSF1B (TNF-R2, p75-r) TNFSF4 (OX-40L, gp34) TNFRSF4 (OX 40) TNFSF5 (CD 40L, gp39) TNFSF6 (FasL, CD95L, APO-1L) TNFSF7 (CD27L) TNFSF8 (CD30L) TNFSF9 (4-1BB-L) TNFSF10 (TRAIL, APO-2L) TNFSF11 (TRANCE, RANKL, ODF) Tabelle 2 TNFRSF3 (Lymphotoxin αr, CD18) TNFRSF5 (CD40) TNFRSF6 (FAS, CD95, APO-1) TNFRSF6B (DcR3, TR6) TNFRSF7 (CD27, Tp55) TNFRSF8 (CD30) TNFRSF9 (4-1BB, ILA) TNFRSF10A (DR4, TRAIL-R1, Apo2) TNFRSF10B (DR5, TRAIL-R2, KILLER) TNFRSF10C (DcR1, TRAIL-R3, TRID) TNFRSF10D (DcR2, TRAIL-R4, TRUNDD) TNFRSF11B (Osteoprotegerin) TNFRSF11A (RANK) TNFRSF11B (Osteoprotegerin) 16

25 I. Einleitung Fortsetzung Tabelle 2 TNFSF12 (TWEAK, APO3L) TNFSF14 (LIGHT) TNFRSF12 (DR3, TRAMP, APO-3) TNFRSF12 (LIGHTR) Tabelle 2 Mitglieder der TNF-Familie und ihre Rezeptoren. Angegeben ist die offizielle Bezeichnung und in Klammer alternative Namen, wobei der gebräuchlichste Name fett angegeben ist. Die Mitglieder der TNF-Rezeptor-Familie sind im extrazellulären Bereich durch den Besitz konservierter cysteinreicher Domänen (CRD) aus je ca. 40 AS mit 6 konservierten Cysteinen gekennzeichnet (Smith et al., 1994). Die Anzahl der CRD variiert innerhalb der Mitglieder zwischen 1 und 4. Bei den meisten Mitgliedern der TNF-Rezeptor-Familie handelt es sich um Typ I Transmembranproteine. Einige liegen als Typ III Transmembranproteine, ohne intrazelluläre Signaldomäne, vor, z.b. ist TRAIL-R3/TR3 über einen Glycolipid an der Membran verankert, OPN und DcR3 liegen ausschließlich in löslicher Form vor (Gruss, 1996; Wang et al., 2003a; Tamada et al., 2006). Eine Untergruppe der Rezeptor-Familie (TRAIL-R 1, 2 und 4, TNFR1, FAS, DR3) ist durch den Besitz einer weiteren homologen intrazellulären Domäne ausgezeichnet, der sogenannten Todesdomäne (Death Domain/ DD), ein ca. 80 Aminosäuren umfassendes Sequenzmotiv, über welches die Interaktion mit zytosolischen Proteinen erfolgt. Die Signalkaskade beginnt durch die Bindung des Liganden an seine spezifischen Rezeptoren, wobei der als stabiler Trimer vorliegende Ligand an drei Rezeptormoleküle bindet. Bisher wurde davon ausgegangen, dass die ungebundenen Rezeptoren als Monomere vorliegen (Hymowitz et al., 2000), allerdings wurde für FAS, TNFR1 und TRAIL-R2 zusätzlich eine Liganden-unabhängige Oligomerisierungsdomäne definiert, die Pre-Ligand-Assembly-Domain (PLAD), was auf eine Assoziation der Rezeptoren vor Ligandenbindung hindeutet (Chan et al., 2000; Clancy et al., 2005). Der timere Ligand-Rezeptor-Komplex bringt die intrazellulären Todesdomänen in eine Anordnung, welche die Interaktion mit den zytosolischen Adaptorproteinen Proteinen FADD (Fas-Associated Death Domain) und TRADD (TNFR1-associated Death Domain), die ebenfalls eine homologe Todesdomäne besitzen, begünstigt. Über diese Proteine erfolgt dann die Assoziation weiterer Faktoren. Eine der DD sehr ähnlichen Domäne, die Todeseffektordomäne (DED Death Effector Domain), vermittelt z.b. die Interaktion mit apikalen Caspasen. Nach der Bildung und Zusammensetzung ihres Signalkomplexes unterscheidet man zwei Gruppen. CD95/FAS, TRAIL-R1 und TRAIL-R2 rekrutieren direkt FADD, Caspase-8 und 10, was zur Bildung des Todessignalkomplexes, des sogenannten DISC 17

26 I. Einleitung (Death Inducing Signaling Complex) und Aktivierung der Apoptose führt. TNFR1 bildet an der Zellmembran den Signalkomplex 1, der TRADD, TRAF (TNFR Associated Factor)2, TRAF5 und RIP1 (Receptor Interacting Protein) umfasst. Durch den Komplex 1 werden verschiedene Kinasesignalkaskaden aktiviert, u.a. der IKK-NF-κB Weg. Der Komplex-1 dissoziiert anschließend von dem Rezeptor und bildet unter Rekrutierung von FADD und Caspase-8 den zytoplasmatischen Signalkomplex 2, welcher unter bestimmten Bedingungen Apoptose aktivieren kann (Micheau et al., 2003). I.7 TNF-Related Apoptosis-Inducing Factor Ligand (TRAIL) Humanes TRAIL (TNF-Related Apoptosis-Inducing Factor Ligand) wurde erstmals 1995 aufgrund seiner Sequenzhomologie zu FasL und TNF als neues Mitglied der TNF-Familie charakterisiert (Wiley et al., 1995; Pitti et al., 1996). Zu FasL hat TRAIL die höchste Homologie. TRAIL wird als transmembranes Protein Typ II exprimiert, d.h. es besitzt eine N-terminale zytoplasmatische Domäne und die C-terminale extrazelluläre Region kann nach Proteolyse ein lösliches Molekül bilden, dessen physiologische Bedeutung aber ungeklärt ist (Mariani et al., 1998b; Kimberley et al., 2004). Biologisch aktiv ist TRAIL als stabiles Trimer (Pan et al., 1997). Die physiologischen Funktionen von TRAIL sind noch weitgehend ungeklärt. Man geht davon aus, dass TRAIL für die Reaktivität und Homöostase des Immunsystems bedeutend ist und, u.a. an der Negativselektion von Immunzellen beteiligt ist (Kaplan et al., 2000; Liu et al., 2001; Hayakawa et al., 2004). Eine wichtige biologische Funktion stellt wahrscheinlich die Immunüberwachung gegen entartete und virusinfizierte Zellen dar. TRAIL wird von natürlichen Killerzellen, T Lymphozyten Makrophagen, Monozyten und dentritischen Zellen zum Teil konstitutiv, zum Teil induziert (z.b. durch Interferon (IFN)) exprimiert (Mariani et al., 1998a; Kayagaki et al., 1999; Liu et al., 2001) und erfüllt eine anti-metastatische Funktion (Smyth et al., 2001; Cretney et al., 2002; Takeda et al., 2002; Kamohara et al., 2004). Im Gegensatz zu den anderen Mitgliedern der TNF-Superfamilie, die nur transient auf aktivierten Zellen exprimiert werden, wurde TRAIL mrna in vielen Geweben nachgewiesen (Wiley et al., 1995; Pitti et al., 1996). Einzigartig innerhalb der TNF-Familie und dadurch für die Krebsforschung von großem Interesse ist TRAIL aufgrund seiner Eigenschaft Apoptose in Krebszelllinien und primären Tumorzellen zu induzieren, nicht aber in untransformierten Zellen (Ashkenazi et al., 1999; Walczak et al., 2000). Eine systematische Verabreichung von TNF-α und FasL (bzw. agonistischen Antikörpern) führt zu schweren toxischen Nebeneffekten. TNF-α führt zu 18

27 I. Einleitung letalen entzündlichen Reaktionen, die hauptsächlich über die Aktivierung von NF-κB in vaskulären Endothelialzellen und Makrophagen vermittelt werden, FasL führt zu tödlichen Leberschädigungen in Folge von massiven Zelltod in Hepatozyten (Tartaglia et al., 1993; Nagata, 1997). Lösliches rekombinantes humanes (rh)trail konnte keine Apoptose in verschiedenen Primärzelllinien induzieren und auch eine systematische Verabreichung von hohen Dosen (rh)trail zeigte keine Toxizität bei Nagern und nicht-humanen Primaten (Ashkenazi et al., 1999; Walczak et al., 1999; Kelley et al., 2001). Die klinische Anwendbarkeit von TRAIL wurde in Frage gestellt als eine Studie zeigte, dass rhtrail Apoptose in kultivierten humanen Hepatocyten induziert (Jo et al., 2000). Außerdem wurde eine Beteiligung von TRAIL an Leberzelltod und Entzündung in Betracht gezogen (Zheng et al., 2004). Lawrence et al wiederum zeigten, dass normale Hepatozyten nur gegen Histidin- oder Flag-tagged rhtrail sensitiv sind, nicht aber gegen die native Version von rhtrail. Rekombinantes lösliches TRAIL befindest sich derzeit in der klinischen Versuchsphase I (Genentech, Inc, CA, USA). Agonistisch-wirkende Antikörper gegen TRAIL-R 1 und TRAIL-R 2 befinden sich in der klinischen Versuchsphase I und II (Human Genome Sciences, Rockville, MD, USA). Bisher sind fünf Rezeptoren identifiziert an denen humanes TRAIL spezifisch bindet. TRAIL Rezeptor (TR)1/ DR4 (Death Receptor 4) (Pan et al., 1997), TRAIL Rezeptor (TR)2/ DR5 (Death Receptor 5) (Walczak et al., 1997; Chaudhary et al., 1997), TRAIL Rezeptor (TR)3/ DcR1 (Decoy Receptor 1) (Degli-Esposti et al., 1997b), TRAIL Rezeptor (TR)4/ DcR2 (Decoy Receptor 2) (Marsters et al., 1997; Degli-Esposti et al., 1997a) und OPG (Osteoprotegerin) (Emery et al., 1998). TR1 und TR2 besitzen eine vollständige intrazelluläre Todesdomäne und können nach Bindung von TRAIL Caspasen und den programmierten Zelltod aktivieren (Pan et al., 1997; Sheridan et al., 1997; Walczak et al., 1997). TR3 besitzt keine intrazelluläre Domäne und ist über einen Glykophosphatidylinositol-Rest in der Zellmembran verankert. TR4 besitzt eine verkürzte intrazellulläre Domäne der 52 AS der 76 AS langen Consensus Todesdomäne fehlen. Die Decoy Rezeptoren TR3 und TR4 können daher kein DISC ausbilden und sind nicht in der Lage Apoptose zu aktivieren (Pan et al., 1997; Sheridan et al., 1997; Degli-Esposti et al., 1997a,b). Die Bezeichnung der TR3 und TR4 als Decoy Rezeptoren stammt von der ursprünglichen Annahme her, dass diese Rezeptoren TRAIL in Konkurrenz mit den Apoptose-aktivierenden Rezeptoren binden und diesen TRAIL dadurch entziehen. OPG liegt in löslicher Form vor und würde daher ebenfalls als Decoy Rezeptor fungieren. Seine Bedeutung für das TRAIL System ist allerdings unklar, da die Affinität von TRAIL zu 19

28 I. Einleitung OPG deutlich geringer ist als zu den TRAIL Rezeptoren 1-4. Der primäre Ligand für OPG ist der Osteoklastendifferenzierungsfaktor (ODF, RANKL), mit welchem zusammen er hauptsächlich an der Regulation der Knochenbildung beteiligt ist (Emery et al., 1998). Abb. 9 zeigt die Domänenstruktur und phylogenetische Beziehung der TRAIL Rezeptoren. 1 CRD2 CRD3 TM DD 1 CRD2 CRD3 i TM DD 1 CRD2 CRD3 TM DD 1 CRD2 CRD3 iiiiiviv G 1 CRD2 CRD3 TM DD TR2 s/dr5 TR2 l/dr5 s/dr5 TR1/DR4 TR3/DcR1 TR4/DcR2 1 CRD2 CRD3 CRD4 OPG Abbildung 9 Phylogenetische und strukturelle Beziehung der TRAIL-bindenden Rezeptoren Der schraffierte Bereich stellt Signalsequenzen dar. TRAIL-R(TR)1-4 besitzen 2 vollständige Cystein-reiche Domänen (CRD2,3) und eine Unvollständige (CRD1). TR2 hat zwei Splicevarianten (TR2s und l), die sich durch ein 87 bp langes Sequenzstück unterscheiden. TM: Transmembrandomäne; DD: Death Domain; G: Glykophosholipidanker. Modifiziert nach Kelley und Ashkenazi, Bindung von TRAIL an TR1 oder TR2 führt zu einer Trimerisierung der Rezeptoren und zu Bildung des intrazellulären DISC. Über die Interaktion der Todesdomänen erfolgt die Rekrutierung des Adaptorproteins FADD (FAS Associated Death Domain) (Kuang et al., 2000), über welches dann Procaspase-8 und -10 an den DISC gebunden werden. Die Rolle der Caspase-10 als Initiatorcaspase ist allerdings umstritten, da gezeigt wurde, dass Caspase-8 essentiell ist für die Initiierung der Apoptose und Caspase-10 Caspase-8 funktional nicht ersetzten kann (Kischkel et al., 2001; Sprick et al., 2002). TRAIL kann ebenfalls durch TR1-, TR2- und eventuell TR4-vermittelt NF-κB aktivieren. Neben der Aktivierung des IKK ist auch die Aktivierung verschiedener anderer Kinasen beschrieben, wie JNK (c-jun-n-terminal Kinase) und p38 MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase). Die Kinasesignalwege werden allerdings wesentlich schwächer aktiviert als durch TNF-α (Chaudhary et al., 1997; Schneider et al., 1997; Secchiero et al., 2003; Varfolomeev et al., 2005). Varfolomeev et al., 2005 fanden kürzlich Hinweise darauf, dass die Aktivierung dieser Signalwege durch die Bildung eines sekundären Signalkomplexes erfolgt. Demnach lösen sich nach Bildung des ersten Signalkomplexes, dem DISC, die assoziierten Caspase-8 und FADD Moleküle von den Rezeptoren und bilden unter Rekrutierung verschiedener, an der Kinasenaktivierung beteiligten Faktoren, wie RIP1, TRAF2, NEMO und eventuell TRADD, einen zweiten Signalkomplex (Abb.10). Eine erhöhte 20

29 I. Einleitung Chemokinsekretion und Induktion von Makrophagenmigration in Folge der durch TRAIL-induzierten Kinasenaktivierung, könnten auf eine Rekrutierung phagozytotischer Zellen an den Ort der Apoptose als biologische Funktion hindeuten. TRAIL TR1/ TR2 DD DD DD FADD DED DD DD DED DD DED DD DED DD Caspase-8 Caspase-8 DISC/ Signalkomplex I TRAF2 FADD Caspase-8 Caspase-8 TRADD TRADD FADD RIP Signalkomplex II Caspase-3/-7 P P NEMO IKKα IKKβ P P p38 JNK IκBα p65 p50 Apoptose NF-κB Aktivierung Abbildung 10 TRAIL-aktivierte Signalkaskaden Nach Varfolomeev et al., 2005 bildet sich zunächst der Apoptose-aktivierende Rezeptorkomplex, der DISC, aus und sekundär ein zytoplasmatischer Signalkomplex II, der verschiedene, an der Kinaseaktivierung beteiligte Faktoren rekrutiert, und zur Aktivierung der p38, JNK und IKK Wege führt, allerdings wesentlich schwächer als durch TNF-α-induziert. I. 8 5-Fluorouracil (5-FU) Der antineoplastische Antimetabolit 5-Fluorouracil (5-FU, Handelsname ADRUCIL) wird in der chemotherapeutischen Behandlung von Kolorektalkrebs, Brustkrebs, Magenkrebs, Pankreaskrebs und Gastrointestinaltumoren eingesetzt, und in der Behandlung von metastasierendem Kolorektalkrebs ist 5-FU das am häufigsten eingesetzte Medikament (Longley et al., 2003). Die zytotoxische Aktivität des 5-FU wird wesentlich über die Induktion von Apoptose vermittelt. Dafür sind drei verschiedene Mechanismen beschrieben, die durch zelluläre 5-FU Metabolite, Deoxyuridinmonophosphat (dump), (Fluoro)deoxyuridintriphosphat ((F)dUTP) und Fluorouridintriphosphat (FUTP), vermittelt werden. 1. Die Inhibition der DNA-Synthese. Die Thymidylat Synthase (TS) katalysiert die Methylierung von dump durch Methylentetrahydrofolate (CHB2BHB4B-Folat) zu dtmp (Deoxytymidinmonophosphat) und Dihydrofolat. FdUMP bildet ein Komplex mit 21

30 I. Einleitung CHB2BHB4B-Folat und der TS und inhibiert dadurch die Aktivität der TS. Da die TS katalysierte Reaktion die einzige intrazelluläre Thymidylatquelle darstellt, kommt als Folge des dttp Mangels die DNA-Synthese und Reparatur zum Stillstand und die Zelle wird arretiert. 2. FdUTP und dutp können in die DNA eingebaut werden, was zu DNA Fehlpaarungen und DNA Strangbrüchen führt. Dadurch wird schließlich der p53-abhängige Signalweg bei DNA Schäden aktiviert. Induziertes p53 Protein arretiert den Zellzyklus, woraufhin Reparaturmechanismen bzw. Apoptose eingeleitet werden. 3. Fehleinbau von FUTP in die RNA führt zu Störungen der RNA Prozessierung und des gesamten RNA Metabolismus. Ein hoher Proliferationszyklus unterstützt die Effekte des DNA und RNA Mangels. Die unterschiedliche Bedeutung dieser Mechanismen für die antitumorale Aktivität des 5-FU ist noch unklar. Letztendlich führen diese Ereignisse aber zur Apoptose der Tumorzelle, wobei der genaue Mechanismus noch nicht vollständig aufgeklärt ist (Longley et al., 2003). Die 5-FU vermittelte Zytotoxizität/Apoptose teilt sich in eine p53-abhängige und eine p53-unabhängige Wirkungsweise auf, wobei letztere den kleineren Anteil stellt und noch kaum aufgeklärt ist. Für die p53-abhängige Apoptose durch zytotoxische Verbindungen wie 5-FU sind verschiedene Mechanismen beschrieben. Einen Mechanismus der p53-abhängigen Apoptose durch zytotoxische Verbindungen wie 5-FU beschreibt die p53-abhängige Induktion der pro-apoptotíschen Proteine Noxa, Puma und Bax aus der Bcl-2 Familie, was zu einer Aktivierung des mitochondrialen Apoptoseweges führt (vgl. Abb. 2) (Dong et al., 2002; Puthalakath et al., 2002; Villunger et al., 2003; Van Geelen et al., 2004). Nach neueren Erkenntnissen ist p53 nicht nur als Trankriptionsfaktor beteiligt, sondern interagiert z.t. auch direkt mit den pro-apoptotischen Proteinen (Schuler et al., 2005). Auch mutiertes p53 könnte dann den mitochondrialen Signalweg aktivieren, da p53 Mutationen größtenteils in der Transaktivierungsdomäne vorkommen und Interaktionen mit anderen Proteinen dadurch nicht betroffen wären. Ein weiterer, noch kontrovers diskutierter Mechanismus beschreibt die Hochregulation des p53-abhängigen CD95 Rezeptors/FAS (Eichhorst et al., 2001). Hochreguliertes CD95/FAS würde durch Bindung des CD95 Liganden/FASL, der entweder konstitutiv von den Zellen selbst exprimiert wird oder in vivo von zytotoxischen T-Zellen vermittelt wird, zu einer Todesrezeptor-vermittelten Apoptose führen. 22

31 I. Einleitung I.9 Zielsetzung Nach einem operativen Eingriff, stellt die chemotherapeutische Behandlung einen essentiellen Bestandteil in der Behandlung maligner Tumore dar, um die vollständige Eliminierung der entarteten und eventuell metastasierten Tumorzellen zu gewährleisten. Die zytoxische Wirkung einer chemotherapeutischen Behandlung basiert größtenteils auf der Induktion der Apoptose in den Tumorzellen. Allerdings erlangen Tumorzellen i.d.r. bereits während ihrer malignen Transformation eine Resistenz gegenüber intrinisischen und extrinisischen, durch Immunzellen-vermittelte, apoptotische Stimuli. Zudem erwerben Tumorzellen während einer chemotherapeutischen Behandlung häufig noch eine Resistenz gegenüber dem jeweiligen Chemotherapeutikum. Diese Resistenzen stellen die größte Hürde in einer Chemotherapie dar. Es ist daher außerordentlich wichtig, die molekularen Mechanismen zu identifizieren, durch welche Tumorzellen eine Resistenz erwerben. Dies ermöglicht es, therapeutische Strategien zu entwerfen, welche diesen Resistenzmechanismen entgegenwirken und so den Erfolg einer chemotherapeutischen Behandlung erhöhen. TRAIL stellt aufgrund seiner Eigenschaft Apoptose selektiv in einem breiten Spektrum von Tumorzellen zu induzieren ein vielversprechender neuer Wirkstoff in der Krebstherapie dar, und rekombinantes lösliches TRAIL sowie agonistische Antikörper gegen TRAIL-R1 und TRAIL-R2 befinden sich derzeit in der klinischen Versuchsphase I bzw. II. Allerdings zeigte sich auch im Falle von TRAIL, dass viele Tumorzelllinien resistent sind gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose. In der vorliegenden Arbeit, sollten daher molekulare Ursachen einer TRAIL Resistenz in Tumorzellen untersucht werden und ihre Bedeutung für einen TRAIL-resistenten Phänotyp bewertet werden. Dafür sollten zwei molekulare Mechanismen untersucht werden, die möglicherweise die TRAIL Sensitivität beeinflußen. Zu einem sollte die Expression der TRAIL Rezeptoren untersucht werden. Dabei sollte zu einem die Rezeptorenexpression als Indikator für die TRAIL-Sensitivität von Tumorzellen bewertet werden, und zum anderen die Bedeutung der TRAIL Rezeptoren für die TRAIL-Sensitivität untersucht werden. Als zweiter Schwerpunkt sollte die Bedeutung von TRAIL-induziertem NF-κB für die TRAIL-Sensitivität von Tumorzellen untersucht werden. NF-κB kann von TRAIL selbst aktiviert werden und die anti-apoptotische Aktivität von NF-κB wurde häufig mit der Resistenz von Tumorzellen gegenüber verschiedenen Chemotherapeutika in Zusammenhang gebracht. In einem Nebenprojekt sollte außerdem die Bedeutung von NF-κB in 5-FU-induzierter Apoptose in Kolorekalkarzinoma untersucht werden. 23

32 II Material und Methoden II. Material und Methoden II.1 Material II.1.1 Geräte BioPhotometer Brutschränke & Inkubatoren Durchflusscytometer, FACSCalibur Elektrophorese PowerSupply Elektroporator Easyject Optima Gelelektrophoresesysteme horizontal vertikal Geltrockner Heizschüttler Kühlzentrifugen: Multifuge 3 RC 5C Plus Licht/Fluoreszenzmikroskop LightCycler Microplate readerversamax MicroluminatPlus LB96V PCR-CycloneGradient PH-Meter MP225 Roller Mixer Schüttler Rotamax Sterilbank Tischzentrifugen: Biofugefresco, pico Ultrazentrifuge Discovery 90SE Vortexer Wasserbad Ultrazentrifuge Sorvall Discovery Ausschwenkrotor Sorvall T-1270 Zählkammer Neubauer Eppendorf, Hamburg, Deutschland Heraeus, Hanau, Deutschland Becton Dickinson, San Jose, CA, USA BioRad, Hercules, CA, USA Equibio, Kent, U.K. PeqLab, Erlangen Deutschland BioRad BioRad Edmund Bühler, Tübingen, Deutschland Heraeus Sorvall, Langenselbold, Deutschland Hund, Wetzlar, Deutschland Roche, Mannheim, Deutschland Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Berthold Technologies, Bad Wildbad, Deutschland PeqLab Mettler Toledo, Greifensee, Schweiz Stuart Scientific, Watford Herts, U.K Heidolph, Schwabach, Deutschland Heraeus Heraeus Sorvall Scientific Industries, Bohemia, NY, USA Grant, Cambridge, U.K Sorvall Sorvall NeoLab, Heidelberg, Deutschland 24

33 II Material und Methoden II.1.2 Chemikalien, Reagenzien und Verbrauchsmaterialien Chemikalien wurden von folgenden Firmen bezogen: AppliChem Darmstadt, Deutschland Biochrom AG Berlin, Deutschland Carl Roth Karlsruhe, Deutschland Fluka/Riedel-de Haen Neu-Ulm, Deuschland J.T. Baker, GmbH, Philippsburg, N.J., USA Merck Frankfurt, Deutschland Sigma St.Louis, MO, USA Antibiotika (Ampicillin, Kanamycin, Chloamphenicol, Puromycin, G418) wurden von Sigma bezogen. Reagenzien Aprotinin γ 32P-ATP BSA CaspaseInhibitor zvadfmk DNA Standard: 100bp, 1kb DNA Ladepuffer (6 ) ECL Detektions Reagenzien FuGene6 Leupeptin Magermilchpulver Pepstatin PolydIdC Propidium Iodide Protease Inhibitor Coctail Proteinstandard prestained low range Proteinstandard rainbow Verbrauchsmaterialien Cryo-Röhrchen Einfrierboxen Elektroporationsküvetten Filterpapier Whatmann (3mm, 5mm) Sigma, St.Louis, MO, USA Amersham, Uppsala, Schweden Sigma Santa Cruz, CA, USA PeqLab, Erlangen Deutschland PeqLab Amersham Roche, Mannheim Biomol, Hamburg, Deuschland Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland Biomol Sigma, St.Louis, MO, USA Sigma Sigma BioRad, Hercules, CA, USA Amersham Nalgene, Rochester, USA Nunc, Wiesbaden, Deutschland Peqlab, Erlangen Deutschland Schleicher und Schüll, Dassel, Deuschland 25

34 II Material und Methoden Hybond Nitrozellulose Membran Amersham Biosciences, Piscataway, USA Hyperfilm ECL Amersham Insulinnadel Micro-Fine 1 ml/0,33 mm Becton Dickinson, San Jose, CA, USA Röntgenfilm Kodak Klonierungsdisks Sigma Polypropylenröhrchen (15ml, 50ml) Falcon Bedford, MA, USA Zellkulturverbrauchsmatrialen wurden von Nunc bezogen. Nicht aufgeführte Reagenzien und Materialien werden im Abschnitt der jeweiligen Methode für welche sie Anwendung fanden spezifiziert. II.1.3 Enzyme E. coli DNA Polymerase I New England Biolabs, Boston, MA, USA Taq Polymerase 5 U/µl Qiagen, Hilden, Deutschland T4 DNA Ligase (400 U/µl) New England Biolabs E. coli DNA Ligase (10 U/µ) New England Biolabs RNase H (2,5 U/µl) Qiagen RNase Inhibitor (20 U/µl) Roche, Mannheim, Deutschland RNase free DNase 1 U/µl Qiagen Restriktionsendonukleasen wurden alle von New England Biolabs bezogen. Nicht aufgeführte Enzyme werden im Abschnitt der jeweiligen Methode für welche sie Anwendung fanden spezifiziert. II.1.4 Antikörper Primärantikörper Alle aufgelisteten Antikörper sind gegen das humane Protein gerichtet. Anti-Bid PAb (rabbit) R&D Sytems, Minneapolis, MN, USA Anti-Caspase 3 MAb (mouse) Transduction Laborotories, Lexington, KY, USA Anti-Caspase 3 PAb (rabbit) Transduction Laborotories Anti-Caspase 7 PAb (rabbit) Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA Anti-Caspase 8 MAb(1C12) (mouse) Cell Signaling Technology Anti-Caspase 9 PAb (rabbit) BD Pharmingen, San Diego, CA, USA Anti-Caspase 10 MBL International, Woburn, USA Anti-CuZnSOD TheBindingSite, Birmingham, England Anti-Flip (Dave2) MAb (rat) Apotech/Alexis, Lausen, Schweiz 26

35 II Material und Methoden Anti-IκB-α (C 21) PAb (goat) Anti-NF-κB p65 (C20) PAb (goat) Anti- NF-κB p50 (C19) PAb (goat) Anti-N NF-κB c-rel PAb (goat) Anti-PARP(C 4C10-5) MAb (mouse) Anti-TRAIL-R1 (HS101) MAb (mouse) Anti-TRAIL-R2 (HS201) (mouse) Anti-TRAIL-R3 (HS301) (mouse) Anti- TRAIL-R4 (HS402) (mouse) Anti-unspecific mouse IgG1 Anti-XIAP PAb (rabbit) Sekundärantikörper Fluoreszenzfarbstoff-konjungiert Anti-mouse IgGB1 B-R-PE (Phycoerythrin) (goat) HRP-konjungiert Anti-goat/sheep (mouse) (C GT-34) Anti-rabbit (donkey) Anti-mouse (sheep) Anti-rat Santa Cruz Biotechnology,inc, Santa Cruz, CA, USA Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz Biotechnology BD Pharmingen Alexis Biochemicals, Lausen, Schweiz Alexis Biochemicals Alexis Biochemicals Alexis Biochemicals Sigma, St. Louis, MO, USA Cell Signaling Technology Apotech/Alexis, Lausen, Schweiz Sigma Amersham Biosciences, Piscataway, USA Amersham Biosciences Apotech/AlexisP II.1.5 Vektoren Säugerexpressions-Plasmide Kommerziell erworbene Parentalvektoren sind unterstrichen, davon abgeleitete Vektoren darunter dargestellt. UpEGFP-N1U (Clontech, Mountain Viev, USA); CMV Promotor-abhängiger Säuger-Expressionvektor, MCS ermöglicht C-terminale Fusion von Proteinen mit EGFP pegfp-p65: Expression eines p65-egfp Fusionsproteins UpcDNA3U (Invitrogen, Carlsbad, USA); CMV Promotor-abhängiger Säuger-Expressionvektor pcdna3-p65 pcdna3-crel pcdna3-p50 pcdna3-dr4/tr1 (Genentech, San Franscisco, CA, USA) 27

36 II Material und Methoden p(cmv)rk5-tr3 (Genentech, San Franscisco, CA, USA) p(cmv)rk5-tr4 (Genentech, San Franscisco, CA, USA) psv-puro; SV Promotor-abhängige Expression eines Puromycinresistenzgens UpU6 EntrU (Invitrogen) UpGL2U (Promega, Madison, USA) Promotorlos; enthält die codierende Sequenz der Leuchtkäfer (Photinus pyralis) Luziferase pgl2.nf-κb-luc: Enthält eine dreifach wiederholte NF-κB-Bindungssequenz vor dem Luziferase-Gen UpRLU (Promega); Promotorlos; enthält die codierende Sequenz der Renilla (Renilla reniformis) Luziferase prl.ub-ren: Enthält einen Ubiquitin-Promotor vor dem Renilla Luziferase-Gen Adenovirale Vektoren Vektoren zur Adenovirusherstellung enthielten E1, E3 deletierte humane adenovirale Sequenzen des Serotyps 5 Ad(CMV) und Ad(CMV).LacZ (Zwacka et al., 1998); Ad(CMV).IκB-SR (Zwacka et al., 2000); pad/ BLOCK-iT Destination Vektor (Invitrogen) II.1.6 Zytotoxische Verbindungen und Zytokine Rekombinantes humanes TRAIL R&D Sytems, Minneapolis, MN, USA gelöst in sterilem PBS mit 0,1% BSA; Stock: 25 µg/µl; 5 µl Aliquots bei 80 C gelagert Rekombinantes humanes TNF-α PeproTech, Rocky Hill, NY, USA gelöst in sterilem HB2BO; Stock: 50µg/µl ; 25 µl Aliquots bei - 80 C gelagert. 5-Fluorouracil Sigma, St.Louis, MO, USA gelöst in sterilem HB2BO mit auf (ph 7,8); Stock: 100 mm; bei -20 C gelagert II.1.7 Puffer, Nährmedien und Zellkulturzusätze Folgend aufgeführt sind Standardpuffer, weitere Puffer sind unter dem jeweiligen Abschnitt spezifiziert PBS (Phospaht Buffered Saline): NaCl 137 mm; Na2HPO4 7 mm; KH2PO4 1.5 mm; KCl 2.7 mm; ph 7,4 PBS- Dulbecco 1x Biochrom AG, Berlin, Deutschland 28

37 II Material und Methoden TM PBS- GibcoP P10x Gibco/Invitrogen, Carlsbad, USA TBS (Tris Buffered Saline): Tris-HCl 25 mm, NaCl 137 mm; 27 mmkcl; PH 7.4 TE (Tris-EDTA): Tris-HCl 10 Mm; EDTA 1 mm; ph 8.0 HEPES (Hydroxyethylpiperazin Sigma, St.Louis, MO, USA ethansulfonsäure) Nährmedien und Zellkulturzusätze LB Medium Agar Fetales Kälberserum (FCS) (Glutamin)/Penicilin/Streptomycin OptiMem Trypsin/EDTA D-Mem Mc Coy s 5A RPMI 1640 Invitrogen, Carlsbad, USA Sigma, St.Louis, MO, USA Biochrom AG, Berlin, Deutschland Gibco/Invitrogen, Carlsbad, USA Gibco/Invitrogen Biochrom AG Gibco/Invitrogen Cambrex; New Jersey, USA Gibco/Invitrogen II.1.8 Zelllinien Bezeichnung Zelltyp Morphologie Charakteristika A549 humanes Lungenkarzinom epithelial Caco-2 humanes Kolonadenokarzinom epithelial Caki-2 humanes Nierenkarzinom epithelial DLD-1 humanes Kolonadenokarzinom epithelial primäre Fibroblasten humane Haut epithelial HCT116 humanes Kolonkarzinom epithelial Hek293 humane embryonale Niere epithelial HeLa humanes Gebärmutterhalskarzinom epithelial N52 Panc-1 humane Amniozyten humanes Pankreaskarzinom epithelial Tabelle 2 Auflistung der in dieser Arbeit verwendeten Zelllinien Transformiert mit Adenovirus 5 DNA Transformiert mit Adenovirus 5 DNA zur Verfügung gestellt von Dr. Stefan Kochanek 29

38 II Material und Methoden II.1.9 Software Blast human Cell Quest GeneFisher Interactive PCR Primer Design EditSeq LightCycler MegAlign ScionImage SiRNA Target Finder SoftmaxPro Summit v3.3 Webcutter2.0 WinGlow BD Biosciences DNAStar, Inc, Madison,WI, USA Roche, Mannheim, Deutschland DNAStar Meyer Instruments, Inc, Houston, TX, USA Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA DakoCytomation, Fort Collins, CO, USA Berthold Technologies, Bad Wildbad, Deutschland II.2 Methoden II.2.1 Zellbiologische Methoden II Kultivierung eukaryontischer Zelllinien Alle zellbiologischen Arbeiten wurden unter einer Sterilwerkbank durchgeführt. Zellen wurden in einem Brutschrank bei 37 C, 5% COB2B und 95% Luftfeuchtigkeit in Gewebekulturflaschen gehalten und alle 3-5 Tage subkultiviert. Zum Passagieren wurden adhärent wachsende Zellen mit PBS gewaschen und durch drei- bis fünfminütige Inkubation mit Trypsin bei 37 C von der Zellkulturflasche gelöst. Die Zellen wurden im Verhältnis 1:3 bis 1:5 mit Medium verdünnt und in eine neue Zellkulturflasche überführt. Die Medien wurden, wenn nicht anders angegeben, mit 10% fetalem Kälberserum (FCS) und 1% (Glutamin)/Penicillin/Streptomycin ergänzt. Die verwendeten Zelllinien wurden in folgenden Medien kultiviert: RPMI-1640 Medium: DLD-1 DMEM-Medium: A549, humane Fibroblasten, HeLa, Panc-1, Hek293, McCoy s: HCT116, Caki-2 α-mem: N52 II Einfrieren und Auftauen von Zellen Zellen aus einer exponentiell wachsenden Population wurden mit PBS gewaschen, durch Trypsinieren abgelöst, abzentrifugiert (400xg, 5 min, RT) und in 1,5 ml Einfriermedium 30

39 II Material und Methoden (Medium, 30% FCS, 20% DMSO) resuspendiert. Die Zellsuspension wurde in 2 ml Cryo- Röhrchen sofort für 30 min auf Eis gestellt, um ein langsames Abkühlen zu gewährleisten, anschließend in Einfrierboxen über Nacht bis 1 Monat bei 80 C belassen und dann in flüssigen Stickstoff aufbewahrt. Das Auftauen der Zellen erfolgte schnell bei 37 C im Wasserbad. Die aufgetauten Zellen wurden sofort mit 10 ml frischem Medium versetzt und abzentrifugiert (400xg, 5 min, RT). Die sedimentierten Zellen wurden in frischem Medium resuspendiert und in Kulturflaschen gegeben. Am nächsten Tag wurde das Medium erneuert. II Transfektion von eukaryontischen Zellen Bei allen aufgeführten Transfektionsmethoden wurden die Zellen am Tag zuvor umgesetzt. Die Transfektion erfolgte über Nacht und am nächsten Morgen wurde das Medium gewechselt. Die Versuche wurden 24 h bis 48 h nach der Transfektion durchgeführt. Bei jeder Transfektion wurde die Transfektionseffizienz ermittelt. Zur Bestimmung der Transfektionseffizienzen wurden eukaryontische Zellen mit dem Plasmid pegfp-n1 transfeziert. 24 h bis 48 h nach der Transfektion wurde der prozentuale Anteil der grünfluoreszierenden Zellen entweder am Mikroskop unter Fluoreszenzlicht oder am Durchflusszytometer bestimmt. II Transfektion durch Elektroporation Bei der Elektroporation werden die Zellen kurz einem elektrischen Feld ausgesetzt, dabei wird die Zellmembran destabilisiert und kleine depolarisierte (elektrisch neutrale) Poren erzeugt, welche die Aufnahme der DNA in die Zelle ermöglichen. Zellen wurden auf 100 cm Platten ausgesät und am nächsten Tag bei einer Konfluenz von 70% für die Elektroporation geerntet. Die Zellen wurden zweimal mit Medium gewaschen und 6 abzentrifugiert (50xg, 10 min, RT). Aliquots von 5 x 10P P Zellen pro Ansatz wurden pelletiert (50xg, 10 min, RT) Tµg DNA wurden in 800 µl Optimem Medium verdünnt und die sedimentierten Zellen darin resuspendiert, 2 min inkubiert und anschließend in eine Tsterile 4 mm TElektroporationsküvette überführt. DieT Elektroporation wurde in einem Easyject Electroporator (Equibio) mit einem einzelnen Impuls von 250 V bei einer Kapazität von 1500 µf durchgeführt. TUnmittelbar nach dem Impuls wurden die Zellen in frisches Medium gegeben und im Brutschrank kultiviert. II Transfektion durch CaB3 B(P0B4B)B2B-Präzipitation Bei der Calziumphosphat-Methode wird die DNA in Form feinkörniger Calziumphosphat-Präzipitate auf die Zellen gebracht und durch Endozytose aufgenommen. 31

40 II Material und Methoden Die Transfektion erfolgte bei einer Konfluenz von ca. 70%. Für ein 6-Well Format wurden pro Well 5-7 µg DNA in 500 µl 2x HBS-Puffer vorgelegt. Dazu wurde tropfenweise, unter ständigen Vortexen, 500 µl CaClB2B-Lösung gegeben. Zur Bildung der Calziumphosphat- Präzipitate wurde der Ansatz 20 min bei RT inkubiert und anschließend gleichmäßig auf die Zellen verteilt. 2x HBS: 140 mm NaCl, 1,5 mm NaB2BHPOB4B; 50 mm HEPES, ph 7.2; steril filtrieren CaClB2B-Lösung: 250 mm in HB2B0; steril filtrieren II Transfektion durch Lipofektion mit FuGENE6 Bei der Lipofektion bilden DNA und Liposomen Komplexe, die von der Zelle aufgenommen werden. Die Transfektion wurde nach Angaben des Herstellers (ROCHE) 5 durchgeführt. 3 x 10P PZellen (75% konfluentes 12-Well) wurden mit 1 µg DNA transfeziert. DNA und FuGENE6 Reagenz wurde in einem Verhältnis 1:3 verwendet. Das FuGENE Reagenz wurde zuvor in serumfreiem Optimem Medium verdünnt. Nach 45 min Inkubation bei RT wurde der Ansatz auf die Zellen verteilt. II Herstellung stabiler Klone Zur Erzeugung stabiler Klone wurde der das Transgen enthaltene Vektor mit einem Vektor, der ein Resistenzgen enthält, im Verhältnis 1:40 co-transfeziert. Bei diesem Verhältnis der Cotransfektion wird davon ausgegangen, dass jeder Klon, welcher das Resistenzgen exprimiert, auch den Transgen enthaltenen Vektor aufgenommen hat. 48 h nach der Transfektion wurden die Zellen mit Selektionsmedium kultiviert. Nach ca. 14 Tagen Selektion wurden die makroskopisch sichtbaren Klone mit Hilfe von Klonierungsringen (5 mm Durchmesser, Sigma) gepickt und in 24-Well-Platten überführt. Die stabile Expression des inserierten Gens wurde mittels Western-Blots oder FACS Analyse überprüft. Zur Selektion wurde Puromycin verwendet. Puromycin hat den Vorteil, dass die Selektion im Gegensatz zu G418 schneller erfolgt. Zur Selektion wurde zelltyp-spezifisch 2,5-6 µg/ml Puromycin eingesetzt. Zum Erhalt der etablierten Klone wurde die Puromycinkonzentration auf 1/5 der entsprechenden Selektionskonzentration gesenkt. II Behandlung der Zellen mit zytotoxischen Verbindungen und Zytokinen Für die Behandlung mit TRAIL oder TNF-α wurden die Zellen so ausgesät, dass sie am Tag der Behandlung eine Konfluenz von 75-85% hatten. Für die Behandlung mit 5-FU wurde eine ca % Konfluenz eingestellt. Die Behandlung erfolgte im jeweiligen Medium, welches nach Entfernen des alten Mediums frisch auf die Zellen gegeben wurde. 32

41 II Material und Methoden Zur Inhibition der Caspase Aktivität wurden die Zellen mit dem Pancaspaseinhibitor zvad.fmk (Santa Cruz) mit einer Konzentration von 25 µm für 1-2 h vorbehandelt. II Durchflusszytometrie/ FACS (Fluorescence activated cell sorting) Analyse Die Durchflusszytometrie erlaubt die optische Analyse mehrerer tausend Zellen innerhalb kürzester Zeit. Die Zellen passieren einen Laserstrahl mit einer bestimmten Wellenlänge (hier Argon Laser 488 nm) und werden von diesem angeregt. Das emittierte Licht wird von verschieden Detektoren mit unterschiedlichen Filtern erfasst und die Daten von einem Computer ausgewertet. Durch die Lichtstreuung werden die morphologischen Parameter der Zelle erfasst. Das Forwärtsstreulicht (forward scatter = FSC) charakterisiert die Zellgröße, das im rechten Winkel gestreute Licht (side scatter = SSC) charakterisiert die Granularität einer Zelle. Diese zwei Parameter werden in einem dot plot dargestellt. Die emittierte relative Fluoreszenzintensität der fluoreszierenden Farbstoffe wird gewöhnlich in einem Histogramm dargestellt. Zur Durchführung der Messungen mit dem Durchflusszytometer FACSCalibur (Becton Dickinson) wurde das Computerprogramm Cell Quest (Becton Dickinson) verwendet. Folgende Messungen wurden mittels FACS Analyse durchgeführt. II Apoptosemessung (Nicoletti et al., 1991) Die Bestimmung der Apoptoserate erfolgte mittels eines DNA-Fragmentierungsassays nach Nicoletti (Nicoletti et al., 1991). Zellen in einem späteren Apoptosestadium sind durch die charakteristische Fragmentierung ihrer DNA gekennzeichnet. Die DNA wird durch spezifische Nukleasen verdaut, die wiederum durch die Effektorcaspase-3 aktiviert werden. Der Nicoletti Assay beruht auf einer Färbung des diploiden Kerns (DNA Gehalt = 2n) mit Propidiumiodid. Propidiumiodid (PI) ist ein Fluorochrom, welches in die DNA interkaliert. Es absorbiert Licht bei 488 nm (Maximum) and emittiert Licht bei 620 nm. Die Messung der Fluoreszenzintensität im FACS ermöglicht eine Zellzyklusanalyse, da die Fluoreszenzintensität dem relativen DNA Gehalt direkt proportional ist. Die Färbung der Zellen erfolgt in einer hypotonen Lösung über Nacht. Die fragmentierte DNA diffundiert durch die perforierte Kernmembran, apoptotische Zellen sind daher durch einen DNA Gehalt >2n gekennzeichnet. Bei der FACS Analyse ist der apoptotische Anteil der Zellpopulation durch diese sogenannte SubG1-Region (>2n) wiedergegeben (Abb. 11). Nach der jeweiligen Behandlung für die angegebene Zeit wurden der Mediumüberstand und dann die Zellen durch Trypsinieren direkt in FACS Röhrchen geerntet und 33

42 P Zellen II Material und Methoden anschließend abzentriguiert (1300 rpm, 7 min, 4 C). Die Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen und anschließend in ein geeignetes Volumen Nicoletti Puffer aufgenommen 5 (ca. 250 µl auf 5 x10p PZellen/12-Well) und 10 s gevortext (mittlere Stufe). Die Proben wurden bei 4 C für 16 h im Dunkeln inkubiert und anschließend im Durchflußzytometer (FACSCalibur, Becton Dickinson) gemessen. Die Messung (6000 Ereignisse) erfolgte im Fluoreszenzkanal 2 (FL-2, λbem B585 nm). Die durch die zytotoxische Behandlung induzierte spezifische Apoptoserate ergibt sich aus der Subtraktion der basalen Apoptose (Mediumwert) von der Gesamtapoptose der behandelten Zellen. Nicoletti Puffer: Sodium Citrat 0.1% (w/v); Triton X-100 0,05-0,1% (v/v); Propidiumiodid 50 µg/ml. Die Propidiumiodidstammlösung (1 mg/ml) wurde lichtgeschützt bei 4 C gelagert und jeweils frisch zu dem Puffer gegeben. sub-g 1 G 0 /G 1 2n 4n Fuoreszenzintensität (logarithmische Skala) S G 2 /M Abbildung 11 Zellzyklusprofil und Apoptoserate einer Zellpopulation in einem DNA-Fragmentierungsassay Das Histogramm stellt die Zellzyklusphasen über den DNA Gehalt anhand der Fluoreszenzintensität in einer Zellpopulation dar. Der DNA Gehalt wachsender Zellen ist abhängig von der Zellzyklusphase. Zellen in der GB0B/GB1B Phase zeichnen sich durch einen DNA Gehalt von 2n (diploid) aus, der dann während der S Phase verdoppelt wird und in der GB2B/M Phase, kurz vor der Kernteilung, bei 4n, dem tetraploiden Kerngehalt liegt. Die apoptotischen Zellen sind durch einen DNA Gehalt kleiner als 2n gekennzeichnet. II Analyse der Expression von Oberflächenproteinen (Rezeptoren) 10P wurden geerntet, mit kalten Waschpuffer zweimal gewaschen, in Eppendorfgefäße pelletiert (800 rpm; 7 min; 4 C) und mit 50 µl Erstantikörper in Färbepuffer (10 µg/ml) 1 h bei 4 C inkubiert. Anschließend wurde zweimal gewaschen und mit dem Zweitantikörper (1:150) verdünnt in Färbepuffer für 30 min bei 4 C im Dunkeln inkubiert. Der Zweitantikörper ist mit einem fluoreszierenden Farbstoff (hier Phycoerythrin, PE) gekoppelt. Nach zweimaligen Waschen wurden die Zellen in 200 µl Fixierpuffer aufgenommen, analysiert bzw. abgedunkelt bei 4 C aufbewahrt. Die relative Fluoreszenzintensität ist direkt proportional zu der Expression der Oberflächenproteine. Waschpuffer: PBS mit 1% BSA (v/w) Färbepuffer: PBS mit 0,2% BSA(v/w), 0,1% NaAzid (v/v) Fixierpuffer: PBS mit 2% Paraformaldehyd (v/v) II Messung der EGFP Expression Durch die Messung der EGFP (Enhanced Green Fluorescence Protein) Expression wurde die Effizienz von DNA Transfektionen und Virus Transduktionen bestimmt. Die Zellen 34

43 P Zellen II Material und Methoden wurden mit eiskaltem PBS geerntet, gewaschen (400 g; 7 min, 4 C) und in einem geeigneten Volumen PBS aufgenommen. Die FACS Analyse (Kanal 1) gibt sowohl den prozentualen Anteil EGFP-positiver Zellen in einer Zellpopulation an, als auch die relative Fluoreszenzintensität. II Luziferase Reporter Assay Zur quantitativen Bestimmung der Promotoraktivität des Transkriptionsfaktors NF-κB wurde das Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison) verwendet. Der von dem Basisvektor pgl2 abgeleiteter Vektor pnf-κb-luc exprimiert das Leuchtkäfer (Photinus pyralis) Luziferase-Gen unter Kontrolle eines NF-κB-abhängigen Promoters. Der Promotor enthält eine 3-fach repetetive NF-κB Consensusbindungssequenz. Der Vektor pub-renilla exprimiert die Renilla (Renilla reniformis) Luziferase unter dem Ubiquitin Promotor, der gleichmäßig stark, konstitutiv und ubiquitinär aktiv ist. Die Leuchtkäfer und Renilla Luziferasen sind unter unterschiedlichen Bedingungen aktiv und ermöglichen getrennte Messungen in der gleichen Probe. Nach Messung der NF-κB-abhängigen Firefly Luziferaseaktivität wird diese gequencht und anschließend die Renilla Luziferaseaktivität gemessen. Die Co-Transfektion des pnf-κb-luc Plasmids mit dem pub-luc Plasmid ermöglicht es, Unterschiede in der Transfektionseffizienz gegen die Expression der Renilla Luziferase zu normieren. 5 10P 5 wurden mit 2 µg pnf-κb-luc Plasmid und pub-renilla Plasmid (1:40) co-transfeziert h später wurden die Zellen stimuliert und nach Angaben des Herstellers in dem angegebenen Minimalvolumen des Lysispuffer geerntet und abzentrifugiert (5000 rpm; 5 min; 4 C; Mikrozentrifuge). 20 µl der Lysate wurden zur Messung in dem Luminometer (MicroluminatPlus LB96V ; Berthold Technologies) eingesetzt. Die Messparameter waren wie vom Hersteller (Promega) angegeben. II.2.2 II Proteinbiochemische Methoden Herstellung von Zellextrakten Für die Herstellung von Proteinextrakten wurden die Zellen auf 10 cm oder 15 cm Platten kultiviert. Die Zellen wurden zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen, mit einem Zellkulturschaber (Nunc) in 1,5 ml kaltem PBS abgeerntet und anschließend pelletiert (5 min, 3000 rpm, 4 C; Mikrozentrifuge). Die Präparation der Proteinextrakte erfolgte nach einem modifizierten Protokoll von Dignam (Dignam et al., 1983). Zur Herstellung von Gesamtzellextrakten wurden die pelletierten Zellen in Dignam C Puffer resuspendiert, zum besseren Zellaufschluss wurde die Zellsuspension 5-7 mal durch eine Insulinnadel mit 35

44 II Material und Methoden 0,33 mm Durchmesser (Becton Dickinson) gezogen. Alternativ wurde der Dignam C Puffer mit 0,5% NP-40 supplememtiert und die Proben 30 s gevortext. Anschließend wurden die Proben für 30 min auf Eis inkubiert. Zur Fraktionierung von nuklearen und zytosolischen Proteinextrakten wurden die pelletierten Zellen in Dignam A Puffer resuspendiert, 5-7 mal durch eine Insulinnadel gezogen und nach 15 min Inkubation auf Eis abzentrifugiert (13000 rpm, 5 min, 4 C; Mikrozentrifuge). Der Überstand mit den zytosolischen Proteinen wurde abgenommen und das, die intakten Zellkerne enthaltene Pellet, in Dignam C Puffer resuspendiert. Die Zellkerne wurden 30 min auf Eis unter leichtem Schütteln lysiert und das Lysat anschließend durch Zentrifugation (13000 rpm, 5 min, 4 C; Mikrozentrifuge) von den Zelltrümmern getrennt. Die Proteinextrakte wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei 80 C gelagert. Dignam A: 10 mm HEPES ph 7,9; 1,5 mm MgClB2B; B B10 mm KCL. Dignam C: 20 mm HEPES ph 7,9; 0,42 mm NaClB2B;B B1,5 mm MgClB2B; 0,2 mm EDTA; 25% Glycerol(v/v). Zu beiden Puffern wurden 1 mm DDT und Proteaseinhibitor-Cocktail (1:5000, Sigma) frisch zugegeben; alternativ zu dem Proteaseinhibitor-Cocktail wurden auch die Proteaseinhibitoren Aprotinin (5 mg/ml 1:1000), Leupeptin (5 mg/ml 1:1000), Pepstatin A (1 mg/ml, 1:200) verwendet. II Bestimmung des Gesamtproteingehalts Die Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford (1976) basiert auf der Eigenschaft von Coomassie Brilliant Blue G-250 sein Absorptionsmaximum von 465 nm auf 595 nm zu verschieben, wenn es an Proteine bindet. Die Messung der Extinktion wurde in 96-Well Platten (Nunc) in einem Microplate readerversamax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) bei 595 nm durchgeführt. Zu 250 µl der Bradfordlösung (BioRad; 1:5 verdünnt in HB2BO) wurde 1 µl der Zelllysate gegeben und 5 min inkubiert. Die Proteinkonzentration der Zellextrakte wurde mit Hilfe des ProSoftMax Programms (Molecular Devices) in Vergleich zu einer BSA-Standardkurve bestimmt. II Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) Bei der diskontinuierlichen, denaturierenden Polyacrylamidgelelektrophorese werden Proteine zunächst in einem niedrigerprozentigen Sammelgel fokussiert und anschließend in einem höherprozentigen Trenngel nach Molekulargewicht aufgetrennt. Sodiumdodecylsulfat (SDS), ein anionisches Detergenz, bindet an die hydrophoben Teile der Proteine und macht sie löslich. Die Proteine verlieren dabei ihre Sekundär- und Tertiärstruktur und werden proportional zu ihrer Größe stark negativ geladen. Die Auftrennung der Proteine in einem elektrischen Feld erfolgt dann nur aufgrund ihrer Größe 36

45 II Material und Methoden durch die Poren des Polyacrylamidgels. Die Acrylamidkonzentration der Sammelgele betrug 4%, die Acrylamidkonzentration der Trenngele 12,5%. Das Acrylamid/Bisacrylamidverhältnis der Stocklösung war 37,5 :1 (v/v). Als Molekulargewichtsstandard wurden Rainbow marker (Amersham) oder prestained Precision Protein Standards low range (BioRad) verwendet. Aufgetragen wurde zwischen 40 µg und 100 µg Gesamtprotein pro Probe. Vor dem Auftragen wurden die Proben 1:1 mit 2x Lämmli-Ladepuffer versetzt und auf dem Heizblock 5 min auf 95 C erhitzt. Die Elektrophorese wurde in einem vertikalem System von BioRad (Mini Protean II) in SDS-Laufpuffer bei zunächst 100 V für 10 min zum Durchlaufen des Sammelgels und dann bei 170 V durchgeführt. 4x SDS Sammelgelpuffer: 4 ml 10% SDS (v/v); 6,07 g Tris/HCl ph 6,8; add 100 ml. 4x SDS Trenngelpuffer: 4 ml 10% SDS (v/v); 18,15 g Tris/HCl ph 8,8; add 100 ml. SDS-PAGE-Laufpuffer: Tris/HCl 3 g; Glycine 14,4 g; 100 ml 10% SDS (v/v); HB2BO ad 1l 2x Lämmli Puffer: 65 mm Tris/HCl ph 6,8; 10% Glycerin (v/v); 4% SDS (v/w); 4% β-mercaptoethanol (v/v); 0,2% Bromphenolblau (v/w). II Membrantransfer (Western-Blotting) und Immunodetektion von Proteinen Der Elektrotransfer der in der Gelelektrophorese aufgetrennten Proteine auf eine Nitrocellulosemembran (Amersham) erfolgte im Nassblotverfahren mit einer Apparatur von BioRad. Die Nitrocellulosemembran wurde mit dhb2bo aktiviert und in Transferpuffer equilibriert. Der Transfer erfolgte unter Kühlung entweder 70 min bei 350 ma und 100 V oder über Nacht bei 90 ma und 30 V. Durch reversible Färbung der Nitrocellulosemembran mit Ponceau S-Lösung (0,2% w/v in 3% w/v Trichloressigsäure) wurde die Effizienz und Gleichmäßigkeit des Transfers kontrolliert. Unspezifische Bindungsstellen wurden durch Inkubation der Membran in Blocklösung für 1 h bei RT abgesättigt. Die Membran wurde anschließend mit PBS gewaschen und dann mit dem Primärantikörper verdünnt in Blocklösung entweder für 2 h bei RT oder über Nacht bei 4 C inkubiert. Nach drei Waschschritten mit Blocklösung (1x) und PBS Tween-20 (PBS-T, 2x) für jeweils 10 min, erfolgte die Inkubation mit dem Horseradish-Peroxidase-gekoppelten Sekundärantikörper in Blocklösung für 1 h bei RT. Die Membran wurde anschließend dreimal für jeweils 10 min mit Blocklösung und einmal in PBS gewaschen. Die Antikörperverdünnungen richteten sich nach der jeweiligen Affinität der Antikörper gegen das Antigen und wurden nach Anleitung des Herstellers eingesetzt oder individuell bestimmt. Die Detektion der auf der Membran immobilisierten Proteine erfolgt durch die indirekte Konjugation an einen Peroxidase-gekoppelten Sekundärantikörper. Die Peroxidase katalysiert eine Chemolumineszensreaktion, bei 37

46 II Material und Methoden welcher Licht (λ=428 nm) emittiert wird und einen Röntgenfilm schwärzt. Die ECL (enhanced chemoluminescence) Reaktion wurde mit dem ECL-Detektions Kit (Amersham) nach Angaben des Herstellers durchgeführt und die Membranen anschließend auf Filmen (Amersham) exponiert. Transferpuffer: 3,3 g Tris; 14,4 g Glycine; 20% Methanol (v/v) add 1000 ml. Blocklösung: PBS mit 4-5% Trockenmilchpulver (v/w); 0,1-0,3% Tween-20 (v/v). Waschlösung: PBS mit 0,1% -0,3% Tween-20 (v/v). II Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) Mit der EMSA Technik kann die DNA-Bindungsaktivität von Transkriptionsfaktoren untersucht werden. Im Falle von NF-κB führt eine Aktivierung zu einer Translokation des Transkriptionsfaktors in den Zellkern, aber auch alle anderen Transkriptionsfaktoren sind, unabhängig von ihrem Aktivierungsmodus, im Zellkern aktiv. Entsprechend kann man die DNA-Bindungsaktivität in Kernextrakten nach folgendem Durchführungsprotokoll messen. Ein nuklearer Proteinextrakt der Probe wird zusammen mit einem markierten Oligonukleotid inkubiert. Das Oligo enthält ein Consensus der DNA-Erkennungssequenz des jeweiligen Transkriptionsfaktors, durch Bindung an das Protein verändert das Oligo seine Mobilität in einer Elektrophorese (electrophoretic mobility shift). In einem nicht denaturierenden Polyacrylamidgel erfolgt eine Trennung der Komplexe aus gebundenem Protein und DNA, und den einzelnen Komponenten. In dieser Arbeit wurde die Aktivität des NF-κB mit Hilfe einer radioaktiv markierten Sonde, die eine NF-κB Consensusbindungssequenz enthält, untersucht. Das NF-κB-Consensus Oligonukleotid 32 wurde am 5 Ende mit γ-p P-ATP (Amersham) in einer T4-Polynucleotid Kinasereaktion (Invitrogen) nach Anleitung markiert und anschließend über 32 G50-Mikrochromatographiesäulen (Amersham) von ungebundenem γ-p P-ATP befreit. Die Radioaktivität des markierten Oligonukleotids wurde in einem β-scintillationszähler mit 1 µl des Oligonukleotids gemessen. Kernextrakte wurden auf 1 µg Protein/µl eingestellt und pro Ansatz wurden 7 µg davon zusammen mit dem Oligonukleotid (10 mol, ca cpm) in 1x DNA-Bindungspuffer in einem Gesamtvolumen von 20 µl für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Zum Nachweis der NF-κB Spezifität wurden supershift assays (als ss bezeichnet) durchgeführt. Durch Bindung spezifischer Antikörper an einzelne Untereinheiten des NF-κB Komplexes wird der DNA-Protein-Komplex in der Elektrophorese zusätzlich retardiert und die spezifische NF-κB Bande zu höherem Molekulargewicht hin verschoben (supershift). Die nuklearen Extrakte wurden dafür vor 38

47 II Material und Methoden Zugabe der Oligonukleotidprobe mit 1 µl p65, c-rel oder p50 Antikörper (1 µg/µl) für 1 h auf Eis inkubiert. Die DNA-Komplexe wurden in einem nativen, kontinuierlichen 4% Polyacrylamidgel in 0.5x Tris-borate-EDTA Puffer bei 250 V aufgetrennt. Danach wurde das Gel auf Whatman-Papier unter Vakuum bei 80 C getrocknet. Die Exposition erfolgte of X-Omat Filmen (Kodak) bei 80 C. Oligonukleotid, NF-κB Consensus (Santa Cruz Biotechnology, inc, Santa Cruz) 5 - AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG - 5 DNA Bindungspuffer: 50 mm Tris ph 7,9; 75 mm NaCl; 3 mm EDTA; 25% Glycerol (v/v); jeweils frisch zugesetzt wurden: 2,5 mm DDT; 1 µg BSA; 1 µg Poly(dIdC)oligo je Probe. Tris-Borate-EDTA (TBE)5x: 54 g Tris; 27,5 g Borat; EDTA 0,5 M; ad 1l. II.2.3 Molekularbiologische und mikrobiologische Methoden II Herstellung und Transformation kompetenter E. coli Bakterien Kompetente E.coli (DH5α) wurden entweder erworben (subcloning efficiency DH5α, Invitrogen Life Technologies) oder selbst hergestellt. 200 ml LB Medium wurde mit 1 ml einer stationären Kultur von E. coli DH5α angeimpft und bis zum Erreichen eines OD595 von 0,3 bis 0,5 im Schüttler bei 37 C inkubiert. 50 ml Aliquots wurden 15 min auf Eis inkubiert, anschließend abzentrifugiert (Sorvall-RC-5B-Zentrifuge, Rotor SLA-3000; 4 C und 3000 rpm 5 min) und das Pellet in 16 ml Transformationspuffer-1 resuspendiert. Nach 15 min Inkubation auf Eis und Wiederholung des Zentrifugationschrittes wurde das Pellet in 4 ml Transformationspuffer-2 aufgenommen, aliquotiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei 80 C aufbewahrt. Zur Transformation kompetenter Bakterien wurden diese auf Eis aufgetaut, je 100 µl mit ng Plasmid DNA gemischt und für 30 min auf Eis inkubiert. Nach 90 s Inkubation bei 42 C (Hitzeschock) wurden die Bakterien für 2 min auf Eis gestellt. Nach Zugabe von 1 ml LB Medium wurden die Bakterien für 1 h bei 37 C geschüttelt, in verschiedenen Verdünnungen auf Agar- Selektionsplatten ausplattiert und diese über Nacht bei 37 C inkubiert. Transformationsbuffer-1: 100 mm RbCl; 50 mm MnClB2B;B B10 mm CaClB2B; 30 mm Kaliumacetat; 15% (w/v) Glycerin ; ph 5,8. Transformationsbuffer-2: 10 mm MOPS; 10 mm RbCl; 7,5 mm CaClB2B; 15% (w/v) Glycerin; ph 7 39

48 II Material und Methoden II Präparation von Plasmid-DNA, Nukleinsäurefällung und Sequenzbestimmung Zur Isolierung kleinerer Mengen Plasmid DNA wurden je 5 ml antibiotikumhaltiges LB-Medium mit einer einzelnen transformierten Bakterienkolonie angeimpft und bei 37 C über Nacht auf einem Schüttler bei 220 rpm inkubiert. 2-4 ml der Übernachtkultur wurden bei 8000 rpm 5 min (Mikrozentrifuge) pelletiert und aus dem Bakterien-Pellet wurde mit dem Miniprep DNA Purifikation Kit (Qiagen) nach Anleitung des Herstellers die Plasmid-DNA präpariert. Die Plasmid-DNA wurde anschießend in dhb2bo oder TE gelöst. Zur Isolierung größerer Mengen Plasmid-DNA wurde 250 ml einer Übernachtkultur bei 3000rpm 15 min zentrifugiert (Sorvall-RC-5B-Zentrifuge, Rotor SLA-3000). Die Isolierung der Plasmid-DNA erfolgte mit Hilfe des QIAGEN-Plasmid-Maxi-Kits (Qiagen) nach Angaben des Herstellers. Die Plasmid-DNA wurde anschießend in dhb2bo oder TE gelöst. War eine Aufkonzentrierung der DNA nötig, wurde eine Nukleinsäure-Fällung gemacht. DNA aus wässriger Lösung wurde mit 1/10 Volumen 3 M Natriumazetat-Lösung (ph 5,2) oder 5 M Ammoniumacetat gemischt und mit dem 2,5-fachen Volumen Ethanol oder dem 0,7-fachen Volumen Isopropanol versetzt. Die Fällung der Nukleinsäuren erfolgte für mindestens 30 min bei 20 C. Die gefällte DNA wurde durch 20 min Zentrifugation bei 14000xg bei 4 C pelletiert und anschließend mit 70% Ethanol gewaschen. Die durch erneute Zentrifugation pelletierte Nukleinsäure wurde an der Luft oder im Vakuum getrocknet und in einem geeigneten Volumen dhb2bo oder TE-Puffer aufgenommen. Die Sequenzbestimmung wurden mit 1-20 ng DNA und einem geeigneten Primer von dem EMBL Sequenzierservice übernommen (EMBL/Genomcore, Heidelberg). II Bestimmung der Nukleinsäure-Konzentration Die Konzentration von Nukleinsäurepräparationen wurde photometrisch in einem Spektralphotometer (Eppendorf) bestimmt. Für die Bestimmung der DNA-Konzentration wurde die in dhb2b0 1:50 bis 1:200 verdünnte DNA-Lösung bei 260 nm und 280 nm gegen dhb2b0 als Referenz bestimmt. Eine Extinktion von 1 bei 260 nm entspricht in einer Küvette mit einer Schichtdicke von 10 mm ca. einer Konzentration von 50 µg/µl doppelsträngiger DNA, 40 µg/ml RNA und 30 µg/ml einzelsträngiger Oligonukleotide. Das Verhältnis der Extinktionen bei 260 nm zu 280 nm (Proteine) ist ein Maß für die Reinheit einer Nukleinsäurelösung und sollte für DNA bei etwa 1,8 liegen. 40

49 II Material und Methoden II DNA Verdau mit Restriktionsendonukleasen und Ligation Restriktionsspaltungen von DNA erfolgten in dem vom Hersteller für die jeweilige Nuklease angegebenen Puffer. Pro 1 µg DNA wurden 1 bis 2 Units Restriktionsenzym eingesetzt. Der Reaktionsansatz wurde für mind. 2 h bei der vom Hersteller für das jeweilige Enzym angegebenen optimalen Temperatur inkubiert. Die Enzyme wurden durch Hitze (2 min bei 65 C) oder durch Zugabe von 50 nm EDTA inaktiviert. Um eine Religation des Vektors zu vermeiden, wurde das linearisierte Plasmid vor der Ligation mit Hilfe der calf intestinal alkaline phosphatase an den 5 Enden dephosphoryliert. Zu dem Restriktionsansatz wurde 4-8 Units der Phospatase pro 1 µg DNA gegeben und 60 min bei 37 C inkubiert. Zur Aufreinigung von DNA wurde das QIAquick PCR-Purificaion-Kit (Qiagen) nach Angaben des Herstellers verwendet. Zur Ligation eines DNA-Fragments mit einem Vektor wurden 50 bis 200 ng Plasmid-DNA und ein drei- bis fünf-facher molarer Überschuß des DNA-Fragments mit 1-2 Units T4-DNA-Ligase in einem Gesamtvolumen von 10 µl eingesetzt. Die Ligation erfolgte über Nacht bei 16 C in einem PCR Gerät (Pequlab). II Agarose-Gelelektrophorese Je nach Größe der zu trennenden DNA-Fragmente wurden 0,8- bis 2%-ige Agarose -Gele verwendet. Die Agarose wurde in TAE Puffer gelöst, der auch als Laufpuffer benutzt wurde. Vor dem Auftragen wurden die Proben mit DNA-Probenpuffer (Endkonz. 1x) versetzt. Parallel zu den Proben wurde ein DNA-Marker mit DNA-Fragmenten definierter Größe aufgetrennt. Die Auftrennung erfolgte bei 90 V bis 150 V in Abhängigkeit von der Größe der Gelkammer. Die DNA-Detektion erfolgte mittels Ethidiumbromid unter UV Licht (Entweder nach dem Gellauf 10 µl der Ethidiumbromidstammlösung in 1 l HB2BO, 10 min Färben und 15 min in HB2BO Entfärben oder unmittelbar vor dem Gießen des Gels 2-4 µl der Ethidiumbromidstammlösung je 10 ml Agarosegellösung). Zur Isolierung eines aufgetrennten DNA-Fragmentes wurde dieses unter UV Licht markiert, aus dem Agarose-Gel geschnitten und anschließend mit dem Qiagen Quick Spin-Kit (Qiagen) nach Angaben des Herstellers eluiert. TAE: 1 mm EDTA; 40 mm Tris-Acetat ph 8,0. DNA-Probenpuffer (10x): 100 mm EDTA; 50% Glycerin; 1% SDS; 0,25% Brompenolblau; 0,25% Xylencyanol; ph 8,0. 41

50 II Material und Methoden II Isolierung von Gesamt-RNA Für alle RNA Protokolle wurde RNase freies dhb2bo verwendet. Wenn nicht vom Hersteller bereitgestellt, wurde dh2b2bo mit DEPC (Diethyl-Pyrocarbonat; Sigma) behandelt: 1 ml auf 1 l dhb2bo für 1 h bei 37 C; 15 min autoklavieren bei 121 C. Die Isolierung der Gesamt-RNA aus Gewebekulturzellen erfolgte mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen) nach Angaben des Herstellers. Ausgangsmaterial stellten Zellen einer 70-80% konfluenten 10 cm Zellkulturflasche dar. Zum kompletten Zellaufschluss wurde die Proben 5 mal durch eine RNase-freie, Insulinnadel mit 0,33 mm Durchmesser (Becton Dickinson) gezogen. Zur vollständigen Entfernung verunreinigender DNA wurden die Proben 30 min bei RT mit DNaseI (Qiagen) nach Angaben des Herstellers behandelt. Die RNA wurde mit RNase freiem dhb2bo eluiert, die Konzentration bestimmt und bei -80 C aufbewahrt. Die Konzentrationsbestimmung erfolgte photometrisch und als Dreifachbestimmung. II cdna-synthese Die Gesamt-RNA aus eukaryontischen Zellen besteht aus ribosomaler RNA (rrna), Transfer RNA (trna) und zu einem geringeren Anteil aus messenger RNA (mrna), wobei der Anteil der poly(a)-mrna in der Regel nur ca. 1-2% beträgt. Das Umschreiben der mrna in komplementäre DNA (cdna) erfolgte mittels Reverser Transkriptase (Omniscript RT PCR Kit, Qiagen). Als sogenannter random Primer für die cdna-synthese wurde ein PAGE aufgereinigtes Oligo(dT)B12B (Biomers) eingesetzt, welches mit der 3 poly(a) Region aller mrna Spezies hybridisiert. Um eventuelle Sekundärstrukturen der RNA aufzuheben, wurde die in die Reaktion einzusetzende RNA-Menge, in dem nach Protokoll vorgesehenem Endvolumen dhb2bo, vor Zugabe der anderen Reaktionskomponenten, 10 Minuten bei 65 C auf dem Heizblock inkubiert. Die cdna-synthese Reaktion wurde nach Anleitung des Herstellers angesetzt, zusätzlich wurde je Reaktionsansatz 1 µl (1 U/µl) Ribonuklease Inhibitor (Roche) zugegeben. Für die cdna-synthese wurde jeweils 1 µg RNA eingesetzt. Die Reaktion erfolgte 60 min bei 37 C in einem PCR Gerät (Peqlab). Die cdna wurde anschließend bei -20 C gelagert. II Primer-Design für die Lightcycleranalyse Die Suche nach geeigneten Primersequenzen erfolgte mit Hilfe des Programms GeneFisher ( Die humane cdna-sequenz der Zielgene wurde der Ensembl Datenbank ( entnommen. Folgende Kriterien wurden bei der Primersuche angelegt: 42

51 II Material und Methoden Oligonukleotidlänge: bp Produktlänge bp GC Gehalt 40-60% Tm > 58 C Ein T am 3 Ende sollte aufgrund höherer Neigung zur Mismatch-Paarung vermieden werden Eine Folge von 3 oder mehr Gs oder Cs am 3 Ende sollte vermiede werden Primer sollten eine Exongrenze überspannen. Dadurch wird die Amplifikation nur von Intron-freier cdna gewährleistet. Alternativ sollte das Primerpaar einen Intron-enthaltenen Bereich umspannen, da von genomischer DNA amplifizierte Produkte wesentlich größer sind, daher mit wesentlich geringerer Effizienz amplifiziert werden und sich von dem DNA Produkt unterscheiden lassen. Durch ein Blast Screening ( wurde die Spezifität der Primersequenzen für das jeweilige Gen geprüft. Die Oligonukleotide wurden von Biomers (Ulm, Deutschland) hergestellt. Die für die Analyse verwendeten Oligonukleotide waren HPLC aufgereinigt. II Real-Time quantitative RT-PCR Der LightCycler (Roche Diagnostics, Mannheim) ist ein Real-Time-PCR-Instrument basierend auf dem Prinzip der Rapid-Cycle-PCR (30 PCR-Zyklen in weniger als 20 Minuten) mit integriertem Fluorimeter (Wittwer et al., 1997). Spezielle Kapillaren aus Borosilicatglas (Roche) als Reaktionsgefäße erlauben sehr kurze Zykluszeiten und gleichzeitig die fluorimetrische Messung. Eine High-Performance-Diode (blaue LED) als Energiequelle regt mit einer Wellenlänge von 470 nm die Proben zur Fluoreszenz an, das emittierte Licht der Proben wird über Spiegel und einen Photomultiplier in einen der drei Analysenkanäle geleitet und analysiert. Für die Fluoreszenzdetektion gibt es verschiedene Applikationen, man unterscheidet Affinitätsfarbstoffe und fluoreszenzmarkierte DNA-Hybridisierungssonden. In der vorliegenden Arbeit wurde der Fluoreszenzfarbstoff SYBR-Green I zur DNA-Detektion benutzt (Anregung maximal bei 497 nm, Emission bei 520 nm). Der Farbstoff interkaliert in doppelsträngige DNA, bindet aber nicht an einzelsträngige DNA. Durch die Bindung wiederum verstärkt sich die Fluoreszenz des Farbstoffes um ein Vielfaches. Das emittierte Fluoreszenzsignal ist proportional zur Menge der cdna (Abb. 12). 43

52 II Material und Methoden Abbildung 12 Prinzip der DNA-Detektion mittels des SYBR-Green I Farbstoffs 1. Vor Reaktionsbeginn liegt nur denaturierte ssdna vor, und in ungebundener Form fluoreszieren die SYBR-Green Moleküle nur sehr schwach. 2. Während des Amplifikationsprozesses entsteht dsdna, an welche der SYBR-Green Farbstoff binden kann. Durch die Bindung wird das Emissionsignal um ein Vielfaches verstärkt. 3. Mit fortschreitender DNA-Synthese bindet mehr und mehr Farbstoff und das Fluoreszenzsignal steigt kontinuierlich und proportional zur eingesetzten cdna-menge an. Entnommen aus ( Im Gegensatz zu der klassischen PCR, bei der nur eine Endproduktbestimmung möglich ist, kann bei der Echt-Zeit-PCR die Amplifikationskinetik online verfolgt werden. Die simultane Aufzeichnung des Fluoreszenzsignals erlaubt es nach jedem Amplifikationszyklus die Produktmenge zu bestimmen. Man bestimmt daher die Zykluszahl, bei der sich das Fluoreszenzsignal erstmalig deutlich vom Hintergrundrauschen abhebt. Zu diesem Zeitpunkt verläuft die Amplifikation noch exponentiell. Man spricht vom sogenannten Schwellenzyklus, cycle treshold value (CT) oder Crossing Point (CP). Je weniger Template-Moleküle zu Beginn der Reaktion in einer Probe enthalten sind, desto mehr Amplifikationszyklen sind notwendig bevor das Fluoreszenzsignal den Schwellenwert erreicht. Die Bestimmung des CT erfolgt durch die Methode des second derivative maximums. Hierbei wird der Punkt, an welchem die Fluoreszenz innerhalb der logarithmisch-linearen Phase maximal ansteigt, über das Maximum der zweiten Ableitung der Amplifikationskurve bestimmt und der Schnittpunkt des logarithmisch-linearen Anteils der Amplifikationskurve mit einer definierten Horizontalen zur Elimination des Hintergrundrauschens ermittelt. Die Lightcyclersoftware gibt am Ende die entsprechende Zykluszahl an (Abb.13 A). Der Nachteil des SYBR-Green Formats ist die fehlende Spezifität hinsichtlich des zu untersuchenden Templates, denn auch Primer-Dimere, die sich während der Reaktion bilden können, interagieren mit dem Farbstoff und verursachen so ein erhöhtes Fluoreszenzsignal. Eine Schmelzkurvenanalyse am Anschluss der PCR-Reaktion ermöglicht aber eine Identifizierung aller Produkte an die der Farbstoff gebunden ist. Bei der Schmelzkurvenanalyse wird die Temperatur graduell erhöht ( 0.5 C) und die Fluoreszenz kontinuierlich gemessen. Am Schmelzpunkt denaturieren die DNA-Stränge, der Farbstoff löst sich und das Fluoreszenzsignal fällt auf den Ausgangswert ab. Der 44

53 II Material und Methoden Schmelzpunkt eines DNA-Fragments ist abhängig von seiner Sequenz, dem GC-Gehalt und seiner Größe. Aufgrund seiner spezifischen Schmelztemperatur ist eine Identifzierung des PCR-Produkts möglich. Primer-Dimere haben einen niedrigeren Schmelzpunkt als das eigentliche PCR-Produkt und sind als kleiner Peak vor dem Peak des PCR-Produkts zu erkennen (Abb. 13 B). Zur zusätzlichen Überprüfung der PCR-Endprodukte wurden diese nach dem Lightcyclerlauf in einem 2% Agarosegel analysiert. A B Spezifisches Produkt Fluoreszenz Primer-Dimer Temperatur Abbildung 13 Fluoreszenzamplifikation und Schmelzkurvenanalyse mit der Lightcyclersoftware A) Amplifikation des Fluoreszenzsignals und CP Bestimmung der Proben. B) Schmelzpunktanalyse einer Probe. Die Graphik zeigt den Verlauf der Fluoreszenzintensität der Schmelzkurve für ein PCR-Produkt. Das Auswertungsprogramm bildet die erste negative Ableitung der Fluoreszenz nach der Temperatur. So erhält man einen scharfen Peak, der eine für das jeweilige Primerpaar spezifische Temperatur ergibt. Primer-Dimere sind durch einen vorgelagerten kleinen Peak erkennbar. Die PCR wurde als two-step PCR durchgeführt, d.h. die cdna-synthese erfolgte im voraus, unabhängig von der Real-time-PCR. Für die Real-time-PCR Reaktion wurde das QuantiTect SYBR-Green Kit der Firma Qiagen nach Anleitung des Herstellers verwendet. Der Master Mix beinhaltet eine thermostabile HotStar Taq Polymerase, zu deren Aktivierung eine initiale Inkubation bei 94 C erforderlich ist, wodurch die Elongation unspezifischer Primeranlagerungen weitgehend vermieden wird. Pro Reaktionsansatz wurden µl der cdna (20 µl Gesamtvolumen aus der cdna-synthese Reaktion) eingesetzt. Es zeigte sich, dass größere Mengen an cdna bzw. RNA (>1 µg) einen inhibitorischen Effekt haben können. Die cdna hatte eine Konzentration von 25 ng/µl ± 1.5 ng. Die Primer wurden in einer Konzentration von 0,3 µm eingesetzt. 45

54 B* II Material und Methoden Segment Zyklen Temperatur Zeit Hotstart 1 94 C 900 s Amplifikation Denaturierung Annealing Elongation 40 Tabelle 3 PCR Reaktionsprofil Theoretisch wird bei jedem Amplifikationszyklus die Ausgangsmenge verdoppelt, daher beträgt die maximale Effizienz 2. Die Endproduktmenge (N) würde dann in Abhängigkeit von der Anzahl der PCR Zyklen (n) und von der Ausgangsmenge (NB0B) n N= NB0B B2P Pbetragen. Aufgrund verschiedener Faktoren (z.b. Produktinibition, Enzymstabilität etc.) liegt die reale Effizienz allerdings i.d.r. unter 2. Die durchschnittliche Amplifikationseffizienz eines PCR-Laufs in Abhängigkeit von den verwendeten Primerpaaren wurde über die Steigung der Standardgerade (slope) berechnet -1/Steigung E = 10P P Die Standardgerade wurde aus zwei bzw. drei unabhängigen Verdünnungsreihen bestimmt. Für die verwendeten Primerpaare ergaben sich folgende Effizienzen: TR1: 1,77; TR2: 1,8; TR3: 1,9; TR4:1,86; PBGD: 1,85 TR = TRAIL Rezeptor; PBGD = Porphobilinogen Deaminase Die Quantifizierung erfolgte immer ausgehend von der gleichen Menge Gesamt-RNA. Um Unterschiede im Template Input in Folge von z.b. unterschiedlicher Effizienz der cdna-synthese, als aber auch Lauf-zu-Lauf Variabilitäten zu berücksichtigen, wurde die Expression jedes Zielgens gegen die Expression eines Referenzgens normiert. Dadurch kann die Expression der Zielgene verschiedener cdna Proben verglichen werden. Das Referenzgen sollte ubiquitär und konstant zu gleicher Menge exprimiert sein. In dieser Arbeit wurde Porphobilinogen Deaminase (PBGD) als Referenzgen verwendet. Jeder Lauf wurde als Doppelbestimmung durchgeführt. Die relative Expression der Zielgene in den zu vergleichenden Zelllinien wurde nach folgender Formel bestimmt: Relative Expressionseinheit = E (Zielgen) P CT = CT (Referenzgen) CT (Zielgen) E = Effizienz CT = Cycle Treshold Value 94 C 60 C 72 C CT 15 s 24 s 30 s Schmelzkurve 1 50 C 95 C 0,1 C/ s Kühlung 1 20 C 30 C/ s 46

55 II Material und Methoden II.2.4 RNA Interferenz Die Technologie der RNA Interferenz (RNAi) hat sich in den letzten Jahren zu einer der wichtigsten Methoden der Genanalyse in Eukaryonten entwickelt und stellt aufgrund ihrer Spezifität und relativen Einfachheit die Methode der Wahl bei sogenannten loss of function Untersuchungen dar, d.h. die Bedeutung und Funktion eines Genes wird durch das Ausschalten desgleichen untersucht. RNAi ist ein Mechanismus, bei welchem doppelsträngige (ds) RNA über die Degradation komplementärer mrna eine potente und spezifische Inhibition der Genexpression induziert (Zamore et al., 2000; Elbashir et al., 2001). Der konservierte Mechanismus des post transcriptional gene silencing, des Ausschalten eines Gens nach der Transkription, wurde zunächst bei Pflanzen und Pilzen beschrieben und hat wahrscheinlich die Funktion, das Genom vor Viren und Transposonaktivität zu schützen und aberrante Transkriptionsprodukte zu eliminieren (Waterhouse et al., 2001). Versuche mit Hilfe langer exogener dsrna in Vertebraten posttranskriptional Gene auszuschalten waren zunächst erfolglos, da lange dsrna Moleküle in Vertebraten eine Interferon Antwort auslösen, was letztendlich zur Apoptose der Zelle führt (Gil et al., 2000). Diese unspezifische Abwehrreaktion gelang es aber durch die direkte Transfektion synthetischer nt langer sirnas zu umgehen und so eine selektive und sequenzspezifische Gen-Inaktivierung in Säugetierzelllinien zu erzielen (Elbashir et al., 2001). Der Mechanismus der RNAi wird wie folgt verstanden. Das Enzym Dicer, eine RNase III spaltet zytoplasmatische dsrna in nt lange dsrna-fragmente mit 5' phosphorylierten Enden, 3' OH-Enden und ungepaarten 2 nt-überhängen. Diese dsrna-fragmente stellen die eigentlichen Effektoren der RNAi dar und werden als short/small interfering RNAs (sirna) bezeichnet. SiRNAs bleiben nach ihrer Prozessierung mit Dicer assoziiert. Das doppelsträngige sirna-molekül wird dann in den RNA-induced silencing complex (RISC) aufgenommen, die Erkennung erfolgt über die spezifische Struktur der RNA (s.o.). Darauf folgt die Aktivierung des RISC (RISC*): die ATP-abhängige Entwindung der sirna, die für die Erkennung der komplementären Ziel-mRNA notwendig ist. Nach der Entwindung dissoziiert einer der beiden sirna-stränge und wird degradiert, während der andere Strang weiterhin mit dem RISC assoziiert bleibt. Dabei entscheiden die terminalen Stabilitäten des RNA Doppelstranges (A:U-Gehalt der terminalen Sequenzen) von welcher Seite die sirna entwunden wird und damit welcher der beiden Stränge mit dem RISC assoziiert bleibt. Der RISC ist nach seiner Aktivierung mit Ribosomen assoziiert und erkennt potentielle mrna-substrate vermutlich während ihrer Translation. Die Erkennung erfolgt über die 47

56 II Material und Methoden Hybridisierung der zellulären komplemetären mrna mit sirna in dem RISC. Die Ziel mrna wird endonukleolytisch durch Slicer katalysiert gespalten und degradiert. Während die dabei entstehenden mrna-fragmente durch unspezifische Nukleasen im Zytosol abgebaut werden, verbleibt die sirna im RISC und kann einen neuen mrna-degradationszyklus einleiten (Elbashir et al., 2001; McManus et al., 2002). Abbildung 14 Das Prinzip des Mechanismus der RNA Interferenz Die Darstellung zeigt vereinfacht die Reaktionsschritte des RNAi-Mechanismus. Das Enzym Dicer prozessiert dsrna so, dass diese durch den RISC erkannt und in diesen inkorporiert wird (1). Darauf folgt die Aktivierung des RISCs (2), Lokalisation und Erkennung des mrna-substrates (3), Spaltung des mrna-substrates (4), Regeneration des RISCs und mrna-degradation (5). sirnas short interfering RNAs; RISC RNA inducedsilencing complex. II Herstellung adenoviraler shrna Expressionsvektoren Chemisch synthetisierte sirnas sind teuer und nur eine relative kurze Zeit stabil. Ein weiterer limitierender Faktor ist, dass sich nur wenige Zelltypen einfach effizient transfezieren lassen. Um diese Limitierungen zu adressieren, wurde ein Vektor-basiertes System entwickelt, das die Expression von shrna bzw. sirna in Säugerzellen ermöglicht (Brummelkamp et al., 2002; Paddison et al., 2004). Die short/small hairpin RNA (shrna) ist eine künstlich designte RNA, die im allgemeinen folgende Merkmale trägt. Eine genspezifische sirna-sequenz zwischen 18 und 29 nt die dem Zielgen entstammt Ein 4-15 nt langes Zwischenstück, die Schleife (hairpin loop) Die reverse komplementäre Sequenz der Zielsequenz Die im Vektor enthaltene sirna-expressionskassette besteht aus einem Polymerase III Promotor (U6 oder H1), gefolgt von der shrna und dem Terminationssignal, bestehend aus fünf oder mehr aufeinander folgenden Thymidin-Nukleotiden (Abb. 15A). Das 48

57 II Material und Methoden entstehende Transkript faltet sich auf sich selbst zurück, dadurch bildet sich eine kurze Haarnadelstruktur-RNA (short hairpin RNA = shrna). Diese Struktur wird von dem Enzym Dicer erkannt und zur funktionstüchtigen sirna prozessiert (Abb. 15B). Die RNA Polymerase III steuert in der Zelle die Transkription einer begrenzter Zahl an Genen die für RNA kodieren (z.b. rrna, trna, U6-snRNA). Der endogene U6 Promotor kontrolliert normalerweise die Expression der U6-RNA, kleiner nuklearer RNA (snrna), die am Splicing beteiligt sind (Paule et al., 2000). Der U6 Promotor ist für die Expression von shrna Molekülen in Säugerzellen geeignet, da er eine starke und konstitutive Aktivität aufweist und in dem meisten Zelltypen aktiv ist. shrna Expressionskassette PolIII Promotor (U6/H1) 19 nt sense 9 nt Spacer 19 nt antisense TTTTT Transkription durch Polyme rase III Dicer Abbildung 15 Struktur und Prozessierung der shrna Oben dargestellt ist der Aufbau einer klassischen shrna-expressionskassette. Nach der Transkription durch Polymerase III bildet das Konstrukt als Haarnadelstrukur eine dsrna, welche dem Enzym Dicer als Substrat dient und zu sirna Molekülen prozessiert wird. Die Herstellung der adenoviralen shrna-expressionsvektoren erfolgte unter Verwendung des BLOCK-iT Adenoviral RNAi Systems der Firma Invitrogen, und umfasste folgende Arbeitsschritte: (1) Identifizierung von Zielsequenzen, (2) Klonierung der shrna Motive in den pu6.entr-vektor, (3) Funktionalitätstest der pu6.entr.shrna-konstrukte in HEK293 Zellen, (4) Klonierung der shrna- Expressionskassette in den adenoviralen Vektor (pad/ BLOCK-iT Dest) und (5) Amplifikation und Aufreinigung der adenoviralen Vektoren. II Herstellung der ds shrna Oligonukleotide Die shrna Oligonukleotide wurden durch die Firma Biomers (Ulm) synthetisiert. Die RNAi Sequenzmotivsuche ist im Ergebnisteil (III.3.2) beschrieben. Beim Design der shrna Oligonukleotide wurde am 5 Ende vor der Zielsequenz die Nukleotideabfolge ACC gestellt und dadurch der Überhang einer Bbs1 Schnittstelle generiert. Im Fall, dass das Sequenzmotiv nicht mit einem G (Transkriptionsstart) beginnt, wurde die 49

58 II Material und Methoden Nukleotideabfolge ACCG vorangestellt. Ansonsten liefert das G des Sequenzmotivs das notwendige Nukleotide um den Bbs1 Überhang zu komplementieren. Am 3 Ende wurde das Transkriptionsstopsignal d(t)b5b erzeugt. Dem Komplementärstrang wurde am 5 Ende die Nukelotideabfolge (TTAA) zugefügt, zur Generierung des EcoR1 Überhangs bei gleichzeitiger Erhaltung der Schnittstelle (Abb. 16). Die Oligonukleotidpaare wurden zunächst hybridisiert (Annealing). Die Oligonukleotide wurden mit der entsprechenden Menge ddhb2bo auf 2 µg/µl eingestellt. 13 µl je Oligo wurden in 1xAnnealing-Puffer (mit ddhb2bo ad 50 µl) in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß in kochendes Wasser gegeben und über Nacht abgekühlt. 5x Annealing Puffer: Kalium Acetat 500 mm ph 7,4; Magnesium Acetat 10 mm; HEPES-KOH 150 mm. Start Stop Abbildung 16 Aufbau der shrna Oligonukleotide Bbs1 und EcoR1 Schnittstellenüberhänge (fett kursiv) ermöglichen die Klonierung in den pu6.entr-vektor ohne Restriktionsverdau des ds Oligonukleotids. Die sense Zielsequenz ist von der antisense Zielsequenz durch die Loop-Sequenz getrennt. G und TTTTT stellen das Transkriptionsstartsignal bzw. Terminationssignal dar. II BbS1 EcoR1 5 ACCG 18-20nt TTCAAGAGA 18-20nt CTTTTTG nt AAGTTCTCA 18-20nt GAAAAACTTAA 5 Zielsequenz sense (oder antisense) Schleife (loop) Zielsequenz antisense oder (sense) Klonierung der ds shrna Oligonukleotide in den pu6.entr-vektor Der pu6.entr-vektor wurde mit Bbs1 und EcoR1 geschnitten. Der Verdau erfolgte sequentiell, zuerst mit Bbs1 (3-4 h) und anschließend mit EcoR1 (über Nacht). In die Ligation des Vektors mit den hybridisierten Oligonukleotiden wurden 0,75 ng Vektor und 100 ng (0,1 µl des Annealingansatzes) Oligos eingesetzt. Kompetente E.coli (DH5a) Bakterien wurden mit dem Ligationsansatz transformiert. Die Selektion erfolgte auf Kanamycin LB Platten Kolonien pro Ansatz wurden gepickt und die Plasmid DNA amplifiziert (Plasmid DNA Minipräparation). Die Inserierung des Oligonukleotids wurde mittels eines Kontrollverdaus (Nde1; Sal1) mit DNA aus der Mini-Präparation auf einem 2% Agarosegel überprüft. Kontrollverdau: Sal1:1 µl; Nde1:1,5 µl; DNA: µl; Puffer Sal1 und BSA; dhb2bo ad µl 50

59 II Material und Methoden Positive Kolonien wurden durch Sequenzieren (Genecore/EMBL Heidelberg) überprüft und anschließend eine Maxi Plasmid Präparation gemacht. Reverser shu6 Sequenzierprimer: GCATATACGATACAAGGCTG II Funktionalitätstest der pu6.entr.shrna-konstrukte in Hek293 Zellen Hek293 Zellen wurden nach der Calzium-Phosphat Methode mit den zu testenden shrna Konstrukten transfeziert. 48 h-72 h nach der Transfektion wurde die Effizienz der Herunterregulation der Zielgene Durch Western-Blot bzw. im Durchflußzytometer überprüft (Vgl. II ). II Klonierung der shrna Expressionskasette in den adenoviralen Vektor Zur Herstellung des adenoviralen Vektors wurde die U6.shRNA-Expressionskassette in den pad/block-it Destination Vektor (Invitrogen) kloniert. Der Vektor enthält Adenovirus Serotyp5 Sequenzen, deletiert in der E1 und E3 Region. Der Plasmid enthält zusätzlich einen Sequenzabschnitt zur Amplifikation des Plasmids in Bakterien. Der pad/block-it Vektor enthält keinen eukaryontischen Promotor, da der U6 Promotor in der shrna-expressionskassette enthalten ist. Die Klonierung erfolgt mittels der Gateway Technologie von Invitrogen. Die Gateway Technologie basiert auf dem site-spezifischen Rekombinationssystem des Bakteriophagen Lambda, was dieser zur Integration in das E. coli Genom nutzt. Die Rekombination erfolgt zwischen spezifischen attachment (att) sites auf den interagierenden DNA Molekülen. Der Entr-Vektor (pu6.entr) enthält attl-sites, der Destination Vektor (pad/block-it ) attr-sites. Der resultierende Expressionsvektor enthält dann den backbone des Destinationvektors und die Expressionskassette des Entr-Vektors (Abb. 17). Der Destinationsvektor enthält das ccdb-gen und das Chloramphenicol-Resistenzgen (cmr). Dieser Vektorabschnitt geht bei der Rekombination verloren, was eine Selektion positiver Expressionsklone ermöglicht. Das CcdB-Protein inhibiert die E. coli DNA Gyrase und inhibiert dadurch das Wachstum der meisten E. coli Stämme (Bernard et al., 1993). Zusätzlich sind positive Klone Ampicillin-resistent und Chloramphenicol-sensitiv. Die Rekombinationsreaktion wird durch das Enzym LR Clonase II katalysiert. Die Rekombinationsreaktion wurde mit dem LR Clonase II Enzymmix (Invitrogen) nach Anleitung des Herstellers durchgeführt. Es wurde jeweils 150 ng des Destination Vektors und 300 ng des Entr-Vektors eingesetzt. Die Reaktion erfolgte bei RT über Nacht. 51

60 II Material und Methoden Abbildung 17 Klonierung der shrna-expressionskassette in den adenoviralen Vektor basierend auf dem Invitrogen Gateway System Site-spezifische Rekombination ermöglicht die Insertion einer Expressionskassette aus einem Entr-Vektor in einen Destination-Vektor. Kompetente E. coli DH5α wurden anschließend mit dem Reaktionsansatz transformiert % des Transformationsansatzes wurden auf Ampicillinplatten ausgestrichen und für mindestens 24 h inkubiert. Klone wurden gepickt und in Ampicllin-LB Medium über Nacht amplifiziert. 1 ml der Kultur wurde dann 6 h in Chloramphenicol-haltigem Medium inkubiert. Mit positiven Klonen wurde eine Maxi-Plasmidpräparation gemacht. Als zusätzliche Kontrolle wurden die Plasmide mit Nde1 verdaut. Die Inserierung der shrna-expressionskassette erzeugt eine zusätzliche Schnittstelle, positive Klone sind daher durch drei DNA Fragmente gekennzeichnet (Abb. 18) Abbildung 18 Kontrollverdau des Ad/U6.shRNA Expressionsklons Bahn 1-10: Positive Klone; Bahn 11, 12: Negativkontrolle (pad/block-it Parentalvektor) Die Herstellung rekombinanter Adenoviren und die Vektorproduktion erfolgte wie im folgenden Abschnitt beschrieben. II.2.5 Produktion und Aufreinigung adenoviraler Vektoren Der für die Herstellung rekombinanter adenoviraler Vektoren verwendete Adenovirus-backbone (Serotyp5) ist deletiert für die E1 und E3 Region. Die Sequenzen entsprechen den adenoviralen Wildtyp-Sequenzen und Die E1 Region ist essentiel für die Transkription später viraler Gene, E1- deletierte Adenoviren sind daher replikations-inkompetent, die Replikation kann nur in Zellen erfolgen welche die E1a und E1b Proteine substituieren (sogennante Package Zelllinien z.b. Hek293, N52). In diesem Fall ist ein vollständiger Replikationszyklus möglich. Andere Zellen können lediglich 52

61 II Material und Methoden transduziert werden, d.h. das adenovirale Genom wird in die Wirtszelle eingebracht und das Transgen vom Genom des adenoviralen Vektors aus transkribiert. Die adenovirale DNA wird in den Zellkern transloziert, integriert aber nicht in das Wirtsgenom. Die Transgenexpression erfolgt in der Regel innerhalb von 24 h nach der Transduktion, die Expression erfolgt solange der adenovirale Vektor anwesend ist und nimmt daher in Abhängigkeit von der Zellteilungsrate und der Anzahl der Vektoren je Wirtszelle zu Beginn ab. Hek293 ist eine sogenannte Package Zelllinie, in welcher die Produktion und Amplifikation Replikations-inkompetenter Adenoviren stattfinden kann. Hek293 Zellen sind stabil mit einer E1 Kopie des Adenovirus 5 transformiert, wodurch die E1 Proteine E1a und E1b, die der Adenovirus für seine Replikation benötigt, in trans bereitgestellt werden. II Herstellung des Crude Extracts in Hek293 Zellen Vor der Transfektion der Hek293 Zellen mit dem adenoviralen Vektor wurde dieser mit dem Restriktionsenzym Pac1 geschnitten. Durch den Verdau mit Pac1 werden die bakteriellen Gensequenzen entfernt und die adenovirale DNA liegt linearisiert mit den viralen ITRs an beiden Enden vor. Die Aufreinigung der Plasmid DNA erfolgte mit dem DNA PCRQuick Purification Kit (Qiagen) nach Anleitung des Herstellers. Hek293 Zellen auf einer ca. 70% konfluenten 10 cm Schale wurden mit 10 µg der adenoviralen DNA nach der Kalzium-Phosphat-Methode transfeziert. Nach ca. 16 h im Brutschrank wurde das Medium gewechselt. Die Zellen wurden in der Regel nach 2-3 Tagen umgesetzt. Nach ca Tagen war der CPE (Cytopathic Effect) der Zellen erkennbar. Die Zellen wurden mit dem Medium in ein 50 ml Falcon Tube geerntet, pelletiert (400xg; 10 min) und in 5 ml sterilem TBS aufgenommen. Der Aufschluss der Zellen erfolgte durch einen Einfrier- und Auftauzyklus. Das Einfrieren erfolgte im flüssigen Stickstoff, das Auftauen im 37 C Wasserbad. Der Vorgang wurde dreimal wiederholt und die Zelltrümmer anschließend abzentrifugiert (1800xg; 10 min). Die Virussuspension, der sogenannte crude extract, wurde zur Infektion von N52 Zellen verwendet. TBS Puffer: 25 mm Tris/HCl ph 7,4; 137 mm NaCl; 27 mm KCl. II Large-scale Adenovirusproduktion in N52 Zellen und Aufreinigung der Adenoviruspräparation Zur Large-scale Adenovirusproduktion wurde die N52 Zelllinie verwendet (Schiedner et al., 2000). Die Zelllinie wurde freundlicherweise von Dr. Stefan Kochanek zur Verfügung gestellt. Die E1-transformierte Amniozytenzelllinie N52 ermöglicht eine effiziente 53

62 II Material und Methoden Virusproduktion, wobei Rekombinationsereignisse wesentlich seltener auftreten als bei Hek293 Zellen, was die Gefahr der Entstehung von Wildtyp Viren minimiert. Ziel war N52 Zellen mit einem Virustiter zu infizieren, der die Zellen nach genau 48 h, d.h. nach einem Replikationszyklus, in den CPE führt. In N52 Zellen ist dies bei der Infektion einer Zelle mit 20 infektiösen Partikeln der Fall. Ein höherer Titer wäre zytotoxisch, ein geringerer Titer könnte zu unerwünschten Rekombinationsereignissen infolge mehrerer Replikationszyklen führen. Um den Titer des crude extracts aus den Hek293 Zellen ungefähr zu bestimmen, wurde dieser auf 6-Well Platten mit 90% konfluenten N52 Zellen austitriert. Für die Viruspräparation wurden 90% konfluente N52 Zellen auf 15 cm Schalen (8-12 Schalen pro Präparation) mit der geeigneten Menge des crude extracts infiziert. Die Zellen wurden am Tag vor der Infektion umgesetzt. Beim Erreichen des CPEs - die Zellen sollten größtenteils von der Platte gelöst sein, aber noch traubenförmig aneinander haften - wurden die Zellen mit dem Medium geerntet (400xg; 10 min), mit sterilem PBS gewaschen und in sterilem TBS (maximales Puffervolumen 6 ml) aufgenommen. Nach dem Aufschluss der Zellen mittels dreier Einfrier- und Auftauzyklen, wurden die Zelltrümmer abgetrennt (1800xg; 10 min). Das Viruslysat wurde anschließend in einem CsCl Gradienten konzentriert und aufgereinigt, wobei zuerst ein diskontinuierlicher CsCl-Step Gradient und anschließend ein kontinuierlicher Gradient gefahren wurde. Diskontinuierlichen CsCl-Step Gradient In einem UZ-Röhrchen (Beckman) wurde der Step-Gradient wie folgt vorsichtig geschichtet 3 ml CsCl der Dichte 1,42 g/ml (10,97 g CsCl ad 20ml TBS/PBS) 5 ml CsCl der Dichte 1,27 g/ml (7,288 g CsCl ad 20ml TBS/PBS) Auf dem Gradienten wurden je Zentrifugenröhrchen 3 ml Viruslysat geladen und mindestens 1,5 h in der UZ Sorvall Discovery (Ausschwenkrotor Sorvall T-1270) zentrifugiert. An der Grenzschicht zwischen den beiden CsCl-Phasen formten die Adenovirus-Partikel eine Bande, die unter direkter Lichtbestrahlung deutlich erkennbar war. Die Banden konnten dann mit einer sterilen 2 ml Spritze abgesaugt werden. Kontinuierlicher CsCl Gradient Die Viruslysate aus dem Stepgradienten wurden vereinigt und in ein UZ Röhrchen gegeben in welchem 5 ml einer CsCl-Lösung der Dichte 1,34 g/ml (9,084 g CsCl ad 20 ml TBS/PBS) vorgelegt war. Der Gradient wurde für mindestens 20 h in der UZ laufen gelassen. Die Viruspartikel wandern durch den CsCl-Gradienten und verbleiben an 54

63 II Material und Methoden der Stelle des Gradienten, der ihrer eigenen Dichte entspricht und die wirkende Auftriebund Zentrifugalkraft im Gleichgewicht ist. Die Adenoviruspartikel sind als scharf abgegrenzte Bande in etwa der Mitte des Zentrifugenröhrchens erkennbar. Oberhalb ist meist eine zweite, diffusere Bande erkennbar, welche unfertige Viruspartikel enthält. Proteinverunreinigungen sammeln sich im oberen Bereich des Röhrchens. Die Virusbande wurde anschließend mit einer sterilen 2 ml Spritze abgesaugt, langsam in ein 15 ml Falcon Röhrchen gegeben und mit Puffer (TBS, PBS) auf 2,5 ml aufgefüllt. Das Viruslysat wurde dann über eine Sephadex Säule (Amersham) vom CsCl gereinigt. Die Säulen wurden zunächst mit 5x 5 ml Puffer äquilibriert, anschließend wurde die Viruslösung aufgetragen. Nach dem Durchlauf wurden 5 ml Puffer aufgetragen und der Durchlauf in 1 ml Fraktionen in Reaktionsgefäßen (Eppendorf) aufgefangen. Der aufgereinigte Virus befand sich in der Fraktion 2 und 3. Die 2 ml Viruslösung wurde mit 220 µl sterilen Glycerol gemischt und Glycerolstocks als 500 µl Aliquots a 500 µl bei -80 C aufbewahrt. II Titerbestimmung und Transduktion Die Titerbestimmung erfolgte photometrisch. Die Viruslösung wurde 1:50 verdünnt und 12 die Optische Dichte (OD) bei 280 nm gemessen. Dabei gilt ein OD von 1 entspricht 10P P Partikel pro ml. Die Messung erfolgte ausgehend von der Verdünnung als Dreifachbestimmung. Bei der photometrischen Bestimmung wird die Gesamtpartikelzahl bestimmt. Die Bestimmung der Anzahl infektiöser Partikel erfolgt über die Bestimmung der Plaque Forming Units (PFU) in Hek293 Zellen. Hek293 Zellen werden in 6-Well Platten ausgesät, so dass sie am nächsten Tag 90% konfluent sind und dann über Nacht mit einer 10-fach Verdünnungsreihe des Virusstocks infiziert. Am nächsten Tag werden die Zellen nach Absaugen des Mediums mit 2 ml vorgewärmten Plaquing Medium (4% Agarose in Medium mit 2% FCS) überschichtet und nach Festwerden der Agaroseschicht im Brutschrank inkubiert. Nach 8-12 Tagen ist die Plaquebildung erkennbar. Zum Auszählen der Plaques wird eine Färbung mit Thiazolylblue (MTT; Sigma) durchgeführt. Auf jedes Well werden 500 µl der MTT (5mg/ml in PBS) gegeben, 3 h bei 37 C inkubiert und anschließend die Plaquezahl bei geeigneten Verdünnungen bestimmt. Der Titer nimmt durch häufiges Aus- und Einfrieren und nach längerer Zeit (>6 Monate) ab und sollte dann neu bestimmt werden. Die Bestimmung der PFU zeigte in der Regel ein Verhältnis von 1 infektiösen Partikel auf 25 Partikel. Bei der Berechnung der 55

64 II Material und Methoden Multiplicity of Infection (MOI) ausgehend von einem photometrisch bestimmten Virustiter wurde daher immer durch den Faktor 25 dividiert. Die MOI ist die Anzahl der infektiösen Partikel pro Zelle bei einer Infektion/Transduktion. Die Transduktion der Zellen erfolgte entweder für 2-3 h in FCS freiem Medium oder über Nacht in Medium mit 2% FCS. II.2.6 Statistik Graphiken geben die Mittelwerte und Standardfehler wieder. Der Mittelwert resultiert aus dem arithmetischen Mittel. Der Standardfehler ist der Quotient aus der Standardabweichung, der Streuung der Stichprobenwerte um das arithmetische Mittel, und der Wurzel aus n (Anzahl der Stichproben). II t-test Die Signifikanz der Unterschiede zweier Versuchsparameter wurde mittels des zweiseitigen t-test (Student schen t-test) für ungepaarte Stichproben mit Excel analysiert. Der resultierende Wert p beschreibt die Wahrscheinlichkeit (0 p 1), mit der die Stichproben aus derselben Grundgesamtheit stammen. Unterschiede mit p<0,05 werden als signifikant gewertet. Die Signifikanzgrenzen (Irrtumswahrscheinlichkeit in Prozent) wurden folgendermaßen festgelegt: 5% (p 0,05) = signifikant (*) 0,1% (p 0,001) = sehr signifikant (**) 56

65 III. Ergebnisse III. Ergebnisse III.1 Einfluss von NF-κB auf die Sensitivität gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose In der Forschung zur Entwicklung neuer Antitumor-Therapien ist TRAIL (TNF-Related Apoptosis Inducing Factor Ligand) aufgrund seiner Eigenschaft Apoptose selektiv in Tumorzellen zu induzieren von großem Interesse. Trotzt des hohen Potentials von TRAIL Apoptose in Krebszellen zu induzieren, zeigen sich viele Krebszelllinien im unterschiedlichen Grade resistent. Für die Entwicklung einer TRAIL-basierten Therapie ist es daher wichtig die molekularen Grundlagen für die Resistenzen von Tumorzellen zu verstehen, um Strategien entwickeln zu können, mit welchen Resistenzen überwunden bzw. verringert werden können. NF-κB stellt eine Familie von Transkriptionsfaktoren dar, die an der Regulation eines breiten Spektrums zellulärere Prozesse beteiligt ist. In der Regulation der Zellhomeostase erfüllt NF-κB eine anti-apoptotische Funktion, es kontrolliert die Transkription einer Reihe von Proteinen, welche die Apoptose inhibieren. Die Resistenz von Krebszellen gegenüber verschiedenen chemotherapeutischen Substanzen und Zytokinen wie TNF-α wurde auf die Aktivierung von NF-κB zurückgeführt (Van Antwerp et al., 1996; Jeremias et al., 1998; Harper et al., 2001; Chawla-Sarkar et al., 2003; Li et al., 2005), die Inhibition der NF-κB Aktivität ist daher eine häufig vorgeschlagenen Strategie zur Überwindung von Resistenzen. Besonders gut untersucht ist dieser Zusammenhang bei TNF-α, einem Verwandten des TRAIL. TNF-α vermittelt Apoptose und Aktivierung von NF-κB über den TNF Rezeptor 2. Die Aktivierung von NF-κB macht Krebszellen gegenüber TNF-α resistent und die Inhibierung von NF-κB sensitiviert gegenüber TNF-α-induzierte Apoptose (Beg et al., 1996; Van Antwerp et al., 1996; Zwacka et al., 2000). Auch TRAIL kann eine Aktivierung von NF-κB signalisieren, welche über TRAIL Rezeptor (TR)1, TR2 und eventuell TR4 vermittelt werden kann (Degli-Esposti et al., 1997a; Schneider et al., 1997; Ravi et al., 2001). Die Bedeutung der NF-κB Aktivierung für den TRAIL-induzierten Zelltod ist allerdings umstritten. Es wurde sowohl berichtet, dass TRAIL-induzierte NF-κB Aktivierung eine schützende Funktion hat (Jeremias et al., 1998; Harper et al., 2001; Chawla-Sarkar et al., 2003) als auch dass NF-κB Aktivierung keinen Effekt auf das Überleben der Zellen hat (Hu et al., 1997; Pawlowski et al., 2000; Leverkus et al., 2003). 57

66 III. Ergebnisse In dem ersten Abschnitt der Doktorarbeit sollte untersucht werden, ob eine Aktivierung von NF-κB die Sensitivität gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose in Krebszelllinien moduliert. Dafür wurden verschiedene Krebszelllinien unterschiedlicher Herkunft untersucht: DLD-1, HCT116 (Dickdarmkarzinoma), Caki-2 (Nierenkarzinom), A549 (Lungenkarzinom), HeLa (Gebärmutterhalskarzinom) und Panc-1 (Pankreaskarzinom). Zusätzlich wurden humane primäre Fibroblasten in die Untersuchung eingeschlossen, da der Schutzmechanismus normaler Zellen vor TRAIL-induzierter Apoptose und damit auch eine Beteiligung von NF-κB noch nicht vollständig aufgeklärt ist. III.1.1 Sensitivität verschiedener Krebszelllinien und humaner Fibroblasten gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose Als erstes wurde die Sensitivität gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose in den verschiedenen Zelllinien bestimmt. Die Zellen wurden für eine bestimmte Zeit mit TRAIL stimuliert und anschließend die Apoptoserate bestimmt. Die Messung der Apoptose erfolgte durch Färbung der DNA des diploiden Kerns mit Propidiumiodid nach Nicoletti (Nicoletti et al., 1991). In Abbildung 19A ist die spezifische Apoptoserate der untersuchten Zelllinien nach 24 h Stimulation mit den angegebenen Dosen TRAIL (1 ng/ml, 2 ng/ml, 5 ng/ml und 10 ng/ml) dargestellt. DLD-1 war die gegenüber TRAIL sensitivste Zelllinie: Fast alle Zellen (93%) starben bei Behandlung mit der höchsten Dosis (10 ng/ml), und auch bei niedriger TRAIL Konzentration (1 ng/ml bzw. 2 ng/ml) konnten noch 23% bzw. 37% der Zellen in den Zelltod geführt werden. HCT116 und Caki-2 waren ebenfalls sensitiv gegenüber TRAIL: Ein großer Anteil der Zellpopulation konnte mit der höchsten TRAIL Dosis getötet werden (74% Caki-2; 68% HCT116), und auch mit geringeren Dosen konnte noch deutlich Apoptose induziert werden (1 ng/ml und 2 ng/ml: 20% und 30% in Caki-2; 16% und 24% in HCT116). HeLa zeigten eine mittlere Sensitivität gegenüber TRAIL: Bei Behandlung mit niedrigen Dosen TRAIL konnte Apoptose induziert werden, wenn auch der Anteil der apoptotischen Zellen gering war (1 ng/ml und 2 ng/ml: 12% und 20%). Mit der höchsten Dosis konnte immerhin fast 50% der Zellen getötet werden. Panc-1 und A549 wurden als TRAIL-resistente Krebszelllinien eingestuft. Selbst bei Behandlung mit der höchsten Dosis TRAIL ist die Apoptoserate sehr gering (14% Panc-1; 17% A549). Bei Behandlung mit niedrigen und damit therapeutisch relevanten Dosen TRAIL überleben fast 100% aller Zellen (Apoptoserate < 3% bzw. < 7% bei 1 ng/ml bzw. 2 ng/ml). Bei 58

67 III. Ergebnisse primären Fibroblasten konnte selbst mit der höchsten Dosis TRAIL keine Apoptose induziert werden. TRAIL induziert Apoptose sehr schnell, d.h. bereits einige Stunden nach Stimulation mit TRAIL können apoptotische Ereignisse beobachtet werden. Um festzustellen, ob sich die unterschiedlichen TRAIL Sensitivitäten auch in dem (initialen) Einsatz der Apoptose wiederspiegeln, wurde die Apoptoserate zu einem frühen Zeitpunkt (7 h) bestimmt (Abb. 19B). In humanen Fibroblasten, Panc-1 und A549 Zellen konnte keine Apoptose induziert werden (< 2%). Für die restlichen Zelllinien war erkennbar, dass sich die Sensitivität gegenüber TRAIL bereits zu frühen Zeitpunkten widerspiegelt. Am Beispiel der TRAIL-sensitiven Zelllinie HCT116 ist die Aktivierung verschiedener proapoptotischer Proteine nach TRAIL Stimulation dargestellt (Abb. 19C). A B DLD-1 TRAIL 24 h Caki-2 HCT TRAIL 7 h 5 ng/ml TRAIL (ng/ml) 10 ng/ml HeLa Hek293 A549 Panc-1 Fibroblasten C t(h) HCT TRAIL (10 ng/ml) HCT116 PARP cparp Procaspase-10 aktive Caspase-10 Procaspase-8 Procaspase-7 aktive Caspase-7 Caspase-9 Caspase-3 Bid α-tubulin t(h) zVAD TRAIL (10 ng/ml) PARP cparp Caspase-9 Caspase-3 Abbildung 19 Sensitivität verschiedener Krebszelllinien und humaner Fibroblasten gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose Die Zellen wurden 24 h (A) bzw. 7 h (B) mit den angegebenen Dosen TRAIL (ng/ml) behandelt und anschließend die spezifische Apoptoserate (%) bestimmt. Kennzeichen des späten Apoptosestadiums ist eine kontrollierte Fragmentierung der DNA, apoptotische Zellen sind daher durch einen DNA Gehalt > 2n gekennzeichnet. Bei der Messung der Fluoreszenzintensität im 59

68 III. Ergebnisse Durchflußzytometer ist der apoptotische Anteil der Zellpopulation durch den sogenannten SubG1-Peak (> 2n) wiedergegeben. Die spezifische Apoptoserate beschreibt den prozentualen Anteil der Zellpopulation der durch ein spezifisches Signal induziert in den Zelltod geht, sie ergibt sich aus der Subtraktion der basalen Apoptose (Mediumwert) von der Gesamtapoptose behandelter Zellen. Gezeigt sind die Mittelwerte ± S.E. dreier unabhängiger Experimente, die als Dreifachbestimmung durchgeführt wurden. C) Aktivierung verschiedener Caspasen, Bid und dem Caspase-3 Substrat PARP (cparp=cleaved PARP nach TRAIL Stimulation in HCT116. Die Zellen wurden für die angegebenen Zeiträume mit TRAIL (10 ng/ml) stimuliert und die zytosolischen Proteinextrakte gegen Caspase-3,-7,-8,-9,- 10, Bid, PARP und α-tubulin (Proteinladekontrolle) immunogeblottet (oben). Vorbehandlung mit dem Caspaseinhibitor zvad.fmk inhibiert die Caspasen-Aktivierung (unten). Zusammenfassend konnte gezeigt werden dass die untersuchten Krebszelllinien unterschiedliche Sensitivität gegenüber TRAIL aufweisen, wobei sich zwei der untersuchten Krebszelllinien (Panc-1, A549) als nahezu TRAIL- resistent erwiesen. III.1.2 Untersuchung des Zusammenhangs zwischen TRAIL Sensitivität und TRAIL-vermittelter NF-κB Aktivierung In 1.1 konnte gezeigt werden, dass sich die Zelllinien deutlich in ihrer TRAIL Sensitivität unterscheiden. Um zu klären, ob eine TRAIL-vermittelte Aktivierung von NF-κB die TRAIL-induzierte Apoptose antagonisiert und damit die TRAIL Sensitivität moduliert, wurden zwei Ansätze verfolgt. Zu einem sollte untersucht werden, ob TRAIL Stimulation in allen Zelllinien zu einer NF-κB Aktivierung führt, zum anderen sollte der Einfluss einer Inhibition der NF-κB Aktivierung auf die TRAIL Sensitivität untersucht werden. III TRAIL-vermittelte NF-κB Aktivierung Zunächst wurde die NF-κB DNA Bindungsaktivität nach TRAIL Stimulation in Electrophoresis Mobility Shift Assays (EMSAs) untersucht. Abbildung 20A zeigt die Translokation von NF-κB in den Zellkern nach 1 h Stimulation mit 10 ng/ml TRAIL. Mit Ausnahme der humanen Fibroblasten, fand in allen Zelllinien eine Aktivierung von NF-κB nach TRAIL Stimulation statt. Die Menge des aktivierten NF-κB Komplexes variierte in den verschiedenen Zelllinien, allerdings konnte keine Korrelation zur TRAIL Sensitivität festgestellt werden: Caki-2 Zellen z.b. zeigten eine vergleichsweise starke NF-κB Aktivierung, sie stellen jedoch eine der TRAIL-sensitivsten Zelllinien dar (vgl. Abb. 19A,B). Bei TRAIL-resistenten humanen Fibroblasten hingegen konnte keine NF-κB Aktivierung gezeigt werden. Supershiftassays für die einzelnen Zelllinien zeigten, dass p65 die Hauptkomponente des aktivierten NF-κB Komplexes darstellt (Daten nicht gezeigt). 60

69 III. Ergebnisse Zusätzlich wurde die NF-κB-Transkriptionsaktivität in einem Luziferase Reporter Assay gemessen. Die Zellen wurden mit einem NF-κB-abhängigen-Firefly Luziferase- Reporterkonstrukt transfeziert und mit einem Ubiquitin Promotor-abhängigen-Renilla Luziferase-Reporterplasmid 1:40 co-transfeziert. Da die Renilla Luziferase konstitutiv exprimiert wird, können durch die Renilla-Aktivität Unterschiede in der Transfektionseffizienz relativiert werden. Das NF-κB Aktivierungsprofil anhand der Luziferase-Aktivitäten entsprach den Ergebnissen aus dem EMSA Versuchen (Abb. 20B) A TRAIL 1 h EMSA NF-κB B Luziferase Assay Medium TRAIL 1 h 1 0 Abbildung 20 NF-κB Aktivierung nach TRAIL Stimulation Mit Ausnahme humaner Fibroblasten wird in allen Zelllinien nach TRAIL Stimulation NF-κB aktiviert. A) NF-κB DNA-Bindungsaktivität im EMSA. Nukleare Extrakte 0 h und 1 h nach Behandlung mit TRAIL (10 ng/ml) wurden zusammen mit einem radioaktiv-markierten Oligonukleotid, welches eine Consensus NF-κB Bindungssequenz enthält, inkubiert. B) NF-κB-Transkriptionsaktivität im Luziferase Reporter Assay. Die Zellen wurden mit einem Firefly Luziferase Reporterkonstrukt, welches drei NF-κB Bindungsstellen enthält, transfeziert. Nach 1 h Stimulation mit TRAIL (10 ng/ml) wurde die Firefly Luziferase-Aktivität gemessen. Unterschiede in der Transfektionseffizienz wurden gegen die Ubiquitin Promotor gesteuerte Expression von Renilla Luziferase normalisiert. Dargestellt ist die fache Induktion der NF-κB-Aktivität in TRAIL behandelten zu nicht behandelten Zellen (Medium). Gezeigt sind die Mittelwerte ± S.E. zweier unabhängiger Experimente, die als Doppelbestimmung durchgeführt wurden III Einfluss einer Inhibierung der NF- κb Aktivierung auf TRAIL-induzierter Apoptose Im vorhergehenden Abschnitt konnte gezeigt werden, dass TRAIL Stimulation in allen Krebszelllinien zu einer NF-κB Aktivierung führt, aber dass keine Korrelation zur TRAIL Sensitivität erkennbar ist. Als nächstes sollte nun untersucht werden, ob durch eine spezifische Inhibierung des NF-κB Signalwegs die gleichzeitig induzierte apoptotische Antwort moduliert werden kann. Hierfür wurde eine nicht-degradierbare Form des inhibitorischen Proteins IκB-α überexprimiert, der sogenannte IκB-α-Superrepressor (IκB-α-SR). In dieser mutanten Form wurden die Serinreste an Position 32 und 36 zu 61

70 III. Ergebnisse Alaninen Mutiert. Die Phosphorylierung and den Serinresten 32/36 durch den Inhibitor Kinase Komplex (IKK) signalisiert die Ubiquitinierung und anschließende Proteosom-vermittelte Degradation des IκB-α. Die mutierte Form des IκB-α kann nicht mehr phosphoryliert werden und wird daher nicht abgebaut. NF-κB wird also permanent im Zytoplasma festgehalten und kann nicht mehr auf das Rezeptor-vermittelte Signal hin in den Zellkern translozieren (Lin et al., 1996; Zwacka et al., 2000). Da bei den meisten der untersuchten Zelllinien eine effektive DNA Transfektion nicht oder nur schwer möglich war, wurde die Transgenexpression adenoviral vermittelt. Die meisten Zelllinien lassen sich effizient mit Adenoviren transduzieren und die Transduktion mit rekombinanten Adenoviren gewährleistet eine gute, reproduzierbare und über mehrere Tage stabile Expression des Transgens. Es wurde ein nicht-replikationsfähiger, E1, E3 deletierter adenoviraler Vektor verwendet, welcher eine CMV Promotor-abhängige IκB-α-Superrepressor Expressionskassette enthält (Ad.IκB-SR) (Zwacka et al., 2000). Die Klonierung der IκB-α-SR Expressionskasette in den adenoviralen Vektor wurde von Dr. Ralf Zwacka durchgeführt, die Virusproduktion und Aufreinigung erfolgte wie in Abschnitt II.2.5 beschrieben. Um vergleichbare Transduktionseffizienzen zu erreichen, wurde zuerst für jede Zelllinie eine geeignete MOI (Multiplicity of Infection) ermittelt. Es sollte eine Transduktionseffizienz von mind. 70% erreicht werden, ohne dass die Virusinfektion zytotoxische Effekte zeigte. Hierfür wurde die EGFP-Expression nach Transduktion mit einem EGFP exprimierenden adenoviralen Vektor unter Verwendung unterschiedlicher MOIs bestimmt (Abb. 21). Caki-2 MOI 100 DLD-1 MOI 100 HCT116 MOI 100 HeLa MOI % 87% 90% 82% A549 MOI 50 Panc-1 MOI 300 Fibroblasten MOI % 85% 75% Abbildung 21 FACS Profile der EGFP Expression der untersuchten Zelllinien Die FACS Histogramme (Zellzahl (Y-Achse) gegen Fluoreszenzintensität (X-Achse)) zeigen die Transduktionseffizienz bei der angegeben MOI in den verschiedenen Zelllinien. In allen nachfolgenden Experimenten wurde mit der jeweils angegeben MOI transduziert Das weiße Histogramm zeigt Kontrollzellen, das dunkle Histogramm Ad.EGFP transduzierte Zellen. 62

71 III. Ergebnisse Nach Festlegung des MOI wurde die Expression des transgenen IκB-α-SR im Western-Blot überprüft. Bei allen Zelllinien lag die Menge des transgenen IκB-α Proteins über der des endogenen IκB-α Proteins (Daten nicht gezeigt). Bei allen nachfolgend durchgeführten Experimenten wurden die Zellen mit der jeweiligen MOI über Nacht in 2% serumhaltigen Medium transduziert. Am folgenden Morgen wurde das Medium durch frisches 10% serumhaltiges Medium ersetzt. Die Stimulation mit TRAIL und die Durchführung der Experimente erfolgte 48 h nach Virusinfektion. In A549 Zellen zeigten sich allerdings 48 h nach Virustransduktion zytotoxische Effekte. Da bei einer Verringerung der MOI der Prozentsatz der transduzierten Zellen sank, wurde bei A549 Zellen die Stimulation mit TRAIL nach 24 h durchgeführt. Als Kontrollzellen der Ad.IκB-SR transduzierten Zellen wurden Zellen mit einem adenoviralen, ß-Galaktosidase (Ad.LacZ) exprimierenden Vektor mit der gleichen MOI transduziert. Dadurch konnten eventuelle Auswirkungen der adenoviralen Transduktion und/ oder der Transgenexpression per se auf TRAIL-induzierter Apoptose berücksichtigt werden. Die Stimulation erfolgte 24 h mit 2,5 ng/ml TRAIL bei HeLa, A549, Panc-1 Zellen und humanen Fibroblasten. Um eine Sensitivierung zu erkennen, wurden die sensitiveren Zelllinien (HCT116, DLD-1, Caki-2) nur mit 1 ng/ml TRAIL stimuliert. Blockierung der NF-κB Aktivierung zeigte keine Sensitivierung gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose in DLD-1, HCT116, A549, HeLa und humanen Fibroblasten (Abb. 22A). Allerdings konnte in IκB-α-SR exprimierenden Panc-1 Zellen die spezifische Apoptoserate signifikant erhöht werden, was darauf hindeutete, dass Inhibierung der NF-κB Aktivität Panc-1 Zellen gegenüber TRAIL-induzierte Apoptose sensitivierte (Abb. 22A, hervorgehoben). Überraschenderweise wurde in IκB-α-SR transduzierten Caki-2 Zellen eine Abnahme der Apoptoserate beobachtet. Da dies auch in den Ad.LacZ transduzierten Kontrollzellen zu beobachten war, stellte die verminderte Empfindlichkeit gegenüber TRAIL wahrscheinlich ein Effekt der adenoviralen Transduktion dar, welcher nicht weiter untersucht wurde. Zur Überprüfung der Funktionalität des exprimierten IκB-α-SR wurden DLD-1 Zellen parallel zur TRAIL Behandlung mit TNF-α behandelt. Für DLD-1 Zellen wurde gezeigt, dass die Inhibierung der NF-κB Aktivierung die Zellen gegenüber TNF-α sensitiviert (Zwacka et al., 2000). Ad.IκB-SR transduzierte DLD-1 Zellen zeigten eine deutliche Sensitivierung gegenüber TNF-α, nicht aber gegenüber TRAIL (Abb. 22B). Zusätzlich 63

72 III. Ergebnisse wurde die Blockierung der NF-κB Aktivierung nach TRAIL Stimulation in Ad.IκB-SR transduzierten Zellen mittels EMSA überprüft. Die Translokation des NF-κB Komplexes in den Nukleus nach TRAIL Stimulation war in IκB-α SR exprimierenden Zellen vollständig blockiert (Abb. 22C). A untransduziert Ad.LacZ Ad.ΙκB-SR * B DLD-1 * untransduziert Ad.LacZ Ad.ΙκB-SR C DLD-1 TRAIL 1 h TNF-α (25 ng/ml) TRAIL (1 ng/ml) Ad.LacZ Ad.IκB-SR NF-κB Abbildung 22 Inhibierung der NF-κB Aktivierung nach TRAIL Stimulation A) In Ad.IκB-SR transduzierten Zellen ist die NF-κB Aktivierung nach TRAIL Stimulation inhibiert. Einzig Ad.IκB-SR transduzierte Panc-1 Zellen zeigen eine deutliche Sensitivierung (p<0.001) gegenüber TRAIL im Vergleich zu untransduzierten bzw. Ad.LacZ transduzierten Kontrollzellen. 48 h nach Virusinfektion wurden die Zellen 24 h mit 1 ng/ml TRAIL (Caki-2, DLD-1, HCT116) bzw. 2,5 ng/ml TRAIL (HeLa, Panc-1, A549, humane Fibroblasten) behandelt und die spezifische Apoptoserate in einem DNA-Fragmentierungsassay nach Nicoletti bestimmt. Gezeigt sind die Mittelwerte ± S.E. dreier unabhängiger Experimente, die als Dreifachbestimmung durchgeführt wurden. B) NF-κB Inhibierung sensitiviert DLD-1 Zellen gegenüber TNF-α (p<0.001), nicht aber gegenüber TRAIL. Ad.IκB-SR transduzierte DLD-1 Zellen und Kontrollzellen wurden 24 h mit TNF-α (25 ng/ml) bzw. TRAIL (1 ng/ml) behandelt und die spezifische Apoptoserate in einem DNA-Fragmentierungsassay nach Nicoletti bestimmt. Gezeigt sind die Mittelwerte ± S.E dreier unabhängiger Experimente, die als Dreifachbestimmung durchgeführt wurden. C) In IκB-α-SR exprimierenden DLD-1 Zellen war die NF-κB Aktivierung nach TRAIL Stimulation inhibiert. DLD-1 wurden 1 h mit 10 ng/ml TRAIL behandelt und nukleare Extrakte für einen EMSA angefertigt. 64

73 III. Ergebnisse III IκB-α-Superrepressor inhibiert konstitutiv aktiviertes NF-κB in Panc-1 Zellen Inhibierung der NF-κB Aktivierung sensitivierte keine der untersuchten Zelllinien gegenüber TRAIL mit Ausnahme von Panc-1 Zellen. Die Sensitivierung der Panc-1 Zellen konnte sowohl beim Einsetzen der Apoptose zu frühen Zeitpunkten beobachtet werden (10 ng/ml TRAIL; 7 h), also auch bei Stimulation mit niedrigen TRAIL Dosen (2,5 ng/ml; 24 h) (Abb. 23A). TRAIL Stimulation führte in Panc-1 Zellen zu einer deutlichen Aktivierung von NF-κB. Diese war aber vergleichbar mit der in A549 Zellen und nur gering stärker als in DLD-1 Zellen (vgl. Abb. 20). Der sensitivierende Effekt einer NF-κB Inhibition einzig in Panc-1 Zellen war daher überraschend. Pankreaskarzinomzelllinien, u.a. Panc-1, wurden mehrfach beschrieben konstitutiv aktiviertes NF-κB zu haben (Wang et al., 1999b; Fujioka et al., 2003a,b). Auch in der vorliegenden Arbeit konnte für Panc-1 Zellen sowohl im EMSA als auch anhand der Luziferaseaktivität (absolute Werte, Daten nicht gezeigt) eine konstitutive NF-κB-Aktivierung festgestellt werden. Dagegen zeigte keine der anderen untersuchten Zelllinien basal aktiviertes NF-κB (vgl. Abb. 20). Dies führte zu der Vermutung, dass konstitutiv aktiviertes NF-κB in Zusammenhang steht mit der TRAIL Resistenz in Panc-1 Zellen. Zur Bestätigung, dass sowohl basal aktiviertes NF-κB als auch TRAIL-induziertes NF-κB in Panc-1 Zellen durch Expression des IκB-α-SR inhibiert wird, wurden EMSA Assays mit untransduzierten Panc-1 Zellen und mit Ad.IκB-SR bzw. Ad.LacZ transduzierte Panc-1 Zellen durchgeführt. In untransduzierten und Kontroll-transduzierten Panc-1 Zellen war basal aktiviertes NF-κB erkennbar und eine Induktion nach TRAIL Stimulation. In IκB-α-SR exprimierenden Panc-1 Zellen jedoch war sowohl basal aktiviertes NF-κB als auch induziertes NF-κB vollständig inhibiert (Abb. 23 B). Die vorliegenden Daten deuteten darauf hin, dass konstitutiv aktiviertes NF-κB Schutz gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose vermitteln kann, während NF-κB welches durch TRAIL selbst aktiviert wird keinen Einfluss auf die gleichzeitig induzierte Apoptose hat. 65

74 III. Ergebnisse A Ad.LacZ TRAIL (10 ng/ml) 7 h 7 % sub-g1 Ad.ΙκB-SR TRAIL (10 ng/ml) 7 h 22 % sub-g1 A Ad.LacZ TRAIL (2.5 ng/ml) 24 h 8 % sub-g1 Ad.IκB-SR TRAIL (2.5 ng/ml) 24 h 24 % sub-g Panc-1 untransduziert Ad.LacZ Ad.IκB-SR * * B Panc-1 TRAIL + 1 h Ad.LacZ Ad.IκB-SR anti-p65 Abbildung 23 Inhibition von konstitutiv aktiviertem NF-κB als auch TRAIL-induziertem NF-κB und Sensitivierung gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose in Panc-1 Zellen A) Links dargestellt sind repräsentative FACS Histogramme des DNA-Fragmentierungsassays nach Nicoletti. Die Apoptoserate wird gemessen als sub-g1 Fraktion, welche Zellen mit einem DNA Gehalt < 2n in Folge von DNA Fragmentierung in einem späteren apoptotischen Stadium repräsentiert. IκB-α-SR exprimierende Zellen (Histogramme unten) zeigen eine signifikant höhere Apoptoserate als ß-Galaktosidase exprimierende Kontrollzellen (Histogramme oben), sowohl bei kurzer Stimulation (10 ng/ml TRAIL, 7 h; Histogramme auf der linken Seite), als auch bei Stimulation mit niedrigen Dosen (2.5 ng/ml TRAIL, 24 h; Histogramme auf der rechten Seite). Das nebenstehende Diagramm zeigt das Mittel ± S.E. der spezifischen Apoptoserate aus drei unabhängigen Experimenten, die als Dreifachbestimmung durchgeführt wurden (p<0.001). B) EMSA. Panc-1 Zellen wurden mit Ad.IκB-SR bzw. Ad.LacZ transduziert oder nicht transduziert, 48 h später mit TRAIL behandelt (10 ng/ml, 1 h) und nukleare Extrakte für EMSAs angefertigt. Durch einen Supershift unter Verwendung eines Antikörpers gegen p65 wurde gezeigt dass die DNA/Proteinbande NF-κB-spezifisch ist. III Preaktiviertes NF-κB vermittelt DLD-1 Zellen einen Schutz gegenüber TRAIL Supershift NF-κB TRAIL (10 ng/ml) 7 h Die bisherigen Ergebnisse deuteten darauf hin, dass basal aktiviertes NF-κB einen Schutz gegenüber TRAIL vermitteln kann. Daher stellte sich die Frage, ob TNF-α-induziertes NF-κB den gleichen Effekt in der TRAIL-sensitiven Zelllinie DLD-1 hat. TRAIL (2.5 ng/ml) 24 h TNF-α induziert in DLD-1 eine starke NF-κB Aktivierung, die bis zu 16 h anhält (Daten nicht gezeigt), aber nur geringfügig Apoptose auslöst (vgl. Abb. 22B). Zudem tritt durch TNF-α-induzierte Apoptose verzögert zu der TRAIL-induzierten auf und manifestiert sich erst nach ca. 20 h. Abbildung 24A und B zeigt die NF-κB Aktivierung 0 66

75 III. Ergebnisse nach TNF-α Behandlung in DLD-1 Zellen. Im Western-Blot (Abb. 24C) ist erkennbar, dass durch TNF-α Stimulation im Vergleich zur TRAIL Stimulation kaum Procaspase-8 aktiviert war. A Supershift NF-κB TNF-α + + anti-p65 + C EMSA DLD-1 TNF-α (25 ng/ml) TRAIL (10 ng/ml) B Procaspase-8 Luziferase Assay 5 DLD Medium TNF-α Procaspase-3 t (h) Abbildung 24 TNF-α induziert eine starke NF-κB Aktivierung in DLD-1 Zellen A) EMSA. Die NF-κB-Spezifität der DNA/Protein-Komplexbande wurde durch einen Supershift mit einem p65 Antikörper bestätigt. B) Luziferase Reporter Assay. DLD-1 Zellen wurden 1 h (A und B) mit TNF-α (25 ng/ml) behandelt C) Western-Blot Analyse. DLD-1 Zellen wurden für die angegebenen Zeitwerte mit TNF-α (25 ng/ml) oder TRAIL (10 ng/ml) behandelt, zytosolische Proteinextrakte hergestellt und gegen Procaspase-8 und 3 geblottet. Um festzustellen, ob voraktiviertes NF-κB die TRAIL Sensitivität modulieren kann, wurden DLD-1 Zellen mit TNF-α (25 ng/ml) für 4 h vorbehandelt und anschließend mit TRAIL (10 ng/ml) für weitere 4 h bzw. 7 h stimuliert (Abb. 25). DLD-1 Zellen die mit TNF-α vorbehandelt wurden zeigten nach TRAIL Stimulation eine signifikant verminderte Apoptoserate gegenüber den Zellen die nur mit TRAIL behandelten wurden, wobei der Effekt sich deutlicher bei 7 h als bei 4 h zeigte (Abb. 25A). Demnach könnte das durch TNF-α voraktivierte NF-κB in DLD-1 Zellen tatsächlich zumindest einen geringen Schutz gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose vermitteln. Zur Bestätigung, dass der protektive Effekt durch preaktiviertes NF-κB vermittelt wird, wurde das Experiment mit IκB-α-SR exprimierenden Zellen wiederholt. Vorbehandlung mit TNF-α führte zu einer signifikant verminderten Sensitivität gegenüber TRAIL in den Kontrollzellen (Ad.LacZ transduzierte DLD-1 Zellen), aber nicht IκB-α-SR exprimierenden Zellen, was zeigte, dass der beobachtete schützende Effekt durch NF-κB vermittelt wird (Abb. 25B). Aufgrund des kurzen Versuchszeitraums zeigte die Expression des IκB-α-Superrepressor keinen Effekt auf die Sensitivität gegenüber TNF-α. 67

76 III. Ergebnisse Vorbehandlung mit TNF-α für nur 0,5 h zeigte ebenfalls keinen schützenden Effekt (Daten nicht gezeigt), was darauf hindeuten könnte, dass NF-κB-regulierte Gene an den Schutzfunktion beteiligt sind und dieser Zeitraum (0,5 h) der NF-κB Aktivierung zu kurz ist um diese anti-apoptotischen Funktionen auszulösen. A TNF-α TRAIL DLD-1 TRAIL 4 h + TRAIL 7 h B TNF-α TRAIL DLD-1 + Ad.LacZ Ad.IκB-SR TRAIL 4 h TNF-α TRAIL DLD-1 Ad.LacZ + Ad.IκB-SR TRAIL 7 h Abbildung 25 TNF-α-induzierte Preaktivierung von NF-κB moduliert die TRAIL Sensitivität in DLD-1 Zellen A) DLD-1 Zellen die mit TNF-α vorbehandelt wurden, zeigten nach TRAIL Stimulation gegenüber nur mit TRAIL stimulierten Zellen eine verminderte spezifische Apotoserate (p<0.001). DLD-1 Zellen wurden 4 h mit TNF-α (25 ng/ml) vorbehandelt, anschließend mit TRAIL (10 ng/ml) für 4 h bzw. 7 h stimuliert und die spezifische Apoptoserate in einem DNA-Fragmentierungsassay nach Nicoletti bestimmt. Gezeigt sind die Mittelwerte +/- S.E. dreier unabhängigen Experimente, die als Dreifachbestimmung durchgeführt wurden. B) Vorbehandlung mit TNF-α vermindert den Anteil apoptotischer Zellen in β-galaktosidase exprimierenden Kontrollzellen, aber nicht in IκB-SR exprimierenden Zellen, wodurch bestätigt wird, dass der schützende Effekt NF-κB-spezifisch ist. Ad.IκB-SR Ad.LacZ transduzierte DLD-1 Zellen wurden mit TNF-α (25 ng/ml) vorbehandelt, anschließend mit TRAIL (10 ng/ml) für 4 h bzw. 7 h stimuliert und die spezifische Apoptoserate in einem DNA-Fragmentierungsassay nach Nicoletti bestimmt. Gezeigt sind die Mittelwerte+/- S.E. zweier unabhängigen Experimente, die als Doppelbestimmung durchgeführt wurden. Zur Untermauerung der bisherigen Ergebnisse, wurden DLD-1 Zellen mit einem die NF-κB Untereinheit p65 exprimierenden Plasmid transfeziert und die TRAIL Sensitivität nach 7 h TRAIL Stimulation bestimmt (Abb. 26A). P65 Homo- bzw. Heteromere stellen den größten Anteil der NF-κB Komplexe und p65 spielt eine Hauptrolle in der Vermittlung der Tumorgenizität (Wang et al., 1996b; Wang et al., 1999a; Sprick et al., 2002). Um in die Apoptosemessung nur transfezierte Zellen einbeziehen zu können, wurden DLD-1 Zellen außerdem mit einem p65-egfp Fusionsexpressionskonstrukt und einen EGFP Expressionskontrollvektor (EGFP-N1) transfeziert. Durch die EGFP Expression war es möglich die apoptotische Antwort ausschließlich in p65 überexprimierenden Zellen 68

77 III. Ergebnisse zu verfolgen. Dafür wurde nach TRAIL Stimulation die Anzahl lebender EGFP-positiver Zellen im FACS bestimmt (Abb. 26B). A DLD-1 pcdna3 TRAIL 7 h * p65 B Abbildung 26 Expression der p65 NF-κB Untereinheit in DLD-1 Zellen vermittelt Schutz gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose A) DLD-1 Zellen wurden mit einem p65 Expressionsplasmid bzw. nur mit pcdna3 transfeziert. Transfektion mit pegfp-n1 diente zur Kontrolle der Transfektionseffizienz (35-45%). 48 h nach der Transfektion wurde mit TRAIL (10 ng/ml) 7 h stimuliert und die spezifische Apoptoserate in einem DNA-Fragmentierungsassay nach Nicoletti bestimmt. Gezeigt sind die Mittelwerte +/- S.E. eines Experiments, das als Dreifachbestimmung durchgeführt wurde (p<0.05). B) DLD-1 wurden mit einem p65-egfp Fusionsplasmid bzw. mit EGFP-N1 transfeziert. 48 h nach der Transfektion wurden die Zellen mit TRAIL (10 ng/ml) für 7 h stimuliert und anschließend die lebenden EGFP-positive Zellen im FACS bestimmt. Die Überlebensrate TRAIL stimulierter Zellen wurde in Relation zu EGFP-positiven Zellen in unbehandelten Proben (= 100%) bestimmt. Gezeigt sind die Mittelwerte +/- S.E. dreier unabhängigen Experimente, die als Dreifachbestimmung durchgeführt wurden (p<0.001). Daneben dargestellt sind repräsentative FACS Histogramme der EGFP Messung in welchen die EGFP-positiven Zellen in Prozent angegeben sind. Hellgraue Histogramme zeigen TRAIL-behandelte Zellen, dunkle Histogramme nicht-behandelte Kontrollzellen. DLD-1 Zellen, die p65 überexprimierten wiesen eine höhere Überlebensrate auf als die EGFP-N1 transfezierten Kontrollzellen und die Reduktion der Apoptoserate war der in der TNF-α Vorbehandlung ähnlich. DLD-1 * TRAIL 7 h EGFP-N1 p65-egfp Voraktiviertes NF-κB kann also in DLD-1 Zellen einen gewissen Schutz gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose vermitteln. Die Experimente mit TNF-α Vorbehandlung zeigten allerdings, dass das Potential von NF-κB DLD-1 Zellen einen Schutz gegenüber Apoptose zu vermitteln bei TRAIL deutlich geringer ist als bei TNF-α. Zu einem wird die Sensitivität gegenüber TNF-α-induzierter Apoptose durch NF-κB stärker moduliert als die Sensitivität gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose (vgl. Abb. 22B und Abb. 25, 26). Zum anderen ist der durch voraktiviertem NF-κB vermittelte Schutz in DLD-1 Zellen nur transient, Vorbehandlung mit TNF-α zeigte bei Stimulation mit TRAIL für 24 h keinen schützenden Effekt mehr. Dennoch konnte durch TRAIL-induziertes NF-κB kein transienter Schutz vermittelt werden, d.h auch nach 7 h TRAIL Stimulation hatte eine NF-κB Inhibition keinen Effekt (Daten nicht gezeigt). EGFP-N1 Medium 53 % TRAIL 23 % p65-egfp Medium 55 % TRAIL 45 % 69

78 III. Ergebnisse Zusammenfassend deuten die Ergebnisse darauf hin, dass durch TRAIL aktiviertes NF-κB nicht das Potential hat die apoptotische Antwort zu antagonisieren. Allerdings scheint voraktivieres bzw. konstitutiv aktiviertes NF-κB die TRAIL Sensitivität modulieren zu können und in Panc-1 Zellen zur TRAIL Resistenz beizutragen. III.1.3 XIAP als NF-κB-abhängiger Resistenzfaktor in TRAIL-induzierter Apoptose Die bisherigen Ergebnisse zeigten, dass NF-κB zumindest einen Faktor darstellt, der zur relativen Resistenz gegenüber TRAIL in Panc-1 Zellen beiträgt. NF-κB ist verantwortlich für die Regulation einer Anzahl von Proteinen, die dem apoptotischen Programm entgegenwirken. Die Hochregulation solcher anti-apoptotischen Proteine ist ein häufiger Mechanismus zur Resistenzerlangung, allerdings scheint der individuelle Beitrag dieser Proteine zum resistenten Phänotyp abhängig zu sein sowohl vom Zelltyp und auch vom apoptotischen Signal. X-Linked Inhibitor of Apoptosis Protein (XIAP), ein Mitglied der IAP Familie, hat ein hohes Potential zur Vermittlung von Chemoresistenz (Cummins et al., 2004; Tong et al., 2005; Nomura et al., 2005). Es wurde vielfach berichtet, dass XIAP in Krebszellen hochreguliert ist und entscheidend zu einem resistenten Phänotyp beitragt (Fong et al., 2000). Auch in der Resistenz gegenüber TRAIL scheint XIAP eine bedeutende Rolle zuzukommen (Siegmund et al., 2001; Kim et al., 2004; Sanna et al., 2002; Rosato et al., 2004). Die Transkription von XIAP wird außerdem über NF-κB reguliert (Stehlik et al., 1998). Daher sollte der Einfluss von XIAP auf die TRAIL Sensitivität in den hier untersuchten Zelllinien untersucht werden und die Rolle von XIAP in Panc-1 Zellen, die NF-κB konstitutiv aktiviert haben, gegenüber der in anderen Zelllinien bewertet werden. III Herunterregulation des XIAP Proteins mittels RNAi Zur Herunterregulation des XIAP Proteins wurde die Technik der RNA Interferenz (RNAi) verwendet (Vgl. III. 4). Die RNAi erfolgte durch eine adenoviral- (Ad.shRNA.XIAP)- vermittelte Expression von small hairpin (sh)rnas, die gegen XIAP mrna gerichtet waren. Das Motiv gegen XIAP sowie der Ad.shRNA.EGFP Kontrollvektor wurde freundlicherweise von Kris Fisher (GlaxoSmithKline, USA) zur Verfügung gestellt. Die Klonierung des XIAP-siRNA Motivs in den adenoviralen Vektor (pad/block-it ), sowie die Virusproduktion und Aufreinigung des Ad.shRNA.XIAP und Ad.shRNA.EGFP wurden von Frau Chirlei Büneker durchgeführt. Frau Chirlei Büneker führte auch die Vorversuche aus, die zeigten, dass nach 48 h und 72 h Expression der shrna ein maximaler Knock-Down Effekt erzielt wird. 70

79 III. Ergebnisse Die Transduktion mit Adenovirus erfolgte wie unter III.1.2 beschrieben. Integration einer EGFP Expressionskasette ermöglichte die Kontrolle der Tansduktionseffizienz im Fluoreszenmikroskop. Die Stimulation mit TRAIL und die Durchführung der Versuche erfolgte 48 h nach der Transduktion mit Ad.shRNA.XIAP. Zu diesem Zeitpunkt war die XIAP Proteinmenge in allen Zelllinien deutlich herunterreguliert (Daten nicht gezeigt). Um Effekte der adenoviralen Transduktion und/oder der shrna Expression zu berücksichtigen, wurden Kontrollzellen parallel mit Ad.shRNA.EGFP transduziert. Abbildung 27A zeigt die XIAP Expression 48 h nach Transduktion mit Ad.shRNA.XIAP bzw. Ad.shRNA.EGFP in DLD-1 und Panc-1 Zellen. Zur Untersuchung des Einflusses von XIAP auf TRAIL-induzierter Apoptose, wurde die spezifische Apoptoserate in Ad.shRNA.XIAP bzw. Ad.shRNA.EGFP transduzierten Zellen nach 24 h Stimulation mit TRAIL bestimmt (Abb. 27B). A B XIAP Proteinmenge Panc-1 DLD XIAP CuZnSOD =Ad.shRNA.EGFP = Ad.shRNA.XIAP Panc-1 DLD untransduziert Ad.shRNA.EGFP Ad.shRNA.XIAP * * Abbildung 27 shrna-vermittelte Herunterregulation des XIAP Proteins und deren Einfluß auf TRAIL-induzierte Apoptose A) Herunterregulation des XIAP Proteins durch RNAi am Beispiel der DLD-1 und Panc-1 Zellen. Die XIAP Proteinmenge konnte auf 4,5% bzw. 9,4% herunterreguliert werden. Die Zellen wurden mit Ad.shRNA.XIAP ( Spur 2) bzw. mit Ad.shRNA.EGFP (Kontrolle, Spur 1) transduziert und nach 48 h für die Western-Blot Analyse gegen XIAP (53 kda) geerntet. Das CuZnSOD Signal (20 kda) zeigt an, dass gleiche Proteinmengen eingesetzt wurden. Die Herunterregulation des XIAP Proteins wurden mittels der Scion Image Software quantifiziert und in dem nebenstehenden 71

80 III. Ergebnisse Diagramm dargestellt. Die Signale wurden prozentual in Bezug zur Ad.shRNA.EGFP transduzierten Kontrolle (100%) dargestellt. B) Spezifische Apoptoserate nach TRAIL Stimulation in shrna.xiap exprimierenden Zellen. Herunterregulation des XIAP Proteins führte zu einer signifikantem Sensitivierung gegenüber TRAIL in Panc-1 Zellen (p<0.001). HCT116 Zellen konnten ebenfalls sensitiviert werden (p<0.05), der Effekt war aber gering. Die Zellen wurden mit Ad.shRNA.XIAP bzw. Ad.shRNA.EGFP transduziert oder nicht-transduziert. Nach 48 h wurden die Zellen mit 1 ng/ml TRAIL (Caki-2, DLD-1, HCT116) oder 2,5 ng/ml TRAIL (HeLa, Panc-1, humane Fibroblasten) für 24 h stimuliert und anschließend die spezifische Apoptoserate in einem DNA-Fragmentierungsassay nach Nicoletti bestimmt. Dargestellt sind die Mittelwerte ± S.E. aus drei unabhängigen Experimenten, die als Dreifachbestimmung ausgeführt wurden. A549 Zellen konnten aufgrund zytotoxischer Effekte 48 h nach viraler Transduktion nicht in den Versuch einbezogen werden. In Caki-2 Zellen war wieder unerwarteter Weise eine reduzierte Apoptoserate in Virus-transduzierten Zellen zu beobachten, was auf einen ungewöhnlichen Effekt der adenoviral-vermittelten Transduktion zurückgeführt wurde (Vgl III.1.2.2). Die Herunterregulation des XIAP Proteins führte zu keiner (signifikanten) Veränderung der apoptotischen Antwort in DLD-1 Zellen, HeLa Zellen und humanen Fibroblasten, woraus folgte, dass in diesen Zelllinien XIAP keinen entscheidenden Block in TRAIL-induzierter Apoptose darstellt. In HCT116 Zellen konnte die TRAIL Sensitivität durch Inhibierung der XIAP Protein Expression leicht erhöht werden, allerdings war der Umfang der Sensitivierung gering. Hingegen zeigten sich Panc-1 Zellen, in denen XIAP herunterreguliert war, deutlich sensitiver gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose als die Ad.shRNA.EGFP transduzierten Panc-1 Kontrollzellen. Die Sensitivierung gegenüber TRAIL durch Inhibierung der XIAP Protein Expression zeigte sich sowohl bei kurzer Stimulationszeit (10 ng/trail, 7 h), als auch bei Stimulation mit niedrigen Dosen TRAIL (2,5 ng/ml; 24 h) (Abb. 28). Ad.shRNA.EGFP TRAIL (10 ng/ml) 7 h Ad.shRNA.EGFP TRAIL (2.5 ng/ml) 8 % 24 h 9% su b-g 1 sub-g1 Ad.shRNA.XIAP TRAIL (10 ng/ml) 7 h Ad.shRNA.XIAP TRAIL (2.5 ng/ml) 24 h 36 % 32 % su b-g 1 su b-g Panc-1 * TRAIL (10 ng/ml) 7 h untransduziert Ad.shRNA.EGFP Ad.shRNA.XIAP * TRAIL (2.5 ng/ml) 24 h Abbildung 28 Herunterregulation des XIAP Proteins sensitiviert Panc-1 gegenüber TRAIL Links dargestellt sind repräsentative FACS Histogramme des DNA-Fragmentierungsassays nach Nicoletti. Die Histogramme zeigen anhand der sub-g1 Fraktion eine signifikant höhere Apoptoserate nach TRAIL Stimulation in Zellen die mit Ad.shRNA.XIAP transduziert wurden 72

81 III. Ergebnisse (Histogramme unten) als in mit Ad.shRNA.EGFP transduzierten Kontrollzellen (Histogramme oben). Der sensitivierende Effekt zeigte sich sowohl bei kurzer Stimulation (10 ng/ml TRAIL, 7 h; Histogramme links), als auch bei Stimulation mit niedrigen Dosen (2,5 ng/ml TRAIL, 24 h; Histogramme rechts). Das nebenstehende Diagramm zeigt das Mittel ± S.E. der spezifische Apoptoserate aus drei unabhängigen Experimenten, die als Dreifachbestimmung durchgeführt wurden (p<0.001). XIAP interagiert mit Caspase-9, -7 und -3 und inhibiert deren vollständige Aktivierung (Keane et al., 1999). Caspase-3 und -7 sind Effektorcaspasen die am Ende des apoptotischen Signalweges stehen und deren proteolytische Aktivität die Zelle letztendlich -/- in den Tod führt. Untersuchungen in Caspase-3P P Modellen zeigten, dass Caspase-7 zwar auch das apoptotische Programm ausführen kann, die im Nicoletti-Assay gemessene DNA-Fragmentierung allerdings Caspase-3 abhängig ist (Krajewska et al., 2003). XIAP interagiert mit der intermediären Form der Caspase-3, die im ersten Prozessierungsschritt entsteht, und inhibiert deren weitere Prozessierung zur aktiven Form. Um zu überprüfen, ob die Herunterregulation von XIAP zu einer erhöhten Prozessierung von Caspase-3 in Panc-1 Zellen führt, wurde die Aktivierung von Caspase-3 nach TRAIL Stimulation mittels Western-Blot analysiert. Parallel wurden Ad.IκB-SR transduzierte Zellen untersucht, da die erhöhte Apoptoserate in NF-κB inhibierten Zellen ebenfalls über eine verstärkte Caspase-3 Aktivierung vermittelt werden sollte (Abb. 29). TRAIL 24 h Panc = Ad.LacZ 2= Ad.shRNA.EGFP 3= Ad.IκB-SR 4= Ad.shRNA.XIAP Procaspase-3 p20 p17 Procaspase-8 Abbildung 29 In IκB-α-SR (Spur 3) und shrna.xiap (Spur 4) exprimierenden Panc-1 Zellen ist die Prozessierung zu aktiver Caspase-3 (p17) nach TRAIL Stimulation verstärkt. Panc-1 wurden mit Ad.shRNA.XIAP bzw. Ad.IκB-SR und den entsprechenden Kontrollen (Ad.LacZ, Ad.shRNA.EGFP) transduziert. 48 h nach der Transduktion wurden die Zellen mit TRAIL (2,5 ng/ml, 24 h) stimuliert und anschließend zur Western-Blot Analyse verwendet. Der Antikörper gegen Caspase-3 erkennt Procaspase-3 (35 kda), die prozessierte intermediäre Form (20 kda) und das aktive Fragment (17 kda). Zusätzlich wurde gegen Procaspase-8 (55 kda) geblottet. CuZnSOD (20 kda) wurde als Ladekontrolle verwendet. Die Western-Blot Analyse zeigte, dass RNAi-vermittelte Herunterregulation des XIAP Proteins die Prozessierung des aktiven p17 Fragments aus Caspase-3 nach TRAIL Stimulation verstärkte. Ebenso ist in IκB-α-SR exprimierenden Zellen, im Vergleich zu den Kontrollzellen (Ad.LacZ), eine stärkere Freisetzung der aktiven Caspase-3 (p17) erkennbar. Diese Ergebnisse konnten von Frau Dr. Andrea Mohr in einem Caspase-Substrat-Assay, in welchem die Caspase-3-Aktivität anhand der Spaltung 73

82 III. Ergebnisse Caspase-3-spezifischer Substrate gemessen wird, bestätigt werden. Zusätzlich war die Degradation/Prozessierung der Procaspase-8 in IκB-α-Superrepressor und shrna.xiap exprimierenden Zellen leicht verstärkt, was wahrscheinlich aus der erhöhten Caspase-3-Aktivität resultierte, da Procaspase-8 ein Substrat der aktiven Caspase-3 darstellt. (Fujita et al., 1999 ; Engels et al., 2000; Tang et al., 2000). III Konstitutiv aktiviertes NF-κB führt zu einer hohen XIAP Expression in Panc-1 Zellen Im vorhergehenden Abschnitt konnte gezeigt werden, dass XIAP zur TRAIL Resistenz in Panc-1 Zellen beiträgt. Da NF-κB an der Regulation der Transkription von XIAP beteiligt ist (Stehlik et al., 1998), stellte sich die Frage, ob der Sensitivierungseffekt, der in IκB-α-SR exprimierenden Panc-1 Zellen beobachtet wurde, einem verringerten XIAP Proteinspiegel als Folge der Inhibierung von konstitutiv aktiviertem NF-κB zuzuschreiben ist. IκB-α-SR exprimierende Panc-1 Zellen wurden daher auf ihre XIAP Protein Expression hin mittels Western-Blot Analyse untersucht (Abb. 30). Panc = untransduziert 2= Ad.LacZ 48 h 4= Ad.IκB-SR 48 h XIAP IκB-SR endogenes IκB-α CuZnSOD 3= Ad.IκB-SR 24 h 5= Ad.IκB-SR + TRAIL 48 h Panc XIAP Proteinmenge Abbildung 30 Herunterregulation von XIAP durch Inhibierung von konstitutiv aktiviertem NF-κB in Panc-1 Zellen. Im Western-Blot (linke Seite) war eine deutliche Abnahme des XIAP Proteinspiegels nach 24 h (Spur 3) und eine weitere Abnahme nach 48 h Transduktion mit Ad.IκB-SR (Spur 4) im Vergleich zu den untransduzierten (Spur 1) bzw. LacZ transduzierten (Spur 2) Kontrollzellen festzustellen. TRAIL Stimulation führte zu einer weiteren Degradation des XIAP Proteins (Spur 5). Das Diagramm (rechte Seite) zeigt die Quantifizierung der XIAP Proteinbanden mit Hilfe der Scion Image Software. Die Signale sind prozentual in Bezug zur Negativkontrolle (untransduzierte Zellen) dargestellt. Panc-1 Zellen wurden nicht-transduziert, oder 48 h mit Ad.LacZ bzw. 24 h und 48 h mit Ad.IκB-SR transduziert. Zellen die mit Ad.IκB-SR (48 h) transduziert waren, wurden mit 10 ng/ml TRAIL für 7 h behandelt. Die Western-Blot Analyse wurde gegen XIAP (53 kda) und IκB-α (41 kda) durchgeführt. Das mutierte IκB-α-Superrepressorprotein trägt ein Polypeptidsignal und hat daher eine geringere Mobilität als das endogene IκB-α. CuZnSOD (20 kda) diente als Proteinladekontrolle. 74

83 III. Ergebnisse Es zeigte sich, dass der XIAP Proteinspiegel in Zellen die 24 h mit Ad.IκB-α-SR transduziert waren, im Vergleich zu dem XIAP Proteinspiegel in den Kontrollzellen abgenommen hatte (65% des Proteinspiegels der untransduzierten Kontrollzellen). 48 h nach der Transduktion war der XIAP Proteinspiegel auf 42% des Proteinspiegels der untransduzierten Kontrollzellen verringert. Die Ad.LacZ-Kontrolle zeigte, dass die adenovirale Transduktion selbst keinen Einfluss auf den XIAP Proteinspiegel hatte. Stimulation der IκB-α-SR exprimierenden Zellen mit TRAIL (10 ng/ml; 7 h) führte zu einer weiteren Degradation des XIAP (auf 16%). Dies verdeutlicht das delikate Gleichgewicht zwischen pro-apoptotischen und anti-apoptotischen Faktoren in einer Zelle. XIAP hat eine Ubiquitin-Ligase Aktivität und vermittelt die Degradation von Caspase-3. XIAP wiederum stellt ein Substrat für aktivierte Caspase-3 dar. Ist eine bestimmte Menge an aktiver Caspase-3 vorhanden, führt dies durch eine Degradation des XIAP Proteins zu einer Amplifikation der Apoptose. Um zu Bestätigen, dass die gezeigte Herunterregulation des XIAP Proteins in Panc-1 Zellen eine Folge der Inhibierung von basal aktiviertem NF-κB ist, wurden DLD-1 Zellen, die kein basal aktiviertes NF-κB haben, parallel zu Panc-1 Zellen mit Ad.IκB-SR transduziert und die XIAP Proteinspiegel mittels Western-Blot Analyse untersucht (Abb. 31). Im Gegensatz zu den Panc-1 Zellen, führte in den DLD-1 Zellen eine Inhibierung von NF-κB zu keiner signifikanten Abnahme des XIAP Proteinspiegels, so dass davon ausgegangen werden kann, dass konstitutiv aktiviertes NF-κB in Panc-1 Zellen tatsächlich den XIAP Proteinspiegel hochreguliert. Wird in Zellen mit basal aktiviertem NF-κB dieses inhibiert, kann dies möglicherweise in einem geringen Umfang eine apoptotische Antwort induzieren. Um Auszuschließen, dass die Verringerung des XIAP Proteinspiegels in IκB-SR exprimierenden Panc-1 Zellen eine Folge von Caspaseaktivität ist, wurden die Zellen zusätzlich mit zvad.fmk behandelt, einem Inhibitor der Aktivität eines breiten Spektrums von Caspasen. Da zvad.fmk Behandlung die Abnahme des XIAP Proteinspiegels in Panc-1 Zellen nicht beeinflusste, ist die beobachtete Degradation tatsächlich auf Inhibierung der transkriptionellen Aktivität von NF-κB zurückzuführen (Abb. 31). 75

84 III. Ergebnisse Ad.LacZ Ad.IκB-SR zvad.fmk DLD-1 Panc XIAP IκB-SR endogenes IκB-α CuZnSOD Abbildung 31 Inhibierung von NF-κB führt zur Herunterregulation von XIAP in Panc-1 aber nicht in DLD-1 Zellen Western-Blot: Expression des IκB-α-SR zeigte in DLD-1 Zellen keinen Einfluss auf den XIAP Proteinspiegel, in Panc-1 Zellen hingegen konnten die Ergebnisse aus Abbildung 31 reproduziert werden. Auch bei Inhibierung der Caspase-Aktivität (Vorbehandlung mit zvad.fmk), wurde XIAP in Panc-1 Zellen herunterreguliert. Die nebenstehenden Diagramme zeigen die Quantifizierung DLD % = Ad.LacZ 2= Ad.LacZ +zvad.fmk 3= Ad.IκB-SR 4= Ad.IκB-SR +zvad.fmk der Proteinbanden mit Hilfe der Scion Image Software. Die Signale sind prozentual in Bezug zur Negativkontrolle (Ad.LacZ; Ad.LacZ + zvad.fmk) dargestellt. DLD-1 und Panc-1 Zellen wurden 48 h mit Ad.LacZ bzw. Ad.IκB-α-SR transduziert. Behandlung mit zvad.fmk Pancaspase Inhibitor (20 µm) verhinderte die Degradation von XIAP in Folge unspezifischer Apoptose. Die Western-Blot Analyse wurde mit Gesamtzellextrakten gegen XIAP, IκB-α und CuZnSOD durchgeführt. Diese Ergebnisse zeigten, dass basal aktiviertes NF-κB zu einem erhöhten XIAP Proteinspiegel in Panc-1 Zellen führt und über diesen Mechanismus zum resistenten Phänotyp dieser Zellen beiträgt. Aufgrund dieses Zusammenhangs war es auch von Interesse die XIAP Expression in den untersuchten Zelllinien zu vergleichen (Abb. 32) DLD-1 XIAP Proteinmenge Panc XIAP Proteinmenge XIAP Procaspase-3 CuZnSOD Abbildung 32 XIAP Expression in den verschiedenen Zelllinien Mit Ausnahme humaner Fibroblasten, zeigten Panc-1 Zellen die höchste XIAP Expression. Die Expression der Caspase-3, des wichtigsten Interaktionspartners von XIAP, ist in den verschiedenen Zelllinien annähernd gleich. Von den aufgeführten Zelllinien wurden Gesamtproteinextrakte angefertigt und eine Western-Blot Analyse gegen XIAP, Caspase-3 und CuZnSOD (Proteinladekontrolle) durchgeführt. Die Western-Blot Analyse zeigte, dass Panc-1 Zellen einen vergleichsweise hohen XIAP Proteinspiegel aufweisen. Allerdings zeigten auch humane Fibroblasten eine ähnlich hohe XIAP Expression. Fibroblasten haben aber kein basal aktiviertes NF-κB und konnten 76

85 III. Ergebnisse auch nicht durch sirna-vermittelte Herunterregulation des XIAP sensitiviert werden. Insgesamt zeigte sich auch, dass alle untersuchten Zelllinien XIAP deutlich exprimieren und dass die XIAP Expression in Panc-1 Zellen nur gering über der in den anderen untersuchten Zelllinien lag. C-Flip stellt ein weiteres NF-κB-abhängiges anti-apoptotisches Protein dar, dessen Überexpression in Krebszellen oft in Zusammenhang mit der Resistenz gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose gebracht wurde (Irmler et al., 1997; Siegmund et al., 2002). Daher wurde der Einfluss der Inhibierung von basal aktiviertem NF-κB auf die c-flip Expression untersucht (Abb. 33). DLD-1 Panc = Ad.LacZ 2= Ad.shRNA.EGFP 3= Ad.IκB-SR 4= Ad.shRNA.XIAP c-flip CuZnSOD Abbildung 33 Die Inhibierung von basal aktiviertem NF-κB hat keinen Einfluss auf die c-flip Expression IκB-α SR veränderte nicht den c-flip Proteinspiegel im Vergleich zu der LacZ Kontrolle. Ebenso hatte shrna.xiap bzw. shrna.egfp Expression keinen Einfluss. Panc-1 und DLD-1 Zellen wurden mit Ad.LacZ, Ad.IκB-SR, Ad.shRNA.XIAP bzw. mit Ad.shRNA-EGFP für 48 h transduziert und eine Western-Blot Analyse gegen c-flip (55 kda) und CuZnSOD durchgeführt. In Panc-1 Zellen konnte durch die Inhibierung von NF-κB kein Einfluss auf die Expression von c-flip festgestellt werden. Ebenfalls konnte ein Einfluss der Expression von shrna.xiap bzw. shrna.egfp auf c-flip ausgeschlossen werden. Interessanterweise zeigten die TRAIL-sensitiven DLD-1 Zellen eine höhere c-flip Expression als TRAIL-resistente Panc-1 Zellen. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass XIAP als ein Resistenzfaktor gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose in direktem Zusammenhang steht mit konstitutiv aktiviertem NF-κB. Herunterregulation des XIAP durch RNAi sensitivierte Panc-1 (als einzige Zelllinie) gegenüber TRAIL. Es wurde gezeigt, dass die Inhibierung von basal aktiviertem NF-κB in Panc-1 Zellen ebenfalls zu einer Abnahme des XIAP um mehr als die Hälfte führte. Dies stellt XIAP als entscheidenden, wenn auch wahrscheinlich nicht einzigen Faktor dar, über den basal aktiviertes NF-κB in Panc-1 Zellen eine Resistenz vermittelt. Gleichzeitig konnte gezeigt werden, dass c-flip nicht an einer durch NF-κB-vermittelten TRAIL Resistenz in Panc-1 Zellen beteiligt ist. In III konnte gezeigt werden, dass voraktiviertes NF-κB in DLD-1 Zellen einen transienten Schutz gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose vermittelt. Aufgrund des 77

86 III. Ergebnisse vorher gezeigten Zusammenhang zwischen basal aktivierten NF-κB und XIAP in Panc-1 Zellen stellt sich die Frage, ob der in DLD-1 Zellen beobachtete Schutzeffekt ebenfalls über eine Hochregulation des XIAP Proteins vermittelt wird. Ein Vorversuch zum Nachweis der Induktion von NF-κB Zielgenen durch TNF-α Behandlung in verschiedenen Zelllinien ergab keine signifikante Veränderung der ciap-1, ciap-2 und XIAP Proteinspiegel (Daten nicht gezeigt). Weitere Analysen sind in Bearbeitung. In diesem Abschnitt der Doktorarbeit konnte zusammenfassend folgendes gezeigt werden. TRAIL führte in allen untersuchten Zelllinien, mit Ausnahme der humanen Fibroblasten, zu einer Aktivierung von NF-κB, allerdings war kein Zusammenhang zwischen der induzierten NF-κBAktivität und der Sensitivität gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose erkennbar. Die Inhibierung der NF-κB-Aktivität führte einzig in Panc-1 Zellen zu einer Sensitivierung gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose. Panc-1 Zellen wiesen als einzige der untersuchten Zelllinien basal aktiviertes NF-κB auf, welches durch Expression des IκB-α-SR vollständig inhibiert wurde. Dies führte zu der Annahme, dass basal aktiviertes, nicht aber durch TRAIL-induziertes NF-κB die TRAIL Sensitivität modulieren kann. Die Aktivierung von NF-κB in DLD-1 Zellen durch Vorbehandlung mit TNF-α und Überexpression von p65 bestätigte, dass eine der TRAIL Stimulation vorangehende NF-κB-Aktivität den Zellen einen Schutz vermitteln kann. Das Potential von NF-κB, Zellen vor dem Zelltod zu schützen, scheint allerdings bei TRAIL-induzierter Apoptose deutlich geringer zu sein als bei TNF-α. Dennoch trägt konstitutiv aktiviertes NF-κB aber zu dem TRAIL-resistenten Phänotyp in Panc-1 Zellen bei. In der TRAIL Resistenz von Panc-1 Zellen, stehen konstitutiv aktiviertes NF-κB und das Caspase-inhibierende anti-apoptotische Protein XIAP in direktem Zusammenhang: Basal aktiviertes NF-κB führt zu einer Hochregulation des XIAP Proteins. Inhibierung des basalen NF-κB reduzierte den XIAP Proteinspiegel um mehr als die Hälfte. Dies stellt XIAP als entscheidenden Faktor dar, über welchen basal aktiviertes NF-κB seine Resistenz in TRAIL-induzierter Apoptose vermittelt. 78

87 III. Ergebnisse III.2 Der Einfluss von NF-κB in 5-FU-induzierter Apoptose Während sich lösliches rekombinantes TRAIL bzw. agonistisch-wirkende Antikörper noch in der klinischen Versuchsphase befinden, ist 5-Fluorouracil (5-FU) eine wichtige zytotoxische Verbindung, die bei der chemotherapeutischen Behandlung verschiedener Krebsarten, u.a. Kolorektal- und Pankreaskarzinoma, Anwendung findet. In einem Nebenprojekt der Doktorarbeit sollte der Beitrag von NF-κB zur Resistenz gegenüber 5-FU-induzierter Apoptose untersucht werden. Seit seiner Einführung vor 35 Jahren stellt 5-Fluorouracil (5-FU) immer noch die effektivste chemotherapeutische Verbindung für die Behandlung von fortgeschrittenem Kolorektalkrebs dar (Tebbutt et al., 2002). Allerdings zeigen bei vielen Patienten die Tumore Resistenz gegenüber 5-FU bzw. entwickeln diese während der Behandlung. Eine Kombinationstherapie mit z.b. Leucovorin und Irinotecan verstärkt die antitumorale Aktivität des 5-FU, dennoch sprechen nur 20-40% der Patienten mit fortgeschrittenem Kolorektalkrebs auf eine Behandlung an [NCI, Bethesda, Maryland, USA]. Die antitumorale Aktivität des 5-FU basiert zumindest teilweise auf der Induktion von Apoptose, vermittelt über den intrinsischen Signalweg. Für einige Chemotherapeutika (z.b. Camptothecin und Etoposide), die ihre Wirkung ebenfalls über den intrinsischen Apoptoseweg ausüben, konnte gezeigt werden, dass sie in einigen Krebszelllinien NF-κB aktivieren, und dass durch eine Inhibierung der NF-κB-Aktivität eine Sensitivierung erfolgt. (Wang et al., 1996a; Das et al., 1997; Pahl, 1999; Barkett et al., 1999; Wang et al., 1999a; Baldwin, 2001). Um das therapeutische Potential einer Inhibition der NF-κB-Aktivität bei einer 5-FU-basierten Therapie evaluieren zu können, wurden im folgenden zwei Punkte untersucht: Der Umfang der durch 5-FU induzierten NF-κB Aktivierung Einfluss der Inhibition von NF-κB auf die Sensitivität gegenüber 5-FU Die Untersuchungen wurden mit den Kolorektalzelllinien HCT116 (p53 wt) und HRT18 (p53 mutiert) bzw. DLD-1 (HRT18 und DLD-1 sind genetisch nahezu identisch) durchgeführt. Desweiteren wurden die Zellklone HRTSR1 und HRTC22 der HRT18 Zelllinie verwendet (Hergestellt von Dr. Ralf Zwacka). HRTSR1 exprimiert stabil eine nicht-degradierbare Mutante des natürlichen NF-κB Inhibitorproteins, das IκB-α-Superrepressor Protein (IκB-α-SR, siehe Abschnitt III.1.2.2), wodurch die NF-κB Aktivierung blockiert ist. HRTC22 ist ein Kontrollklon, d.h. er hat den Selektionsprozess durchlaufen, exprimiert aber nicht das Transgen. 79

88 III. Ergebnisse III FU-induzierte Aktivierung von NF-κB Die nachfolgenden Experimente wurden mit DLD-1 bzw. HRT18 Zellen durchgeführt, da in DLD-1/HRT18 sowohl eine starke Induzierbarkeit von NF-κB durch TNF-α als auch eine Sensitivierung gegenüber TNF-α durch Inhibition von NF-κB gezeigt ist, d.h. diese Zelllinie kann ein NF-κB-vermitteltes Zellschutzprogramm grundsätzlich aktivieren. In 5-FU behandelten Zellen ist entsprechend der indirekten Wirkungsweise von 5-FU (Vgl I.8) nach 24 h nur eine geringe Apoptoserate messbar und erst nach 48 h bzw. 72 h ist eine deutliche Apoptoserate in sensitiven Zellen messbar. Demzufolge ist auch der Zeitpunkt der NF-κB Aktivierung nicht so eingrenzbar wie im Falle einer rezeptor-vermittelten Aktivierung. Zum Nachweis einer 5-FU-induzierten NF-κB Aktivierung wurde zunächst die DNA Bindungsaktivität des NF-κB Komplexes in einem EMSA nach 1 h, 2 h und 16 h 5-FU Behandlung in HRT18, HRTC22 und HRTSR1 Zellen (Negativkontrolle) untersucht. Als Positivnachweis wurden HRT18 Zellen mit TNF-α behandelt (Abb. 34). Nach 16 h 5-FU Behandlung war in HRT18 und HRTC22 nach sehr langer Exposition eine geringfügige Induktion der NF-κB Bande zu erkennen. Diese war allerdings sehr gering und im Vergleich zu der durch TNF-α-induzierten NF-κB vernachlässigbar, so dass man nicht von einer spezifischen durch 5-FU-induzierten NF-κB Aktivierung sprechen kann. HRT 18 SR1 C22 18 SR1 C22 18 SR1 C22 18 SR1 C22 18 ss (c-rel/p65) NF-κB 0 h 1 h 5-FU 400 µm 2 h 16 h 5-FU 400 µm 1 h TNF-α 25 ng/ml Abbildung 34 5-FU-induzierte NF-κB-Bindungsaktivität im EMSA. HRT18, HRTC22 und HRTSR1 wurden 0 h, 1 h, 2 h und 16 h mit 5-FU (400 µm) behandelt und die nuklearen Extrakte mit einem radioaktiv markierten Oligonukleotid, welches ein NF-κB Consensus-Bindungsmotiv enthält, inkubiert. Aufgrund einer sehr langen Expositionszeit (120 h) des gezeigten Films, sollte auch eine schwache Induktion der NF-κB-spezifischen Bande erkennbar sein. Als Positivkontrolle wurden HRT18 Zellen mit TNF-α (25 ng/ml) behandelt. Die Spezifität der NF-κB Bande zeigt ein Supershift (ss): TNF-α behandelte Zellextrakte wurden zusätzlich mit einem c-rel (vorletzte Spur) bzw. p65 (letzte Spur)-spezifischen Antikörper inkubiert. 80

89 III. Ergebnisse Zusätzlich wurde die Induktion der NF-κB-Transkriptionsaktivität durch 5-FU Behandlung in einem Luziferase-Reporter-Assay untersucht (Vgl.III.1.2.). Da in Hek293 und HeLa Zellen im Gegensatz zu den Kolorektalzelllinien eine sehr hohe Transfektionseffizienz gewährleistet ist, wurden diese Zelllinien in die Untersuchung eingeschlossen. Die NF-κB-Aktivität wurde 1 h, 6 h, 24 h (HRT) und 48 h (Hek293 und HeLa) nach 5-FU Behandlung untersucht, zum Positivnachweis wurden Zellen mit TNF-α behandelt (Abb. 35) Medium 5-FU µm TNF - 25 ng/ml t [h] Hek293 HeLa HRT18 HRTC22 HRTSR1 Abbildung 35 5-FU-induzierte NF-κB-Transkriptionsaktivität im Luziferase Reporter Assay. Die Zellen wurden mit einem Firefly Luziferase Reporterkonstrukt, welches drei NF-κB Bindungsstellen enthält, transfeziert. Nach Stimulation mit 5-FU (400 µm) bzw. TNF-α (25 ng/ml) für die angegebenen Zeiträume, wurde die Firefly Luziferase-Aktivität gemessen. Unterschiede in der Transfektionseffizienz wurden gegen die Ubiquitin Promotor gesteuerte Expression von Renilla Luziferase eines co-transfezierten Plasmids normalisiert. TNF-α Behandlung diente als Positivkontrolle. Gezeigt ist die fache Induktion der NF-κB-Aktivität behandelter zu nicht-behandelten Zellen (Medium). Dargestellt sind Mittelwerte ± S.E eines Experimentes, das als Dreifachbestimmung durchgeführt wurde. Während durch TNF-α in Hek293 Zellen eine deutliche Induktion der NF-κB Aktivität nach 1 h bzw. 6 h gezeigt werden konnte (3,5-fach bzw. 9.4-fach), fand nach 5-FU Behandlung zu diesen Zeitpunkten keine Induktion statt. Nach 24 h bzw. 48 h 5-FU Behandlung war eine schwache Induktion der NF-κB-Aktivität messbar (1,8-fach bzw. 1,6-fach). In HeLa Zellen war ebenfalls nach 24 h bzw. 48 h 5-FU Behandlung eine geringe Induktion erkennbar (jeweils 1,4-fach). In HRT18 und HRTC22 Zellen war nach 24 h 5-FU Behandlung nur eine geringfügige Induktion der NF-κB-Aktivität messbar (1,25-fach bzw. 1,35-fach). Der NF-κB-Komplex ist im inaktiven Zustand an Inhibitorproteine (IκBs) im Zytoplasma gebunden, wobei die hier relevanten NF-κB Funktionen, hauptsächlich über NF-κB-Komplexe vermittelt werden, die an IκB-α gebunden vorliegen. Die 81

90 III. Ergebnisse Signalkaskaden führen letztendlich zur Aktivierung des Inhibitor Kinase Komplexes, welcher das IκB-α für die proteasomale Degradation kennzeichnet. Eine Aktivierung von NF-κB kann daher indirekt über die Degradation des IκB-α Proteins nachgewiesen werden. IκB-α ist wiederum ein NF-κB Zielgen, durch diese positive Rückkopplung reguliert sich die NF-κB Antwort selbst und ist zeitlich begrenzt. Die Kinetik bei TNF-α Stimulation zeigte, dass IκB-α nach 20 Minuten degradiert ist und bereits nach 60 Minuten der ursprüngliche IκB-α Proteinspiegel wieder hergestellt ist (Abb. 36A). Zum Nachweis einer NF-κB Aktivierung während der 5-FU induzierten Apoptose wurde eine eventuelle IκB-α Degradation in einem Zeitraum von 24 h nach 5-FU Gabe (10 µm) in 30 Minuten Intervallen in DLD-1 Zellen untersucht (Abb. 36B). Zu keinem der untersuchten Zeitpunkte konnte eine vollständige Degradation des IκB-α Proteins festgestellt werden. Allerdings war in dem Zeitbereich von 11 h bis 13 h nach 5-FU Behandlung eine geringe Degradation des IκB-α Proteins erkennbar. Eine Analyse des IκB-α Proteinspiegels 24 h, 48 h und 72 h nach 5-FU Behandlung (400 µm) zeigte eine Degradation des IκB-α nach 72 h. Diese war allerdings auf einen allgemeinen Proteinabbau infolge des apoptotischen Prozesses zurückzuführen, da durch die Inhibition der Caspase-Aktivität (zvad.fmk Behandlung) der Abbau verhindert werden konnte (Abb. 36C). Eine Aktivierung von NF-κB nach 5-FU Stimulation wurde auf verschiedenen Ebenen untersucht. Bei Behandlung mit 5-FU fand während den ersten 24 h keine vollständige und deutliche Degradation des IκB-α Proteins statt. Lediglich eine schwache Abnahme des IκB-α Proteinspiegels war zwischen 11 h und 13 h erkennbar. Im EMSA konnte nach langer Expositionszeit des Films nach 16 h 5-FU Stimulation eine geringfügige Induktion der NF-κΒ DNA- Bindungsaktivität festgestellt werden. Lediglich in Hek293 Zellen war im Luziferase Reporter Assay eine geringe Induktion der NF-κΒ-Transkriptionsaktivität nach 24 h erkennbar, in den Kolorektalzelllinien war diese nur sehr gering und nicht signifikant. Zusammenfassend ließ sich eine geringe Induktion der NF-κΒ-Aktivität nach ungefähr 12 h 24 h 5-FU Behandlung in den untersuchten Kolorektalzelllinien feststellen. Diese war aber im Vergleich zu einer TNF-α induzierten Aktivierung so gering, dass sie nicht signifikant ist und wahrscheinlich sekundär auf zytotoxische Effekte des 5-FU zurückzuführen ist. 82

91 III. Ergebnisse A B C DLD-1 TNF-α (25 ng/ml) FU (10 µm) IκB-α CuZnSOD t [min] 0 0,5 30 min Intervalle 5, min Intervalle 10 5-FU (10 µm) 0 10,5 30 min Intervalle 14, min Intervalle 18 t [h] 5-FU (10 µm) IκB-α CuZnSOD 0 18,5 30 min Intervalle 23,5 t [h] 5-FU (400 µm) 5-FU (400 µm) +zvad IκB-α CuZnSOD t [h] IκB-α CuZnSOD IκB-α CuZnSOD t [h] Abbildung 36 IκB-α Proteinspiegel nach Stimulation mit 5-FU A) TNF-α induziert die Degradation von IκB-α in DLD-1 Zellen. Die Kinetik zeigt, dass bereits 20 min nach TNF-α Stimulation IκB-α nahezu vollständig degradiert war und nach 60 min infolge der Selbstregulationsschleife der ursprüngliche Proteinspiegel wieder hergestellt war. B) 5-FU Behandlung induzierte innerhalb von 24 h keine vollständige Degradation des IκB-α Proteins, im Zeitraum zwischen 11 h und 13 h ist allerdings eine geringe Abnahme des Proteinspiegels erkennbar (mit Balken markiert). C) Nach 72 h ist findet eine Degradation des IκB-α Proteins statt (linker Blot). Diese ist aber eine Folge der Caspase Aktivität und lässt sich mittels zvad.fmk Behandlung verhindern (rechter Blot). DLD-1 Zellen wurden mit 25 ng/ml TNF-α (Α), 10 µm (B) oder 400 µm (C) 5-FU stimuliert und zu den angegebenen Zeitpunkte Gesamtzellextrakte angefertigt. Die Western-Blots wurden gegen IκB-α und CuZnSOD (Ladekontrolle) geprobt. III.2.2 III Einfluss des NF-κΒ auf die Sensitivität gegenüber 5-FU Einfluss einer Inhibition von NF-κΒ auf die 5-FU Sensitivität Der vorhergehende Abschnitte zeigte keine signifikante 5-FU-induzierte NF-κΒ Aktivierung in den untersuchten Kolorektalzelllinien. Um eine Beteiligung von NF-κΒ an der 5-FU Sensitivität der untersuchten Zelllinien auszuschließen, sollte als nächstes untersucht werden, ob durch eine Inhibition der NF-κΒ-Aktivität eine Sensitivierung gegenüber 5-FU erzielt werden kann. Die Inhibition der NF-κΒ Aktivität erfolgte durch die Expression des IκB-α-Superrepressor (IκB-α-SR), einer nicht-degradierbaren Form des IκB-α Proteins (Vgl. III ). 83

92 III. Ergebnisse Eine Beteiligung von NF-κΒ in der 5-FU-vermittelten Zytotoxizität wurde zunächst anhand der Wachstumsinhibition in dem HRTSR1 Klon im Vergleich zu HRT18 und HRTC22 Zellen untersucht. HRTSR1 exprimiert stabil das IκB-α-SR Protein, HRTC22 ist ein das Transgen nicht exprimierender Kontrollklon, HRT18 die Parentalzelllinie. Die Wachstumskurven unter verschiedenen 5-FU Konzentrationen sollten zeigen, ob NF-κΒ zu irgendeinem Zeitpunkt an den, durch 5-FU-induzierten, zellulären Prozessen beteiligt ist und den Zellen einen Schutz vermittelt. In diesem Falle sollte HRTSR1 sensitiver gegenüber 5-FU sein, d.h. weniger Zellen sollten überleben und der Wachstum stärker retardiert sein, da NF-κΒ nicht aktiviert werden kann. Ausgehend von der gleichen Zellzahl, wurden die Zellen mit steigenden 5-FU Konzentration (0 µμ, 3,8 µμ, 38 µm und 380 µm) behandelt und die Zellzahl an 5 aufeinander folgenden Tagen bestimmt (Abb. 37A). Bei allen drei Zelllinien zeigte sich die zytotoxische Wirkung des 5-FU anhand eines verringerten Zellwachstums im Vergleich zu den unbehandelten Zellen, der zytotoxische Effekt war abhängig von der 5-FU Konzentration. Der SR1 Klon zeigte keine verstärkte Wachstumsretardation unter 5-FU Behandlung im Vergleich zu HRT18 bzw. zu HRTC22 bei 38 µμ bzw. 380 µμ, lediglich bei geringer 5-FU Konzentration (3,8 µμ) war ein kleines Fenster erhöhter Sensitivität zwischen dem 3. und 5. Tag erkennbar. Zur Überprüfung, ob bei geringen 5-FU Konzentrationen tatsächlich durch NF-κΒ Inhibition eine Sensitivierung stattfindet, wurde der Wachstumsversuch mit geringen 5-FU Konzentrationen (0 µμ, 5 µμ, 8 µμ und 12 µμ) wiederholt. Das Ergebnis ließ sich aber nicht reproduzieren, es konnte keine signifikante Sensitivierung des SR1 Klons gegenüber 5-FU festgestellt werden. Eine Western-Blot Analyse der Caspase-3 nach Stimulation mit 100 µm 5-FU zeigte ebenfalls keine verstärkte Aktivierung von Caspase-3 in HRTSR1 im Vergleich zu der Parentalzelllinie HRT18 (Abb. 37B). 84

93 III. Ergebnisse A µm 5-FU 3.8 µm 5-FU 38 µm 5-FU 380 µm 5-FU HRT FU Behandlung [Tage] µm 5-FU 5 µm 5-FU 8 µm 5-FU 12 µm 5-FU HRT FU Behandlung [Tage] endogenes IκB-α HRTC µm 5-FU 3.8 µm 5-FU 38 µm 5-FU 380 µm 5-FU HRTC FU Behandlung [Tage] µm 5-FU 5 µm 5-FU 8 µm 5-FU 12 µm 5-FU HRTC FU Behandlung [Tage] HRTSR1 IκB-α SR endogenes IκB-α B HRTSR HRT18 0 µm 5-FU 3.8 µm 5-FU 38 µm 5-FU 380 µm 5-FU Procasase-3 HRTSR FU Behandlung [Tage] µm 5-FU 5 µm 5-FU 8 µm 5-FU 12 µm 5-FU HRTSR FU Behandlung [Tage] CuZnSOD t [h] Abbildung 37 Einfluss der Inhibition von NF-κB auf das Wachstum A) Diagramme linke Seite: Bei Behandlung mit einem breiten Konzentrationsspektrum 5-FU (3,8 µμ, 38 µm und 380 µm) zeigte der NF-κB inhibierte SR1 Klon keine verstärkte Retardation im Wachstum im Vergleich zu der Parentalzelllinie HRT18 bzw. dem Kontrollklon HRTC22, mit Ausnahme eines kleinen Fensters erhöhter Sensitivität bei 3,8 µm. Diagramme rechte Seite: Behandlung mit geringen 5-FU Konzentrationen (5 µμ, 8 µμ, 12 µμ) zeigte keine Sensitivierung des SR1 Klons gegenüber 5-FU. Die nebenstehenden Western-Blots zeigen die Überexpression des IκB-α-SR in dem HRTSR1 Klon und die Abwesenheit der Transgens in dem HRTC22 Kontrollklon. Das mutierte IκB-α-SR Protein hat aufgrund eines Polypeptidtags ein höheres Molekulargewicht. Die Zellen wurden mit 5-FU in den angegebenen Konzentrationen behandelt und die Zellzahl an 5 aufeinander folgenden Tagen bestimmt. Dargestellt sind die Ergebnisse aus zwei bzw. drei unabhängigen Experimenten ± S.E. B) Aktivierung von Caspase-3 bei 5-FU Behandlung (100 µm) in HRT18 und HRTSR1. Zytosolische Proteinextrakte der Zelllinien wurden gegen Procaspase-3 und CuZnSOD geprobt. Die antitumorale Aktivität des 5-FU ist größtenteils auf die Induktion von Apoptose zurückzuführen. Daher wurde als nächstes der Einfluss einer NF-κΒ Inhibition auf die 5-FU-induzierte Apoptose in DLD-1 und HCT116 Zellen untersucht. Dafür wurden die Zellen mit dem, die IκB-α-SR Expressionskassette enthaltenen, rekombinanten 85

94 III. Ergebnisse Adenovirus (Ad.IκB-α-SR) transduziert (Vgl. III.1.2.2). Die Zellen wurden über Nacht in 2% serumhaltigen Medium mit einer MOI von 100 transduziert. Am folgenden Morgen wurde das Medium erneuert und die Zellen nach 8 h Regeneration mit 5-FU (10 µm bzw. 100 µm) behandelt. Die spezifische Apoptoserate wurde nach 24 h, 48 h und 72 h Stimulation mit 5-FU bestimmt (Abb. 38) HCT t [h] 5-FU - 10µM 5-FU - 10µM LacZ 5-FU - 10µM IκB-SR 5-FU - 100µM 5-FU - 100µM LacZ 5-FU - 100µM IκB-SR DLD t [h] 5-FU - 10µM 5-FU - 10µM LacZ 5-FU - 10µM IκB-SR 5-FU - 100µM 5-FU - 100µM LacZ 5-FU - 100µM IκB-SR Abbildung 38 Einfluss einer NF-κΒ Inhibition auf 5-FU-vermittelte Apoptose in HCT116 und DLD-1 Zellen HCT116 Zellen (linkes Diagramm) und DLD-1 Zellen (rechtes Diagramm) in denen die Aktivierung von NF-κΒ durch Überexpression des IκB-SR inhibiert war, zeigten keine Änderung in der 5-FU-induzierte Apoptose im Vergleich zu den LacZ transduzierten bzw. den nichttransduzierten Kontrollzellen. DLD-1 und HCT116 Zellen wurden mit Ad.Iκ-α-SR bzw. Ad.LacZ-Kontrolle transduziert oder nicht transduziert, für die angegebenen Zeitpunkte mit 5-FU (10 µm und 100 µm) behandelt und die spezifische Apoptoserate in einem DNA-Fragmentierungsassay nach Nicoletti bestimmt. Dargestellt sind die Mittelwerte ± S.E. aus drei unabhängigen Experimenten, die als Dreifachbestimmung durchgeführt wurden. IκB-α-SR exprimierende DLD-1 und HCT116 Zellen zeigten keine Veränderung der Apoptoserate im Vergleich zu den ß-Galaktosidase exprimierenden Kontrollzellen bzw. den nicht-transduzierten Zellen. Demnach hatte eine Inhibition der NF-κΒ-Aktivität keinen Einfluss auf die 5-FU-induzierte Apoptose in HCT116 und DLD-1 Zellen. In dem vorhergehenden Abschnitt der Doktorarbeit (III.1) wurde gezeigt, dass konstitutiv aktiviertes NF-κΒ zu dem TRAIL-resistenten Phänotyp in der Pankreaskarzinomzelllinie Panc-1 beiträgt, und dass eine Inhibition von NF-κΒ diese Zelllinie gegenüber TRAIL-induzierte Apoptose sensitiviert. Daher stellte sich die Frage, ob die Inhibition von NF-κΒ in Panc-1 Zellen ebenfalls die Sensitivität gegenüber 5-FU-induzierter Apoptose erhöht. Panc-1 Zellen sind nahezu resistent gegenüber 5-FU (Abb. 39). Interessanterweise konnten Panc-1 Zellen durch Inhibition von NF-κB gegenüber 5-FU sensitiviert werden: In IκB-α-SR exprimierenden Panc-1 Zellen war die Apoptoserate im Vergleich zu den LacZ transduzierten Kontrollzellen signifikant erhöht (Abb. 39). 86

95 III. Ergebnisse Abbildung 39 Einfluss der NF-κB Inhibition auf 5-FU-induzierte Apoptose in Panc-1 Zellen In dem DNA-Fragmentierungsassay nach Nicoletti zeigten IκB-α-SR exprimierende Panc- 1 Zellen eine dosisabhängige erhöhte Sensitivität gegenüber 5-FU im Vergleich zu den ß-Galaktosidase exprimierenden Kontrollzellen. Panc-1 Zellen wurden mit Ad.IκB-α-SR bzw. Ad.LacZ über Nacht in 2% Medium mit einer MOI von 300 transduziert. Am folgenden Morgen wurden die Zellen erneut 2 h in serumfreiem Medium transduziert. 8 h nach Mediumwechsel wurden die Zellen mit 5-FU in den angegebenen Konzentrationen behandelt. Dargestellt sind Mittelwert ± S.E. eines Experiments, das als Dreifachbestimmung durchgeführt wurde. NF-κB Inhibition hebt die 5-FU Resistenz in Panc-1 Zellen teilweise auf. Allerdings wurde nicht die 5-FU-induzierte NF-κB Aktivierung in Panc-1 Zellen adressiert. Da nicht untersucht wurde, ob 5-FU Behandlung zu einer NF-κB Induktion in Panc-1 Zellen führt, kann keine Aussage darüber getroffen werden, ob die Schutzfunktion durch konstitutiv aktiviertes NF-κB oder 5-FU-induziertes NF-κB vermittelt wird. Die Rolle von XIAP in 5-FU induzierter Apoptose wird in der Doktorarbeit von Frau Chirlei Bueneker adressiert. III Panc-1 LacZ IκB-SR Konzentration 5-FU [µm] Einfluss einer Aktivierung von NF-κΒ auf die 5-FU Sensitivität 5-FU Behandlung induzierte keine signifikante Aktivierung von NF-κB in den Kolorektalzelllinien HCT116 und DLD-1/HRT18. Im Einklang damit führte auch eine Inhibition der NF-κB Aktivität zu keiner Veränderung der 5-FU Sensitivität in diesen Zelllinien. Allerdings konnte in Panc-1 Zellen ein Einfluss von NF-κB auf die 5-FU Sensitivität gezeigt werden. Nun stellte sich die Frage, ob eine Aktivierung von NF-κB die Sensitivität gegenüber 5-FU-induzierter Apoptose in HCT116 und DLD-1 Zellen modulieren kann. NF-κB sollte durch TNF-α Behandlung induziert werden. In DLD-1 induziert TNF-α eine starke NF-κΒ Antwort die bis zu 16 h anhält und die Zellen vor TNF-α-induzierter Apoptose schützt (Vgl.Abschnitt III ). In HCT116 Zellen aktiviert TNF-α ebenfalls NF-κΒ (Daten nicht gezeigt), allerdings nur transient (Zwacka et al., 2000) und die Zellen sind gegenüber TNF-α induzierter Apoptose sensitiver. DLD-1 und HCT116 Zellen wurden für 4 h mit TNF-α (25 ng/ml) vorbehandelt und anschließend mit 5-FU (10 µm, 87

96 III. Ergebnisse 100 µm und 300 µm) behandelt. Die Apoptoserate wurde nach 24 h, 48 h und 72 h bestimmt (Abb. 40A ). Die Behandlung mit TNF-α alleine induzierte in DLD-1 Zellen keine signifikante Apoptoserate, in HCT116 Zellen induzierte TNF-α Apoptose nach 24 h im geringen Umfang. TNF-α und 5-FU in Kombination führte bei keiner der beiden Zelllinien zu keinem Zeitpunkt zu einer Verringerung der Apoptoserate im Vergleich zu den nur mit 5-FU behandelten Zellen. In HCT116 war die Apoptoserate sogar erhöht, was auf den additiven Effekt beider zytotoxischen Verbindungen zurückzuführen ist. Zusätzlich wurden DLD-1 und HCT116 Zellen mit einem p65 Expressionsplasmid transfeziert und die Apoptoserate 24 h, 48 h und 72 h nach 5-FU Behandlung bestimmt (Abb. 40B). Sowohl bei DLD-1 als auch bei HCT116 zeigten die p65 überexprimierenden Zellen keine signifikante Abnahme der Sensitivität gegenüber 5-FU im Vergleich zu den Kontrollzellen. Nach 24 h und 48 h war in den p65 transfezierten Zellen die Apoptoserate sogar erhöht. A B HCT t [h] HCT t [h] 5-FU 100 µm TNF-α /3 00 µm 5 -FU 300 µm 5-FU TN F-α /1 00 µm 5 -FU 100 µm 5-FU TNF-α /10 µm 5-FU 10 µm 5-FU TNF-α Medium Ktr. Transfektions Ktr. p65 Abbildung 40 Eine Aktivierung von NF-κB vermittelt keinen Schutz gegenüber 5-FU A) Durch TNF-α Vorbehandlung konnte die Sensitivität gegenüber 5-FU nicht reduziert werden. DLD-1 und HCT116 Zellen wurden 4 h mit TNF-α (25 ng/ml) und anschließend mit den angegeben Konzentrationen 5-FU behandelt. Nach 24 h, 48 h und 72 h wurde die spezifische Apoptoserate in einem DNA-Fragmentierungsassay nach Nicoletti bestimmt. Dargestellt sind Mittelwert ± S.E. dreier unabhängiger Experimente, die als Dreifachbestimmung durchgeführt wurden. B) Überexpression von p65 moduliert nicht die Sensitivität gegenüber 5-FU. DLD-1 und HCT116 Zellen wurden über Nacht mit einem (CMV)p65 Expressionsplasmid transfeziert, nur mit dem Transfektionsreagenz behandelt oder nicht behandelt. 24 h später wurde 5-FU (100 µm) zugegeben und die Apoptoserate nach 24 h, 48 h und 72 h im DNA-Fragmentierungsassay nach DLD t [h] DLD t [h] 5-FU 100 µm 88

97 III. Ergebnisse Nicoletti bestimmt. Kontrolltransfektion mit einem EGFP-exprimierenden Plasmid (EGFP-N1) zeigte eine Transfektionseffizienz von cirka 40%. Dargestellt sind die Mittelwert ± S.E. zweier unabhängiger Experimente, die als Zweifachbestimmung durchgeführt wurden. Die durchgeführten Versuche geben Hinweise darauf, dass durch NF-κB-Aktivität die 5-FU Sensitivität in den Kolorektalkarzinomzellinien HCT116 und DLD-1 nicht moduliert wird. Allerdings könnte die Zeitspanne zwischen TNF-α-vermittelte NF-κB Induktion und 5-FU-induzierter Apoptose (24 h 72 h) kritisch sein. Als weiterer kritischer Punkt kann angeführt werden, dass bei der Überexpression der p65 NF-κB Untereinheit zwar die Transfektionseffizienz überprüft wurde, allerdings nicht die NF-κB- Aktivität mittels EMSA oder Luziferase Assay, so dass zusammenfassend die Ergebnisse zwar darauf hindeuten, dass NF-κB in den untersuchten Zelllinien die 5-FU Sensitivität nicht beeinflusst, für eine abschließende Aussage bedarf es aber detaillierterer Versuche. In diesem Abschnitt der Doktorarbeit konnte zusammenfassend folgendes gezeigt werden. In den Kolorektalkarzinomzellinien HCT116 und DLD-1/HRT18 führte 5-FU Behandlung zu keiner signifikanten Induktion von NF-κB. Eine Inhibition von NF-κB führte zu keiner Sensitivierung gegenüber 5-FU in den Kolorektalkarzinomzelllinien HCT116 und DLD-1/HRT18, dies konnte sowohl für den Einfluss des 5-FU auf das Zellwachstum, als auch für 5-FU-induzierte Apoptose gezeigt werden. Eine durch durch TNF-α Vorbehandlung bzw. p65 Überexpression erzielte Aktivierung von NF-κB konnte die Sensitivität gegenüber 5-FU-induzierter Apoptose in den untersuchten Kolorektalkarzinomzelllinien nicht verändern, was darauf hindeutet, dass in diesen Zelllinien NF-κB keinen Einfluss auf die 5-FU Sensitivität hat. Auf der anderen Seite konnte in der Pankreaskarzinomzelllinie Panc-1, welche gegenüber 5-FU resistent ist, die 5-FU Resistenz durch Inhibition der NF-κB-Aktivität teilweise aufgehoben werden. Noch zu untersuchen bleibt, ob der NF-κB-vermittelte Schutz in der Panc-1 Zellen allein auf konstitutiv aktiviertes NF-κB zurückzuführen ist oder ob 5-FU Behandlung ebenfalls zu einer Induktion von NF-κB führt. 89

98 III. Ergebnisse III.3 Untersuchung des Zusammenhangs zwischen TRAIL Sensitivität und Expression der TRAIL Rezeptoren In Abschnitt III.1 wurde der Einfluss einer TRAIL-induzierten NF-κB Aktivierung auf die TRAIL Sensitivität untersucht. Die Aktivierung von NF-κB und die des apoptotischen Signalweges wird durch TRAIL Rezeptor (TRAILR oder TR)1 und TR2 vermittelt. In Primaten sind drei weitere TRAIL-spezifische Rezeptoren beschrieben, an die TRAIL spezifisch bindet: TR3, TR4 und das, in gelöster Form vorliegende, Osteoprotegerin (OPG). Die Bedeutung von OPG für das TRAIL System ist allerdings noch umstritten, da sein primärer Ligand RANKL ist und OPG TRAIL im Vergleich zu den anderen Rezeptoren mit geringerer Affinität bindet (Elbashir et al., 2001). Die Bedeutung der Komplexität des TRAIL Systems mit vier TRAIL-spezifischen membranständigen Rezeptoren ist noch nicht aufgeklärt. Es ist allerdings naheliegend, dass die Expression der Rezeptoren Einfluss auf die TRAIL Sensitivität hat, besonders im Hinblick darauf, dass die Rezeptoren unterschiedliche Funktion erfüllen: TR1 und TR2 sind als Zelltodinduzierende Rezeptoren beschrieben, da sie eine funktionelle C-terminale intrazelluläre Todesdomäne besitzen, welche die Caspase Aktivierung und dadurch das apoptotische Signal vermittelt. TR3 und TR4 hingegen wurden als Zelltod-inhibierende Rezeptoren beschrieben, da sie kein Zelltodsignal übermitteln können. TR3 besitzt keine zytoplasmatische Domäne und ist über ein Glycophospholipid an der Zelloberfläche verankert. TR4 besitzt eine stark verkürzte zytoplasmatische Todesdomäne, welche keinen Zelltod-induzierenden Komplex ausbilden kann, eventuell aber eine schwache NF-κB Aktivierung induzieren kann (Degli-Esposti et al., 1997a). Es wurde angenommen, dass TR3 und TR4 mit den Todesrezeptoren um die Bindung von TRAIL konkurrieren und Zellen vor TRAIL-induzierter Apoptose schützen können (Degli-Esposti et al., 1997a; Sheridan et al., 1997; Pan et al., 1997; Walczak et al., 1999), sie werden daher auch geläufig als Decoy Rezeptoren bezeichnet. Die Resistenz normaler Zellen gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose wurde auf die Expression der Decoy Rezeptoren zurückgeführt, welche, wie zunächst angenommen wurde, den Krebszellen abhanden gekommen ist (Sheridan et al., 1997; Pan et al., 1997; MacFarlane et al., 1997; van Noesel et al., 2002). Allerdings konnte später auch in Krebszellen die Expression von Decoy Rezeptoren nachgewiesen werden. Der genaue Mechanismus der TRAIL Resistenz normaler Zellen, sowie die genaue Funktion und Bedeutung der Decoy Rezeptoren bleibt ungeklärt. Ebenso ungeklärt ist die einzelne Bedeutung der beiden Apoptose- 90

99 III. Ergebnisse induzierenden Rezeptoren TR1 und TR2. Hinweise auf eine dominierende Rolle bei der Vermittlung der Apoptose gibt es sowohl für TR1 als auch TR2. In diesem Abschnitt der Doktorarbeit sollte die Bedeutung der Expression der TRAIL Rezeptoren für die TRAIL Sensitivität in Krebszelllinien untersucht werden und in normalen Zellen, am Beispiel humaner Fibroblasten der Haut (Vgl. III.1.1). III.3.1 Untersuchung der Expression der TRAIL Rezeptoren in verschiedenen Krebszelllinien Es ist nicht vollständig geklärt, inwieweit die Expression der TRAIL Rezeptoren ein Mechanismus darstellt, durch welchen Krebszellen im Rahmen der malignen Progression Resistenz gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose erwerben. Die folgenden Untersuchungen sollten nun zeigen, ob in Krebszelllinien eine Korrelation zwischen der Expression der einzelnen TRAIL Rezeptoren und der Sensitivität gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose besteht. Es wurden humane Krebszelllinien verschiedenen Ursprungs mit unterschiedlicher Sensitivität gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose untersucht: DLD-1, HCT116, Caco-2 (Kolorektalkarzinoma), A549 (Lungenkarzinom), Caki-2 (Nierenkarzinom), HeLa (Gebärmutterkarzinom), und Hek293 (transformierte embryonale Nierenzelllinie). Bisherige Untersuchungen der TRAIL Rezeptorexpression waren meistens auf die Proteinexpression oder die mrna/transkription beschränkt. Hier wurde die Expression der TRAIL Rezeptoren sowohl auf der Ebene der mrna Transkription als auch auf der Ebene der Proteinexpression an der Zelloberfläche untersucht. Über den Nachweis der Rezeptoren an der Zelloberfläche kann die funktionelle Expression der TRAIL Rezeptoren bestimmt werden, die entscheidend ist um einen Zusammenhang mit der TRAIL Sensitivität zu untersuchen. Eine Analyse der mrna Transkription zusammen mit der Proteinoberflächenexpression ermöglicht einen Vergleich beider Methoden. Mit Tumormaterial von Patienten ist eine Expressionsanalyse anhand von mrna einfacher durchführbar als eine Analyse der Oberflächenproteinexpression. Daher ist es wichtig die Aussagefähigkeit eines mrna Expressionsprofils im Vergleich zu der Oberflächenproteinexpression bzw. letztendlich im Bezug auf die TRAIL Sensitivität zu bewerten. Zusätzlich gibt der Vergleich der Genexpression mit der Proteinexpression Hinweise, auf welcher Ebene die Rezeptorexpression reguliert wird. 91

100 P Zellen III. Ergebnisse III Expression der TRAIL Rezeptoren an der Zelloberfläche Die Expression der TRAIL Rezeptoren auf der Zelloberfläche wurde mittels spezifischer Antikörper gegen die einzelnen Rezeptoren bestimmt. Ein Set mit Antikörper, die jeweils spezifisch den nativen Rezeptor erkennen, wurde von der Firma Alexis erworben. Der Zweitantikörper war mit dem Fluoreszenzfarbstoff Phycoerythrin konjungiert. Die relative Fluoreszenzintensität nach Inkubation mit dem jeweiligen Antikörper wurde im Durchflußzytometer analysiert. Abbildung 41A zeigt repräsentative FACS Histogramme von DLD-1 Zellen. Anhand des Oberflächenproteinexpressionsprofil der TRAIL Rezeptoren (Abb. 41B) wurde die Beziehung zwischen der Rezeptorexpression und der TRAIL Sensitivität (Abb. 41C) der Zelllinien untersucht. A DLD-1 TR1 TR2 TR3 TR4 B Fluoreszensintensität TR1 TR2 TR3 TR4 Oberflächenprotein Fluoreszensintensität C Fluoreszensintensität TRAIL 2ng TRAIL 5ng TRAIL 10ng Fluoreszensintensität TRAIL Sensitivität Abbildung 41 Relative Oberflächenexpression der TRAIL Rezeptoren in verschiedenen Krebszelllinien A) FACS Histogramme der Immunofärbung gegen die TRAIL Rezeptoren TR1, TR2, TR3 und 6 TR4 in DLD-1 Zellen. Je 1x10P wurden zuerst mit 10 µg/ml des spezifischen Antikörper gegen den Rezeptor (dunkles Histogramm) oder mit 10 µg/ml eines unspezifischen Mausantikörpers (weißes Histogramm) und anschließend mit einem FITC gekoppelten Zweitantikörper inkubiert. Die relative Fluoreszenzintensität (FI) wurde im FACS gemessen. Subtraktion der unspezifischen FI (unspezifischer Antikörper und Zweitantikörper) von der Gesamt-FI ergab die FI des spezifischen Antikörpers. B) Die relative Oberflächenexpression der TRAIL Rezeptoren in verschiedenen Krebszelllinien. Dargestellt ist die FI für den spezifischen Antikörper nach Subtraktion der unspezifischen FI. Die Zelllinien sind bezüglich ihrer steigenden TRAIL Sensitivität von links nach rechts gezeigt. C) TRAIL Sensitivität der untersuchten Zelllinien. Die Zellen wurden 24 h mit den angegeben Konzentrationen TRAIL stimuliert und die spezifische Apoptoserate in einem 92

101 III. Ergebnisse DNA-Fragmentierungsassay nach Nicoletti bestimmt. Dargestellt sind jeweils die Mittelwerte ± S.E. aus mindestens drei unabhängigen Experimenten (B,C). Es ist deutlich zu erkennen, dass eine Korrelation zwischen der Expression der Apoptose-induzierenden Rezeptoren TR1 und TR2 und der TRAIL Sensitivität besteht. Tendenziell geht eine steigende Sensitivität gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose mit einer steigenden Expression der Rezeptoren TR1 und TR2 einher. Allerdings scheint der Rezeptor TR1 mit dem Anstieg der Sensitivität gegenüber TRAIL besser zu korrelieren als TR2, dies gilt zumindest für A549 und Hek293 Zellen. A549 Zellen sind nahezu TRAIL-resistent, Hek293 Zellen zeigen bei niedriger TRAIL Konzentration eine mittlere Sensitivität, allerdings lässt sich mit höheren TRAIL Konzentrationen der Anteil apoptotischer Zellen nur gering steigern. Dennoch zeigen beide Zelllinien eine relativ hohe Expression des TR2, die vergleichbar ist mit der TR2 Expression in HCT116 Zellen und über der in HeLa Zellen liegt, obgleich HCT116 und HeLa Zellen deutlich sensitiver gegenüber TRAIL sind. Die Expression des TR1 hingegen ist in A549 und Hek293 Zellen deutlich geringer als in HCT116 und HeLa Zellen. Um die Signifikanz der einzelnen Rezeptoren für die TRAIL Sensitivität in den hier untersuchten Krebszelllinien besser zu erkennen, wurde eine Regressionsanalyse des Verhältnisses zwischen TRAIL-induzierter Apoptose und der Expression der Rezeptoren durchgeführt. Die Regressionskoeffizienten der Korrelation zwischen Rezeptorexpression und TRAIL-induzierter Apoptose nach Stimulation mit 2 ng/ml, 5 ng/ml und 10 ng/ml sind in Tabelle 5 angegeben. In Abbildung 42 sind einige graphische Beispiele der Regressionsanalyse dargestellt. Es wurde die Expression der einzelnen Apoptose-induzierenden Rezeptoren, deren Summe bzw. die Expression der Apoptose-induzierenden Rezeptoren in Relation zu der Expression der Decoy Rezeptoren TR3 und TR4 in unterschiedlicher Kombination betrachtet. TRAIL Tabelle 4A TRAIL Rezeptor 2ng/ml 5ng/ml 10ng/ml Mittel Regressionskoeffizienten der Regressionsanalyse des TRAIL-R Verhältnisses zwischen TRAIL-R TRAIL-induzierter Apoptose TRAIL-R und der Expression der TRAIL-R Rezeptoren. TRAIL-R1+TRAIL-R Regressionskoeffizienten aus TRAIL-R3+TRAIL-R der Regressionsanalyse des Verhältnisses zwischen Tabelle 5A *1= TRAIL-R1; 2=TRAIL-R2 TRAIL-induzierter Apoptose (24 h Stimulation mit den angegebenen Konzentrationen) und der Expression der Rezeptoren anhand der mittleren relativen FI. A) Die Korrelation zwischen TRAIL Sensitivität und der Expression der Apoptose-induzierenden Rezeptoren TR1 und TR2 bzw. deren Summe. Tab. 5B, Seite folgt 93

102 III. Ergebnisse TRAIL Regressionskoeffizienten der TRAIL Rezeptor 2ng/ml 5ng/ml 10ng/ml Mittel Regressionsanalyse des TRAIL-R1 / Verhältnisses zwischen TRAIL-R3+TRAIL-R4 TRAIL-induzierter Apoptose und der Expression der TRAIL-R2 / Rezeptoren TRAIL-R3+TRAIL-R4 B) Gezeigt ist die Korrelation TRAIL-R1+TRAIL-R2/ , zwischen TRAIL Sensitivität TRAIL-R3+TRAIL-R4 und dem Verhältnis der Tabelle Tab. 5B *1=TRAIL-R1; 2=TRAIL-R2; 3=TRAIL-R3; 4=TRAIL-R4 Expression der Apopotoseinduzierenden Rezeptoren zu den Decoy Rezeptoren in der angegeben Kombinationen. Tabelle 5B A D R 2 =0.939 HeLa Hek293 Panc-1 A549 Caco-2 HCT116 DLD-1 Caki TRAIL-R1 Expression (F.I.) R 2 =0.941 Caki-2 DLD-1 TRAIL-R1/ TRAIL-R3 +TRAIL-R4 Expression (F.I.) B E 80 R 2 =0.824 C 70 DLD-1 70 DLD-1 60 Caki Ca ki-2 40 HeLa HCT HeLa HCT Hek Hek293 Panc-1 Panc-1 10 A A549 Caco-2 Caco TRAIL-R2 Expression (F.I.) R 2 =0.561 Caki-2 DLD HCT116 HCT Hek293 HeLa 30 HeLa Hek Panc-1 Panc-1 A A549 Ca co-2 Ca co TRAIL-R2/ TRAIL-R3 +TRAIL-R3 Expression (F.I.) 80 F R 2 =0.920 R 2 =0.938 TRAIL-R1 +TRAIL-R2 Expression (F.I.) Caki-2 DL D-1 40 HeLa HCT Hek Panc-1 A549 Caco TRAIL-R1+TRAIL-R2/ TRAIL-R3+TRAIL-R4 Expression (F.I.) Abbildung 42 Regressionsanalyse des Verhältnisses zwischen TRAIL-induzierter Apoptose und der Expression der Rezeptoren. Dargestellt ist die spezifische Apoptoserate (nach 24 h Stimulation mit 5ng /ml TRAIL) gegen die Expression der Rezeptoren. Die Regressionsanalyse bestätigte, dass eine hohe Korrelation zwischen der Expression der Apoptose-induzierenden Rezeptoren TR1 und TR2 und der TRAIL Sensitivität besteht. Eine höhere Korrelation des TR1 im Vergleich zu TR2 mit der TRAIL Sensitivität war zum großen Teil auf die Zelllinien A549 und Hek293 zurückzuführen, da ohne diese beiden Zelllinien der Korrelationskoeffizient für TR2 deutlich höher lag (Daten nicht gezeigt). Interessanterweise zeigte sich, dass das Verhältnis der Expression von TR1 bzw. TR1 und TR2 zusammen zu der Summe der Decoy Rezeptoren (TR3 und TR4) am besten mit der TRAIL Sensitivität korreliert (Tab. 5B 1. und 3. Spalte von links, Abb. 42D 94

103 III. Ergebnisse und E). Die Regressionsanalyse zeigte auch, dass die Expression des inhibitorischen TR4 die TRAIL Sensitivität stärker zu bestimmen scheint als die Expression des TR3. III Genexpression der TRAIL Rezeptoren in verschiedenen Krebszelllinien Die Analyse Genexpression anhand der relativen mrna Transkription wurde mittels Real-Time PCR im Lightcycler (Roche) durchgeführt. Die Suche nach geeigneten Primersequenzen erfolgte mit Hilfe des Programms GeneFisher ( die humane cdna Sequenz der Zielgene wurde Ensembl ( entnommen. Durch ein Blast Screening ( wurde die Spezifität der Primersequenzen geprüft. Für die Zielgene wurden jeweils drei bis vier Primerpaare getestet. Primerpaare die unspezifische Produkte bzw. Primerdimere bildeten wurden verworfen. Unter den verbleibenden Primerpaaren wurden diese gewählt deren PCR Produkte ähnliche Schmelzpunkte bei der Schmelzpunktanalyse zeigten (Abb. 43) TR1 82,3 o C TR2 84,3 o C TR3 86,7 o C TR4 87,4 o C PBGD 86,8 o C Abbildung 43 Schmelzkurven und Tm Werte der Produkte der verwendeten Primerpaare in der Lightcycler Software. Die Proben wurden zunächst gegen GAPDH (Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase) und PBGD (Porphobilinogen Deaminase) normalisiert, sogenannte Housekeeping Gene, die an der Erfüllung einer Grundfunktion der Zelle beteiligt sind und daher konstitutiv und ubiquitär in annähernd gleicher Menge exprimiert sind. Später und für die Auswertung wurden die Proben nur gegen PBGD normiert, da die Expression der 95