Untersuchungen zu Aufnahme, Metabolismus und Pharmakokinetik von modifizierten Nukleosiden als Therapeutika von HIV-Infektion und Tumorerkrankungen Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fachbereiche der Georg-August-Universität zu Göttingen vorgelegt von Nicole Frijus-Plessen aus Bremerhaven Göttingen 12
INHALTSVERZEICHNIS Seite THEORETISCHER TEIL 1 1. Einleitung 1 1.1. Entstehung der Immunschwächekrankheit AIDS 1 1.2. Prinzipien der Anti-HIV-Therapie 3 1.3. Modifizierte Nukleoside als Anti-HIV-Therapeutika 7 1.4. Prinzipien der Chemotherapie maligner Tumoren 11 1.5. Modifizierte Pyrimidine als Zytostatika 14 1.6. Zelluläre Aufnahme von Nukleosiden 16 1.7. Metabolismus von modifizierten Pyrimidinen 18 1.8. Ansätze zur Verbesserung der Wirksamkeit von modifizierten Pyrimidinen 24 2. Aufgabenstellung 28 3. HPLC-Methode zur Quantifizierung von AZT (5), ddc (1) und FT (6) in komplexen ZeilSystemen 30 4. Pharmakokinetische Untersuchungen an isoliert perfundierten Organen der Ratte 33 4.1. Pharmakokinetik von AZT (5), ddc (1) und FT (6) in der isoliert perfundierten Rattenleber 35 4.2. Pharmakokinetik von AZT (5) in der isoliert perfundierten Rattenlunge 40 5. Elimination potentieller Anti-HIV-wirksamer Substanzen in isolierten Zellen 42
II 5.1. Inkubation von isolierten Rattenhepatozyten 46 5.1.1. Inkubation von isolierten Rattenhepatozyten mit FT (6) 46 5.1.2. Inkubation von isolierten Rattenhepatozyten mit ddc (1) 48 5.1.3. Inkubation von isolierten Rattenhepatozyten mit AZT (5) 49 5.1.4. Vergleich der Rattenhepatozyteninkubationen von FT (6), ddc (1) und AZT (5) 52 5.2. Inkubation von Kupffer'schen Sternzellen der Ratte mit AZT (5) 52 5.3. Inkubation von humanen peripheren Lymphozyten 54 5.3.1. Inkubationen von humanen peripheren Lymphozyten mit FT (6) 54 5.3.2. Inkubation von humanen peripheren Lymphozyten mit ddc (1) 58 5.3.3. Inkubation von humanen peripheren Lymphozyten mit AZT (5) 59 5.3.4. Vergleich der Inkubationen von humanen peripheren Lymphozyten mit FT (6), ddc (1) und AZT (5) 62 5.4. Inkubation von humanen Granulozyten mit AZT (5) 64 6. Modulation der Elimination des Zytostatikums 5- Fluor-2'-desoxyuridin (FUDR, 8) in isolierten Zellen 65 6.1. Synthese von Enzyminhibitoren 66 6.2. Inkubation von isolierten Rattenhepatozyten mit FUDR (8) und Enzyminhibitoren 70 6.3. Inkubationen von Novikoff-Hepatom-Zellen der Ratte mit FUDR (8) und Enzyminhibitoren 73
III 7. Diskussion 81 7.1. HPLC-Methode zur Detektion von modifizierten Nukleosiden in verschiedenen, komplexen Zellsystemen 81 7.2. Pharmakokinetik von modifizierten Nukleosiden in Rattenleber und -lunge 83 7.3. Aufnahme und Metabolismus von AZT (5), FT (6) und ddc (1) in unterschiedlichen Zellsystemen 86 7.4. Modulation des Metabolismus des Zytostatikums FUDR 3. (8) mit Hilfe von Enzyminhibitoren Zusammenfassung 92 96 EXPERIMENTELLER TEIL 1. 1.1. 1.2. 1.3. 1.4. 1.5. 1.6. 1.7. 1.8. 1.9. 1.10. 1.11. 1.12 Allgemeine Angaben Schmelzpunkte Spektren Dünnschichtchromatographie (DC, TLC) Säulenchromatographie Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) Radioaktivitätsmessungen Zentrifugen Geräte für die Perfusion Lösungsmittel Chemikalien Zellkultur Versuchstiere 100 100 100 101 101 102
IV 2. Methoden 103 2.1. Lösungen, Puffer und Nährmedien 103 2.1.1. Zur HepatozytenIsolierung 103 2.1.2. Zur Kupfferzellisolierung 104 2.1.3. Zur Lymphozytenisolierung 106 2.1.4. Zur Granulozytenisolierung 106 2.1.5. Zur Perfusion 107 2.2. Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung von Zellen 108 2.2.1. Isolierung von Rattenhepatozyten 108 2.2.2. Isolierung und Kultivierung von Kupffer'schen Sternzellen der Ratte 109 2.2.3. Isolierung und Kultivierung von menschlichen Lymphozyten 110 2.2.4. Isolierung von menschlichen Granulozyten 110 2.2.5. Isolierung von Novikoff-Hepatom-Zellen der Ratte 111 2.2.6. Zellzählung und Bestimmung der Vitalität der Zellen 111 2.2.7. Bestimmung von Zellvolumina 112 2.2.8. Färbemethoden 113 2.3. Inkubation und Aufarbeitung von Zellen 113 2.3.1. Inkubationsversuche 113 2.3.2. Durchführung der Inkubationen 115 2.3.3. Zellaufschluß und Proteinfällung 116 2.4. Präparation und Perfusion der isolierten Rattenleber 117 2.4.1. Präparation der isolierten Rattenleber 117 2.4.2. Perfusion der isolierten Rattenleber 117 2.5. Präparation und Perfusion der isolierten Rattenlunge 118 2.5.1. Präparation der isolierten Rattenlunge 118
2.5.2. Perfusion der Rattenlunge 118 2.6. Analytik 119 2.6.1. Probenvorbehandlung 119 2.6.2. AZT (5)-, FT (6)- und ddc (l)-analytik mittels HPLC 119 2.6.3. FUDR (8)- und FU (7)-Analytik mittels HPLC 120 2.6.4. DC-Analytik von AZT (5) und seinen Metaboliten 120 2.6.5. DC-Analytik von FUDR (8) und seinen Metaboliten 121 2.6.6. ß-Glucuronidase- und Arylsulfatase-Inkubation 121 2.7. Synthesen 122 2.7.1. Synthese von 5-Benzyluracil (BU, 21) 122 2.7.2. Synthese von 5-Benzyl-l-[(2'-hydroxyethoxy)methyl] uracil (BAU, 22) 123 2.7.3. Synthese von 5-Benzyl-l-[(l',3'-dihydroxy-2'- propoxy)methyl]uracil (HMBAU, 24) 126 2.7.4. Synthese von 5-Benzyl-l-[(r,3'-diazido-2'- propoxy)methyl]uracil (HMBAUAz, 41) 128 Literaturverzeichnis 130