NF-κB = Nuclear Factor kappab 1. Transkriptionsfaktor 2. weitgehend ubiquitär exprimiert 3. durch eine Vielzahl von unterschiedlichen Stimuli induzierbar 4. zentrale Rolle bei der Entstehung und Aufrechterhaltung von Entzündungsreaktionen
Allgemeine zelluläre Prozesse, die durch NF-κB gesteuert werden 1. Dorsal-Ventral Entwicklung in Drosophila 2. Aktivierung von Immunzellen 3. Entwicklung und Proliferation von B- und T-Zellen 4. Steuerung der Immunantwort gegen Viren und Bakterien 5. Multiple Antworten einer Zelle auf Stress 6. Kontrolle von Apoptose (v.a. Anti-Apoptose) 7. Embryonalentwicklung im Säuger?
Funktion eines Transkriptionsfaktors Aktivierungsdomän DNA- Bindedomän e e RNA- Polymerase Genexpression Erkennungssequenz Promoto r
Aktivierung des NF-κB Systems nach: Baeuerle PA and Baltimore D, Cell 87, 13-20,1996
Einzelne molekulare Komponenten des NF-κB Systems nach: Karin M and Ben-Neriah Y,Annu. Rev. Immunol., 18, 621-663,2000
Verschiedene NF-κB Dimere nach: Perkins ND, Trends Biochem. Sci., 25, 434-440,2000
Beispiele von Homo- und Heterodimerbildung von NF-κB Untereinheiten Transaktivierend: p50/p65: sehr abundant, DER induzierbare NF-κB Komplex p50/c-rel: konstitutiv exprimiert in B-Zellen p52/p65 p65/c-rel Repressoren der Transkription: (p50)2: konstitutiv z.b. in T-Zellen (p52)2: konstitutiv z.b. in Makrophagen
Phänotypen von NF-κB/Rel/IκB transgenen und knockout Mäusen nach: Baeuerle PA and Baltimore D, Cell 87, 13-20,1996
NF-κB-aktivierende Faktoren Bakterielle Produkte Viren Virale Produkte Eukaryonte Parasiten Zytokine T-Zellmitogene B-Zellmitogene LPS, TSST1, Muramylpeptide HIV, HTLV-1, HBV, HSV-1, EBV, HHV6, Adenovirus dsrna, Tax (HTLV-1), HBx, HBs, EBNA-2, LMP Theileria parva TNF, LTβ, IL-1, IL-2, LIF, LT-B4 Antigen, PHA, Kalzium-Ionophore, α-cd3, α-cd2, α-cd28 α -Oberflächen IgM Stress UV, γ-strahlung, H 2 O 2 Pharmazeutika Phorbolester, ocadaic acid
IκB-Poteine und Verwandte Serin-Phosphorylierungsstellen nach: Karin M, J. Biol. Chem. 274, 27339-27342,1999
Aktivierung des NF-κB System (etwas detaillierter) nach: Karin M and Ben-Neriah Y,Annu. Rev. Immunol., 18, 621-663,2000
Der IκB-Kinase-Komplex }aktivierende Phosphorylierung (Serin) } inhibierende Autophosphorylierung regulatorische Untereinheit nach: Karin M and Ben-Neriah Y,Annu. Rev. Immunol., 18, 621-663,2000
Ubiquitinierung von IκB nach: Karin M and Ben-Neriah Y,Annu. Rev. Immunol., 18, 621-663,2000
Aktivierung des IKK-Komplexes Verschiedene aktivierende Kinasen werden durch unterschiedliche Stimuli aktiviert nach: Perkins ND, Trends Biochem. Sci., 25, 434-440,2000
Aktivierung des IKK-Komplexes durch TNF TNF TNF-R55 TRADD TRAF-2 RIP RIP NIK, MEKK1, Akt/ PKB, ASK1, T2 K??? IKK-Komplex
Toll-like Rezeptoren (Rezeptoren zur Erkennung von Mikroorganismen) nach: Akira S, Takeda K, and Kaisho T, Nature Immunol., 2, 675-680,2001
Aktivierung des IKK-Komplexes durch TLRs nach: Akira S, Takeda K, and Kaisho T, Nature Immunol., 2, 675-680,2001
Aktivierung des IKK-Komplexes durch TLR4 nach: Akira S, Takeda K, and Kaisho T, Nature Immunol., 2, 675-680,2001
Aktivierung des IKK-Komplexes durch den TCR nach: Wallach D, Nature Immunol., 3,803-803, 2002
IKK aktiviert NF-κB über zwei unterschiedliche Wege nach: Karin M and Anning L,Nature Immunol., 3, 221-227,2002
Aktivierung von NF-κB Transaktivierende Funktion von NF-κB wird unterschiedliche Modifikationen verändert nach: Baeuerle PA and Baltimore D, Cell 87, 13-20,1996
Regulation der transaktivierenden Funktion von NF-κB durch Phosphorylierung nach: Ghosh, S and Karin M, Cell 109, S81-S96, 2002
NF-κB Zielgene Viren Immunrezeptoren Zelladhäsionsmoleküle Zytokine Wachstumsfaktoren Akut-Phase Proteine Transkriptionsfaktoren anti-apoptose Proteine Sonstige HIV, HCMV, Adenoviren, SV40 Ig κ light chain, TCR α und β-ketten, versch. MHC-Gene, β 2 -Mikroglobulin, Invariante Kette ELAM-1 (endothelial leukocyte adhesion molecule), VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule), ICAM-1 (intercellular cell adhesion molecule) TNF, LT-β, IL-2, IL-6, IL-8, IFN-β GM-CSF, G-CSF, M-CSF, Angiotensinogen, Komplementfaktoren c-rel, p105, IκB-α, c-myc, IRF-1 (interferon regulatory factor) IAPs, TRAFs, A20, c-flip inos, Vimentin
NF-κB induziert Faktoren, welche die TNFinduzierte Apoptose blockieren nach: Karin M and Anning L,Nature Immunol., 3, 221-227,2002
EMSA (electrophoretic mobility shift assay) = bandshift assay 1. Radioaktive Markierung eines NF-κB-spezifischen Oligonukleotids: NF- κb Bindestell e 5` 3` + 32 P- γ-atp und Polynukleotid-Kinas e 5` * P NF- κb Bindestell e 3` 2. Annealing mit einem unmarkierten Gegenstrang-Oligonukleotid: 5` * P NF- κb Bindestell e 3` + NF-κB Bindestelle 5` 3` Kochen und langsam kalt werden lasse n 5` * P NF- κb Bindestell e 3` NF-κB Bindestelle 5` 3` 3. Präparation eines Kernextraktes aus unstimulierten oder stimulierten Zellen 4. Bindung von nukleärem NF-κB an das radioaktiv markierte Oligonukleotid: 1. Absättigung von unspezifisch an DNA bindenden Proteinen mit poly-di/dc 2. Spezifische Bindung 5. Natives Polyacrylamid-Gel: 1 2 3 4 5 6 1: ohne Kernextrakt 2: unstimulierte Zellen 3: TNF 4: Serum 5: TNF mir Kompetitor 6: TNF mit unspez. Kompetitor Oligonukleotid mit gebundenem p50/p65-heterodime r freies Oligonukleoti d
Messung der NF-κB Aktivität indirekt über Abbau/Phosphorylierung von IκB 1. Zellen mit gewünschtem Stimulus behandeln 2. Gesamt-Lysate herstellen (Detergens-Lyse, Debris abzentrifugieren) 3. Lysate mittels SDS-PAGE auftrennen, blotten und mit spezifischen anti-iκb bzw. anti-phospho-iκb Antikörpern färben 4. Ergebnis: 1 2 3 4 5 6 1: unbehandelte Zellen 2: 1 Min. TNF IκB IκB Phospho-IκB 3: 5 Min. TNF 4: 10 Min. TNF 5: 30 Min. TNF 6: 120 Min. TNF
Messung der NF-κB Aktivität über Reportergen-Konstrukte 1. Zellen mit Reportergen-Konstrukten transfizieren 2. Gesamt-Lysate herstellen (Detergens-Lyse, Debris abzentrifugieren) 3. Menge des Reportergen-Produktes ermitteln (CAT-assay, Luciferase assay, β-galaktosidase assay, etc.) 4. Beispielhaftes Ergebnis: RLU untransfizierte Zellen 445 unstimulierte Zellen 25670 20 Min. TNF 55788 2 Std. TNF 127590 4 Std. TNF 155400 8 Std. TNF 87339 24 Std. TNF 30893 2 Std. Serum 22386
Regulationsmechanismen nach: Perkins ND, Trends Biochem. Sci., 25, 434-440,2000
Mögliche Effekte einer NF-κB Fehlregulation nach: Perkins ND, Trends Biochem. Sci., 25, 434-440,2000
nach: Perkins ND, Trends Biochem. Sci., 25, 434-440,2000
Entzündliche Erkrankungen, die mit erhöhter NF-κB Aktivierung einhergehen
Mögliche therapeutische Strategien zur NF-κB Inhibition
Strategien zur NF-κB Inhibition nach: Perkins ND, Trends Biochem. Sci., 25, 434-440,2000