Methoden der Gentechnik *** DNA-Rekombination und Klonierung *** 1. Allgemeine Grundprinzipien 1.1. Wesen der Gentechnik 1.2. Allgemeine Ziele der Gentechnik 1.3. Molekulare Voraussetzungen 1.4. Wichtige Begriffe aus der Gentechnik 2. Überblick über Teilschritte und Methoden 2.1. Gemeinsame Teilschritte vieler gentechnischer Experimente 2.2. Gewinnung des genetischen Ausgangsmaterials 2.3. DNA-Rekombinationstechnik 2.4. Einbringen von fremder DNA in Wirtszellen 2.5. Klonierung 2.6. Selektion 2.7. Expression 2.8. Spezielle Techniken und Methoden
3. Klonierungsvektoren 3.1. Plasmide 3.1.1. Grundlegende Merkmale 3.1.2. Größe und Kopienzahl 3.1.3. Konjugation und Kompatibilität 3.1.4. Klassifikation 3.1.5. Genkarten wichtiger Plasmide 3.2. Bakteriophagen 3.2.1. Eigenschaften 3.2.2. Lysogene Phagen 3.2.3. Lambda- und M13-Phagen 3.2.4. Cosmide 3.3. Klonierungsvektoren für andere Organismen als E.coli 3.3.1. Überblick 3.3.2. Künstliche Hefechromosomen (YAC) 3.3.3. Ti-Plasmid 4. Isolierung und Reinigung von DNA und RNA aus Zellen 4.1. Grundsätzliche Probleme und Teilschritte 4.2. Gesamt-DNA 4.2.1. Bakterienzucht und -ernte 4.2.2. Zellaufschluß und Gewinnung des Zellextraktes 4.2.3. Reinigung der DNA aus dem Zellextrakt 4.2.4. Anreicherung und Konzentrationsbestimmung der DNA 4.2.4. Gesamt-DNA aus anderen Organismen als Bakterien 4.3. Plasmid-DNA 4.3.1. Grundproblem der Plasmidisolierung 4.3.2. Trennung nach der Molekülgröße 4.3.3. Trennung nach der Konformation 4.3.4. Plasmidamplifikation 4.4. Bakteriophagen-DNA 4.4.1. Spezielle Probleme der Phagenkultivierung 4.4.2. Ernte der Phagenkultur und DNA-Reinigung aus λ-phagen 4.4.3. Präparation der DNA aus M13-Phagen
4.5. Gewinnung von RNA 4.5.1. Strategien zur RNA-Isolierung 4.5.2. Inhibierung der RNase-Aktivität 5. Enzyme zur DNA-Manipulation 5.1. Überblick über wichtige Enzymklassen 5.1.1. Nucleasen 5.1.2. Ligasen 5.1.3. Polymerasen 5.1.4. Modifikationsenzyme 5.2. Restriktionsendonucleasen 5.2.1. Bedeutung und Vorkommen 5.2.2. Einteilung 5.2.3. Wirkungsweise 5.2.4. Durchführung einer Restriktionsspaltung 5.2.5. Analyse der Restriktionsprodukte 5.3. Ligasen 5.3.1. Wirkungsweise 5.3.2. Probleme der Ligation 5.3.3. Linker, Adaptoren und tailing 6. Einschleusen von DNA in lebende Zellen 6.1. Ziele der Klonierung 6.2. Transformation von Bakterienzellen mit Plasmid-DNA 6.2.1. Herstellung kompetenter Zellen 6.2.2. Selektion transformierter Zellen 6.2.3. Selektion der Rekombinanten 6.2.3.1. Inaktivierung eines Antibiotika-Markers 6.2.3.2. Inaktivierung eines Nicht-Antibiotika-Markers 6.3. Transfektion von Bakterienzellen mit Phagen-DNA 6.3.1. Transfektion und in-vitro-verpackung 6.3.2. Selektion der infizierten Zellen 6.3.3. Selektion rekombinanter Phagen
6.4. Einschleusen von DNA in eukaryotische Zellen 6.4.1. Transformation/Transfektion einzelner Zellen 6.4.2. Transformation/Transfektion ganzer Organismen 7. Selektion von Klonen eines speziellen Gens 7.1. Das Problem der spezifischen Selektion 7.2. Selektionsprinzipien 7.2.1. Direkte Selektion und marker rescue -Verfahren 7.2.2. Selektion aus Genbibliotheken 7.3. Klon-Suche in Genbibliotheken 7.3.1. Arten von Genbibliotheken 7.3.1.1. Genomische Bibliothek 7.3.1.2. cdna-bibliothek 7.3.2. Methoden zur Klon-Identifizierung 7.3.2.1. Nucleinsäure-Hybridisierung 7.3.2.2. Kolonie- und Plaque-Hybridisierung 7.3.2.3. Verwendung geeigneter Gen-Sonden 7.3.2.4. Identifizierung durch Nachweis des Genproduktes 8. Strukturelle und funktionelle Untersuchungen an Genen 8.1. Lokalisierung eines Gens auf einem DNA-Molekül 8.1.1. Gelelektrophorese und Nucleinsäure-Blotting 8.1.2. Genlokalisierung auf kleinen DNA-Molekülen (Plasmide, Phagen-DNA) 8.1.3. Genlokalisierung auf großen DNA-Molekülen (eukaryotische Chromosomen) 8.1.4. Genom-Kartierung 8.2. Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP) 8.2.1. Mutationsanalyse 8.2.2. Genetischer Fingerabdruck 8.3. Sequenzierung eines Gens 8.3.1. Sanger-Coulson-Methode 8.3.2. Maxam-Gilbert-Methode
8.4. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 8.4.1. Grundprinzip der Methode 8.4.2. Experimentelle Durchführung 8.4.3. Möglichkeiten und Probleme der PCR-Anwendung 8.5. Untersuchungen zur Genexpression 8.5.1. Analyse der Transkripte 8.5.2. Untersuchungen zur Expressionsregulation 8.5.3. Analyse der Translationsprodukte 9. Praktische Anwendungsgebiete der Gentechnik 9.1. Synthese wertvoller Proteine mit klonierten Genen 9.1.1. Expression eukaryotischer Gene in E.coli 9.1.2. Beispiele für gentechnische Herstellung wichtiger Proteine 9.1.3. Synthese von Impfstoffen 9.2. Gene als diagnostische Sonden 9.3. Gentherapie 9.4. Tumorgene 9.5. Transgene Pflanzen und Tiere 9.6. Gentechnik in Industrie und Landwirtschaft