Inhalt Inhalt... Abbildungsverzeichnis... T abellenverzeichnis... Abkürzungsverzeichnis... 1. Einleitung... 2. Literatur... 2.1 Arthropoden-übertragene Krankheitserreger (VBDs)... 2.1.1 Die Ausbreitung von Vector-borne diseases - aktuelle Entwicklungen 2.2 Untersuchte Erreger... 2.2.1 Dirofilaria spp... 2.2.1.1 Taxonomische Einordnung und Morphologie:... 2.2.1.2 Wirtsspektrum und Vektoren:... 2.2.1.3 Entwicklungszyklus... 2.2.1.4 Klinisches Bild, Diagnostik,Therapie und Prophylaxe... 2.2.1.5 Verbreitung und Epidemiologie... 2.2.1.6 Zoonotisches Potenzial... 2.2.1.7 Weitere Filarienarten... 2.2.2 Anaplasma phagocytophilum... 2.2.2.1 Taxonomische Einordnung und Morphologie... 2.2.2.2 Wirtsspektrum und Vektoren... 2.2.2.3 Klinisches Bild, Diagnostik und Therapie... 2.2.2.4 Verbreitung und Epidemiologie... 2.2.2.5 Zoonotisches Potenzial... 2.2.3 Ehrlichia canis... 2.2.3.1 Taxonomische Einordnung und Morphologie... 2.2.3.2 Wirtsspektrum und Vektoren... 2.2.3.3 Klinisches Bild, Diagnostik und Therapie... 2.2.3.4 Verbreitung und Epidemiologie... 2.2.3.5 Zoonotisches Potenzial... 2.2.4 Candidatus Neoehrlichia mikurensis... 2.2.5 Rickettsia spp... 2.2.6 Piroplasmen.....VI VIII..IX... 1...2...2...3...5...7..11..12..13.14..15..17..17..18..18..19..20 3. Material und Methoden 23
3.1 Aufbau der Studie.23 3.1.1 Standortwahl... 23 3.1.2 Probengewinnung und -lagerung...24 3.1.3 Fragebogen für Patientenbesitzer...25 3.2 Material... 26 3.2.1 Chemikalien... 26 3.2.2 Einwegartikel... 27 3.2.3 Enzyme...27 3.2.4 Geräte...28 3.2.5 Lösungen, Puffer und weitere Flüssigkeiten...29 3.2.6 Marker...29 3.2.7 Reaktionskits... 30 3.2.8 Software...30 3.2.9 Weitere Laborartikel... 31 3.2.10 Herstellung von Lösungen, Puffern und Reagenzien... 31 3.2.10.1 50 x TAE Puffer... 31 3.2.10.2 100 bp, 1 kb und AEcoRI/Hindlll Marker... 31 3.2.10.3 LB-Agar... 31 3.2.10.4 6 x Loading Dye... 31 3.2.10.5 Einfache Phosphatgepufferte Salzlösung (1 x PBS)...32 3.3. Methoden...32 3.3.1 DNA Isolation...32 3.3.1.1 DNA Isolation aus Blutproben mit Maxwell 16 LEV Blood DNA K it...32 3.3.1.2 DNA Isolation aus Blutproben mittels innuprep Blood DNA mini Kit...33 3.3.1.3 DNA Isolation aus Fuchsmilzproben mit innuspeed Tissue DNA K it...34 3.3.2 Messung von DNA mit Epoch Biotek Spektralphotometer...35 3.3.3 Polymerase-Kettenreaktion... 36 3.3.3.1 Primer... 36 3.3.3.2 Polymerasen... 37 3.3.3.3 Konventionelle PCR zur Untersuchung auf Dirofilarien... 37 3.3.3.4 High Resolution Melt PCR zur Untersuchung auf Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia canis und Candidatus Neoehrlichia mikurensis...40 3.3.3.5 Konventionelle PCR zur Untersuchung auf Piroplasmen... 41 3.3.3.6 Konventionelle PCR zur Untersuchung auf Rickettsia spp...42 3.3.4 Agarosegelelektrophorese... 42
3.3.5 Sequenzierung von DNA...43 3.3.6 Aufreinigung von DNA und Plasmiden... 44 3.3.6.1 Aufreinigung mit DNA cleaner and concentrator - 5 Kit... 44 3.3.6.2 Aufreinigung von PCR Produkten mittels Zymoclean Gel DNA Recovery Kit...44 3.3.7 Klonierung... 45 3.3.7.1 Vektoren... 45 3.3.7.2 Klonierung von DNA in E. coli Top 10 kompetente Zellen mittels Zero Blunt TOPO PCR Cloning K it... 48 3.3.7.3 Klonierung von DNA in E. coli Top 10 kompetente Zellen mittels TOPO TA PCR Cloning Kit... 49 3.3.7.4 Klonierung von DNA in StrataClone SoloPack kompetente Zellen mittels StrataClone Blunt PCR Cloning K it...49 3.3.7.5 Retransformation von Plasmiden... 50 3.37.6 Isolation von Plasmiden... 50 3.37.6.1 Aufreinigung von Plasmiden mittels NucleoSpin Plasmid... 50 3.37.6.2 Aufreinigung mit EasyPrep Pro K it...51 3.3.8 Restriktionsenzyme... 51 3.3.8.1 Restriktionsverdau von Plasmiden mit EcoRI Enzym... 51 3.3.8.2 Restriktionsverdau von PCR Produkten mit Vspl (Asel) Enzym...52 3.3.9 Giemsa-Färbung von Blutausstrichen... 52 3.3.10 Saure Phosphatase Färbung... 53 3.3.11 Modifizierter Knott-Test...53 3.3.12 Berechnung der Kopienzahl von Plasmiden...53 3.3.13 Statistische Auswertung...54 3.3.14 Berechnung der Stichprobengröße...54 4. Ergebnisse... 55 4.1 Stichprobengröße... 55 4.2 Geographische Herkunft und Verteilung der Proben... 56 4.3 Fragebogenauswertung... 58 4.3.1 Signalement... 58 4.3.2 Herkunft der Hunde... 60 4.3.3 Wohnumfeld der Hunde...0 4.3.4 Reisegewohnheiten... 61 4.3.5 Infektionswahrscheinlichkeit mit einem studienrelevanten Erreger...2
4.3.6 Parasitenprophylaxe... 63 4.3.7 Mid-p Exact Test...3 4.4 Prävalenzen der Erreger bei Hunden und Füchsen in Brandenburg... 63 4.4.1 Nachweis von Filarien... 64 4.4.1.1 Nachweis von Filarien-DNA... 64 4.4.1.2 Differenzierung von Mf mithilfe der sauren Phosphatase Aktivität... 66 4.4.2 A. phagocytophilum, E. canis und Candidatus N. mikurensis...6 4.4.3 Piroplasmen... 69 4.4.4 Rickettsia spp...70 4.5 Einzelfallbeschreibung Hund Nr. 117...71 5. Diskussion... 73 5.1 Sammelgebiet und Stichprobengröße...73 5.2 Beurteilung der Fragebogenanalyse...74 5.3 Limitationen der Studie...75 5.4 Beurteilung der Prävalenzen von Krankheitserregern bei Hunden und Füchsen in Brandenburg...76 5.4.1 Dirofilaria spp... 76 5.4.2 A. phagocytophilum, E. canis und Candidatus N. mikurensis...79 5.4.3 Rickettsia spp...81 5.4.4 Piroplasmen... 82 5.5 Einflussfaktoren für die Verbreitung von VBDs...84 5.6 Schlussfolgerungen und Ausblick... 85 6. Zusammenfassung...88 7. Summary... 90 8. Literaturverzeichnis... 92 9. Publikationsverzeichnis... 106 10. Anhang... 107 10.1 Therapieplan für eine nachgewiesene D. immitis Infektion... 107 10.2 Fragebogen für Patientenbesitzer... 108 10.3 geographische Herkunft der Hunde- und Fuchsproben nach Landkreisen...110 10.3.1 Hundeblutproben...110 10.3.2 Fuchsproben... 110
10.4 Parasitenprophylaxe: studienrelevante Wirkstoffgruppen, Beispiele für Wirkstoffe und ihre Wirkung auf Arthropoden... 111 10.5 Mid p-exacttest... 112 10.6 Danksagung...113 10.7 Selbstständigkeitserklärung...115