ASA/SVV Fortbildungsreihe Genetik Module 2 Erfassung, Beschreibung und Bedeutung von Sequenzvarianten sowie Umgang mit Datenbanken

Transkript

1 Zentrum für Kardiovaskuläre Genetik und Gendiagnostik Das Genetikzentrum der Stiftung für Menschen mit seltenen Krankheiten ASA/SVV Fortbildungsreihe Genetik Module 2 Erfassung, Beschreibung und Bedeutung von Sequenzvarianten sowie Umgang mit Datenbanken Olten, 28. August 2014 PD Dr. Gabor Matyas, FAMH Medizinische Genetik Leiter Zentrum für Kardiovaskuläre Genetik & Gendiagnostik Geschäftsleiter Stiftung für Menschen mit seltenen Krankheiten

2 Grundlagen - Modul 1 (Rückblick)

3 Das menschliche Erbgut (DNA) Chatterjee et al., Oncogene (2006) 25: Zellkern Mitochondrium mtdna

4 3 Milliarden Buchstaben im Zellkern (in jeder Zelle!) 23 Chromosomen- Paare ca Gene

5 UMSETZUNG BAUPLAN (Momentaufnahme) BAUPLAN Das menschliche Erbgut (DNA) Genomics (DNA) Transcriptomics (mrna) Proteomics (Proteins) Aminosäuren Metabolomics, Glycomics, Lipidomics

6 Downing et al Cell 85: FBN1 Schematische Darstellung RNA Synthese prä-mrna Splicing DNA mrna Protein Faltung Ca N Ca mrna trna C Protein: 2871 Aminosäuren Disulfidbrückenbildung Calcium-Bindung Glykosylierung Ca Ca Gen: Abschnitt der DNA, der die Information zur Herstellung eines Proteins trägt

7 Veränderung der DNA

8 Classification of Mutations by Effect on Structure 1. Genome mutations Numerical change of the whole chromosome set (e.g. triploidy (3n), tetraploidy (4n)) Numerical change of a single chromosome (e.g. trisomy 21, 18, 13) 2. Chromosomal mutations 3. Gene mutations Point mutations, deletions, insertions C>T A>G

9 In vitro (Transkript) Analyse Stille Mutation c.6354c>t (p.i2118i) Exon bp cf 380bp C>T Exon 51...C 66bp Exon 52 Intron 50 Intron 51 Intron bp 2247bp 117bp Exon 53 cr 120bp PD Dr. G. Matyas

10 Genetic Assessment in Patients with a Large Aorta Difficulties in sequence data interpretation In vitro (Transkript) Analyse Prediction of the effect of novel sequence variants Silent mutation c.6354c>t (p.i2118i) C>T Deletion of 66bp (22 amino acids) c.6314_6379del (p.glu2105_val2126del) Exon 50 Exon 51 Exon 52 Exon 53 Intron 50 Intron 51 Intron 52...C 380bp 244bp 2247bp 150bp cf 66bp 117bp cr 120bp 400bp M a. Heteroduplex of b. + c bp 200bp b. Normal transcript (317bp) M 100bp marker 1. FBN1 c.6354c>t 2. FBN1 c.6354c>t 3. Control c. Transcript with deletion of exon 51 (251bp) Seminar von PD Dr. G. Matyas / 56 PD Dr. G. Matyas / 10

11 FBN1 Schematische Darstellung RNA Synthese DNA Splicing Auswirkung intronischer (+ exonischer) Mutationen: - Exon Skipping - Cryptic/Novel Splice Site - Intron Retention Ca Ca PD Dr. G. Matyas / 11

12 Die Änderung im Kodon für dieselbe Aminosäure (silent mutation) führt zu veränderter Proteintranslation PD Dr. G. Matyas

13 Das Projekt ENCODE (the Encyclopedia of DNA Elements) zeigt, dass das Genom aus viel mehr als nur aus Genen besteht: Die rund 20'000 proteinkodierenden Gene werden von etwa vier Millionen «molekularen Schaltern», die je nach Zelltyp gewisse Abschnitte des Erbguts an oder ausschalten, kontrolliert.

14

15 Lesen und Interpretation von genetischen Informationen Erfassung (Gentest) Beschreibung (Nomenklatur) Bedeutung (Interpretation) Umgang mit Datenbanken

16 Detection of Genome and Chromosomal Mutations 1. Genome mutations Numerical change of the whole chromosome set (e.g. triploidy (3n), tetraploidy (4n)) Numerical change of a single chromosome (e.g. trisomy 21, 18, 13) 2. Chromosomal mutations >5Mb Karyotyp >1Mb 1 Mb BAC Array Trisomy 21. Fluorescence in situ hybridization (FISH) of interphase nuclei (2x green spots 13q14, 3x red spots 21q22) >100kb Hochauflösende BAC Array <10kb Hochauflösende CGH/SNP Array

17 Diagram of the microarray-based comparative genomic hybridization (acgh) process. Nature Education:

18 Affymetrix SNP Array NspI/StyI NspI/StyI NspI/StyI Modified after

19 Classification of Mutations by Effect on Structure 1. Genome mutations Numerical change of the whole chromosome set (e.g. triploidy (3n), tetraploidy (4n)) Numerical change of a single chromosome (e.g. trisomy 21, 18, 13) 2. Chromosomal mutations 3. Gene mutations Dynamic mutations (tandem repeats that often change size on transmission to children) 15 CAG-Repeats 49 CAG-Repeats Size standards

20 FRAXA & AD Trinukleotidexpansionskrankheiten Risiko für Vollmutation bei Nachkommen Krankheit Anzahl (n) der Basentripletts Normalbereich Prämutation Vollmutation STABIL INSTABIL (n) Position der Basentripletts 5 UTR ATG offenes Leseraster (ORF) Stop 3 UTR (CGG)n (CAG)n (CTG)n Auswirkung fehlendes oder vermindertes Genprodukt infolge Hypermethylierung Verlust der Proteinaktivität Effekte auf andere Proteine Effekte der Aggregatbildung Toxizität verminderte Proteinsynthese Krankheit Fragiles X-Syndrom Polyglutaminkrankheiten: HD, DRPLA SCA 1, 2, 3, 6, 7 DM 1 SCA 8 Vererbung X-chromosomal (Xq27.3), jedoch weder rezessiv noch dominant! autosomal dominant

21 5 UTR ATG offenes Leseraster (ORF) Stop 3 UTR (CGG)n (CAG)n (CTG)n

22 Classification of Mutations by Effect on Structure 1. Genome mutations Numerical change of the whole chromosome set (e.g. triploidy (3n), tetraploidy (4n)) Numerical change of a single chromosome (e.g. trisomy 21, 18, 13) 2. Chromosomal mutations 3. Gene mutations Point mutations, deletions, insertions, inversions C>T A>G Single nucleotide polymorphisms (SNP) genotyping 1 Hybridization-based methods 1.1 Dynamic allele-specific hybridization 1.2 Molecular beacons 1.3 SNP microarrays 2 Enzyme-based methods 2.1 Restriction fragment length polymorphism 2.2 PCR-based methods 2.3 Flap endonuclease 2.4 Primer extension nuclease 2.6 Oligonucleotide ligase assay 3 Other post-amplification methods based on physical properties of DNA 3.1 Single strand conformation polymorphism (SSCP) 3.2 Temperature gradient gel electrophoresis 3.3 Denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) 3.4 High-Resolution Melting of the entire amplicon 3.5 SNPlex 4 Sequencing

23 Detection of Gene Mutations 1. Genome mutations Numerical change of the whole chromosome set (e.g. triploidy (3n), tetraploidy (4n)) Numerical change of a single chromosome (e.g. trisomy 21, 18, 13) 2. Chromosomal mutations 3. Gene mutations Point mutations, deletions, insertions, inversions C>T A>G Sanger DNA sequencing Next-generation sequencing (NGS) technologies (targeted, wholeexome, and whole-genome sequencing)

24 Detection of Gene Mutations How to find point mutations and small ins/dels? Sanger DNA sequencing Polymerasekettenreaktion (PCR) DNA-Sequenzierung Zyklus 4 DNA zu amplifizieren Zyklus 3 Zyklus 35 Schema der PCR Zyklus 2 A>G DNA Zyklus 1... usw. Zyklus = 4 Kopien 2 3 = 8 Kopien 16 Kopien 32 Kopien 68 Mrd. Kopien 2 36 = 68 Milliarden Kopien / 24

25 Laser-induced fluorescence CE (LIF-CE) Cycle Sequencing (only one primer per reaction) 5' 5' 5' 5' ddntps during the primer-extension step (=> stop) C T G A DNA Sequencing Example 5' 5' 5' 5' X PD Dr. G. Matyas November 2009 / 25

26 Detection of Gene Mutations Point mutations, small deletions/insertions/inversions, dynamic mutations PCR-based standard qualitative sequencing (Sanger and NGS) Intron- Primer F Exon Intron+ Primer R not analyzed analyzed not analyzed Long-range PCR Whole genome sequencing (WGS) RNA-based transcript analysis (if possible) PD Dr. G. Matyas

27 Downing et al Cell 85: Das menschliche Erbgut (DNA) Chromosom 15q21.1 DNA FBN1: ~237,000 nucleotides Exons Splicing Protein Synthese N Transkript: ~10 Kilobasen Protein: Protein Faltung C 2871 Aminosäuren Disulfidbrückenbildung Calcium-Bindung Ca Ca Glykosylierung Ca Ca Gen: Abschnitt der DNA, der die Information zur Herstellung eines Proteins trägt

28 Detection of Gene Mutations Point mutations, small deletions/insertions/inversions, dynamic mutations PCR-based standard qualitative sequencing (Sanger and NGS) Intron- Primer F Exon Intron+ Primer R not analyzed analyzed not analyzed Long-range PCR Whole genome sequencing (WGS) RNA-based transcript analysis (if possible) Problem: Deletions and duplications larger than the amplified region Real-time (long-range) PCR, MLPA, CGH/SNP arrays, Quantitative sequencing (Sanger or NGS), Southern PD Dr. G. Matyas DELETION DUPLICATION

29 Relative Genkopienzahl FBN1 Ex 1 FBN1 Ex 2 FBN1 Ex 4 FBN1 Ex 5 FBN1 Ex 6 FBN1 Ex 7 FBN1 Ex 8 FBN1 Ex 9 FBN1 Ex 13 FBN1 Ex 16 Detection of Large Deletions How to find large deletions/insertions? Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA): 1.5 Kontrolle 1.5 Patient MLPA Fragment MLPA Fragment Deletion von Exons 1-16 des FBN1-Gens PD Dr. G. Matyas / 29

30 Detection of Large Deletions How to find large deletions/insertions? Microarrays (SNP and array CGH) Custom designed array CGH with exon enriched probes (CGH 2.1M, NimbleGen ) Probes of CGH 3x720K human whole genome Additional exon probes Exon-intron annotation, July 2010 FBN1 CEP152 SHC4 Structural variants, DGV PD Dr. G. Matyas v0310, July / 30

31 Characterization of large deletions (Example Sanger sequencing) 46,489, ,724,391 46,820,637 46,890,519 46,903,226 47,042,933 EID1 FBN1 CEP152 SHC q21.1 Centromere 50 kb 15q21.1 Decreased MLPA signals SNP_A rs ,571,789 SNP_A rs ,888,783 SNP_A rs ,063,708 Loss of heterozygosity Decreased SNP array signal intensity LR primer 70F LR primer 70R Deletion of 302,580 bp 46,580,456 46,883,035 T T TTGAATA T T TTCA GTAC T TTAAACA GCC TACCCCa t a a t c a t c a t g t t a g a g t c a a t t c a g c t a t a t a t c Junction Reference sequence T PD T TTGAATA Dr. G. Matyas T T TTCA GTAC T TTAAACA GCC TACCCCCCAT TCT TGA A AT GAGGGA TAT CCTACA T TCGGAT G 46,580,491 / 31 a t t t t t a t t a a c a t g a a g t t t t t t a c a a a t t t a a c c a t a a t c a t c a t g t t a g a g t c a a t t c a g c t a t a t a t c 46,883,071 Matyas et al., 2007, Hum Genet 122:23-32

32 Detection of Gene Mutations 1. Genome mutations Numerical change of the whole chromosome set (e.g. triploidy (3n), tetraploidy (4n)) Numerical change of a single chromosome (e.g. trisomy 21, 18, 13) 2. Chromosomal mutations 3. Gene mutations Point mutations, deletions, insertions, inversions C>T A>G Sanger DNA sequencing Next-generation sequencing (NGS) technologies (targeted, wholeexome, and whole-genome sequencing)

33 DNA Sequencing Sanger sequencing read length: ~600 bp one fragment/sequence per reaction no allele discrimination Next generation sequencing (NGS) read length: up to ~2 kb many sequences per reaction allele discrimination targeted NGS whole exome (WES) whole genome (WGS) 33

34 Target Region & Exome Sequencing

35 95 44 (blood) 280 (blood) 326 (fibroblasts) (blood) (blood) (saliva) 90 Mean Coverage at 20x [%] Agilent_V1 Agilent_V2 NimbleGen_V1 NimbleGen_V3 Illumina_V1 Illumina_V4 Mean percent of coverage of all RefSeq exons at 20 per platform (Agilent, NimbleGen, Illumina) and vendor (V1, V2, V3, and V4) for all six DNA samples derived from blood, fibroblasts or saliva.

36 Comparison of different enrichment platforms and sequencing vendors Nimblegen (Roche); Vendor 3 Nimblegen (Roche); Vendor 1 SureSelect (Agilent); Vendor 2 SureSelect (Agilent); Vendor 1 Nextera (Illumina); Vendor 4 Nextera (Illumina); Vendor 1 Design: NimbleGen SureSelect Nextera

37 GC-rich regions - WES Nimblegen (Roche); Vendor 3 Nimblegen (Roche); Vendor 1 SureSelect (Agilent); Vendor 2 SureSelect (Agilent); Vendor 1 Nextera (Illumina); Vendor 4 Nextera (Illumina); Vendor 1 Exon 2: 77.5% GC Design: NimbleGen SureSelect Nextera

38 GC-rich regions - WGS Patient 1, Vendor 3 Patient 1, Vendor 4 Patient 2, Vendor 3 Exon 2: 77.5% GC

39 GC-rich regions Proton (Ion Torrent, Life Technologies) Exon 2: 77.5% GC

40 Zukunft der Gendiagnostik Einerseits stehen Ultra-Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien (UHTS) zur Verfügung Andererseits stellt die Auswertung und Interpretation der durch UHTS entstandenen Datenmengen noch eine grosse Herausforderung für die Zukunft dar COSTS: Next Generation Sequencing (NGS) technologies (targeted, whole-exome, and whole-genome sequencing) Sequence data $ ~ Data analysis/interpretation $ ~ PD Dr. G. Matyas

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42 Zukunft der Gendiagnostik Einerseits stehen Ultra-Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien (UHTS) zur Verfügung Andererseits stellt die Auswertung und Interpretation der durch UHTS entstandenen Datenmengen noch eine grosse Herausforderung für die Zukunft dar Gentest ist nicht gleich Gentest (direkte vs. indirekte Analyse von bekannten vs. unbekannten Mutationen, Analyse von einzelnen vs. sämtlichen Mutationen/Genen, Analyse von Exom vs. Genom) PD Dr. G. Matyas

43 Zukunft der Gendiagnostik Einerseits stehen Ultra-Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien (UHTS) zur Verfügung Andererseits stellt die Auswertung und Interpretation der durch UHTS entstandenen Datenmengen noch eine grosse Herausforderung für die Zukunft dar Gentest ist nicht gleich Gentest (direkte vs. indirekte Analyse von bekannten vs. unbekannten Mutationen, Analyse von einzelnen vs. sämtlichen Mutationen/Genen, Analyse von Exom vs. Genom) Internet-Gentests sind problematisch: - bei Kindern, urteilsunfähigen und hypochondrisch veranlagten Personen - ohne begleitende Beratung von Experte zu Patient, vor allem bei Risikobewertung und Interpretation der Untersuchungsergebnisse - durch die Ungewissheit der Testqualität - bezüglich Datenschutz PD Dr. G. Matyas

44 Über Gentests berichten die Medien aber Gentest Gentest

45 45

46 az Personalisierte Medizin: die SAMW warnt vor Fehlentwicklungen Die Schweizerische Akademie der Medizinischen Wissenschaften (SAMW) befürchtet, dass Patientinnen und Patienten unnötig verunsichert werden, wenn sie ohne qualifizierte ärztliche Beratung mit Ergebnissen von Gentests konfrontiert werden. Sie warnt insbesondere vor unseriösen Gentest-Angeboten aus dem Internet und fordert eine bessere Aufklärung der Bevölkerung über Nutzen und Risiken von genetischen Untersuchungen. Die neuen technischen Möglichkeiten dürfen die persönliche Arzt-Patienten-Beziehung nicht verdrängen, sondern sollen in die ärztliche Beratung eingebettet werden. «Ohne richtige Interpretation Verkommt der Gentest zum Horoskop.» az 46

47 GWAS: Genome-Wide Association Study 47

48 Penetrance: high/full penetrance, low/reduced penetrance Expressivity: describes quantitative differences in the manifestation of the disease

49 Downing et al Cell 85: Gentest ist nicht gleich Gentest DNA Marker (e.g. SNP) Splicing Protein Synthese Protein Faltung N... Disease-causing mutation... C 65 Exons Gentest Gentest direkte vs. indirekte Analyse von Transkript: bekannten ~10 vs. Kilobasen unbekannten Mutationen, Protein: Analyse von einzelnen vs Aminosäuren sämtlichen Mutationen bzw. Genen, Disulfidbrückenbildung Analyse von Exom vs. Calcium-Bindung Genom Ca Ca Glykosylierung Indirect testing is used when the gene or disease-causing mutation cannot Ca Ca be directly identified/analyzed but can be located within a specific region of a chromosome

50 ACHTUNG: Bei 23andme werden nicht die einzelnen Gene auf Mutationen untersucht, sondern vorwiegend nur Risikofaktoren (ausgewählte SNPs). Daraus wird dann eine Wahrscheinlichkeit abgeleitet, ob man die Krankheit bekommt. 50

51 Affymetrix SNP Array NspI/StyI NspI/StyI NspI/StyI Modified after

52 Fachleute für Humangenetik: In der Schweiz gibt es ~100 Medizinische Genetiker FMH/FAMH

53 23andMe has, for example, suggested that its longer-range goal is to collect a massive biobank of genetic information that can be used and sold for medical research and could also lead to patentable discoveries. Fachleute für Humangenetik: In der Schweiz gibt es ~100 Medizinische Genetiker FMH/FAMH

54 Ask your physician. That is insufficient guidance unless your physician has ready access to a clinical geneticist or genetic counselor. Fachleute für Humangenetik: In der Schweiz gibt es ~100 Medizinische Genetiker FMH/FAMH

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56 Lesen und Interpretation von genetischen Informationen Erfassung (Gentest) Beschreibung (Nomenklatur) Bedeutung (Interpretation) Umgang mit Datenbanken

57 Chr15 g.1 Genomic DNA (gdna) level: Chr15(GRCh37(hg19)):g A>G FBN1 Exon 1 Complementary DNA (cdna) level: NM_ :c.5377T>C 5 377:3= => First position of codon for amino acid #1793. Wildtype: TGT = Cys, mutated: CGT = Arg Protein: p.cys1793arg (p.c1793r) c.5377t>c

58 Alternative splicing a process by which a given gene is spliced into more than one type of mrna molecule DNA prä-mrna mrna 1 Gen => mehrere Proteine ~ Gene => ~ Proteine Nature Education:

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61 Genetic Assessment in Patients with a Large Aorta Difficulties in sequence data interpretation In vitro (Transkript) Analyse Prediction of the effect of novel sequence variants Silent mutation c.6354c>t (p.i2118i) C>T Deletion of 66bp (22 amino acids) c.6314_6379del (p.glu2105_val2126del) Exon 50 Exon 51 Exon 52 Exon 53 Intron 50 Intron 51 Intron 52...C 380bp 244bp 2247bp 150bp cf 66bp 117bp cr 120bp 400bp M a. Heteroduplex of b. + c bp 200bp b. Normal transcript (317bp) M 100bp marker 1. FBN1 c.6354c>t 2. FBN1 c.6354c>t 3. Control c. Transcript with deletion of exon 51 (251bp) Seminar von PD Dr. G. Matyas / 56 PD Dr. G. Matyas / 61

62 Lesen und Interpretation von genetischen Informationen Erfassung (Gentest) Beschreibung (Nomenklatur) Bedeutung (Interpretation) Umgang mit Datenbanken

63 Rare/orphan diseases Penetrance: high/full penetrance, low/reduced penetrance Expressivity: describes quantitative differences in the manifestation of the disease

64 Downing et al Cell 85: Gentest ist nicht gleich Gentest DNA Marker (e.g. SNP) Splicing Protein Synthese Protein Faltung N... Disease-causing mutation... C 65 Exons Gentest Gentest direkte vs. indirekte Analyse von Transkript: bekannten ~10 vs. Kilobasen unbekannten Mutationen, Protein: Analyse von einzelnen vs Aminosäuren sämtlichen Mutationen bzw. Genen, Disulfidbrückenbildung Analyse von Exom vs. Calcium-Bindung Genom Ca Ca Glykosylierung Indirect testing is used when the gene or disease-causing mutation cannot Ca Ca be directly identified/analyzed but can be located within a specific region of a chromosome

65 MFS Gendiagnostik Gendiagnostik Mutation gefunden Bekannte Mutation DIAGNOSE Ja Unbekannte Mutation Q1: Ist die identifizierte Sequenzänderung pathogen? Ja Q2: Verursacht die pathogene Sequenzänderung den klinischen Phänotyp des Patienten? PD Dr. G. Matyas

66 Human Gene Mutation Database: HGMD ( HGMD Professional (

67 MFS Gendiagnostik Gendiagnostik Mutation gefunden Bekannte Mutation DIAGNOSE Ja Unbekannte Mutation Q1: Ist die identifizierte Sequenzänderung pathogen? Ja Q2: Verursacht die pathogene Sequenzänderung den klinischen Phänotyp des Patienten? PD Dr. G. Matyas

68 MFS Gendiagnostik ant Allele and Clinical Phenotype Q1: Ist die identifizierte Sequenzänderung pathogen? ts responsible for the MFS-like phenotypes of the patients? Analyse der evolutionären Konservierung der Sequenz TAG 9 TGFBR2 ATG Extracellular Transmembrane Kinase Cytoplasmic Ser/Thr TAG 0G>A 87Q G..... A. A. T. C. C I-2 SS: - c.773t>g p.v258g c.1106g>t p.g369v c.1159g>c p.v387l c.1159g>a p.v387m c.1181g>a p.c394y c.1561t>c p.w521r c.1657t>a p.s553t Human (H. sapiens) GTC GGG GTG TGC TGG TCG Chimp (P. troglodytes) Dog (C. familiaris) T Mouse (M. musculus) c Rat (R. norvegicus) c Chicken (G. gallus).. G.. T..... T PD Dr. Fugu G. Matyas (T. rubripes) A C Zebrafish (D. rerio).. G T..... T Matyas et al. 2006, Hum Mutat 27:

69 MFS Gendiagnostik Q1: Ist die identifizierte Sequenzänderung pathogen? Analyse der evolutionären Konservierung der Sequenz In silico Vorhersagen => Mutation => Mutation => Mutation => Mutation => Mutation => Keine Mutation => Unsicher => Mutation => Mutation => Unsicher Matyas et al. 2006, Hum Mutat 27: PD Dr. G. Matyas

70 Q1: Ist die identifizierte Sequenzänderung pathogen? B C G331 Normal H V387 C393 β9 β10 β6 β8 β7 D G331 H Mutant Destabilisierende Interaktion zwischen Met387 und Cys393 αef 2.5 Å M387 C393 PD Dr. G. Matyas Matyas et al. 2006, Hum Mutat 27:

71 MFS Gendiagnostik Q1: Ist die identifizierte Sequenzänderung pathogen? Analyse der evolutionären Konservierung der Sequenz In silico Vorhersagen Aber Vorsicht: In silico Vorhersageprogrammen müssen sowohl mit bekannten krankheitsverursachenden Mutationen als auch mit harmlosen Polymorphismen für das betreffende Gen evaluiert werden (Bestimmung von falsch-positiven und falsch-negativen Vorhersagen) PD Dr. G. Matyas

72 MFS Gendiagnostik Q1: Ist die identifizierte Sequenzänderung pathogen? Analyse der evolutionären Konservierung der Sequenz In silico Vorhersagen In vitro Analysen, funktionelle Assays PD Dr. G. Matyas

73 MFS Gendiagnostik Q1: Ist die identifizierte Sequenzänderung pathogen? Analyse der evolutionären Konservierung der Sequenz In silico Vorhersagen In vitro Analysen, funktionelle Assays Analyse von entsprechenden Kontrollproben und Abfrage von entsprechenden Datenbanken (e.g. TGP, ESP, dbsnp) PD Dr. G. Matyas

74 MFS Gendiagnostik Q1: Ist die identifizierte Sequenzänderung pathogen? Analyse der evolutionären Konservierung der Sequenz In silico Vorhersagen In vitro Analysen, funktionelle Assays Analyse von entsprechenden Kontrollproben und Abfrage von entsprechenden Datenbanken (e.g. TGP, ESP, dbsnp) In vivo Analysen in Modellorganismen (z.b. Mausmodell) PD Dr. G. Matyas

75 MFS Gendiagnostik Gendiagnostik Mutation gefunden Bekannte Mutation DIAGNOSE Ja Unbekannte Mutation Q1: Ist die identifizierte Sequenzänderung pathogen? Ja Q2: Verursacht die pathogene Sequenzänderung den klinischen Phänotyp des Patienten? PD Dr. G. Matyas

76 ociation MFS Between Gendiagnostik Mutant Allele and Clinical Phenotype re the disease-causing sequence variants responsible for the MFS-like phenotypes of the patients? cellular Transmembrane Cytoplasmic Q2: Verursacht die TAG GS Kinase pathogene Sequenz- c.799a>c änderung den p.n267h klinischen Phänotyp c.722c>t p.s241l c.1460g>a p.r487q apiens) TCG AAT CGG oglodytes) iliaris).. A usculus).. A.. C.. A egicus).. A.. C.. A gallus). des. A Patienten?.. C.. T ripes).. C.. C.. C. rerio).. T.. C.. C Segregationsanalyse in der Familie des I-1 I-2 I-1 I-2 (#96) SS: - OS: - SS: - OS: - SS: - SS: + CS: - CS: - CS: - CS: + II-1 (#SZ) Patienten II-1 II-2 SS: + OS: - CS: + SS: + OS: - CS: + SS: + OS: - CS: + I-1 I-2 SS: - SS: - OS: - OS: - CS: - CS: - II-1 (#147) SS: - OS: - CS: + de novo segregating de novo ious alleles occurred de novo or segregated disease in the families, indicating a causative tion between the sequence variant and clinical ype (linkage disequilibrium cannot be excluded). Extracellular PD Dr. G. Matyas I-1 TGFBR2 ATG Transmembrane Kinase Cytoplasmic c.773t>g p.v258g c.1106g>t p.g369v c.1159g>c p.v387l c.1159g>a p.v387m Human (H. sapiens) GTC GGG GTG TGC TGG TCG Chimp (P. troglodytes) Dog (C. familiaris) T Mouse (M. musculus) c Rat (R. norvegicus) c Chicken (G. gallus).. G.. T..... T Fugu (T. rubripes)..... A C Zebrafish (D. rerio).. G T..... T I-2 SS: - OS: - CS: - II-1 II-2 (#104) SS: + SS: + OS: - OS: - CS: + CS: + segregiert segregating I-1 I-2 SS: - OS: - CS: - II-1 II-2 (#102) SS: (+) OS: - CS: + III-1 III-2 SS: - SS: (+) OS: - OS: - CS: - CS: (+) II-3 SS: - OS: - CS: - II-4 SS: - OS: - CS: - segregating segregiert Matyas et al. 2006, Hum Mutat 27: Ser/Thr c.1181g>a p.c394y I-1 I-2 II-1 II-2 (#72) SS: - OS: - CS: + II-3 SS: - OS: - CS: + segregiert segregating c.1561t>c p.w521r III-1 (*1988) SS: - OS: - CS: - I-1 (#67) I-2 SS: (+) OS: - CS: + II-1 SS: - OS: - CS: - II-2 SS: - OS: - CS: - I-1 I-2 SS: - SS: - OS: - OS: - CS: - CS: - II-3 SS: - OS: - CS: - II-1 (#50) SS: + OS: - CS: + SS: - OS: - CS: - TAG c.1657t>a p.s553t I-1 I-2 II-1 (#130) SS: - OS: - CS: + de de novo de novo? segregiert (Normalallel) segregating (normal allele) Matyas et al. 2006, Hum Mutat 27:

77 Comprehensive Genetic Testing for MFS in Switzerland Clinical signs of MFS: Referrals from - general practitioners and paediatricians because of Marfanoid habitus, - cardiologist because of aortic dilatation or dissection, - ophthalmologist because of dislocated lens. Preanalytical requirements: - Sample collection (3-6 ml EDTA blood, shipped without cooling) - Informed consent of the patient - Clinical data (needed to decide the order of the genes to be analyzed) - Approval of expenses (provided upon request) vom Arzt veranlasst genetische Beratung vor und nach dem Gentest Recht auf Nichtwissen präsymptomatischer Gentest nur bei Volljährigen schriftliche Zustimmung Genetic testing (analytical phase) - Sequence analysis - MLPA analysis - Special analyses (could be time-consuming) Special analyses Known mutation associated with the clinical phenotype Diagnosis is highly probable Yes Mutation found Novel mutation with unknown effect Q1: Is the identified sequence variant a pathogenic mutation? Yes Q2: Is the pathogenic sequence variant responsible for the clinical phenotype of the patient? No No No mutation found because the disease-causing mutation is - not detectable with the method used (ability of the testing method) - located in another gene Further analyses in order to find the disease-causing mutation (could be very time-consuming, up to several years)

78 MFS Gendiagnostik EDTA-Blutprobe (>3ml) + klinische Angaben + Zustimmung des Patienten + Kostengutsprache Gendiagnostik (Analytische Phase) - Sequenzanalysis - MLPA-Analysis - Spezial Analysis (z.b. cdna-analyse) Bekannte Mutation Yes Mutation gefunden Unsere Mission: Unbekannte Mutation Q2: Verursacht die pathogene Sequenzänderung den klinischen Phänotyp des Patienten? No Keine Mutation gefunden, da - die verwendete Methode/Strategie dies nicht ermöglicht, oder - ein anderes Gen mutiert ist Bei allen uns zugewiesenen Patienten die krankheitsverursachende Weitere Analysen (Forschung), Q1: Ist die identifizierte Mutation zu finden. (Über um die krankeitsverursachende Sequenzänderung pathogen? No «Pflichtleistungen» hinaus erfolgt dies Mutation kostenlos zu finden (kann für sehr die DIAGNOSE Yes lange dauern, bis zu 5-15 Jahren!) KK; nur bei uns in der Schweiz.) PD Dr. G. Matyas / 78

79 Lesen und Interpretation von genetischen Informationen Erfassung (Gentest) Beschreibung (Nomenklatur) Bedeutung (Interpretation) Umgang mit Datenbanken

80 Core internet sites: - Information on human diseases: GeneReviews ( - Information on mendelian phenotypes: OMIM ( - Information on rare diseases: Orphanet ( - Biomedical literature: Pubmed ( - Nomenclature for the description of sequence variants: HGVS ( - Human Gene Mutation Database: HGMD ( HGMD Professional ( Genomes Project (1000genomes.org) - Database of single nucleotide polymorphisms (SNPs): dbsnp (ncbi.nlm.nih.gov/snp) - Genome data: ENSEMBL ( UCSC (genome.ucsc.edu) - Genetic data: NCBI ( EBI (

81 GeneReviews

82

83 OMIM (

84 GeneCards (

85 GenAtlas (

86 Orphanet (

87 Zentrum für Kardiovaskuläre Genetik und Gendiagnostik Das Genetikzentrum der Stiftung für Menschen mit seltenen Krankheiten 13:15-14:15 Genetische Krankheitsbilder und deren Abklärungen Aortenkrankeiten und Orphan Diseases Olten, 28. August 2014 PD Dr. Gabor Matyas, FAMH Medizinische Genetik Leiter Zentrum für Kardiovaskuläre Genetik & Gendiagnostik Geschäftsleiter Stiftung für Menschen mit seltenen Krankheiten