Grundpraktikum Pflanzenphysiologie

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1 Grundpraktikum Pflanzenphysiologie Versuch: Enzymatik Versuchstag :

2 Versuch 1: Succinatdehydrogenase aus Brassica oleracea var. Botrytis (Blumenkohl) Ansprechpartner: Einleitung Mitochondrien stehen im Mittelpunkt des Energiestoffwechsels einer Zelle. In ihrer Matrix sind Enzyme des Zitronensäurezyklus zu finden. An den Innenmembranen sind Enzyme der Atmungskette und der ATP-Bildung lokalisiert. Auch die Succinatdehydrogenase (SDH) ist hier anzufinden und vermittelt zwischen Zitratzyklus und Atmungskette, wobei die SDH die Produktion von Fumarat katalysiert. Dabei wird gleichzeitig FAD reduziert. Ubichinon ist der physiologische Wasserstoffakzeptor. In diesem Versuch wird die Elektronentransportkette der Atmungskette durch Na-azid gestört. 2,6-Dichlorphenolinophenol (DCPIP) übernimmt die Aufgabe des Ubichinon. Dieser Indolfarbstoff ist in oxidierter Form blau und in reduzierter Form farblos. Photometrisch kann dieser Farbumschlag bei einer Wellenlänge von 620 nm gemessen werden. Dies ist proportional zum Verbrauch an Succinat, welches enzymatisch durch SDH verbraucht wird. Succinat + FAD SDH Fumarat + FADH2 Ziel des Versuches ist es die Enzymaktivitat der Succinatdehydrogenase zu bestimmen. Dazu wird eine spektrophotometrische Messung durchgeführt. Die Extinktion wird bei 620 nm eine Stunde in 15 Minuten Intervallen gemessen und später ausgewertet. Die Lichtabsorption erfüllt das Lambert-Beer sche Gesetz: ΔE=log I0/I=ε*c*d => ε=δe/c*d [cm³/mol*cm]. Variiert werden bei diesem Versuch die Temperatur, die Enzymkonzentration und der Einfluss von Malonat auf die Umsatzgeschwindigkeit. Malonat ist ein Inhibitor und bewirkt eine kompetitive Hemmung des Enzyms. Material und Methoden Siehe Skript: Pflanzenphysiologisches Praktikum, WS10/11, S Resultate Es wurden für die Extinktionsmessung für die Proben die folgenden Werte ermittelt. Aus diesen Werten wurden dann die Differenzen gebildet. Die Proben 1 und 14 wurden zur Konfiguration ( blank ) verwendet. Beide beinhalteten weder DCPIP noch Malonat. Ansatz 2 diente

3 als Kontrollansatz und enthielt keine Mitochondriensuspension und somit auch kein SDH und kein Malonat. Die Messergebnisse sind in Tabelle 1.1 aufgelistet. Bei den Ansätzen 3 bis 8 wurde die Temperatur verändert. Der Temperaturbereich lag zwischen 100 C (Ansatz 3) und 0 C (Ansatz 8). Enzymkonzentration und Substratmenge blieben unverändert. Auch wurde kein Malonat hinzugefügt. Bei den Ansätzen 3 und 4 nahm die Extinktion in den 60 Minuten im Allgemeinen mit einigen Schwankungen zu. Bei den Proben 5 bis 6 sank sie. Bei Probe 8 lag die Temperatur bei 0 C und die Extinktion blieb relativ konstant, um die 0,5-0,4. In den Ansätzen 9 bis 13 wurde bei konstanter Temperatur und Enzymkonzentration, das Verhältnis von Succinat und Malonat variiert. In der Probe 9 wurde weder Succinat noch Malonat hinzugeführt. Die Extinktion hielt einen relativ konstanten Wert um die 0,4 bei. Bei Ansatz 10 wurde nur Malonat verwendet. Mit Ausnahme eines Ausreißers bei t=60 min, lag auch hier der Wert der Extinktion konstant um die 0,4. Die Extinktion bei den Ansätzen 11 bis 13 sank stetig. Dabei sank der Wert bei Ansatz 11 schneller als bei den anderen beiden Proben. Bei Ansatz 15 wurde die Menge an Mitochondriensuspension erhöht. Damit stieg auch die Enzymkonzentration. Die Werte sanken, aber negative Extinktionswerte machen keinen Sinn. Dies wird in der Diskussion besprochen. Tabelle 1.1: Dargestellt ist die Extinktion der Ansätze 1 bis 15. Die Extinktion wurde bei 620 nm zum Zeitpunkt t=0 und dann eine Stunde in 15 Minuten Intervallen gemessen. Ansatz 1 und 2 sind Blank Werte, Ansatz 2 dient als Kontrollwert und Ansatz 14 als Korrekturwert für Ansatz 15. Ansatz t=0 min t=15 min t=30 min t=45 min t=60 min ,208 0,191 0,205 0,188 0, ,356 0,451-0,023 1,118 0, ,361 0,181 0,357 0,428 0, ,362 0,05 0,033 0,055 0, ,32 0,02-0,089-0,097-0, ,346 0,126 0,041 0,022 0, ,555 0,526 0,466 0,457 0, ,473 0,442 0,418 0,405 0, ,459 0,44 0,419 0,408-0, ,408 0,331 0,262 0,207 0, ,469 0,415 0,383 0,357 0, ,462 0,401 0,346 0,29 0, ,062-0,084-0,097-0,095-0,09 Tabelle 1.2.: Dargestellt ist die Extinktionsdifferenz. Die Extinktionsdifferenz berechnet sich aus der Differenz der Extinktion beim Start der Reaktion und der Extinktion zum Zeitpunkt t: ΔEt=E0-Et. Beispiel für t=15 Minuten, Ansatz 3: E(15)=0,356-0,451=-0,095 Ansatz E(0) E(15) E(30) E(45) E(60)

4 2 0 0,017 0,003 0,02 0, ,095 0,379-0,762-0, ,18 0,004-0,067-0, ,312 0,329 0,307 0, ,3 0,409 0,417 0, ,22 0,305 0,324 0, ,029 0,089 0,098 0, ,031 0,055 0,068 0, ,019 0,04 0,051 0, ,077 0,146 0,201 0, ,054 0,086 0,112 0, ,061 0,116 0,172 0, ,146 0,159 0,157 0,152 Grafik 1.1: Dargestellt ist die Extinktionsdifferenz in Abhängigkeit der Zeit. Die dazugehörigen Messwerte sind Tabelle 1.1, die gebildeten Differenzwerte Tabelle 1.2 zu entnehmen.

5 Grafik 1.2: Dargestellt ist die relative Umsatzgeschwindigkeit als Funktion der Temperatur bei t=15 min der Ansaätze 3 bis 8. Die Proben wurden bei 0, RT, 30,40,50 und 100 C behandelt und deren Extinktionswerte gemessen. Für die Raumtemperatur wurde 20 C angenommen. Grafik 1.3: Die Grafik zeigt die relative Umsatzgeschwindigkeit als Funktion der Zeit für Ansatz 7 und 15. Hierbei wird die bei konstanter Temperatur der Einfluss verschiedener Enzymkonzentrationen verglichen. Dazu wurde die Extinktionsdifferenz zum Zeitpunkt t durch die Zeit dividiert und in Abhängigkeit zur Zeit betrachtet. Grafik 1.1 stellt die Extinktionsdifferenz in Abhängigkeit der Zeit dar. Diese Grafik stellt somit die Extinktionsdifferenzen aller Proben miteinander in Bezug. Bei den Ansätze 3 bis 8 wurde der Einfluss der Enzymaktivität bei verschiedenen Temperaturen untersucht. Das Ergebnis ist in Grafik 1.2 dargestellt. Dabei wurde die Extinktionsdifferenz für t=15 min gewählt. Die relative Umsatzgeschwindigkeit stieg zuerst an. Bei C etwa lag das Opti-

6 mum. Danach sank sie wieder stark ab und lag bei 100 C um die null. In Grafik 1.3 wird die relative Umsatzgeschwindigkeit als Funktion der Zeit betrachtet. Nur Ansatz 7 und 15 wurden verglichen. Die Grafik stellt einen Zusammenhang zwischen der relativen Umsatzgeschwindigkeit in Abhängigkeit vom Enzymeinsatz bei konstanter Temperatur dar. Beispielrechnung für den Graph (Extinktionsdifferenzen sind aus Tabelle 1.2 zu entnehmen): Ansatz 7 E(15)=0,22: 0,22/15=0,0147 0,0147 0,0097 0,0102 0,0053 0,0072 0,0035 0,0050 0,0025 Ansatz 7: Ansatz 15: Fragen: 1. Wie sind die Ergebnisse der Ansätze 10 bis 13 zu erklären? Bei Ansatz 10 bis 13 wird Malonat mit in die Reagenzien gemischt. Malonat wirkt als Inhibitor, daher sollte die Aktivität geringer sein. Ansatz 10 beinhaltet kein Substrat und es kann somit keine Reaktion stattfinden. In Ansatz 11 wird Succinat und Malonat im Verhältnis 2:1 verwendet. Genauso in Ansatz 13. Hier wurde die Menge an Succinat und Malonat im Vergleich zu 11 ebenfalls verdoppelt. Bei 12 beträgt das Verhältnis 1:1. Wurde die Substratkonzentration erhöht wurde die Hemmung aufgehoben. Es muss sich also bei Malonat um einen kompetitiven Inhibitor handeln. 2. Warum kommt eine enzymkatalysierte Reaktion bei hohen Temperaturen rasch zum Stillstand? Enzyme bestehen aus Proteinen und sind somit bei hohen Temperaturen empfindlich und denaturieren. Die Denaturierung bewirkt, dass sie ihre spezifische Raumstruktur verändert und sie nicht mehr funktionstüchtig sind. 3. Mit welchem physiologischen H-Akzeptor besitzt die reduzierbare Gruppe des 2,6-DCPIP strukturell Ähnlichkeit? Ubichinon ist der physiologische H-Akzeptor, der eine strukturelle Ähnlichkeit zu der reduzierbaren Gruppe 2,6-DCPIP aufweist. In der Atmungskette ist Ubichinon der Akzeptor, welcher die Elektronen von FADH2 aufnimmt, die wiederum durch die katalytische Reaktion durch SDH gebildet werden. 4. Warum kann die Atmungskette pro oxidiertes Mol Succinat nur 2 Mol ATP liefern?

7 Aus einem Mol Succinat werden ein Mol FAD zu FADH2 umgesetzt. Dabei werden 2 Elektronen aus Ubichinon übertragen. Diese Elektronen werden weiter auf den Komplex III der Atmungskette transportiert. Pro Elektron werden zwei Protonen in den Intermembranraum gepumpt. Das ergibt bis hierhin insgesamt vier Protonen. Weiterhin werden zwei Cytochrom C mit je einem Elektron reduziert. Diese geben an Komplex IV zwei Elektronen ab und es werden wieder zwei Protonen ind den Intermembranraum gepumpt. Zusammen sind dies nun sechs Protonen. Für ein Mol ATP werden in der ATP-Synthase drei Protonen gebraucht. Aus den sechs Protonen ergeben sich somit 2 ATP. Diskussion Der Kontrollansatz zeigte wie zu erwarten kaum eine Veränderung der Extinktion. Der Wert bleibt stets niedrig. Die Veränderung der Temperatur zeigte größtenteils auch die gewünschten Ergebnisse. Das Optimum lag bei C. Somit kann man darauf schließen, dass das Enzym in diesem Temperaturbereich am besten funktioniert. Bei zu niedrigeren Temperaturen blieb der relative Umsatzgeschwindigkeit entweder konstant bei etwa null oder lief langsamer. Bei 100 C denaturierte das Enzym und es kam zu keiner Erniedrigung der Extinktion. Die negativen Extinktionswerte bei 30 C kamen wahrscheinlich durch eine falsche Durchmischung vor der Messung. Der Einfluss von Malonat entsprach auch den Erwartungen. Die Enzymaktivität wurde durch Malonat beeinträchtigt. Bei höheren Konzentrationen an Succinat als Malonat konnte die Hemmung aufgehoben werden. Die Enzymkonzentration beeinflusste die Reaktion, indem bei steigender Enzymkonzentration die Aktivität stieg. Erkennbar durch eine Erniedrigung der Extinktion. Die negativen Werte bei der Messung sind einem Fehler beim Versuch zuzuschreiben. Mögliche Fehlerquellen können sein: eine nicht konstant gehaltene Temperatur der Wasserbäder, fehlerhaftes homogenisieren, nicht genügende Durchmischung der Lösung bevor jeder Extinktionsmessung. Zusammenfassung Die Funktionalität eines Enzyms wie der Succinatdehydrogenase wird durch viele Faktoren beeinflusst. Darunter vor allem die Temperatur, die Hemmung durch Inhibitoren wie Malonat

8 oder auch die Enzymkonzentration an sich. Diese Bereiche bewirken eine Veränderung in der Aktivität eines Enzyms. Literatur Skript Pflanzenphysiologisches Praktikum Biochemie, Stryer, Kapitel 17: Der Citratzyklus 2. Experiment mit dem Enzym Urease Ansprechpartner: Einleitung Enzyme sind in ihrer Funktion als Katalysatoren von biochemischen Reaktionen abhängig von ihrer Substratspezifität. Sie besitzen ein aktives Zentrum mit einer spezifischen räumlichen Struktur, an welches das zu katalysierende Substrat bindet. In diesem Versuch soll die Aktivität von dem Enzym Urease und dessen Spezifität zu dem Substrat Harnstoff bewiesen werden. Das Enzym Urease katalysiert eine Reaktion in der Harnstoff mit Wasser durch mehrere Schritte zu CO2 und Ammoniak reagieren. Da Ammoniak in wässriger Umgebung als Base wirkt, kann als Nachweis der standgefundenen Katalyse eine ph- Wert- Messung genutzt werden. Das freigesetzte Ammoniak kann auch durch die Reaktion nach Berthelot sichtbargemacht werden, da es dann durch Ammoniak zu einer Blaufärbung kommt. Diese Methode wurde jedoch bei diesem Versuch nicht angewendet. Um die Spezifität nachzuweisen, werden außer Harnstoff noch zwei Harnstoffderivate, Thioharnstoff und N, N - Dimethylharnstoff, verwendet. Bei dem Versuch ist zu erwarten, dass es nur bei dem Ansatz mit Harnstoff und Urease zu einem alkalischen ph- Wert kommt, da das Enzym Urease nur für Harnstoff eine Substratspezifität besitzt. Material und Methoden Dies ist dem Skript des Pflanzenphysiologischen Praktikums WS 10/11, S.82 zu entnehmen. Jedoch haben wir die Enzymaktivität nicht durch die Farbreaktion (Reaktion nach Berthelot) nachgewiesen, sondern durch eine Messung des ph- Wertes mit ph- Indikatorpapier.

9 Resultate Tabelle 2.1: ph- Wert Entwicklung im Abstand von 40min bei den Ansätze Negativkontrolle, Enzym+ Harnstoff, Enzym+ Thioharnstoff, Enzym+ N,N - Dimethylharnstoff, um die Substratspezifität von Urease nachzuweisen. Probe Nr. 1.pH- Wert 2.pH- Wert Negativkontrolle 6 6 Enzym+ Harnstoff 6 8 Enzym+ Thioharnstoff 6 6 Enzym+ N,N - Dimethylharnstoff 6 6 In Probe Nummer 1 wurde destilliertes Wasser mit Harnstoff gemischt, um somit eine Negativkontrolle zu erstellen. Aus der Tabelle kann man entnehmen, dass es hier zu keiner ph- Wert- Veränderung kam. Bei den Probennummern 3 und 4 blieb der ph- Wert auch innerhalb von 40 Minuten bei ph 6. Bei diesen Ansätzen wurden die Derivate von Harnstoff, Thioharnstoff(Probe 3) und N, N - Dimethylharnstoff (Probe 4), mit der Urease gemischt. In Probenummer 2 wurde Harnstoff mit der Urease zusammengebracht. Nach 40 Minuten hatte sich der ph- Wert von 6 auf 8 verändert, was ein leicht basisches Milieu bedeutet. Diskussion In dem Versuch kam es nur zu einer ph- Verschiebung in den alkalischen Bereich nur bei Probe 2. Dies war der Ansatz in dem Urease mit Harnstoff vermischt wurde. Urease ist ein substratspezifisches Enzym, welches die Reaktion von Harnstoff zu Kohlenstoff und Ammoniak katalysiert. Die Katalyse konnte in diesem Ansatz nachgewiesen werden, da die ph- Wert- Erhöhung auf ph 8 bewies, dass Ammoniak, welches ein basisches Milieu erzeugt, vorhanden war. Dass Urease substratspezifisch ist, wurde auch durch die Proben 3 und 4 bewiesen, da die beiden Substrate, die hier verwendet wurden, Derivate von Harnstoff sind und somit eine nur ähnliche und nicht gleiche Raumstruktur wie Harnstoff besitzen. Daher kam es zu keiner Katalyse, denn keins der beiden Substrate kann mit einer Bindung an das aktive Zentrum eine katalytische Reaktion hervorrufen. Dies wird durch den ph- Wert, welcher sich innerhalb von 40 Minuten nicht verändert hat, unterstrichen.

10 Als Fazit kann man schließen, dass die Ergebnisse genau die Erwartungen aus der Einleitung wiederspiegeln. Literatur Skript zu dem Pflanzenphysiologischen Praktikum WS 2010/ Versuch: Stärkesynthese mit Phosphorylase und Glucose-1-Phosphat: Ansprechpartner: Einleitung: Ziel dieses Versuches ist es die Stärkesynthese mit Phosphorylase und Glucose-1-Phosphat durch die Lugol schen Lösung nachzuweisen. Zur Stärkesynthese benötigt man Primer (Startersubstanzen), das funktionsfähige Enzym Phosphorylase und das Substrat Glucose-1-Phosphat. Die Primer und dieses Enzym werden hierbei aus dem Kartoffelsaft extrahiert. Zudem wird die Stärke, die sich auch im Kartoffelsaft befinden durch Kaolin gebunden und wird sich nach der Zentrifugation als Pellet am Boden absetzen, so dass im Überstand nur noch die Phosphorylase und die Primer vorhanden sind. Phosphorylase katalysiert bei der Stärkesynthese folgende Gleichgewichtsreaktion: Phosphorylase (C6H10O5)n + Glc-1P (C6H10O5)n+1 + Pi Ist Glucose-1-Phosphat im Überschuss vorhanden, wie in unseren Versuchsansätzen zwei und drei, so kommt es zur Stärkesynthese. Die Primer, die -1,4-Bindungen enthalten, dienen als Startsequenz, an welche die Glucose-Moleküle durch die Phosphorylase gehangen werden. Woraus zum Schluss schließlich die Stärke entsteht und wie aus der Reaktionsgleichung zu entnehmen ist, auch anorganisches Phosphat freigesetzt wird. Wir weisen die neu synthetisierte Stärke durch die Lugol sche Lösung nach. Wenn in einem der drei Versuchsansätze Stärke entstanden sein sollte, so wird sich nach Zugabe der Lugol`schen Lösung eine bläulich-violette Färbung einstellen. Ansatz eins dient bei den Versuchsansätzen lediglich als Kontrollansatz Es soll nachgewiesen werden, dass die Stärke des Kartoffelsafts komplett vom Kaolin gebunden wurde und somit im Überstand keine Stärke mehr vorhanden ist. Wodurch es nach Zugabe der Lugol`schen Lösung vermutlich nicht zu einer Verfärbung kommen wird. Auch bei Ansatz drei ist keine Verfärbung zu erwarten, da das Enzym durch das kurze Aufkochen vermutlich denaturiert ist. Vermutlich wird sich lediglich

11 in Ansatz zwei eine Verfärbung einstellen, wodurch auch nur hier eine Stärkesynthese zu erwarten ist. Material und Methoden: Siehe Skript Pflanzenphysiologisches Praktikum WS 2010/2011, Seite 83. Resultate: Wie in Tabelle 4.1 zu erkennen, haben wir drei unterschiedliche Ansätze angesetzt. Den Überstand erhielten wir, indem wir den gewonnen Kartoffelsatz zuerst einmal durch Zugabe von Kaolin von Stärke befreiten. Durch die anschließende Zentrifugation setzte sich die durch das Kaolin gebundene Stärke als Pellet am Boden ab. Dadurch erhielten wir den Überstand, indem sich unser Enzym Phosphorylase und die Startersubstanzen befanden. Mit diesem Überstand haben wir dann, wie in Tabelle 4.1 zu erkennen, drei unterschiedliche Ansätze angesetzt. Vor der Zugabe der Lugol schen Lösung wurde der ph-wert in allen drei Ansätzen durch Zugabe von 10%iger Essigsäure auf ph 6 eingestellt. Nach Zugabe der Lugol`schen Lösung war der Stärkenachweise nur beim zweiten Ansatz positiv und bei Ansatz eins und drei negativ. Die im Wasser dissoziierten Polyiodidionen (I3 - ) lagern sich in die helikale Struktur der Stärke ein und bewirken dadurch eine bläulich-violette Färbung, wenn Stärke vorhanden ist. Tabelle 4.1: Ein Enzymansatz (Phosphorylase und Startersubstanzen) wird unter unterschiedlichen Bedingungen mit der Jod-Jod-Kaliumlösung auf Stärke untersucht. In dieser Tabelle wird der Überstand als Enzymansatz bezeichnet, der aus Phosphorylase und den Startersubstanzen besteht. Durch die Zugabe von Kaolin wird sichergestellt, dass im Überstand keine Stärke mehr vorhanden ist. Es ist zu sehen, dass es nur beim Ansatz Zusammensetzung Ergebnis nach Behandlung mit der Jod-Jod-Kaliumlösung 1 5 ml Überstand + 5 ml H2O dest. Keine bläulich-violette Färbung 2 5 ml Überstand + 5 ml Glucose-1-Bläulich-violette Färbung Phosphat-Lösung 3 5 ml Überstand kurz aufkochen + 5 Keine bläulich-violette Färbung, aber Ausflockung ml Glucose-1-Phosphat-Lösung zweiten Ansatz zu einer Stärkebildung gekommen ist. Diskussion und Zusammenfassung: Beim ersten Ansatz ohne Zugabe der Glucose-1-Phosphat-Lösung kam es zu keiner Stärkebildung. In diesem Ansatz fehlt das Substrat Glucose-1-Phosphat, wodurch es zu keiner Stärkebildung kommen kann. Dieser Ansatz diente lediglich als Kontrolle, um nachzuweisen, dass

12 die Stärke der Kartoffel komplett vom Kaolin gebunden wurde und somit im Überstand keine Stärke mehr vorhanden war. Da nach Zugabe der Lugol`schen Lösung der Stärkenachweis hierbei negativ war, ist also bewiesen, dass Kaolin die Stärke komplett gebunden hat und nach der Zentrifugation keine Stärke mehr im Überstand vorhanden war. Beim zweiten Ansatz mit Zugabe der Glucose-1-Phosphat-Lösung kam es zu einer Stärkebildung. Dies liegt daran, dass für die Stärkebildung alle notwendigen Komponenten vorhanden waren. Zur Stärkesynthese müssen nämlich Primer, das funktionsfähige Enzyme Phosphorylase und das Substrat Glucose-1-Phosphat im Ansatz vorhanden sein. Der Primer und die Phosphorylase befinden sich beide im Überstand und die Glucose-1-Phosphat-Lösung wurde zum Ansatz hinzugegeben. Die hieraus gebildete Stärke wird dann mit der Lugol`schen Lösung durch eine bläulich-violette Färbung nachgewiesen. Der dritte Ansatz zeigt keine Färbung, obwohl er die gleichen Komponenten enthält, wie der zweite Ansatz. Dies liegt aber daran, dass dieser Ansatz kurz aufgekocht wurde. Dadurch ist die Phosphorylase denaturiert. Bei der Denaturierung wird die Tertiärstruktur der Phosphorylase zerstört, so dass eine irreversible Inhibition vorliegt, bei der die Phosphorylase ihre Funktion verliert. Aufgrund der günstigen Gleichgewichtslage der Phosphorylase nahm man lange Zeit an, dass sie die Synthese von Stärke und Glykogen katalysiert. Unsere Versuchsergebnisse würden diese Annahme stärken. Jedoch sprechen einige Befunde, die auch im Skript auf Seite 83 erläutert werden, dagegen. So fehlt bei gewissen erblichen Stoffwechselstörungen die Muskelund Leberphosphorylase. Und dennoch kommt es auch in diesen Fällen zur Synthese von Glykogen. Unsere Versuchsergebnisse könnten aber auch eine andere Annahme bestärken und zwar, dass es nur zur Synthese von Stärke durch Phosphorylase kommt, wenn die Stärke zuvor entfernt wurde (dies geschah in unserem Versuch durch die Zugabe von Kaolin). Davon geht man mittlerweile auch aus und kann somit als Schlussfolgerung sagen, dass die Phosphorylase in lebenden Organismen bevorzugt am phosphorolytischen Abbau von Stärke beteiligt ist. Literatur: Das Skript: Pflanzenphysiologisches Praktikum von Dr. Schaffrath und Prof. Slusarenko. Heß, Dieter: Pflanzenphysiologie, 11. Auflage. Stryer, Lubert: Biochemie, Ausgabe 1991.

13 Versuchsteil 4: Bestimmung der Michaeliskonstanten Km von NAD+ der Alkoholdehydrogenase (ADH) Ansprechpartner Kai Gro- mann ADH Einleitung In diesem Versuch geht es darum, die Michaeliskonstate der Reaktion Ethanol + NAD+ Acetaldehyd + NADH + H+ zu bestimmen. Bevor an dieser Stelle auf die Erläuterung der Michaeliskonstanten eingegangen werden soll, sollte zunächst erwähnt werden, dass die betrachtete Reaktion im Stoffwechsel normalerweise in die entgegengesetzte Richtung verläuft und dadurch umgekehrt werden kann, dass das gebildete Acetaldehyd sofort durch Semicarbazid gebunden wird, und sich das Gleichgewicht dadurch auf die Seite des Acetaldehyds verschiebt. Als Biokatalysator (Enzym wirkt hier das Protein Alkoholdehydrogenase) Diese Reaktion ist gekoppelt mit der Reduktion des Co-Substrats NAD+ zu NADH und H+ Über die Lichtabsorption bei 340nm von diesem gebildeten NADH lässt sich der Fortschritt (Umsetzungsrate) der Reaktion bestimmen. Über diese photometrischen Extinktionsmessungen lassen sich daraufhin auch die Maximalgeschwindigkeit berechnen und die Konzentration, an der die Reaktionsgeschwindigkeit 1/2 Vmax beträgt. Diese Konzentration wird auch Michaelis-Menten-Konstante Km der Reaktion genannt. Sie lässt sich graphisch bestimmen wenn man die Reaktionsgeschwindigkeit über die Substratkonzentration aufträgt, bzw. beiden Größen in der doppelt-reziproken Darstellung als Lineweaver-Burk-Diagramm, die lineare Darstellung erleichtert hier das Ablesen von Vmax und Km. Um aus den Daten der photometrischen Messung die Geschwindigkeit zu erhalten benutzt man das Gesetz von Lambert-Beer: v = (ΔE/min)/d*ε*t Material und Methoden

14 Siehe Skript Pflanzenphysiologisches Praktikum WS 10/11, RWTH Aachen S Resultate Tabelle 4.1: Dokumentation der Extinktionswerte des Photometers bei 340nm in 15-Sekunden-Intervallen. 15s 30s 45s 60s 75s 90s 105s 120s 1 0,059 0,087 0,108 0,120 0,122 0,109 0,112 0,12 2 0,045 0,068 0,79 0,094 0,126 0,141 0,154 0, ,065 0,087 0,107 0,128 0,161 0,177 0,144 0, ,049 0,067 0,083 0,102 0,131 0,144 0,156 0, ,035 0,062 0,700 0,080 0,106 0,188 0,128 0, ,062 0,082 0,101 0,120 0,154 0,170 0,187 0, ,184 0,241 0,288 0,333 0,413 0,447 0,483 0, ,74 0,167 0,134 0,157 0,203 0,226 0,246 0,268 Tabelle 4.2: Auswertung der Messdaten anhand im Folgenden aufgeführten Berechnungen. [S] NAD + ΔE/min v 1/[S] NAD + 1/v [µmol/l] [ 1 * 1 0 ^ - 8 [l/µmol] µmol/min*ml] [min*ml/mol] ,066 1,061 0,018 94, ,5 0,052 0,836 0, , ,082 1,318 0,009 75, ,07 1,125 0,006 88, ,036 0,579 0, , ,076 1,222 0,003 81, ,184 2,958 0,002 33, Fehler...

15 Erläuterung zur Tabelle 4.2: [S] NAD + [µmol/l] steht für die Konzentration von NAD+ im Gesamtvolumen, berechnet sich aus der Angabe im Skrip von [NAD+]=3,3 µmol/ml, dem Volumen V von NAD und dem Gesamtvolumen der Probe. Beispielrechnung: [NAD + ]= 3,3 µmol/ml V(NAD + )= 0,050 ml VGesamt= 3,0 ml daraus ergibt sich dann: Stoffmenge n(nad + )= 3,3 µmol/ml*0,050 ml = 0,165 µmol Konzentration [NAD + ]= 0,165 µmol/3*10-3 l = 55,000 µmol/l ΔE/min ergibt sich aus der Extinktionszunahme zwischen 30 und 60 Sekunden mal 2, dabei wird die Geschwindigkeit im Bereich des linearen Anstiegs ausgewertet. Beispielrechnung: ΔE= 0,120-0,087 = 0,033 ΔE/min = 0,033 * 2 = 0,066 V wird mit der eingangs erwähnten Formel v = (ΔE/min)/d*ε*t berechnet, Beispielrechnung: ΔE/min =0,066 d = 1 cm ε = 6,22*10 6 cm 2 /mol t = 1 min v = (ΔE/min)/d*ε*t = (0,066)/(1* 6,22*10 6 cm 2 /mol * 1 min) = 1,06*10-8 µmol/min*ml 1/V und 1/[s] werden einfach wie angegeben ausgerechnet

16 3E-8 Diagramm 4.1 Vmax 2,25E-8 Bereich linearen Anstiegs 1,5E-8 7,5E Enzymkonzentration [S] in µmol/l Reaktionsgeschwindigkeit V in µmol/min*ml Diagramm 4.1: Michaelis-Menten-Sättigungskurve - Diagramm zeigt Reaktionsgeschwindigkeit v gegenüber der Co-Substratkonzentration von NAD. Messergebnisse (+) sind sehr gestreut, Kurvenverlauf durch Regressionsfunktion in Exel hinzugefügt. Diagramm 4.1 zeigt die Michaelis-Menten-Sättigungskurve, bezüglich der Messergebnisse aus Tabelle 4.2. Deutlich zu erkennen ist, dass die Kurve mit zunehmender Substratkonzentration deutlich abflacht, also ein Sättigungseffekt eintritt, und am Anfang ist andeutungsweise ein linearer Anstieg zu erkennen. Vmax und Km sind hier graphisch (also sehr ungenau) bestimmt. Der ungefähre Km-Wert liegt hier bei ca 150 µmol/l und die Maximalgeschwindigkeit Vmax bei etwa bei 2,25 *10^-8 µmol/min*ml.

17 Diagramm 4.2: Linewaever-Burk-Diagramm, dass in doppeltreziproker Darstellung V gegenüber der Konzentration von FAD aufträgt. Die Messung sehr ungenau und enthält von Hand ergänzte Angaben zu Km und Vmax an den Schnittstellen mit den Achsen. Vmax=1/ = 1,7 * 10^-8 µmol/min*ml, Km = -1/-0,025= 40 µmol/l In Diagramm 4.2 sollte man nun eigentlich an den Schnittpunkte mit der X- und Y-Achse die Werte für Km und Vmax ablesen können, wobei der Kehrwert des Schnittpunkt mit der Y-Achse Vmax ist und der negative Kehrwert mit der X-Achse der Km-Wert. Graphisch bestimmt beträgt Vmax=1/ = 1,7 * 10^-8 µmol/min*ml, und die Michaelis-Konstante Km = -1/-0,025= 40 µmol/l Diskussion

18 Mit dem Versuch sollte bewiesen werden, dass bei zunehmender Substratkonzentration oder der entsprechenden Co-Substratkonzentration die Reaktionsgeschwindigkeit steigt, bis ab einer bestimmten Konzentration eine Sättigung eintritt, die keine weitere Steigung der Reaktionsgeschwindigket mehr zulässt. Im Groben werden diese Erwartungen im Versuch auch erfüllt, da sich zumindest in den von Exel angelegten Regressionsgraden ein deutliches Michaelis-Menten-Verhalten abzeichnet. Zu beachten ist allerdings im gesamten Versuch, dass die Messergebnisse sehr sehr schlecht und Fehlerbehaftet sind, was vermutlich auf Verunreinigungen auf den Küvetten (Fingerfett) und mangelnde Konzentration beim Notieren der Extinkstionswerte zurückzuführen ist. Durch diese groben Ungenauigkeiten ist es nicht möglich, deutliche Werte für die gesuchten Größen Km und Vmax anzugeben, lediglich Tendenzen lassen sich hier erkennen, die sich dadurch bestätigen zu scheinen, dass zumindest die Werte aus dem Michaelis-Menten-Diagramm und aus dem Lineweaver-Burk-Diragramm in der selben Größenordnung liege, jedoch sehr weit entfernt von den Referenzwerten aus dem Skript.