Fehlinterpretation S.c. zeigt aber keinen Pasteur-Effekt, alkoholische Gärung bevorzugte Form der Energiegewinnung Crabtree-Effekt

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1 Pasteur-Effekt In Gegenwart von Sauerstoff wird bei vielen Organismen der Metabolitenstrom durch die Glycolyse schnell sehr stark vermindert. Durch die Veratmung (kommt später im Detail) der Reduktionsäquivalente (NADH...) wird pro Glucose viel mehr Energie gewonnen, dadurch muss nicht so viel Glucose durchgesetzt werden. Der Effekt beruht auf einer Hemmung der PFK durch hohes ATP und geringes AMP (Effekt des geringen ADP-Spiegels), sowie einem Mangel an ADP und freiem Phosphat, was die GAPDH/PGK und PK-Reaktionen hindert.

2 Pasteur-Effekt Ironischerweise beruht der Name des Effekts auf einer Fehlinterpretation. Louis Pasteur hatte bei der Bäckerhefe (S. cerevisiae) beobachtet, dass unter Belüftung mehr Zellmasse entsteht als unter Luftabschluss. Gerade S.c. zeigt aber keinen Pasteur-Effekt, da bei ihr die alkoholische Gärung (anaerobe Glycolyse) die bevorzugte Form der Energiegewinnung ist und auch in Gegenwart von Sauerstoff geschieht (das wird Crabtree-Effekt genannt).

3 Pasteur-Effekt Durch Glucose-Repression schaltet S.c. die Zellatmung einfach ab. Wenn die Glucose verbraucht ist (die Konzentration unter 0,1% gesunken ist), wird die Atmung aktiv und setzt das Ethanol zu Energie/Wachstum um. Was Pasteur beschrieben hat, ist biphasisches Wachstum (anaerobes Wachstum durch Gärung, nach Umschalten des Stoffwechsels wegen Verbrauch des Gärungssubstrates aerobes Wachstum durch Atmung).

4 Pentosephosphat-Weg Hauptzweck des Pentosephosphatwegs ist nicht die Energiegewinnung, sondern die Bereitstellung von NADPH zu Bauzwecken (z.b. Fettsäuresynthese) und von Pentosen für die Nucleinsäuresynthese.

5 NADH vs. NADPH Während die Zelle nur eine Energiewährung benutzt, das ATP, das mit allen anderen Energieformen frei austauschbar ist, hält sie sich zwei getrennte Pools an Reduktionsäquivalenten, NADH und NADPH, die nur umständlich konvertierbar sind. Dadurch kann die Zelle beide Pools getrennt regeln. Der Brennstoffpool liegt weitgehend oxidiert vor (NAD + :NADH 1000:1), was die Metabolitoxidation (z.b. in der Glycolyse) erleichtert, der Baustoffpool ist weitgehend reduziert (NADP:NADPH 1:100), was die reduktiven Synthesen fördert.

6 Überblick über den Pentosephosphat-Weg

7 Der oxidative Teil des Pentosephosphat-Wegs

8 Der oxidative Teil des Pentosephosphat-Wegs Zunächst wird die Aldehydgruppe der Glucose zur Carbonsäure oxidiert (unter Bildung von NADPH). Da das im Halbacetal passiert, entsteht ein Lacton (intramolekularer Ester), der spontan oder durch Lactonase zerfällt. Dann wird an C3 die Alkoholgruppe zur Ketogruppe oxidiert (wieder entsteht dabei NADPH). Das hypothetische Zwischenprodukt, eine β-ketosäure, decarboxyliert sofort zum Ribulose-5-phosphat. Durch die Lactonspaltung und die Decarboxylierung ist dieser Teil praktisch irreversibel.

9 Der nicht-oxidative Teil des Pentosephosphat-Wegs Dieser Bereich ist durchgehend reversibel. Zum einen werden verschiedene Pentosen ineinander umgewandelt: Ribulose-5-Phosphat Isomerase (Ketose Aldose): Ribulose-5-Phosphat Ribose-5-Phosphat Ribulose-5-Phosphat Epimerase ( Spiegelung an C3): Ribulose-5-Phosphat Xylulose-5-Phosphat (In den weiteren Schritten ist es nie die Ribulose-5-Phosphat, die benötigt wird.)

10 Der nicht-oxidative Teil des Pentosephosphat-Wegs Zum anderen wandern C2- oder C3-Einheiten von einem Zucker zum anderen. Durch Kombination dieser Übertragungen können theoretisch beliebige Zuckergrößen produziert werden. 5+5>3+7 2er wandert 7+3>4+6 3er wandert 5+4>3+6 2er wandert

11 Transketolase Die C2-Einheit wandert in der Transketolasereaktion. Dabei wird das Coenzym Thiaminpyrophosphat benötigt. Es greift den Zucker an und bindet intermediär die C2- Einheit (als Dihydroxyethyl-Thiaminpyrophosphat).

12 Transketolase

13 Transaldolase Die Transaldolasereaktion beruht, ähnlich wie die Aldolase (Glycolyse), auf der Aldolspaltung/kondensation. Die Aminogruppe eines Lysinrests des Enzyms bildet mit der Ketogruppe des Spenderzuckers eine Schiff sche Base (-N=C) und übernimmt dann die C3-Einheit. Durch die Übertragung auf den Empfängerzucker wird das Enzym wieder regeneriert.

14 Transaldolase Während bei der Transketolasereaktion die beiden Carbonylgruppen (Keto- bzw. Aldehydgruppe) miteinander reagieren, ist es bei der Aldolreaktion das azide Kohlenstoff neben der Carbonylgruppe (hier der C3 des Zuckers).

15 Transaldolase und Transketolase Bei beiden Übertragungen stammt der wandernde Teil von einer Ketose (die dadurch zu einer Aldose wird) und wird auf eine Aldose (nämlich auf die Aldehydgruppe) übertragen, die dadurch zur Ketose wird.

16 Entner-Doudoroff-Weg Bei einigen Gram-Negativen, besonders bei Pseudomonaden findet sich ein Abbauweg für Zucker, der wie der Pentosephosphatweg beginnt. Nach der ersten Oxidation und Lactonöffnung folgen die zwei spezifischen Schritte: - 6-Phosphogluconat-Dehydratase produziert 2-Keto-3- desoxygluconsäure-6-phosphat (KDGP), eine Art intramolekularer Disproportionierung (aus zwei Alkoholgruppen wird ein Keton und ein Alkylrest) - KDGP-Aldolase (!) spaltet in Glycerinaldehydphosphat (>Glycolyse) und Pyruvat

17 Entner-Doudoroff-Weg

18 Entner-Doudoroff-Weg Im Vergleich mit der Glycolyse findet man: - es entsteht ein ATP weniger, dafür entsteht ein NADPH statt eines NADH. Wenn die Zelle NADPH zu Bauzwecken benötigt, hat sie keinen ATP-Verlust (die Zelle kann mit Transhydrogenasen unter ATP-Verbrauch aus NADH + NADP > NAD + + NADPH erzeugen). - während die Kohlenstoffatome 4-6 wie in der Glycolyse in GAP (und später Pyruvat) orientiert sind, sind C1-3 invertiert, C1 bildet die Carboxylgruppe im Pyruvat, nach Glycolyse C3.

19 Verbreitung des Entner- Doudoroff-Wegs Unterdessen hat man den Entner-Doudoroff-Weg auch in anderen Bakterien (z.b. auch gram-positiven), Archaen und sogar in Eukaryonten gefunden, oft parallel zu Glycolyse oder Pentose-Phosphat-Weg. Wahrscheinlich ist es der evolutionäre Vorgängerweg der Glykolyse beim Zuckerabbau, während sich die Glykolyse später aus der Gluconeogenese entwickelt hat.

20 Verbreitung des Entner- Doudoroff-Wegs Organismus Pseudomonas aeruginosa Zymomonas mobilis Clostridium pasteurianum Rhodobacter sphaeroides Halobacterium halobium Aspergillus niger Reich Bacteria Bacteria Bacteria Bacteria Archaea Eucaryota Variante cyclisch linear halb-phosph. linear halb-phosph. nicht-phosph.

21 Verbreitung des Entner- Doudoroff-Wegs Neben dem normalen Entner-Doudoroff-Weg gibt es noch eine lineare Variante (das GAP wird via Gluconeogenese wieder zu Glucose-6-P, ATP-Ausbeute 0, dient wohl nur der Vorbereitung für die Atmung), eine halbphosphorylierende (startend mit Glucose, erst das KDG wird zu KDGP phosphoryliert), und eine nichtphosphorylierende, bei der die Aldolspaltung Glycerinaldehyd liefert, das zu Glycerat oxidiert und dann zu 2-Phosphoglycerat phosphoryliert wird (liefern beide auch je 1 ATP pro Glucose).

22 Phosphoketolase-Weg und Milchsäurebakterien Milchsäurebakterien sind eine Ordnung gram-positiver, nicht-sporenbildender meist aerotoleranter Bakterien (Stamm: Firmicutes, Klasse: Bacilli). Milchsäurebakterien produzieren aus Pyruvat mit dem Enzym Laktatdehydrogenase Milchsäure, dabei wird das vorher beim Zuckerabbau gebildete NADH wieder zu NAD + oxidiert. Nach den Gärungsprodukten lassen sich zwei Klassen von Milchsäurebakterien unterscheiden:

23 Phosphoketolase-Weg und Milchsäurebakterien - die homofermentativen Milchsäurebakterien erzeugen das Pyruvat durch Glycolyse, aus einer Glucose entstehen zwei Pyruvat, daraus zwei Lactat als einziges Produkt im Medium. - die heterofermentativen Milchsäurebakterien bauen Glucose über den Phosphoketolase-Weg ab. Ihnen fehlen die Glycolyseenzyme PFK, Aldolase und TPI. C 6 H 12 O 6 2CH 3.CHOH.COOH C 6 H 12 O 6 CH 3.CHOH.COOH. + CH 3 CH 2 OH + CO 2

24 Phosphoketolase-Weg

25 Phosphoketolase-Weg und Milchsäurebakterien Die Anfangsreaktionen entsprechen denen des Pentosephosphatzyklus, allerdings wird NAD + als Elektronenakzeptor benutzt (und wohl kein Lacton gebildet, sondern gleich die Säure).

26 Phosphoketolase-Weg und Milchsäurebakterien Das Xylulose-5-Phosphat wird von der Phosphoketolase unter Einbau von Phosphat gespalten. Es entstehen GAP (>Glycolyse zu Pyruvat, Lactat) und Acetylphosphat. Die Reaktion ähnelt der Transketolasereaktion. Eine C2-Einheit wird auf Thiaminpyrophosphat übertragen, dann weiter auf ein Phosphat.

27 Phosphoketolase-Weg und Milchsäurebakterien Phosphoketolasereaktion im Überblick...

28 Phosphoketolase-Weg und Milchsäurebakterien... und im Detail. Durch die Wasserabspaltung (2. Schritt) entsteht ein Enol, das sich umlagert.

29 Thiaminpyrophosphat Durch den Elektronenzug des Nachbarstickstoffs (+ geladen!) ist der Thiazolkohlenstoff azide. Darum läßt sich die Acetylgruppe auch wieder leicht abspalten (immerhin wird eine C-C-Bindung gespalten, was sonst nur sehr schwer geht).

30 Phosphoketolase-Weg und Milchsäurebakterien Obwohl Acetylphosphat eine energiereiche Verbindung ist, wird es ohne ATP-Bildung in Acetyl-CoA umgewandelt, dann zu Acetaldehyd und schließlich zu Ethanol reduziert (und nimmt so die Elektronen auf, die aus den ersten oxidativen Schritten stammen). Auf diese Weise entsteht pro Glucose nur ein einziges ATP!! Pentosen haben über diesen Weg eine bessere Bilanz (2 ATP). Da hier kein NADH gebildet wurde, kann das Acetyl- Phosphat zur ATP-Bildung eingesetzt werden, Essigsäure entsteht.

31 Phosphoketolase-Weg

32 Struktur von Acetyl- CoA. Die Thioestherbindung ist (wie die bei der GAPDH- Reaktion) energiereich (ΔG -31,4 kj/mol). CoA ist ein wichtiger Überträger (Carrier) von Acetat und Fettsäuren. Coenzym A

33 Phosphoketolase-Weg und Milchsäurebakterien Die Bildung von Acetyl-CoA aus Acetylphosphat ist energetisch günstig. Acetyl-CoA ist energiereicher als ATP, über Acetylphosphat kann es zur ATP-Bildung genutzt werden (Enzyme: Phosphotransacetylase, Acetatkinase). Dabei zieht die Kinasereaktion die Transacetylase.

34 Phosphoketolase-Weg und Milchsäurebakterien Das Reduzieren von Acetylphosphat via Acetyl-CoA zu Acetaldehyd sieht wie eine Energieverschwendung aus. Warum wird nicht erst das ATP gebildet und dann die Essigsäure reduziert? Diese Reduktion geht viel schlechter (Reduktionspotential -0,581 V) und kann nicht von NADH bewerkstelligt werden (-0,315 V, d.h., die Elektronen fließen eher vom Acetaldehyd auf NAD + ). Die Extraenergie im Acetylphosphat/Acetyl-CoA treibt also die Reduktion in die gewünschte Richtung.

35 Phosphoketolase-Weg und Milchsäurebakterien Das Reduktionspotential läßt sich direkt in die freie Enthalpie umrechnen: ΔG = - z * F * ΔE (z Zahl der übertragenen Elektronen, F Faraday-Konstante 96,5 kj/(mol*v), ΔE Potentialunterschied Elektronenakzeptor - Donor in V ). >> Nur wenn der Akzeptor positiver ist als der Donor, ist die freie Enthalpie negativ = die Reaktion begünstigt.

36 Phosphoketolase-Weg und Milchsäurebakterien Wie sieht nach dieser Formel das Reduktionspotential von Acetyl-CoA aus? Nach meiner Rechnung -0,418 V, also immer noch zu negativ. Die folgende Reaktion, Acetaldehyd zu Ethanol, ist aber sehr günstig (-0,197 V) und dürfte die erste Reduktion ziehen (heißt, das Acetaldehyd wird durch die Aldehyddehydrogenase effektiv verbraucht und liegt daher im steady state in sehr kleinen Konzentrationen vor). Das Reduktionspotential ist wie die freie Enthalpie von den Konzentrationsverhältnissen abhängig, die angegebenen Werte sind wieder die Standartwerte (E ) (also erhöht ein hohes Acetyl-CoA/Acetaldehyd Verhältnis das effektive Reduktionspotential).

37 Konzentrationsabhängigkeit des Redoxpotentials Analog zur Konzentrationsabhängigkeit der freien Enthalpie errechnet sich die Konzentrationsabhängigkeit des Redoxpotentials: E = E o + R * T/(z * F) * ln [conz ox ]/[conc red ]

38 Phosphoketolase-Weg und Milchsäurebakterien Schicksal der Kohlenstoffatome von Glucose im Phosphoketolaseweg.

39 Heterofermentative Milchsäurebakterien Einige Milchsäurebakterien vergären Glucose homofermentativ, Pentosen aber über die Phosphoketolase heterofermentativ. Dabei (z.b. Lactobacillus plantarum, L. casei) induziert Ribose die Phosphoketolase. (Kleiner Selbsttest: Wie ist die ATP-Bilanz, wenn die Ribose über den nichtoxidativen Teil des Pentosephosphatwegs und die Glycolyse abgebaut wird, vs. Phosphoketolaseweg?)

40 Heterofermentative Milchsäurebakterien Andere heterofermentative Lactobazillen (L. brevis) übertragen ihre Reduktionsäquivalente auf das Ausgangssubstrat, die Glucose, und reduzieren sie zu Mannit. Sie produzieren kein Ethanol, sondern können aus dem Acetylphosphat ein ATP gewinnen (dafür liefert die Mannit-Glucose keine Energie). Die Bilanz ist dabei noch schlechter als bei der Reduktion von Acetyl-CoA, da jede reduzierte Glucose nur ein NADH regeneriert: 3 Glucose > 2 Mannit + Lactat + Acetat unter Bildung von 2 ATP

41 Milchsäurebakterien Milchsäurebakterien sind grampositive nicht-sporenbildner. Sie sind obligative Gärer, können kein Häm machen und haben daher nicht nur keine Atmungskette, sondern auch keine Katalase (Schutz vor Peroxiden). Trotzdem vertragen (tolerieren) sie Sauerstoff. Sie benötigen die meisten Aminosäuren, Nucleotidbasen und viele Coenzyme, die sie in ihrem natürlichen Substrat, Milch (Pflanzen, Darm, Schleimhäute), reichlich zur Verfügung haben. Dafür können sie Milchzucker, Lactose, in Glucose und Galactose spalten, was in der Natur selten ist. Auch E. coli (natürlich kein Milchsäurebakterium!!!) kann das, wohl, weil er als Darmbewohner auch Milch im Angebot hat.

42 Homo- und heterofermentative Milchsäurebakterien Kokken Stäbchen

43 Milchsäurebakterien Milchsäurebakterien verdrängen Konkurrenten durch das Ansäuern des Nährmediums. Das wird in der Nahrungsmittelindustrie vielfältig genutzt: Sauerkraut (Leuconostoc), Sauermilch (Streptococcus lactis, S. cremoris), Joghurt (S. thermophilus, L. bulgaricus), Kefir (heterofermentative Lactobacillen - Alkohol), Salami, Sauerteig. Zur Diagnose von Milchsäurebakterien dient Kreideagar, die Säure löst das Calciumcarbonat darin auf und erzeugt klare Höfe um die Kolonien.

44 Milchsäurebakterien Bifidobakterium bifidum (zwar gram-positiv, aber keine echte Milchsäurebakterie, sondern vom Stamm Actinomycetales) ist streng anaerob und benötigt N-Acetyl- Glucosamin. Das ist in menschlicher, aber nicht in Kuhmilch enthalten. Daher riecht ein gestillter Säugling (und seine Ausscheidungen) anders (besser!!) als ein Kuhmilchgefütterter.

45 Milchsäurebakterien Nicht alle Milchsäurebakterien sind nützlich oder gutartig. Streptococcus mutans ist der wichtigste Karieserreger, Streptococcus pneumoniae verursacht Lungenentzündung, und Streptococcus pyogenes Scharlach. In immunsupprimierten Patienten können auch z.b. die Milchsäurebakterien aus Actimel (Warum grade die? Weil sie Biofilme bilden, was ihre probiotische Wirkung erklärt) durch Befall innerer Organe schwere Krankheiten verursachen ( Actimel-Tote ).