Praktikum Bakteriengenetik SS 2010

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1 Praktikum Bakteriengenetik SS 2010 Wolfgang Schumann Versuchsteil 1 S. 2 Nachweis σ W -regulierter Gene aus Bacillus subtilis mittels Northern-Blot Versuchsteil 2 S. 15 Anreicherung rekombinanter Taq-Polymerase / Kolonie-PCR Versuchsteil 3 S. 19 Klonierung des rapa-gens aus Bacillus subtilis mit N-terminalem His6-tag 1

2 Versuchsteil 1 Nachweis σ W -regulierter Gene aus Bacillus subtilis mittels Northern-Blot Das σ W -Regulon aus B. subtilis umfasst ca. 60 Gene, deren Funktion vermutlich vor allem in der Abwehr antimikrobieller Komponenten, wie z.b. bestimmter Peptide, liegt (Butcher and Helmann, 2006). Die Aktivität des alternativen ECF (extracytoplasmic function) Sigmafaktors σ W wird durch einen in der Cytoplasmamembran verankerten Anti-Sigmafaktor (RsiW) kontrolliert, der durch direkte Bindung die Wechselwirkung von σ W mit dem RNA-Polymerase Core-Enzym verhindert. Die Gene des Sigmafaktors (sigw) und des Anti-Sigmafaktors (rsiw) befinden sich in einem bicistronischen, autoregulierten Operon. Nach Einwirkung bestimmter extracytoplasmatischer Signale (z.b. eine Alkali-Schock) wird RsiW in einer proteolytischen Kaskade abgebaut, wodurch σ W freigesetzt wird und die Transkription seines eigenen Operons und der etwa 60 Gene des σ W -Regulons initiiert. Am stress-induzierten Abbau von RsiW sind mindestens drei verschiedene Proteasen beteiligt, die Site-1 Protease PrsW (Heinrich and Wiegert, 2006; Ellermeier and Losick, 2006), die Site- 2 Protease RasP (eine intramembrane cleaving Protease; Schöbel et al., 2004), und die cytoplasmatische ATP-abhängige AAA-Protease ClpXP (Zellmeier et al., 2006). Dieser Mechanismus, die Freisetzung eines Regulatorproteins durch Regulated Intramembrane Proteolysis (RIP), ist bei Bakterien bislang nur für wenige Beispiele bekannt und untersucht, bei Eukaryoten jedoch in vielen Variationen zu finden. Das σ W -Regulon wird durch einen Alkalischock spezifisch und signifikant induziert (Wiegert et al., 2001), obwohl die Gene des σ W -Regulons offensichtlich keine Funktion in der ph-homöostase besitzen. Diese 2

3 vermutlich artifizielle Induktion ist dennoch hervorragend geeignet, um den Mechanismus der RIP molekulargenetisch zu untersuchen. Im Rahmen des Praktikums soll die Methode des Northern-Blots erlernt werden. Dazu sollen Riboprobe-Sonden gegen die σ W kontrollierten Gene pbpe und yuag, und als Kontrolle gegen das ebenfalls alkali-induzierbare aber σ W unabhängige Gen yhau und gegen das konstitutiv exprimierte Gen gyra hergestellt werden. Methoden: Herstellung DIG-markierter Riboprobe-Sonden gegen die Gene yuag, pbpe, yhau und gyra Präparation von Gesamt-RNA aus B. subtilis 1012 und 1012 sigw vor und nach einem ph-schock Northern-Blot Analyse Bakterienstämme: B. subtilis 1012 B. subtilis 1012 sigw Primer-Paare: yhau-rp5' : GTGTGAGCCCGATGGACCATC yhau-rp3' : CTAATACGACTCACTATAGGGAGACGGGCTGAACCTCAGGCTTCC gyra5' : TGCGTACGTCCTTCTTGGATTA gyra3 -T7 : CTAATACGACTCACTATAGGGAGATATAACGCATGGCCGCCGCT yuag RP5' : GATATGACAATGCCGATTATA yuag RP3' : CTAATACGACTCACTATAGGGAGATGTTGCGATATCAGCATCGCG 3

4 pbpeex-5 : GGCCATGGATCCATGAAGCAGAATAAAAGAAAGCA pbpe3'-t7 : CTAATACGACTCACTATAGGGAGACTCAGGCGAAAGCCTCCTGT DNA-Sequenz des T7-RNA Polymerase-abhängigen Promotors ist unterstrichen Durchführung: Vorschriften siehe Anhang 1 1. Tag ÜNK der Stämme B. subtilis 1012 und B. subtilis 1012 sigw in 5 ml LB (1012) bzw. 5 ml LB + Bleomycin (1 µg/ml; sigw) animpfen und bei 30 C schütteln PCR-Reaktion zur Herstellung der T7-Polymerase Matrize für die in vitro Transkription zur Herstellung der Riboprobe-Sonden; jeweils zwei Gruppen bekommen ein Primer-Paar 2. Tag Je 50 ml LB in 100 ml Schikanen-Erlenmeyer Kolben mit den ÜNKs auf eine OD 578 = 0,05 animpfen; alle 30 min die OD 578 messen. Bei einer OD 578 = 0,7 Entnahme einer 10 ml Probe, schnell auf Killing- Eis (gefrorener, zerstoßener Killing-Puffer) pipettieren, vermischen und Bakterien mittels Zentrifugation sedimentieren (s. Anhang 1 RNA-Präparation ). Dann Zugabe von 2 N NaOH zu den restlichen Kulturen (120 µl pro 10 ml: Menge berechnen!). Zweite Probe 10 min nach NaOH-Zugabe entnehmen. Präparation der Gesamt-RNA aus den Proben; Ethanol-Fällung ÜN bei -20 C Überprüfung der PCR-Produkte im Agarosegel 3. Tag Gefällte RNA-Proben mittels Zentrifugation sedimentieren, waschen, trocknen und lösen Photometrische Bestimmung der RNA-Konzentration (1 OD 260 entspricht 33 µg/ml einzelsträngiger RNA) 4

5 RNA-Proben vorbereiten und Gelelektrophorese In vitro Transkriptionsansatz für Riboprobe-Sonden ansetzen; Fällung ÜN 4. Tag Northern-Blot Riboprobe-Sonden fertig stellen und überprüfen Riboprobe Sonden durch Präabsorption reinigen 5. Tag Northern-Blot entwickeln Literatur Butcher, B. G. and J. D. Helmann Identification of Bacillus subtilis sigma-dependent genes that provide intrinsic resistance to antimicrobial compounds produced by Bacilli. Mol. Microbiol. 60: Ellermeier, C. D. and R. Losick Evidence for a novel protease governing regulated intramembrane proteolysis and resistance to antimicrobial peptides in Bacillus subtilis. Genes Dev. 20: Heinrich, J. and T. Wiegert YpdC determines site-1 degradation in regulated intramembrane proteolysis of the RsiW anti-sigma factor of Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 62: Schöbel, S., S. Zellmeier, W. Schumann, and T. Wiegert The Bacillus subtilis σ W anti-sigma factor RsiW is degraded by intramembrane proteolysis through YluC. Mol. Microbiol. 52: Wiegert, T., G. Homuth, S. Versteeg, and W. Schumann Alkaline shock induces the Bacillus subtilis σ W regulon. Mol. Microbiol. 41: Zellmeier, S., W. Schumann, and T. Wiegert Involvement of Clp protease activity in modulating the Bacillus subtilis sigma W stress response. Mol. Microbiol. 61:

6 Anhang 1 1. RNA-Präparation aus Bacillus subtilis und Northern- Blot 1.1 DEPC-Behandlung von Lösungen und Glasgeräten Zur Inaktivierung potentiell vorhandener RNasen werden einige Lösungen und Glasgeräte mit DEPC (giftig!) behandelt. Hierzu werden die Lösungen mit 0,1% DEPC (v/v) versetzt, 2 min kräftig geschüttelt, ÜN bei RT inkubiert und anschließend autoklaviert. Glasgefäße werden mit Wasser gefüllt und wie oben beschrieben mit DEPC behandelt. Nach dem Autoklavieren wird das Wasser abgegossen. Hybridisierungsröhren werden zusätzlich nach der DEPC-Behandlung für 1 h bei 120 C getrocknet. 1.2 Isolierung von Gesamt-RNA aus B. subtilis Die Präparation von Gesamt-RNA erfolgt mit Hilfe einer Sauren-Phenol - Methode. Das Prinzip der Methode beruht auf einer Protoplastenbildung der Bakterienzellen durch Lysozym, die durch Überführung in eine Lysislösung mit SDS lysiert werden. Nach der Behandlung mit saurem Phenol liegt die DNA in der organischen Phase vor, während die RNA in der wässrigen Phase bleibt. RNA ist sehr kurzlebig und unterliegt dem Abbau durch RNasen, die sehr stabil sind und sich in nahezu allen biologischen Materialien finden (z.b. Schweiß; Spitzenkästen immer mit Handschuhen auffüllen!). Daher muss die Probenentnahme und Aufarbeitung sehr schnell und sehr sauber erfolgen! Sofort nach der Probenentnahme werden 10 ml Bakteriensuspension auf 5 ml Killing-Eis in Zentrifugenröhrchen gegeben und zentrifugiert (8000 rpm, 4 C, 10 min). Das Pellet wird in 1 ml Killing-Puffer resuspendiert und zentrifugiert (8000 rpm, 4 C, 5 min). Anschließend wird das Pellet auf Eis in 1 ml Lysislösung I resuspendiert, 50 µl Lysozymlösung zugegeben 6

7 und für 5 min auf Eis inkubiert. Während dieser Zeitspanne werden Eppendorfgefäße für den eigentlichen Zellaufschluss vorbereitet: pro RNA- Probe wird ein Reaktionsgefäß mit 270 µl Lysislösung II und 30 µl 10% SDS bei 95 C im Heizblock vorgewärmt. Die durch Lysozymbehandlung in hyperosmotischem Medium erzeugten Protoplasten werden sedimentiert (4000 rpm, 4 C, 5 min), das Pellet in 300 µl Lysislösung II resuspendiert und mit den vorbereiteten 300 µl Lysislösung II/SDS vereinigt. Das Gemisch wird 5 min bei 95 C inkubiert. In diesem Zeitraum werden durch das kombinierte Einwirken von SDS und der hohen Temperatur die Protoplasten lysiert und ihr Inhalt freigesetzt. Unmittelbar nach Beendigung des Aufschlusses werden 600 µl saure Phenol/Chloroform- Lösung vorsichtig zugegeben. Vorsicht! Das Phenol kann aus den Eppendorfgefäßen heraussprudeln. Langsam pipettieren. Selbstverständlich Schutzbrille, Handschuhe und Kittel tragen! Anschließend wird 5 min bei RT geschüttelt, 5 min bei U/min zentrifugiert, 500 µl der Oberphase entnommen und die Phenolbehandlung (500 µl) wiederholt. Dann wird 400 µl der wässrigen Phase mit 1 Volumen Chloroform/Isoamylalkohol (v/v; 1:1) versetzt, 5 min bei RT geschüttelt und anschließend 5 min bei U/min zentrifugiert. Anschließend wird die gesamte wässrige Oberphase (ca. 400 µl) in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Bei der Extraktion ist besonders wichtig, dass keine Bestandteile der weißen Interphase in die abgenommene wässrige Phase gelangen! Daher im Zweifelsfall weniger abnehmen und die Pipettenspitze nur an der Oberfläche der oberen Phase eintauchen! Zur Einstellung einheitlicher RNA-Sekundärsturkturanteile bei allen Proben einer RNA-Präparation wird nun für 10 min bei 65 C und dann 30 min bei RT inkubiert. Anschließend wird 40 µl 3 M Natriumacetat (ph 5,2) und 2,5 7

8 Volumina 96%iger Ethanol zugegeben. Die Fällung der RNA erfolgt für mindestens 1 h bei -80 C oder bei -20 C über Nacht. Das RNA-Präzipitat wird bei rpm und 4 C für 15 min zentrifugiert, das Pellet mit 1 ml 70%igem Ethanol gewaschen und erneut für 15 min zentrifugiert. Das Pellet wird getrocknet und danach in 100 µl DEPCbehandeltem H 2 O dest. gelöst (3 h in Eis und 30 min bei RT). Die Nukleinsäurekonzentration wird bei 260 nm gemessen. Zur Bestimmung werden 5 µl der RNA-Lösung entnommen und mit 995 µl DEPCbehandeltem H 2 O dest. verdünnt. Die beschriebene Methode liefert Ausbeuten von 1 3 µg RNA/µl. Die RNA-Präparationen werden bei -80 C aufbewahrt und vor Gebrauch in Eis aufgetaut. Killing-Puffer : 20 mm Tris/HCl, ph 7,5 5 mm MgCl 2 20 mm NaN 3 aliquotieren und einfrieren Lysislösung I: 25 % Saccharose 50 mm Tris/HCl, ph 8,0 0,25 mm EDTA Lysozymlösung: 20 mg Lysozym/ml H 2 O dest Lysislösung II: 3 mm EDTA 200 mm NaCl Saures Phenol : Aqua-Phenol (Roth), Chloroform, Isoamylalkohol (v/v/v; 25 : 24 : 1), zweimal ausgeschüttelt mit H 2 O dest. Chloroform/Isoamylalkohol: Chloroform, Isoamylalkohol (v/v; 24 : 1), mit 100 mm Tris/HCl, ph 8,0, äquilibriert 1.3 Elektrophorese von RNA in Agarosegelen Die Auftrennung von RNA-Proben erfolgt in denaturierenden 1,2%igen Agarosegelen. Dazu werden zu 0,6 g Agarose 41 ml H 2 O demin./depc und 5 ml zehnfach MOPS gegeben und im Mikrowellenherd zur vollständigen Quellung gebracht. Die gelöste Agarose wird für 30 min bei 65 C 8

9 temperiert, anschließend werden 4,25 ml Formaldehyd zugegeben und der Ansatz erneut für 30 min bei 65 C inkubiert. Im Anschluss werden 35 ml des Agaroseansatzes in eine vorbereitete Flachbettapparatur gegossen. Zum Erstarren wird das Gel 1 h bei RT belassen. Die Elektrophorese erfolgt bei Raumtemperatur mit 1 x MOPS-Puffer als Laufpuffer. Zuerst erfolgt ein Vorlauf von 10 min bei 100 V. In der Zwischenzeit werden die RNA-Proben (je 2 µg in 25 µl H 2 O/DEPC) für die Elektrophorese präpariert. Dazu werden die RNA-Lösungen mit jeweils einem Volumen Probenpuffer versetzt, für 10 min bei 65 C zum Auflösen von Sekundärstrukturen inkubiert und dann sofort in Eis gestellt. Das Gel wird mit 10 µl der RNA- Proben (= 4 µg RNA) und RNA-Molekulargewichtsstandard (1,5 µl plus 1,5 µl RNA-Probenpuffer) beschickt. Die Elektrophorese erfolgt bei 80 V (entspricht 4 V/cm Elektrodenabstand) für zweimal 90 min, wobei nach den ersten 90 min der Laufpuffer gut gemischt, das Gel umgedreht und die Polung an der Spannungsquelle vertauscht wird. Nach der Elektrophorese wird das Gel angefärbt (5 min mit 5 µg/ml Ethidiumbromid in MOPS-Puffer), dreimal für 20 min mit H 2 O/DEPC entfärbt und fotografiert. Über Nacht wird das Gel bei 4 C und mit DEPC-behandeltem H 2 O dest. überschichtet aufbewahrt. 10x MOPS-Puffer: 200 mm MOPS 50 mm Natriumacetat 10 mm EDTA ph mit NaOH auf 7,0 einstellen autoklavieren RNA-Probenpuffer: 6,5 ml Formamid 1,2 ml Formaldehyd 2,0 ml 10x MOPS-Puffer 0,4 ml 50 % Saccharose 20 mg Bromphenolblau 9

10 1.4 Transfer von RNA auf Nylonmembranen Zum Nachweis bestimmter mrna-sequenzen durch Hybridisierungs- Experimente müssen die RNA-Proben auf eine Nylonmembran übertragen werden. Hierfür wird die Northern-Transfer-Methode angewandt. 1.5 Northern-Blot Die Northern-Blot-Technik erlaubt eine qualitative und quantitative Bestimmung spezifischer RNA-Moleküle in RNA-Gemischen. Hierzu werden nach einer gel-elektrophoretischen Auftrennung die RNA-Moleküle auf eine Nylonmembran übertragen und dort immobilisiert. Die Identifikation erfolgt durch Hybridisierung mit einer spezifischen Sonde. Der Vakuum-Transfer wird mit einer Vakuum-Blot-Anlage (VacuGene TM X1) der Firma Pharmacia durchgeführt. Dazu wird eine positiv geladene Nylonmembranen (Pall) mit einer Größe von 8 x 11 cm zunächst für 15 min in 20x SSC eingelegt und danach auf die gut mit H 2 O demin. durchfeuchtete, poröse Trägerplatte gelegt. Mit einer Plastikmaske wird die Membran abgedichtet und abschließend luftdicht das Agarosegel auf die Membran und Plastikmaske aufgelegt. Dann wird ein Vakuum von 50 mm Hg an die Vakuum-Kammer angelegt und das Gel mit den folgenden Lösungen überschichtet: 1. Denaturierungslösung 5 min 2. Neutralisierungslösung 5 min 3. 20x SSC 6 h Die Inkubation mit Denaturierungslösung bewirkt dabei die partielle alkalische Hydrolyse der RNA. Folglich werden die hochmolekularen RNA- Moleküle im Gel zu kleineren Molekülen fragmentiert, was die Transfereffizienz auf die Nylonmembranen erhöht. Nach dem Blotten werden die Filter 2 min mit 20x SSC gespült, um noch anhaftende Agarosereste zu entfernen. Durch einstündiges Erhitzen auf 120 C wird die RNA auf der Nylonmembran fixiert. Auf der UV-Durchlichtbank wird 10

11 der RNA-Längenstandard auf der Nylonmembran markiert. Die Membran wird in Folie eingeschweißt und bei 4 C bis zur Hybridisierung gelagert. Denaturierungslösung: 50 mm NaOH 10 mm NaCl Neutralisierungspuffer: 100 mm Tris/HCl, ph 7,4 20xSSC 3 M NaCl 0,3 M Natriumcitrat, ph 7,0 1.6 Herstellung DIG-markierter ssrna-sonden in vitro Für die in-vitro-transkription wird zunächst mit Hilfe einer PCR eine DNA- Matrize hergestellt. Dazu werden ausgehend von einem 3 -Primer, der neben der komplementären Sequenz weiterhin einen Promotor für die T7- RNA-Polymerase enthält, die gewünschten Bereiche von chromosomaler B. subtilis-dna bzw. DNA eines Plasmids amplifiziert. Das erzeugte Produkt enthält also ebenfalls eine T7-Promotorregion, von der aus ein Antisense- Transkript hergestellt werden kann. Nach Reinigung des Produkts mit QIAquick-PCR-Purification-Kit wird die DNA auf einem Agarosegel auf Reinheit und Integrität geprüft. 1.7 In-vitro-Transkription Zur Herstellung der DIG-markierten ssrna-sonden werden in-vitro- Transkriptionen durchgeführt. Dazu werden folgende Ansätze vorbereitet: 2 µl 10x Transkriptionspuffer 9,5 µl Aqua dest. DEPC-behandelt 2 µl NTP-Markierungsgemisch (mit Digoxygenin) 1 µg DNA-Matrize 2 µl RNA-Polymerase T7 11

12 0,5 µl RNAse-Inhibitor Der Transkriptionsansatz wird zunächst für 3 h bei 37 C inkubiert, und die DNA-Matrize anschließend durch Zugabe von 2 µl DNaseI und Inkubation für 15 min bei 37 C abgebaut. Danach werden 2 µl 0,2 M EDTA, ph 8,0 zugegeben und die RNA-Sonde nach Zugabe von 2,5 µl 4 M LiCl und 75 µl Ethanol abs. über Nacht bei -20 C gefällt. Am nächsten Tag wird das Präzipitat durch 15-minütige Zentrifugation bei rpm und 4 C pelletiert, der Überstand abgenommen, das Pellet mit 1 ml 70% Ethanol gewaschen, erneut bei rpm für 10 min zentrifugiert und das Pellet nach Abnahme des Überstands getrocknet. Aufgenommen wird das Pellet abschließend in 100 µl DEPC-behandeltem Wasser. Zusätzlich wird 0,5 µl RNAse-Inhibitor zugegeben. Die fertige Sonde wird bei -20 C gelagert. 1.8 Reinigung DIG-markierter ssrna-sonde durch Präabsorption Vor ihrer erstmaligen Verwendung werden die ssrna-sonden gereinigt, um bei der Detektion der membran-gebundenen RNA starke Hintergrundsignale auf den Röntgenfilmen zu vermeiden. Daher werden die RNA- Sonden vor ihrer erstmaligen Verwendung zweimal durch Präabsorption gereinigt. Am nächsten Morgen wird die gereinigte Sonde entnommen und bis zur weiteren Verwendung bei -20 C gelagert. 1.9 Hybridisierung membran-gebundener RNA mit Digoxygeninmarkierten Einzelstrang RNA-Sonden Alle nachfolgenden Angaben beziehen sich auf Membrangrößen von maximal 8 x 11 cm. Die Hybridisierung membran-gebundener RNA erfolgt mit Digoxygenin-markierten Einzelstrang-RNA-Sonden (Riboprobes) in DEPC-behandelten Hybridisierungsröhren. Die Nylonmembran mit der hitze-fixierten RNA wird mit 20 ml Prähybridisierungslösung in eine Hybridisierungsröhre transferiert und mindestens 1 h bei 68 C im 12

13 Hybridisierungsofen inkubiert. Währenddessen erfolgte zur Auflösung potentieller Sekundärstrukturen eine Inkubation der Einzelstrang-RNA- Sonde, die sich aus 3 ml Prähybridisierungslösung mit 1 µg Digoxygeninmarkierter RNA zusammensetzt, bei 65 C für 15 min, anschließend wird sie 15 min in Eis inkubiert. Die Prähybridisierungslösung wird entfernt und durch die Hybridisierungslösung ersetzt. Die Hybridisierung erfolgt über Nacht bei 68 C. Am nächsten Morgen wird die Sonde entfernt und bis zum weiteren Gebrauch bei -20 C gelagert. Die Nylonmembran wird zur Entfernung unspezifisch gebundener RNA zuerst zweimal einem niedrigstringenten Waschschritt unterzogen (5 min bei RT in 50 ml 2x SSC, 0,1 % SDS) und danach dreimal einem hochstringenten (15 min bei 68 C in 50 ml prätemperiertem 0,1x SSC, 0,1 % SDS). Danach werden Digoxygenin-markierte RNA-RNA-Hybride nachgewiesen. Prähybridisierungslösung: 50 % (v/v) Formamid 5x SSC 2 % (w/v) Blocking Reagenz/DEPC 0,1 % (w/v) N-Lauroylsarcosin 0,02 % (w/v) SDS Alle Komponenten werden unmittelbar vor Gebrauch aus Stammlösungen zusammenpipettiert, das Gesamtvolumen mit DEPC-behandeltem H 2 O demin. ergänzt und die Lösung vor Gebrauch 30 min bei 37 C präinkubiert Nachweis Digoxygenin-markierter Nukleinsäuren mittels Chemolumineszenz Der Nachweis Digoxygenin-markierter Nukleinsäuren erfolgt in zwei Schritten. Zunächst bindet ein Konjugat aus dem F ab -Fragment eines hochaffinen Anti-Digoxygenin-Antikörpers und dem Enzym alkalische Phosphatase spezifisch an die Digoxygenin-markierte Sonde. Im zweiten Schritt erfolgt durch Katalyse der alkalischen Phosphatase die Spaltung des Chemolumineszenz-Substrats CDP Star, wobei eine Lichtemission ausgelöst wird. Diese Lichtemission kann durch Schwärzung eines 13

14 aufgelegten Röntgenfilms oder mit einem geeigneten Imaging-System detektiert werden. Die nachfolgend beschriebenen Schritte werden bei RT unter leichtem Schütteln in Plastikschälchen durchgeführt. Alle Angaben beziehen sich auf Membrangrößen von maximal 8 x 11 cm. Nach der Hybridisierung wird die Nylonmembran 5 min mit 30 ml Waschpuffer gespült. Danach erfolgt eine Inkubation für 30 min in 30 ml Puffer 2, um unspezifische Antikörper- Bindungsstellen auf der Membran abzusättigen. Nun erfolgt die Bindung des Anti-Digoxigenin-Antikörpers an die Digoxygenin-markierte Sonde für 30 min in 20 ml Antikörperkonjugatlösung (75 mu/ml, Verdünnung 1: in Puffer 2). Um nicht-gebundene Antikörper zu entfernen, wird dreimal 30 min mit 30 ml Waschpuffer gewaschen. Für die Photoemission werden die Membranen mit 3 ml CDP-Star-Lösung (Vorratslösung 10 mg/ml, 1:1000 in 0,1 M Diethanolamin, 1 mm MgCl 2, ph 9,5) überschichtet und 5 min inkubiert. Nach Entfernung der überschüssigen Lösung erfolgt die Detektion der Signale im LAS4000 Imaging System. Puffer 1: 100 mm Maleinsäure, ph 7,5 150 mm NaCl Puffer 2: 1 % (w/v) Blocking Reagenz in Puffer 1 unmittelbar vor Gebrauch angesetzt und 30 min bei 37 C vorinkubieren Waschpuffer: 0,3 % (v/v) Tween 20 in Puffer 1 14

15 Versuchsteil 2 Anreicherung rekombinanter Taq-Polymerase / Kolonie-PCR Die Kolonie-PCR ist eine einfache und schnelle Methode zur Überprüfung einer großen Anzahl von Escherichia coli-transformanten nach einer Klonierung und kann die zeitaufwendige Plasmid-Minipräparation ersetzen. Hierbei wird Zellmaterial von Einzelkolonien direkt von der Platte für eine PCR-Reaktion benutzt, die mittels geeigneter Primer den Nachweis des richtigen Inserts eines zu klonierenden Plasmids ermöglicht. Durch das Erhitzen des PCR-Ansatzes während des ersten PCR-Zyklus platzen die E. coli-zellen und die DNA wird freigesetzt. Typischerweise werden in der Kolonie-PCR 24 bis 98 Einzelklone getestet. Zellmaterial einer Einzelkolonie wird mit einem sterilen Zahnstocher in ein 200 µl Eppendorfgefäß mit 20 µl des entsprechenden PCR-Reaktionsansatzes überführt, und dann auf eine LB-Platte mit einem entsprechenden Raster gepickt. Diese LB-Platte wird dann bei 37 C inkubiert. Die in der PCR als richtig identifizierten Klone werden dann von der LB-Platte zur weiteren Analyse (Plasmid-Präparation, Restriktionsanalyse) verwendet. Klon 1: Klon 2: etc. 15

16 Die routinemäßige Durchführung von Kolonie-PCRs benötigt große Mengen an thermostabiler Taq-DNA-Polymerase, die sehr teuer ist. In diesem Versuchsabschnitt soll deshalb die Taq-Polymerase aus einem rekombinanten E. coli-stamm angereichert werden. Methoden: Überexpression der Taq-Polymerase und Anreicherung durch Hitzefällung Überprüfung der angereicherten Taq-Polymerase mittels SDS-PAGE Überprüfung von Klonen aus Versuchsteil 3 per Kolonie-PCR mit der selbst hergestellten Taq-Polymerase Bakterienstämme: E. coli XL1-Blue / ptp4 (XL1-Blue reca1 enda1 gyra96 thi-1 hsdr17 supe44 rela1 lac [F proab laciqzδm15 Tn10 (Tet-resistent)]) EcoRV BclI bla ptp bps EcoRI HindIII SphI SalI taq AatII KpnI HindIII BamHI Primer-Paar: 16

17 Taq5: GGCCATAGATCTATGCTGCCCCTCTTTGAGCCC Taq3: GGCCATCTGCAGCTCTAGAGGATCTATCACTCCTT Durchführung: Vorschriften siehe Anhang 1. Tag ÜNK E. coli XL1-Blue /ptp4 2. Tag E. coli XL1-Blue /ptp4 aus ÜNK in 500 ml 2xYT Medium (16 g/l Trypton, 8 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl; Amp 100 mg/l) animpfen, bei 37 C schütteln und bei einer OD 600 = 0,8 IPTG (1 mm Endkonz.) zugeben 4 h weiterschütteln, Zellen ernten (6000 rpm, 4 C, 15 min) Zellpellet in 20 ml Puffer A resuspendieren; Suspension in ein 50 ml Redcap überführen und zentrifugieren; Pellet einfrieren 3. Tag Zellpellets auftauen; Präparation der Taq-Polymerase (s. Anhang) 4. Tag Überprüfung der angereicherten Taq-Polymerase im SDS-PAGE Kolonie-PCR mit den Transformanten der Klonierung 5. Tag Überprüfung der Kolonie PCR im Agarosegel Literatur 17

18 Engelke DR, Krikos A, Bruck ME, Ginsburg D. (1990). Purification of Thermus aquaticus DNA polymerase expressed in Escherichia coli. Anal. Biochem. 191: Versuchsteil 3 Klonierung des rapa-gens aus Bacillus subtilis mit N-terminalem His-Tag Das rapa-gen aus B. subtilis codiert für eine Phosphatase, welche das Protein Spo0F~P spezifisch dephosphoryliert. Die Menge an RapA- Phosphatase könnte von der FtsH-Metalloprotease moduliert werden. Um dies in vitro untersuchen zu können, benötigt man gereinigte Komponenten. Methoden: Anfügen eines Reinigungstags Affinitäts-Chromatographie Das bicistronische rapa - phra Operon: aaatatgacatatctcgggtaattcaaaaggggggattaattgaggatgaagcagacgattccgtcctc ttatgtcgggcttaaaattaatgaatggtatactcatatccggcagttccacgtcgctgaagccgaacgg gtcaagctcgaagtagaaagagaaattgaggatatggaagaagaccaagatttgctgctgtattattct ttaatggagttcaggcaccgtgtcatgctggattacattaagccttttggagaggacacgtcgcagctag agttttcagaattgttagaagacatcgaagggaatcagtacaagctgacagggcttctcgaatattacttt aatttttttcgaggaatgtatgaatttaagcagaagatgtttgtcagtgccatgatgtattataaacgggc agaaaagaatcttgccctcgtctcggatgatattgagaaagcagagtttgcttttaaaatggctgagattt tttacaatttaaaacaaacctatgtttcgatgagctacgccgttcaggcattagaaacataccaaatgtat gaaacgtacaccgtccgcagaatccaatgtgaattcgttattgcaggtaattatgatgatatgcagtatcc agaaagagcattgccccacttagaactggctttagatcttgcaaagaaagaaggcaatccccgcctgat cagttctgccctatataatctcggaaactgctatgagaaaatgggtgaactgcaaaaggcagccgaata ctttgggaaatctgtttctatttgcaagtcggaaaagttcgataatcttccgcattctatctactctttaacac aagttctgtataaacaaaaaaatgacgccgaagcgcaaaaaaagtatcgtgaaggattggaaatcgc 18

19 ccgtcaatacagtgatgaattatttgtggagctttttcaatttttacatgcgttatacggaaaaaacattga cacagaatcagtctcacacacctttcaatttcttgaagaacatatgctgtatccttatattgaagagctggc gcatgatgctgcccaattctatatagaaaacggacagcccgaaaaagcactttcattttatgagaaaatg gtgcacgcacaaaaacaaatccagagaggagattgtttatatgaaatctaaatggatgtcaggtttgttg ctcgttgcggtcgggttcagctttactcaggtgatggttcatgcaggtgaaacagcaaacacagaaggg aaaacatttcatattgcggcacgcaatcaaacatgatgcataaaaaaagacccttaggggtcttttttatt tcttcagctt Primer: unterstrichen in der obigen DNA-Sequenz (Beginn und Ende rapa und des partiell überlappenden Gens phra); Start- und Stop-Codons gelb unterlegt RapA5-BamHI: GGCCAT GGACC aggatgaagcagacgattccgt (68 C) RapA3-SmaI: GGCCAT CCCGGG ttagatttcatataaacaatctcctct (68 C) SphI rep Cm SacI Amp XhoI 6000 pht bps 2000 LacI ORF Pgrac Plasmid: pht08 ORF-1 ORF-3 KpnI BamHI SmaI Durchführung: 1. Tag 19

20 PCR zur Amplifikation von rapa mit chromosomaler DNA aus B. subtilis 168 als Template; Überprüfung von 3 µl des PCR-Ansatzes im Agarose-Gel 2. Tag Verdau des PCR-Produkts und des Plasmids pht08 mit BamHI/SmaI; Behandlung mit alkalischer Phosphatase; Reinigung der Restriktionsansätze, Ligation und Transformation 3. Tag Kolonie PCR zur Überprüfung der Transformanten Nguyen,H.D. (2007) Expression vectors for the rapid purification of recombinant proteins in Bacillus subtilis. Current Microbiol. 55: Anhang 1. Herstellung von SDS-Polyacrylamidgelen (SDS- PAGE) Lösungen für SDS-PAGE: Menge für 8 Mini-Gele Trenngel (10%): 15 ml 30% Acrylamid/Bisacrylamid 11,3 ml 1,5 M Tris-HCl, ph 8,8 18 ml Aqua bidest. Unmittelbar vor dem Gießen erfolgt die Zugabe von: 450 µl 10% SDS 22, 5 µl TEMED 225 µl 10% APS (Ammoniumpersulfat) 20

21 Trenngelkante vorsichtig mit ca. 300 µl H 2 O überschichten. Polymerisation für ca. 1 h. Vor dem Giessen des Sammelgels H 2 O mit Filterpapier entfernen. Sammelgel: 2 ml 30% Acrylamid/Bisacrylamid 3.25 ml 1 M Tris-HCl, ph 6,8 9,15 ml Aqua bidest. Unmittelbar vor dem Gießen erfolgt die Zugabe von: 150 µl 10% SDS 15 µl 10% TEMED 75 µl 10% APS Zügig die Kämme einsetzen. Polymerisation für ca. 1 h. Auftragspuffer (8 ml): 1,6 ml Glycerin 0,4 ml -Mercaptoethanol (14 M) 1,6 ml 10 % SDS 0,4 ml Bromphenolblau (0,5 % w/v in H 2 O) 3 ml Aqua bidest. 1,0 ml 0,5 M Tris-HCl ph 6,8 Elektrophoresepuffer (10x): 30 g Tris 140 g Glycin 10 g SDS Aqua dest. ad 1000 ml Färbelösung: 225 ml techn. Methanol (45%) 50 ml techn. Eisessig (10%) 1,25 g Coomasie Blau R-250 Aqua dest. ad 500 ml 21

22 Entfärbelösung: 1500 ml techn. Methanol (30%) 500 ml techn. Eisessig (10%) Aqua dest. ad 5000 ml 2. Anreicherung der Taq-DNA Polymerase Zellpellet aus 500 ml Kultur in 1 ml Puffer A+Compl. suspendieren und auf zwei 2 ml Eppendorfgefässe aufteilen. Zugabe von je 100 µl Lysozym (20 mg/ml) und 750 µl Puffer B. 15 min bei 37 C inkubieren. Danach Zellaufschluss mittels Ultraschallbehandlung. 50 µl Probe entnehmen und einfrieren (1). Inkubation für 1 h bei 75 C im Wasserbad 15 min bei rpm und 4 C zentrifugieren (Eppendorfzentrifuge) Überstand in neues 1,5 ml Eppendorfgefäss überführen und erneut zentrifugieren (15 min bei rpm und 4 C). 50 µl Probe entnehmen und einfrieren (2). Überstände der zwei Proben in eine Amicon Ultra-4 Ultrafiltrationseinheit geben und bei 4000 x g bei 4 C zentrifugieren, bis das Volumen auf 500 µl eingeengt ist. Zweimal auf je 4 ml mit kaltem Puffer C auffüllen und auf 500 µl einengen. In ein Schraubdeckelgefäss überführen und das gleiche Volumen Glycerin zugeben. 50 µl Probe entnehmen und einfrieren (3). Den Rest bei -20 C aufbewahren. SDS-PAGE der Proben. 100 ml Puffer A: 50 mm Tris HCl ph 7,5 50 mm Saccharose 1 mm EDTA 22

23 Puffer A+Compl. 1 Tablette Complete Protease Inhibitor in 10 ml Puffer A Puffer B: 50 mm Tris HCl ph 7,5 50 mm KCl 1 mm EDTA 0,5 % TEEN-20 (v/v) 0,5 % Nonidet P-40 (v/v) Puffer C: 40 mm HEPES ph 7,5 200 mm KCl 0,2 mm EDTA 2 mm DTT 3. Kolonie PCR Master Mix für 24 Reaktionen à 20 µl datp, dctp, dgtp, dttp (10 mm) je 11 µl 10 x PCR-Puffer + MgCl 2 52 µl Primer 5 / 3 je 5 µl Taq-Polymerase 10 µl H 2 O 404 µl Gut durchmischen und je 20 µl auf 24 Eppendorfgefäße verteilen. Anhang: Medien und Puffer 1. Medien und Puffer 23

24 LB-Medium: 10 g Caseinhydrolysat (Trypton oder Pepton) 5 g Hefe-Extrakt 5 g NaCl deionisiertes Wasser ad 1000 ml LB-Platten: LB-Medium mit 15 g Agar pro Liter; nach dem Autoklavieren auf C abkühlen lassen (in ein 55 C Wasserbad stellen); ggf. unmittelbar vor dem Gießen das entsprechende Antibiotikum zugeben TE-Puffer: 10 mm Tris-HCl, ph 8,0 1 mm EDTA 2. Mini-Plasmid-Präparation nach Birnboim (alkalische Lyse) 1. 3 ml ÜNK des Bakterienstammes in LB mit dem entsprechenden Antibiotikum; bei 37 C inkubieren 2. 1,5 ml Bakterien in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß geben und zentrifugieren: Microfuge, 1 min, volle Umdrehungszahl (= x g) 3. Überstand dekantieren, Pellet in 100 µl Birnboim-Lösung A suspendieren 4. Plus 200 µl Birnboim-Lösung B; 5 min bei RT inkubieren 5. Plus 150 µl Birnboim-Lösung C; per Hand durchmischen (kein Vortex), bis ein unlöslicher Komplex aus Protein-chromosomaler DNA- RNA ausfällt; 10 min in Eis inkubieren 6. Zentrifugieren: Microfuge, 10 min, volle Umdrehungszahl, 4 C 7. Überstand von oben entnehmen und in ein neues Reaktionsgefäß geben 24

25 8. Plus 200 µl Phenol, TE-gesättigt und 200 µl Chloroform/IAA (24:1); ca. 30 sec schütteln 9. Zentrifugieren: Microfuge, 5 min, volle Umdrehungszahl µl Überstand von oben entnehmen und in ein neues Reaktionsgefäß geben; plus 400 µl Chloroform/IAA (24:1), ca. 30 sec schütteln 11. Zentrifugieren: Microfuge, 5 min, volle Umdrehungszahl µl Überstand von oben entnehmen und in ein neues Reaktionsgefäß geben; plus 1 ml Ethanol abs., mischen; 10 min in Eis 13. Zentrifugieren: Microfuge, 15 min, volle Umdrehungszahl, 4 C 14. Pellet einmal mit 70% Ethanol waschen 15. Pellet unter Vakuum trocknen (Speed-vac) 16. Getrocknetes Pellet in 30 µl TE Puffer resuspendieren, 0,5 µl RNAse A (20 mg/ml) zugeben Birnboim-Lösungen: Birnboim-Lösung A: 25 mm Tris-HCl, ph mm Glucose 10 mm EDTA, ph 8.0 Birnboim-Lösung B: 0.2 N NaOH 1% SDS; immer frisch ansetzen Birnboim-Lösung C: 3 M Na-acetat, ph M Na-acetat in geringem Volumen Aqua bidest. lösen, mit Eisessig auf ph 4.8 einstellen, dann auf das Endvolumen auffüllen 3. Kolonie-PCR 25

26 Master Mix für 24 Reaktionen à 20 µl datp, dctp, dgtp, dttp (10 mm) je 11 µl 10 x PCR-Puffer + MgCl 2 52 µl Primer 5 / 3 je 5 µl Taq-Polymerase 10 µl H 2 O 404 µl Gut durchmischen und je 20 µl auf 24 Eppendorfgefäße verteilen. 26