Charakterisierung des Oberflächenproteins SSPP105 von Staphylococcus saprophyticus

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1 Aus der Abteilung für Medizinische Mikrobiologie des Institutes für Hygiene und Mikrobiologie der Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum Leiter: Prof. Dr. med. S. G. Gatermann Charakterisierung des Oberflächenproteins SSPP105 von Staphylococcus saprophyticus Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Stephan Rodepeter aus Bochum 2012

2 Dekan: Referent: Korreferent: Prof. Dr. med. Klaus Überla Prof. Dr. med. Sören G. Gatermann Prof. Dr. rer. nat. Hans-Jürgen Streckert Tag der mündlichen Prüfung: 02. Juli 2013

3 Für meinen Großvater

4 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Staphylokokken Koagulase-negative Staphylokokken Staphylococcus saprophyticus MSCRAMM-Proteine LPXTG-Motive Oberflächenassoziierte Virulenzfaktoren von S. saprophyticus Zielsetzung Material Chemikalien Antibiotika Nährmedien Geräte Zentrifugen PCR-Cycler Sonstige Geräte Puffer Erstellung transformationskompetenter E. coli-zellen Mini-Plasmid-Präparation nach Doly (Birnboim und Doly, 1979) Maxi-Plasmid-Präparation mit dem Plasmid Midi Kit der Firma Qiagen Gelelektrophorese Aufreinigung von DNA mit dem QIAquick PCR Purification Kit der Firma Qiagen DNA-Isolierung aus Agarosegelen (präparatives Gel) mit dem QIAquick Gel Extraction Kit der Firma Qiagen

5 3.5.7 Aufreinigung genomischer DNA mit dem QIAamp Mini Kit der Firma Qiagen Protoplastentransformation von S. saprophyticus und S. carnosus DNA-Gewinnung aus Staphylokokken durch Kochlyse (Reischl et al., 2000) Puffer für die Durchflußzytometrie Puffer für die Kollagenadhärenztests Enzyme Verwendete Oligonukleotide Vektoren Zellinien Bakterienstämme Methoden Erstellung transformationskompetenter E. coli-zellen (modifizierte CaCl 2 - Methode) Transformation von E. coli (Hitzeschockmethode) Mini Plasmid-Präparation aus E. coli (alkalische Lyse nach Birnboim und Doly (Birnboim und Doly, 1979)) Maxi Plasmid-Präparation aus E. coli mit dem Plasmid Midi Kit der Firma Qiagen Agarose-Gelelektrophorese DNA-Isolierung aus Agarosegelen (präparatives Gel) mit dem QIAquick Gel Extraction Kit der Firma Qiagen Vektor-Dephosphorylierung mit CIP (calf intestinal phosphatase) Aufreinigung von DNA mit dem QIAquick PCR Purification Kit der Firma Qiagen Restriktion von DNA Restriktionsansätze Restriktionsansätze mit DNA einer Mini-Plasmid-Präparation

6 Restriktionsansätze mit DNA einer Maxi-Plasmid-Präparation Erfolgskontrollen der Maxi-Plasmid-Präparation Restriktionen von weiterverwendeter Maxi-Plasmid-Präparations- DNA Restriktionsansätze mit aufgereinigten PCR-Amplifikaten Verwendete Puffer für Mehrfachrestriktionen Ligation von DNA-Fragmenten Aufreinigung genomischer DNA von Staphylococcus saprophyticus mit dem QIAamp Mini Kit der Firma Qiagen Gramfärbung Herstellung von Protoplasten mit partiellem Lysostaphinverdau für S. saprophyticus und S. carnosus Transformation von Protoplasten Homologe Rekombination bei Staphylococcus saprophyticus Kochlyse zur DNA-Gewinnung von Staphylokokken (Reischl et al., 2000) Invasionsversuche von S. saprophyticus und S. carnosus mit Durchflußzytometrie (Szabados et al., 2008) Kollagenadhärenztest mit Bakterien (Sakinc et al., 2006) Speziesidentifikation anhand biochemischer Reaktionen Speziesidentifikation mit dem Vitek 2-Gerät der Firma biomérieux Speziesidentifikation mit Matrix-unterstützter Laser-Desorption/Ionisation Time-of-flight (MALDI-TOF MS) mit dem Microflex LT der Firma Bruker Daltonics PCR-Bedingungen PCR des kompletten sspp105-genes inklusive Randfragmenten aus S. saprophyticus Inverse PCR des sspp105-gens in puc PCR des Konstruktes aus sspp105-randfragmenten und ermb-cassette PCR der Randfragmente des sspp105-gens

7 PCR zum Nachweis von Kontinuität zwischen ermb-cassette und Randfragmenten des sspp105-gens PCR zum Nachweis der ermb-cassette PCR zum Nachweis des Repeats1 des Aas-Gens von S. saprophyticus PCR zum Nachweis des sspp105-gens von S. saprophyticus Software und Online-Datenbanken Ergebnisse Erstellung der sspp105-mutanten Erstellung des sspp105-knockout-konstruktes in E. coli Klonierung des sspp105-genes inklusive Randfragmenten in puc Mini-Plasmid-Präparation der 24 Klone aus der Transformation von puc18 und sspp Inverse PCR des sspp105 in puc Aufreinigung und Restriktion des PCR-Amplifikates der inversen PCR Religation und Transformation des ClaI-restringierten PCR- Amplifikates in DH5α und XL10 gold Mini-Plasmid-Präparation der 24 DH5α-Klone und Restriktion mit EcoRI Verifizierung der ClaI-Schnittstelle des klonierten Plasmides der Klone 4, 5, 7, 10, 11, 16 und Maxi-Plasmid-Präparation Klon Maxi-Plasmid-Präparation von pec4 aus DH5α Isolierung der ermb-cassette von pec Linearisierung und Dephosphorylierung des Vektors von Klon Ligation von Vektor-DNA aus Klon 7 und ermb-cassette mit anschließender Transformation in DH5α Verifizierung des erstellten Konstruktes im puc18-vektor in Klon 4 &

8 Isolierung des erstellten Konstruktes aus puc Schneiden des Vektors pbt2 mit EcoRI und PstI Ligation von pbt2 und Konstrukt mit Transformation in DH5α Verifizierung des Konstruktes im pbt2 von Klon Konstruktion des sspp105-knockouts in S. saprophyticus Protoplastentransformation in S. saprophyticus pbt2-elimination in S. saprophyticus Speziescharakterisierung und Verifizierung des Konstruktes in den Klonen 40, 71, 72 und Klonierung von sspp105 in S. carnosus TM Präparation von prb473 aus DH5α und Isolierung von sspp105 aus puc Ligation von sspp105 mit prb473 und Transformation in DH5α Protoplastentransformation in S. carnosus TM Charakterisierung der erstellten Stämme mittels eines durchflußzytometrischen Invasionsassays Kollagenbindungsaktivität der sspp105-knockout-mutante In-silico Analyse der sspp105-sequenz Diskussion Erstellung der sspp105-knockout-mutante von S. saprophyticus 7108 und der Rekombinate S.carnosus TM300+sspp Kollagenbindungsaktivität Charakterisierung der erstellten Mutanten mit einem durchflußzytometrischen Invasionsassay In-silico Analyse der sspp105-sequenz Zusammenfassung und Ausblick Literaturverzeichnis Anhang

9 Abkürzungen C Grad Celsius A. bidest Aqua bidest Amp Ampicillin AS Aminosäure ATCC American type cell culture collection ATP Adenosintriphosphat BHI Brain-Heart-Infusion bp Basenpaare BSA bovines Serumalbumin bzw. beziehungsweise ca. circa CFU koloniebildende Einheiten (colony forming units) CIP calf intestinal phosphatase Cm Chloramphenicol Da Clindamycin DNA Desoxyribonukleinsäure DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen E Erythromycin EDTA Ethylendiamintetraessigsäure FACS Durchflußzytometrie (fluorescence activated cell sorting) FITS Fluoreszein-Isothiozyanat g Erdbeschleunigung 9,81 m/s² GVO genetisch veränderter Organismus h Stunde kb Kilobasen kbp Kilobasenpaare kda Kilodalton l Liter LB Luria-Bertani M Mol MALDI-TOF MS Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation Time-of-flight 6

10 ml Milliliter mm Millimol MCS multiple cloning site MSCRAMM microbial surface components recognizing adhesive matrix min. Minute OD optische Dichte ORF Offener Leserahmen (open reading frame) PBS Phosphatpuffer (phosphate buffered saline) PCR Polymerase Kettenreaktion (polymerase chain reaction) PEG Polyethylengykol rpm Umdrehungen pro Minute (rotates per minute) RPMI Roswell Park Memorial Institute RT Raumtemperatur SDS Natriumdodecylsulfat sec. Sekunde SK Schüttelkultur STE NaCl/Tris/EDTA (Sodium Chloride-Tris-EDTA) TAE Tris/Acetat/EDTA TBE Tris/Borat/EDTA Tris Tris (hydroxymethyl) aminomethan U Einheiten (units) ÜN über Nacht z. B. zum Beispiel 7

11 Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Verwendete Oligonukleotide Tabelle 2: Verwendete Vektoren Tabelle 3: Verwendete Bakterienstämme Tabelle 4: GVO-Liste Tabelle 5: Vektor-Dephosphorylierung mit calf intestinal phosphatase Tabelle 6: Einzel- & Doppelrestriktionsansatz von DNA aus Mini-Plasmid- Präparationen Tabelle 7: Einzel- & Doppelrestriktionsansatz von DNA aus Maxi-Plasmid- Präparationen Tabelle 8: Einzelrestriktionsansatz von weiterverwendeter Maxi-Plasmid-Präparations- DNA Tabelle 9: Doppelrestriktionsansatz von weiterverwendeter Maxi-Plasmid-Präparations- DNA Tabelle 10: Dreifachrestriktionsansatz von weiterverwendeter Maxi-Plasmid- Präparations-DNA Tabelle 11: Einzel- und Doppelrestriktion von PCR-Amplifikat Tabelle 12: Verwendete Puffer für Mehrfachrestriktionen Tabelle 13: Ansatz und PCR-Bedingungen für das sspp105-gen inklusive Randfragmenten Tabelle 14: Ansatz und PCR-Bedingungen für die inverse PCR des sspp105-genes in puc Tabelle 15: Ansatz und PCR-Bedingungen für die PCR des Konstruktes aus sspp105- Randfragmenten und ermb-cassette Tabelle 16: Ansatz und PCR-Bedingungen für die PCR der Randfragmente des sspp105-genes Tabelle 17: Ansatz und PCR-Bedingungen für den Nachweis der Kontinuität zwischen ermb-cassette und den Randfragmenten des sspp105-genes Tabelle 18: Ansatz und PCR-Bedingungen für den Nachweis der ermb-cassette Tabelle 19: Ansatz und PCR-Bedingungen für den Nachweis des Reapeats1 des Aas- Gens von S. saprophyticus Tabelle 20: Ansatz und PCR-Bedingungen für den Nachweis des sspp105-genes Tabelle 21: Ligationsansätze von puc18 und sspp

12 Tabelle 22: Transformation von puc18 mit sspp Tabelle 23: Transformationsergebnis von inversem PCR-Amplifikat in E. coli Tabelle 24: Ligationsansätze von Konstrukt und pbt Tabelle 25: Wachstumsverhalten von vier selektierten Klonen der Protoplastentransformation Tabelle 26: Primerkombinationen zur Konstruktverifizierung der vier Klone aus der Protoplastentransformation Tabelle 27: CFUs auf PY-Platten mit Erythromycin 10 mg/l nach pbt2-eliminierung Tabelle 28: CFUs auf PY-Platten mit Chloramphenicol 20 mg/l nach pbt2- Eliminierung Tabelle 29: Resistenzverhalten von 88 S. saprophyticus-klonen nach pbt2- Eliminierung Tabelle 30: Primerkombinationen zur Konstruktverifizierung in Klon Tabelle 31: Gen-Cluster von sspp103-sspp105 und deren Proteine bei verschiedenen Staphylokokken-Spezies Tabelle 32: Gen-Cluster von sspp103-sspp105 bei verschiedenen Staphylokokken- Spezies

13 Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Inverse PCR von sspp105 in puc Abbildung 2: Inverse PCR von sspp105 in puc18 bei optimalen PCR-Bedingungen.. 66 Abbildung 3: Aufreinigung des ClaI-restringierten PCR-Amplifikates Abbildung 4: EcoRI-restringierte Mini-Präparations-DNA von 24 Klonen der Transformation von religiertem Amplifikat aus inverser PCR Abbildung 5: ClaI-restringierte Mini-Präparations-DNA der Klone 4, 5, 7, 10, 11, 16, 22 aus der Transformation mit religiertem inversen PCR-Amplifikat Abbildung 6: Restriktionen der Vektor-DNA von Klon 7 mit EcoRI, PstI, EcoRI-PstI und PCR-Amplifikate mit dem Primerpaar sspp105_1f_ecori und sspp105_2r_psti Abbildung 7: Restriktion von pec4 mit ClaI Abbildung 8: Isolierte ermb-cassette aus pec Abbildung 9: Aufgereinigte ermb-cassette und Vektor-DNA von Klon Abbildung 10: Restriktionsansätze mit EcoRI und PstI der Mini-Plasmid-Präparations- DNA von 24 Klonen aus der Transformation von Ligation von Vektor- DNA aus Klon 7 und ermb-cassette Abbildung 11: Verifizierung des Inserts in der Vektor-DNA von Klon 4 und 12 durch Restriktion mit ClaI Abbildung 12: Restriktionansätze der Vektor-DNA von Klon 12 mit ClaI und Restriktionsansatz von pbt2 mit EcoRI Abbildung 13: Charakterisierung der Randfragmente des Inserts in der Vektor-DNA von Klon Abbildung 14: PCR zur Identifikation der Orientierung der ermb-cassette im Insert.. 79 Abbildung 15: Dreifachrestriktion der Vektor-DNA von Klon 12 mit PvuI, EcoRI und PstI Abbildung 16: Isolierung des Konstruktes aus der Vektor-DNA von Klon Abbildung 17: Restriktion von pbt2 mit PstI und Doppelrestriktion mit PstI und EcoRI Abbildung 18: Einzelrestriktionen von pbt2 mit EcoRI und PstI Abbildung 19: Aufgereinigte Doppelrestriktionsansätze von pbt Abbildung 20: Restriktion der Mini-Plasmid-Präparations-DNA mit EcoRI & PstI aus der Transformation pbt2 + Mutationskonstrukt in E. coli

14 Abbildung 21: Restriktion der Vektor-DNA von Klon 28 mit ClaI Abbildung 22: Vergleich von EcoRI/PstI-restringierter zu nicht restringierter Vektor- DNA von Klon Abbildung 23: Vergleich von ClaI-restringierter Vektor-DNA von Klon 28 zu nativer pbt2-dna Abbildung 24: Vergleich der Vektor-Länge von nativen pbt2 zur Vektor-DNA von Klon Abbildung 25: Charakterisierung des Inserts in der Vektor-DNA von Klon 28 mit PCR Abbildung 26: Konstruktcharakterisierung der Klone 5, 22, 25 und 47 aus der Protoplastentransformation von pbt2+insert in S. saprophyticus Abbildung 27: Konstruktcharakterisierung der S. saprophyticus-klone 40, 70, 71 und 73 nach erfolgter pbt2-eliminierung Abbildung 28: Verifizierung des sspp105-knockouts in S. saprophyticus 7108 Klon 40 durch PCR Abbildung 29: Isolierte prb473-dna aus E. coli DH5α Abbildung 30: Restriktion von prb473 mit EcoRI/PstI und Dreifachrestriktion des im puc18 enthaltenen sspp105-gens mit EcoRI/PstI/PvuI Abbildung 31: Quantifizierung der DNA-Menge nach Dephosphorylierung der prb473-dna und isoliertem sspp Abbildung 32: EcoRI/PstI-Restriktion der Vektor-DNA von 24 Klonen aus der Transformation prb473+sspp105 in E. coli DH5α Abbildung 33: Isolierung des sspp105-gens aus prb473 der Klone 56 und Abbildung 34: PCR zur Darstellung der Randfragmente des sspp105 in Vektor-DNA von Klon 56 und Abbildung 35: Durchflußzytometrische Bestimmung der Invasion von S. saprophyticus in die Blasenkarzinom-Zellinie 5637 (Konzentration 3*10 5 /ml) Abbildung 36: Durchflußzytometrische Bestimmung der Invasion von S. saprophyticus in die Blasenkarzinom-Zellinie 5637 (Konzentration 6*10 5 /ml) Abbildung 37: Durchflußzytometrische Bestimmung der Invasion von S. carnosus in die Blasenkarzinom-Zellinie 5637 (Konzentration 3*10 5 /ml)

15 Abbildung 38: Durchflußzytometrische Bestimmung der Invasion von S. saprophyticus und S. carnosus in die Leberzellkarzinom-Zellinie Hep2 (Konzentration 3*10 5 /ml) Abbildung 39: Kollagenadhärenztest von S. saprophyticus 7108 im Vergleich zu 7108 sspp Abbildung 40: Ergebnis der Analyse der AS-Sequenz von SSPP105 durch den SignalP 3.0 Server der technischen Universität Dänemark Abbildung 41: Ergebnis der Analyse der AS-Sequenz von SSPP105 durch den TMHMM Server v. 2.0 der technischen Universität Dänemark Abbildung 42: Ergebnis der Analyse der AS-Sequenz von SSPP105 durch Toppred auf der Mobyle-Plattform des Institut Pasteur Abbildung 43: Graphische Auswertung des Vergleiches der AS-Sequenzen von USA300HOU_2646 bzw. SAR2725 mit SSPP105 durch den CLC Sequence Viewer Abbildung 44: Graphische Auswertung des Vergleiches der AS-Sequenzen von Sca_2431 mit SSPP105 durch den CLC Sequence Viewer Abbildung 45: Graphische Auswertung des Vergleiches der AS-Sequenzen der zu SSPP105 homologen Proteine durch den CLC Sequence Viewer Abbildung 46: Plasmid 1 von S. saprophyticus Abbildung A1: puc18-vektor Abbbildung A2: Schnittstellen der ermb-cassette Abbildung A3: pbt2-vektor

16 1 Einleitung 1.1 Staphylokokken Staphylokokken (von griech: σταφυλή (staphylé) = die Weintraube) sind grampositive, kugelförmige Bakterien, die sich meistens in unregelmäßigen Haufen, Tetraden oder Paaren lagern und sich sowohl unter aeroben als auch anaeroben Bedingungen vermehren. Die Gattung läßt sich aufgrund der Biosynthese des Enzymes Koagulase in zwei Untergruppen differenzieren: koagulase-positive und koagulase-negative Staphylokokken. In der Gruppe der koagulase-positiven Staphylokokken ist Staphylococcus aureus ein wichtiger und gut charakterisierter humanpathogener Keim. S. aureus findet sich als häufige Ursache für Abszesse, Furunkel, Karbunkel, Weichteilund sonstigen Wundinfektionen (Lowy, 1998). 1.2 Koagulase-negative Staphylokokken Koagulase-negative Staphylokokken sind die mit am häufigsten isolierten Keime in der klinischen Mikrobiologie (Rahman et al., 2012). Da koagulase-negative Staphylokokken wie Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hominis, Staphylococcus haemolyticus und Staphylococcus capitis ubiquitärer Bestandteil der menschlichen Hautflora sind, werden hohe Anforderungen an die Diagnostik zur Unterscheidung zwischen klinisch relevanten Infektionen und Kontaminationen gestellt. Lange Zeit ging man davon aus, daß koagulase-negative Staphylokokken nur geringe humanpathogene Bedeutung hätten. Insbesondere der verstärkte Einsatz von Kunstoffmaterialien in der modernen Medizin in Form von Venen- und Harnröhrenkathetern, Bestandteilen von Gelenkersatz- und Gefäßprothesen, künstlichen Herzklappen, Elektroden in Herzschrittmachern und künstlichen Linsen in der Kataraktchirugie zeigte eine Erhöhung der Infektionsrate mit koagulase-negativen Staphylokokken, allen voran S. epidermidis. Ein wichtiger Faktor für die Kolonisierung dieser körperfremden Polymer-Materialien ist die Fähigkeit, an der Kunststoffoberfläche einen dicken, vielschichtigen Biofilm auszubilden, der die Bakterienzellen vor Angriffen des menschlichen Immunsystems schützt (Heilmann et 13

17 al., 1996; Rupp et al., 2001; von Eiff et al., 2002). Neben der Besiedlung dieser Kunststoffmaterialien gibt es Hinweise auf Wundinfektionen, Mittelohrentzündungen, Harnwegsentzündungen, Meningitiden und Endokarditiden, die durch S. epidermidis verursacht werden können (Huebner und Goldmann, 1999; Miele et al., 2001). 1.3 Staphylococcus saprophyticus Ein weiterer wichtiger Vertreter in der Gruppe der koagulase-negativen Staphylokokken ist Staphylococcus saprophyticus. S. saprophyticus ist bei jungen Frauen zwischen 15 und 30 Jahren nach E. coli der zweithäufigste Erreger für Harnwegsentzündungen (Wallmark et al., 1978). Es konnte ein Zusammenhang zwischen der erhöhten sexuellen Aktivität, der Benutzung von spermiziden Kontrazeptiva und der Anzahl der vorangegangenen Harnwegsinfekte mit der Häufigkeit von Infektionen des Harntraktes durch S. saprophyticus bei jungen Frauen gezeigt werden (Fihn et al., 1998). Obwohl in den meisten Fällen Frauen von einer Infektion betroffen sind, konnte der Erreger gelegentlich auch bei Männern mit einer unspezifischen Urethritis nachgewiesen werden (Hovelius et al., 1984). Mögliche prädisponierende Faktoren hierfür können eine Obstruktion der Harnröhre, beispielsweise infolge einer Prostatahyperplasie (Hovelius et al., 1979), oder transurethrale Katheter sein (Widerstrom et al., 2012). Es handelt sich somit meist um ältere männliche Patienten. Neben der Besiedlung des Urogenitaltraktes verursacht S. saprophyticus nur selten andere Infektionen beim Menschen, jedoch wurden bereits Endokarditiden und septische Krankheitsbilder beschrieben (Lee et al., 1987; Singh und Raad, 1990). Die Herkunft von S. saprophyticus ist nicht genau geklärt, allerdings gibt es Hinweise, daß die Kolonisierung mit diesem Keim aus tierischen Erzeugnissen wie Rind-, Geflügel- und Schweinefleisch, Molkereiprodukten und kontaminierten Gemüseprodukten erfolgt (Hedman et al., 1990). Zudem konnte mit S. saprophyticus subsp. bovis eine weitere Subspezies aus den Nüstern von Kühen isoliert werden (Hajek et al., 1996). Gegen ein tierisches Reservoir sprechen andere Arbeiten, die Unterschiede im Invasionsverhalten von tierischen zu humanen Isolaten gezeigt haben (Szabados et al., 2009). Ein weiterer Riskofaktor für eine Besiedelung mit S. saprophyticus stellt das Schwimmen in Freigewässern dar (Hedman und Ringertz, 1991). Vor einigen Jahren wurde vermutet, daß sich uropathogene Klone von S. saprophyticus über einen langen Zeitraum und 14

18 große Distanzen bei jungen Frauen nachweisen lassen und die Trägerinnen dieser Stämme ebenfalls ein Reservoir für S. saprophyticus darstellen können (Widerstrom et al., 2007). Als ein wichtiger Virulenzfaktor von S. saprophyticus wurde bereits Ende der 80er Jahre die bei allen Stämmen vorkommende Urease beschrieben (Gatermann et al., 1989). Dieses Enzym bewirkt eine Alkalisierung des Harnes durch die Hydrolyse von Harnstoff zu Ammoniak und Kohlendioxid und kann die Bildung von Harnsteinen fördern (Takebe et al., 1984; McLean et al., 1985). In den Konkrementen können sich ebenfalls Bakterien ansiedeln und zu einer Persistenz der Infektion führen. Allerdings sind auch andere Spezies in der Lage, Urease zu synthetisieren und somit ist dieses Enzym zur alleinigen Erklärung der Virulenz von S. saprophyticus nicht hinreichend (Gruter et al., 1992). Bereits Ende der 80er Jahre zeigten erste Versuche mit der humanen Leberzellkarzinom-Zellinie Hep2 die Fähigkeit zur Adhäsion (Schmidt et al., 1989) und und später auch zur Invasion von S. saprophyticus in eukaryotische Zellen (Szabados et al., 2008). Weitere Untersuchungen zeigten, daß viele Stämme von S. saprophyticus die Fähigkeit besitzen, durch das 160 kda große Hämagglutinin Schaferythrozyten zu agglutinieren (Hovelius und Mardh, 1979; Gatermann et al., 1992b). Diese Agglutination wird an der Oberfläche von S. saprophyticus vermittelt (Morioka und Tachibana, 1995). Des Weiteren ist der Erreger in der Lage, sich an humanes Urothelgewebe des Ureters und des Tubulusepithels zu binden (Gatermann et al., 1991; Meyer et al., 1996) und sich an Bestandteilen der extrazellulären Matrix anzulagern (Switalski et al., 1983). 15

19 1.4 MSCRAMM-Proteine Die oberflächenassoziierte Proteinfamilie der MSCRAMM-Proteine (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) bei grampositiven Mikroorganismen interagiert mit extrazellulären Matrixproteinen der Wirtszellen und stellt einen wichtigen Faktor bei der Adhäsionsfähigkeit dar (Patti et al., 1994). MSCRAMMs bestehen in der Regel aus einem positiv geladenen C-terminalen Ende und einer hydrophoben M-Region. Dieser Bereich bildet die membrandurchspannende Domäne des Proteins. Des Weiteren besitzen MSCRAMMs ein für Oberflächenproteine bei grampositiven Bakterien typisches Signalerkennungs-Motiv für das Enzym Sortase. Diesem charakteristischen Motiv folgt normalerweise eine W-Domäne, die die Bakterienzellwand durchspannt und reich an den Aminosäuren Glycin und Prolin ist. Der W-Domäne schließt sich eine variable R-Region an, die Aminosäure-repeats unterschiedlicher Länge beinhaltet. Die eigentliche Funktion des jeweiligen Proteins wird durch eine A-Region im Anschluß bestimmt. Abschließend zeigen MSCRAMMs eine N-terminale Signalsequenz, die der Sekretion dient. Wichtige Proteine der MSCRAMM-Familie sind unter anderem der fibrinogenbindende Clumping-Faktor A und das kollagenbindende Cna von S. aureus (McDevitt et al., 1994; Snodgrass et al., 1999; Hartford et al., 2001). 1.5 LPXTG-Motive Viele Oberflächenproteine bei grampositiven Bakterien weisen das sogenannte LPXTG- Motiv auf (Navarre und Schneewind, 1994) (Schneewind et al., 1995). Dieses Aminosäuremotiv, bestehend aus den Aminosäuren Leucin-Prolin-X-Threonin-Glycin, befindet sich am N-terminalen Ende des jeweiligen Proteins. Diese Motive dienen als Signalsequenz für die Sortase A. Bei S. aureus werden nach dem Schnitt des Motivs zwischen Threonin und Glycin durch das Enzym Sortase A die Oberflächenproteine mit der Carboxylgruppe des Threonins an die freie Aminogruppe der Pentaglycingruppe des Peptidoglykans der Bakterienzellwand gekoppelt (Schneewind et al., 1992; Mazmanian et al., 1999; Ton-That et al., 1999). Bakterienzellen, bei denen die Sortase A ausgeschaltet wurde, waren nicht mehr in der Lage, Oberflächenproteine mit dem 16

20 LPXTG-Motiv in die Zellwand zu verankern (Mazmanian et al., 2000; Gaspar et al., 2005). Wichtige LPXTG-Motiv-tragende Oberflächenproteine sind beispielsweise der Clumpingfaktor A von S. aureus (McDevitt et al., 1994) und das M-Protein von S. pyogenes (Navarre und Schneewind, 1999). 1.6 Oberflächenassoziierte Virulenzfaktoren von S. saprophyticus Aas 1998 wurde mit dem Protein Aas (autolysin/adhesin of S. saprophyticus) ein Protein identifiziert, welches neben der Autolyse des Erregers eine wichtige Erklärung für die Adhäsionsfähigkeit lieferte. Dieses 160 kda große Protein besteht aus zwei Enzymen, einer Alaninamidase und einer Glucosaminidase, die durch die Spaltung der Mureinschicht die Zellteilung des Keims ermöglichen. Eine Aas-knockout Mutante zeigte eine Verminderung der Adhäsions- und Autolysefähigkeit von S. saprophyticus (Hell et al., 1998). Aas zeigt Homologien zu Atl, einem Autolysin von S. aureus (Foster, 1995; Oshida et al., 1995; Yamada et al., 1996) und dem Autolysin AtlE von S. epidermidis (Heilmann et al., 1997; Ziebuhr et al., 1997; Mack et al., 1999). Ssp Das Ssp (staphylococcus surface-associated protein) wurde bereits 1992 als 95 kda großes Oberflächenprotein von S. saprophyticus identifiziert. Elektronenmikroskopisch konnte nachgewiesen werden, daß Ssp auf der Zelloberfläche 50 bis 75 nm lange Strukturen bildet (Gatermann et al., 1992a). Erst kürzlich konnte gezeigt werden, daß es sich bei Ssp um eine oberflächenassoziierte, echte Lipase mit Ähnlichkeiten zur Lipase von S. aureus und S. epidermidis handelt (Sakinc et al., 2005; Sakinc et al., 2007). Die Funktion von Lipasen bei Staphylokokken ist jedoch nicht ausreichend geklärt. Versuche in der Erklärung für die Virulenz liegen in der Kolonisierung der menschlichen Haut durch die Erzeugung der für die Bakterienzelle verwertbaren Nährstoffe (Longshaw et al., 2000) bzw. in der Adhärenz an menschliche Zellen (Gribbon et al., 1993; Bowden et al., 2002). 17

21 SdrI Mit SdrI wurde 2005 ein drittes Oberflächenprotein von S. saprophyticus idenfiziert. SdrI gehört in die Gruppe der Serine-Aspartat-repeat-Proteine. Sdr-Proteine ihrerseits gehören der Familie der MSCRAMM-Proteine an. SdrI zeigte Kollagen Typ I gegenüber eine Adhärenz und stellt somit einen weiteren wichtigen zellwandverankerten Adhärenzfaktor von S. saprophyticus dar (Sakinc et al., 2006). Weiterhin wurde gezeigt, daß SdrI auch an der Fibronectinbindung beteiligt ist (Sakinc et al., 2006). UafA 2005 konnte im Zuge der Analyse des kompletten Genomes von S. saprophyticus ein weiteres Oberflächenprotein ermittelt werden. UafA (uro-adherence factor A) wird die Funktion der Hämagglutinations- und Adhäsionsfähigkeit an eukaryotische Zellen von S. saprophyticus zugeschrieben (Kuroda et al., 2005). Erst kürzlich konnte gezeigt werden, daß UafA aus zwei N-Domänen und einer B-Domäne besteht. Die Hämagglutinationsfähigkeit des UafA scheint durch alle drei Domänen verursacht zu werden, wohingegen die Adhäsionsfähigkeit nur durch die B-Domäne bedingt wird (Matsuoka et al., 2010). UafB Überschneidend mit dieser Arbeit wurde Anfang 2011 mit UafB ein weiteres Oberflächenprotein von S. saprophyticus identifiziert. Für das extrachromosomal gelegene Protein konnte eine Bindungsaktivität an Fibrinogen und Fibronectin nachgewiesen werden (King et al., 2011). S. saprophyticus zeigt Unterschiede in der Ausprägung der einzelnen Oberflächenproteine. UafA und Aas kommen häufiger vor als Ssp und SdrI (Kleine et al., 2010). 18

22 2 Zielsetzung Im Rahmen der 2005 durchgeführten Sequenzierung des Genomes von S. saprophyticus ATCC (Kuroda et al., 2005) wurde im fünften Leserahmen des ersten Plasmides ein hypothetisches Oberflächenprotein mit einem LPXTG-Motiv gefunden. Dieses Protein trägt die Bezeichnung SSPP105 und soll durch diese Arbeit näher charakterisiert werden. Die entsprechende Sequenz für das Gen lautet sspp105. Für die Charakterisierung soll eine sspp105-knockout Mutante von S. saprophyticus 7108 erstellt werden. Weiterhin soll das Gen in S. carnosus TM300 kloniert werden, um mit diesem genetisch veränderten Organismus ein Instrument für eine Charakterisierung zu erhalten. Neben Internalisierungsversuchen in eukaryotische Zellen ist eine Testung der Kollagenbindungsfähigkeit geplant. Daneben soll eine In-Silico-Analyse der DNA- und Aminosäuresequenz des SSPP105 erfolgen. 19

23 3 Material 3.1 Chemikalien Agar-Agar Agarose BHI-Medium (brain heart infusion) Borsäure Bromphenolblau Casaminosäuren Chloroform Dikaliumhydrogenphosphat (K 2 HPO 4 ) Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Dulbeccos-PBS Essigsäure Ethanol absolut Ethidiumbromid 1%-Lösung FITS Glucose Glycerin Harnstoff Hefeextrakt Isoamylalkohol Isopropanol Otto Norwald GmbH Biozym Oxoid J.T. Baker Merck BD Diagnostic System Riedel-de-Haën AppliChem Serva PAA J.T. Baker Riedel-de-Haën AppliChem AppliChem AppliChem Riedel-de-Haën Merck Oxoid Riedel-de-Haën Merck 20

24 Kälberserum Kaliumacetat Kaliumhydrogenphosphat (KH 2 PO 4 ) Kalziumchlorid Karbol-Gentiana-Violett Karbol-Fuchsin Kollagen Typ 1 Lugol sche Lösung Luria Broth Base Lysostaphin Magnesiumchlorid (MgCl 2 ) Magnesiumsulfat (MgSO 4 ) Maleinsäure Mannose Natriumchlorid (NaCl) Natriumdodecylsulfat (SDS) (C 12 H 25 NaO 4 S) Natriumhydrogenphosphat (Na 2 HPO 4 ) Natriumhydroxid (NaOH) Natriumpyruvat Natriumsuccinat (Na 2 C 4 H 4 O 4 ) Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol Phenolrot Polyethylenglykol PAA J.T. Baker AppliChem Riedel-de-Haën AppliChem AppliChem Nutacon AppliChem Invitrogen WAK-Chemie Medical J.T. Baker J.T. Baker AppliChem AppliChem J.T. Baker AppliChem J.T. Baker J.T. Baker Invitrogen J.T. Baker AppliChem PAA J.T. Baker 21

25 Rinderserumalbumin Fraction V (BSA) RPMI Salzsäure (HCl) Sorbit Spezialpepton Trehalose Tris(hydroxymethyl)aminomethan Triton X-100 Tryptone Soya Broth Trypton Tween 20 Roth PAA Riedel-de-Haën AppliChem Oxoid Merck Sigma Aldrich AppliChem Oxoid AppliChem AppliChem 22

26 3.2 Antibiotika Die verwendeten Antibiotika wurden von der Firma AppliChem bezogen. Die hergestellten Stocklösungen wurden bei -80 C gelagert. Ampicillin Stocklösung Chloramphenicol Stocklösung Erythromycin Stocklösung Gentamicin Stocklösung 100 mg/ml in A. bidest 20 mg/ml in Ethanol 10 mg/ml in Methanol 10 mg/ml in A. bidest Die verwendeten Antibiotikaplättchen stammten von der Firma Oxoid und wurden bis zum Gebrauch bei 4 C gelagert. Ampicillin Erythromycin Clindamycin Novobiocin 10 µg/plättchen 15 µg/plättchen 2 µg/plättchen 5 µg/plättchen 23

27 3.3 Nährmedien BHI-Agar (Firma Oxoid) 12,5 g/l Rinderhirninfusion 5 g/l Rinderherzinfusion 10 g/l Proteose Pepton 5 g/l NaCl 2,5 g/l Na 2 HPO 4 2 g/l Glucose Zur Herstellung des BHI-Agars wurde 47 g/l BHI-Medium in A. bidest gelöst und mit 10 g/l Agar-Agar vermengt. Das Gemisch wurde daraufhin autoklaviert. Purple-Agar (Firma Oxoid) 10 g/l Proteose Pepton Nr. 3 5 g/l NaCl 1 g/l Rindfleischextrakt 0,02 g/l Bromokresolviolett 15 g/l Agar-Agar Zunächst wurden 31 g/l des Purple-Agars in A. bidest gelöst und autoklaviert. Vor Benutzung des Purple-Agars wurden 5 ml/l eines sterilfiltrierten entsprechenden Zuckers in der Konzentration 1 g/ml A. bidest hinzugefügt. Urea-Agar (Firma Oxoid) 1 g/l Pepton aus Fleisch 1 g/l Glucose 5 g/l NaCl 2 g/l Kaliumhydrogenphosphat 0,012 g/l Phenolrot 12 g/l Agar-Agar Vom Urea-Agar wurden 21 g/l in A. bidest im Dampftopf gelöst und autoklaviert. Vor Gebrauch wurde das Gemisch wiederum im Dampftopf gelöst und es erfolgte die Zugabe von 50 ml/l einer 40%igen Harnstofflösung. 24

28 Luria Bertani-Medium (ph 7,5) 10 g/l Trypton 5 g/l Hefe-Extrakt 5 g/l NaCl ad 1000 ml A. bidest Luria Bertani-Agar LB-Medium mit 16 g/l Agar-Agar PY-Medium (ph 7,2 7,4) 10 g/l Spezialpepton 5 g/l Hefe-Extrakt 1 g/l Glucose 1 g/l NaCl 1,25 g/l Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O ad 1000 ml A. bidest PY-Agar PY-Medium mit 12 g/l Agar-Agar DM3-Agar 5 g Agar-Agar 2,5 g Hefeextrakt 175 ml A. bidest Der Ansatz wurde vermischt und autoklaviert. Danach kamen folgende Bestandteile hinzu: 250 ml 1 M Na-Succinat 50 ml 5% Casaminosäuren 5 ml 10x Phosphatpuffer Anschließend wurde der Puffer im Dampftopf gelöst und im Wasserbad auf 56 C abgekühlt. Vor dem Gießen der Platten wurden noch die folgenden Komponenten hinzugefügt: 5 ml 50%ige Glucose sterilfiltriert 10 ml 1 M MgCl 2 5 ml 5%ige BSA-Lösung sterilfiltriert 25

29 CY-Overlay-Agar 10 g Caseinhydrolysat 10 g Hefe-Extrakt 5,9 g NaCl 4 g Agar-Agar 0,4 l A. bidest Das CY-Overlay-Agar-Gemisch wurde im Dampftopf gelöst, zu je 50 ml portioniert und autoklaviert. Vor Benutzung wurde zu jeweils 25 ml 1 M Na-Succinat-Puffer hinzugefügt, das Gemisch erneut im Dampftopf gelöst und mit jeweils 8 ml CY Stock- Mix versetzt. CY Stock-Mix 20 ml 1 M MgCl 2 10 ml 50 % Glucose 40 ml 1,5 M Glycerolphosphat 10 ml 5 % BSA Trypton-Soja-Medium Modifiziertes RPMI 30 g/l Tryptone Soya Broth 10 % hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum 1 mg/ml Natriumpyruvat in RPMI 1640 mit oder ohne Phenolrot 26

30 3.4 Geräte Zentrifugen Biofuge pico Heraeus Instruments (Rotor Cat. Nr. #3325) Biofuge 13 Heraeus Sepatech (Rotor Cat. Nr. #3757) Biofuge 15R Heraeus Sepatech (Rotor HFA 22.2 #3042) Biofuge stratos Heraeus Instruments (Rotor Cat. Nr. #3332, #3336) Varifuge 3.0 RS Heraeus Instruments (Rotor Cat. Nr. #5315) PCR-Cycler Mastercycler epgradient Mastercycler personal Primus 96 plus Eppendorf Eppendorf MWG-Biotech Sonstige Geräte Photometer Biophotometer Eppendorf Wasserbadschüttler GFL (Gesellschaft für Labortechnik) 1083 Inkubationsschüttler Innova 4330 New Brunswick Scientific GFL (Gesellschaft für Labortechnik) 3033 Brutschränke Heraeus Function line BB 16 Heraeus T6060 Sequenziergerät MWG-Biotech DNA Analyzer Gene Readir 4200 Geldokumentationssystem BIO-RAD Fluor-S MultiImager (Monkey-Box) Mikroskop Olympus BX40 (Objektiv: UPlanFl 100x) Durchflußzytometer FACSCalibur flowcytometer (BD Bioscience) Mikrobielles Identifikationssystem Vitek 2 Biomerieux MALDI-TOF MS Microflex LT Bruker Daltonics 27

31 3.5 Puffer Erstellung transformationskompetenter E. coli-zellen SOB-Medium ph 7,5 20g/l Trypton 5g/l Hefeextrakt 0,5 g/l NaCl MgCl 2 -CaCl 2 -Lösung 80 mm MgCl 2 20 mm CaCl 2 CaCl 2 -Lösung 0,1 M CaCl 2 SOC-Medium SOB-Medium 20 mm MgSO 4 1 M Glucose Mini-Plasmid-Präparation nach Doly (Birnboim und Doly, 1979) Alkalische Lyse Puffer (AL I) 50 mm Glucose 20 mm Tris/HCl ph 8,0 10 mm EDTA Alkalische Lyse Puffer 2 (AL II) 0,2 M NaOH 1 % SDS (w/v) Alkalische Lyse Puffer 3 (AL III) 60 ml 5 M Kaliumacetat 11,5 ml Essigsäure 28,5 ml A. bidest Phenol-Chloroform 25 Volumen gepuffertes Phenol ph 8,0 24 Volumen Chloroform 1 Volumen Isoamylalkohol 28

32 3.5.3 Maxi-Plasmid-Präparation mit dem Plasmid Midi Kit der Firma Qiagen Die genannten Puffer entstammten, mit Ausnahme des 10 x STE-Puffers, dem Plasmid Midi Kit der Firma Qiagen. STE-Puffer (10x) 1 M NaCl 0,1 M Tris 0,01 M EDTA Puffer P1 (Resuspensionspuffer) 50 mm Tris ph 8,0 10 mm EDTA 100 µg/ml RNase A Puffer P2 (Lysepuffer) 200 mm NaOH 1 % SDS (w/v) Puffer P3 (Neutralisierungspuffer) 3.0 M Kaliumacetat ph 5,5 Puffer QBT (Äquilibrierungspuffer) 750 mm NaCl 50 mm 3-N(Morpholino)propansulfonsäure ph 7,0 15 % Isopropanol (v/v) 0,15 % Triton X-100 (v/v) Puffer QC (Waschpuffer) 1 M NaCl 50 mm 3-N(Morpholino)propansulfonsäure ph 7,0 15 % Isopropanol (v/v) Puffer QF (Elutionspuffer) 1,25 M NaCl 50 mm Tris ph 8,5 15 % Isopropanol (v/v) 29

33 3.5.4 Gelelektrophorese 10x DNA-Probenpuffer 0,25 % Bromphenolblau (w/v) 10 mm EDTA (ph 8,0) 50 % Glycerin (v/v) 100 mm Tris-HCl (ph 8,0) 1x TAE-Laufpuffer 40 mm Tris-Acetat 0,5 mm EDTA 1x TBE-Laufpuffer 89 mm Tris-HCl 89 mm Borsäure 2,5 mm EDTA Aufreinigung von DNA mit dem QIAquick PCR Purification Kit der Firma Qiagen Puffer PB gehört zum QIAquick PCR Purification Kit der Firma Qiagen Puffer PE gehört zum QIAquick PCR Purification Kit der Firma Qiagen DNA-Isolierung aus Agarosegelen (präparatives Gel) mit dem QIAquick Gel Extraction Kit der Firma Qiagen Puffer QG Puffer PE gehört zum QIAquick Gel Extraction Kit der Firma Qiagen gehört zum QIAquick Gel Extraction Kit der Firma Qiagen 30

34 3.5.7 Aufreinigung genomischer DNA mit dem QIAamp Mini Kit der Firma Qiagen ATL-Staph 1 ml 1 M Tris ph 8,0 200 µl 0,5 M EDTA 600 µl Triton X-100 ad 50 ml A. bidest Der angesetzte Puffer wurde anschließend sterilfiltriert. Proteinkinase K-Lösung gehört zum QIAamp Mini Kit der Firma Qiagen Lysepuffer AL gehört zum QIAamp Mini Kit der Firma Qiagen Waschpuffer AW1 gehört zum QIAamp Mini Kit der Firma Qiagen Waschpuffer AW2 gehört zum QIAamp Mini Kit der Firma Qiagen Eluationspuffer AE gehört zum QIAamp Mini Kit der Firma Qiagen Protoplastentransformation von S. saprophyticus und S. carnosus 2x SoMM (ph 6,5) 1 M Sorbit 0,04 M Maleinsäure 0,04 MgCl 2 4x PAB 70 g/l Difco antibiotic Medium No. 3 SoMMP (ph 6,5) 8 Teile 2x SoMM 2 Teile 4x PAB 0,5 Teile 5% BSA Na-Succinat-Puffer (ph 7,3) 1 M Bernsteinsäure-Natriumsalz 31

35 10x Phosphatpuffer 0,2 M K 2 HPO 4 0,11 M KH 2 PO DNA-Gewinnung aus Staphylokokken durch Kochlyse (Reischl et al., 2000) Lysis Puffer 1 ml 1% Triton X 100 0,5 ml 0,5% Tween 20 1 ml 1 M Tris-HCl ph 8,0 0,2 ml 0,5 M EDTA ad 100 ml A. bidest Puffer für die Durchflußzytometrie PBS-Puffer ph 7,4 140 mm NaCl 8 mm Na 2 HPO 4 2 mm KH 2 PO Puffer für die Kollagenadhärenztests PBS A -Puffer 140 mm NaCl 270 µm KCl 430 µm Na 2 HPO µm KH 2 PO 4 ph 7,4 32

36 3.6 Enzyme EcoRI (Invitrogen Cat. No ) & REact 3 (Invitrogen Cat. No. Y90004) Schnittstelle: 5 -G AATT C-3 3 -C TTAA G-5 Stamm: Escherichia coli RY13 Reaktionsansatz mit REact 3 (1x): 50 mm Tris/HCl ph 8,0 10 mm MgCl 2 10 mm NaCl Reaktionstemperatur: 37 C PstI (Invitrogen Cat. No ) & REact 2 (Invitrogen Cat. No. Y92500) Schnittstelle: 5 -C TGCA G-3 3 -G ACGT C-5 Stamm: Providencia stuartii Reaktionsansatz REact 2 (1x): 50 mm Tris/HCl ph 8,0 10 mm MgCl 2 50 mm NaCl Reaktionstemperatur: 37 C 33

37 ClaI (Invitrogen Cat. No ) & REact 1 (Invitrogen Cat. No. Y90002) Schnittstelle: 5 -AT CG AT-3 3 -TA GC TA-5 Stamm: Caryophanon latum Reaktionsansatz mit REact 1 (1x): 50 mm Tris/HCl ph 8,0 10 mm MgCl 2 Reaktionstemperatur: 37 C PvuI (Invitrogen Cat. No ) & REact 7 Schnittstelle: 5 -CG AT CG-3 3 -GC TA GC-5 Stamm: Proteus vulgaris Reaktionsbedingungen mit REact 7 (1x): 50 mm Tris/HCl ph 8,0 10 mm MgCl 2 50 mm NaCl 50 mm KCl Reaktionstemperatur: 37 C T4 DNA Ligase (Invitrogen Cat. No ) & 5X DNA Ligase Reaction Buffer T4 Rapid DNA-Ligation Kit (Roche Cat. No ) CIP (calf intestinal phosphatase) & one-phor-all Puffer (10x) (Amersham Pharmacia) 34

38 3.7 Verwendete Oligonukleotide Tabelle 1: Verwendete Oligonukleotide Name Sequenz Schnittstelle Verwendungszweck sspp105_1 F_EcoRI 5 -CGCGAATTCATCTGTTTTAAAATTATATGAACAAGAAG-3 EcoRI Amplifizierung der sspp105-sequenz sspp105_2 R_PstI 5 -GCGCTGCAGAAGATTATGCTGTTTCTTCAACA-3 PstI inklusive Promotorbereich sspp105_1 R_ClaI sspp105_2 F_ClaI 5 -GCGATCGATAATCAACTTATATTTAAAACTGTCGT-3 5 -CGCATCGATCTCCATTCAAAGTGAACACTAGTA-3 ClaI ClaI inverse PCR EM seq 1 5 -CCGTTTACGAAATTGGAACAGG-3 - Nachweis der ermb- EM rev 2 5 -GAATCGAGACTTGAGTGTGC-3 - Cassette und FragmentermB-Kontinuität 35 SSA Rep1 seq SSA Rep1 rev 5 -CAGGTACCGTTAAAGTAC-3 5 -GATACAACTAACTTGGCAG Amplifizierung des Repeat 1 des Aas-Gens von S. saprophyticus

39 3.8 Vektoren Tabelle 2: Verwendete Vektoren Name Quelle Größe Charakteristika Bemerkungen puc18 E. coli 2,68 kb Amp (Ampicillin) r Pharmacia Klonierungsvektor pec4 E. coli 4,3 kb pbt2 prb473 S. saprophyticus E. coli S. carnosus E. coli 6,97 kb Ery (Erythromycin) r Da (Clindamycin) r Amp r Cm (Chloramphenicol) r 5,76 kb Amp r, Cm r Abbildung A1 (Anhang) Träger der ermb- Resistenzcassette (Brückner, 1997) Abbildung A2 (Anhang) Shuttlevektor Replizierbar in E. coli und Staphylokokken temperatursensitive Replikation Gram + Bakterien (Brückner, 1997) Abbildung A3 (Anhang) Shuttle-Vektor Replizierbar in E. coli und Staphylokokken (Brückner et al., 1993) 3.9 Zellinien 5637 Humane Blasenkarzinomzellinie DSMZ Braunschweig Hep2 Humane Leberzellkarzinomzellinie DSMZ Braunschweig 36

40 3.10 Bakterienstämme Tabelle 3: Verwendete Bakterienstämme Stamm Spezies Eigenschaften (Genotyp) Referenz DH5α XL10 gold Escherichia coli Escherichia coli 7108 S. saprophyticus supe44 lacu169 (φ80 lacz M15) hsdr17 reca1 enda1 gyra96 thi-1 rela1 enda1 glnv44 reca1 thi-1 gyra96 rela1 lac Hte (mcra)183 (mcrcb-hsdsmrmrr)173 tet R F'[proAB laci q Z M15 Tn10(Tet R Amy Tn5(Kan R )] Wildtyp-Isolat; Hämagglutination positiv, Ssp positiv, SdrI positiv, sspp105 positiv TM 300 S. carnosus Lipase-negativer Referenzstamm RN 6390 S. aureus nicht-kollagenbindender Referenzstamm (Grant et al., 1990) Stratagene (Gatermann et al., 1988) (Wagner et al., 1998) (Gillaspy et al., 1998) Tabelle 4: GVO-Liste GVO-Nummer Bakterienstamm Plasmid einkloniertes Gen pmb 2004 E. coli XL10 gold pbt2 pmb 2005 E. coli DH 5α prb473 Die verwendeten Bakterienstämme wurden mit der GP-Karte für das Vitek 2-Gerät der Firma biomérieux und mittels Matrix-unterstüzter Laser-Desorption/Ionisation und Timeof-flight (MALDI-TOF MS) auf ihre Spezieseigenschaft überprüft (Szabados et al., 2012). Die während der Arbeit erstellten genetisch veränderten Organismen wurden in das GVO- Verzeichnis des Institutes für medizinische Mikrobiologie der Ruhr-Universität Bochum aufgenommen und erhielten eine fortlaufende Nummer. sspp105- Randsequenzen + ermb sspp105 + Promotorbereich 37

41 4 Methoden 4.1 Erstellung transformationskompetenter E. coli-zellen (modifizierte CaCl 2 -Methode) Zunächst erfolgte eine Beimpfung von 5 ml LB-Medium mit einer E. coli-kolonie und einer anschließenden Inkubationsperiode von 18 Stunden bei 37 C über Nacht im Wasserbadschüttler. Die Kultur wurde in einem Verhältnis von 1:50 in 50 ml, mit 1 ml 1M MgSO 4 versetztes SOB-Medium gegeben. Der Ansatz wurde bis zum Erreichen einer OD 600nm von 0,3 bis 0,4 bei 37 C und 100 rpm in einem 500 ml Erlenmeyerkolben inkubiert und anschließend in ein 50 ml-kunststoffröhrchen überführt. Darauf folgte eine Zentrifugation der Zellen bei 4 C (4.000 xg, 10 min, Varifuge 3.RS) und ein Verwurf des Überstandes. Das Bakterien-Pellet wurde in 25 ml eiskalte MgCl 2 -CaCl 2 -Lösung resuspendiert und 30 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz erneut abzentrifugiert (4.000 xg, 10 min, 4 C, Varifuge 3.RS) und der Überstand wiederum verworfen. Das Sediment wurde nun in 2,5 ml eisgekühlte CaCl 2 -Lösung aufgenommen und nochmals 30 min auf Eis inkubiert. Die so behandelten Zellen wurden daraufhin sofort zur Transformation weiterverwendet. 4.2 Transformation von E. coli (Hitzeschockmethode) Es wurden 200 µl transformationskompetente E. coli-zellen in ein vorgekühltes 1,5 ml- Reaktionsgefäß gegeben und mit 10 µl Ligationsansatz versehen. Der Ansatz wurde vermischt und 30 min auf Eis inkubiert. Anschließend erfolgte der Hitzeschock über einen Zeitraum von 2 min in einem auf 42 C temperierten Wasserbad. Darauf folgte eine 2- minütige Abkühlphase des Ansatzes auf Eis. Dem Transformationsansatz wurde dann 800 µl SOC-Medium zugefügt und bei 37 C mit einer langsamen Schüttelbewegung 30 min inkubiert. 100 µl des Ansatzes wurden auf eine mit einem entsprechenden Antibiotikum versehene LB-Agarplatte gegeben und ausgestrichen. Der Rest des Ansatzes wurde abzentrifugiert ( xg, 1 min, RT, Biofuge pico), in 100 µl SOC resuspendiert und auf eine weitere Agarplatte ausgestrichen. Anschließend wurden die Zellen Stunden über Nacht bei 37 C inkubiert. 38

42 4.3 Mini Plasmid-Präparation aus E. coli (alkalische Lyse nach Birnboim und Doly (Birnboim und Doly, 1979)) Es wurden 5 ml LB-Medium mit 5 µl eines entsprechenden Antibiotikums versetzt und anschließend mit einer E. coli-kolonie beimpft. Die Kultur wurde bei 37 C in einem Wasserbadschüttler Stunden über Nacht inkubiert. Nach dieser Inkubationsperiode wurden 1,5 ml der Kultur in ein 1,5 ml-reaktionsgefäß gegeben und dieses bei xg 5 Minuten bei RT zentrifugiert (Biofuge pico). Der Kulturüberstand wurde verworfen und das Bakterien-Pellet in 100 µl Puffer AL I resuspendiert. Nach einer Zugabe von 200 µl Puffer AL II erfolgte eine 5-minütige Inkubationszeit bei RT. Danach wurden 150 µl Puffer III dem Ansatz zugefügt und kräftig geschüttelt. Der fertige Ansatz wurde nach einer weiteren 5-minütigen Inkubationszeit auf Eis abzentrifugiert (5 min, xg, RT, Biofuge pico) und der Überstand in ein neues 1,5 ml-reaktionsgefäß überführt. Anschließend erfolgte eine Zugabe von 400 µl Phenol-Chloroform und eine kräftige Durchmischung des Ansatzes. Nach einer 5-minütigen Zentrifugation ( xg, RT, Biofuge pico) wurden 300 µl der oberen Phase in ein neues 1,5 ml-reaktionsgefäß gegeben und mit 1 ml absolutem Ethanol versetzt. Die so gefällte Plasmid-DNA wurde 20 min bei 4 C abzentrifugiert ( xg, Biofuge stratos). Der Überstand wurde verworfen und das DNA-Pellet mit 1,5 ml 70%igem Ethanol gewaschen. Nach einer weiteren Zentrifugation (5 min, xg, RT, Biofuge pico) und einer Abnahme des Überstandes erfolgte eine 5-minütige Vakuumtrocknung der isolierten DNA. Das getrocknete DNA-Pellet wurde anschließend in 50 µl 10 mm Tris ph 8,0 suspendiert. Zur Überprüfung der gewonnenen DNA wurde eine Gelelektrophorese durchgeführt. Die Probe wurde mit den entsprechenden Restriktionsenzymen geschnitten und anschließend auf ein 0,8%iges Agarosegel aufgetragen. 4.4 Maxi Plasmid-Präparation aus E. coli mit dem Plasmid Midi Kit der Firma Qiagen Zur Durchführung einer Maxi Plasmid-Präparation wurde das Plasmid Midi Kit der Firma Qiagen verwendet. Die Animpfung der Kultur erfolgte je nach verwendeten High-Copy Vektoren oder Low-Copy Vektoren in 50 ml oder 100 ml LB-Medium in einem 500 ml Erlenmeyerkolben. Hierzu wurde das Medium unter Zugabe von einem 1:100-Verhältnis eines entsprechenden Antibiotikums mit einer E. coli-kolonie beimpft und 18 Stunden über Nacht mit 100 rpm bei 37 C inkubiert. Die angezüchtete Kultur wurde in ein 50 ml 39

43 Kunststoffgefäß gegeben und 10 min bei 4 C abzentrifugiert (4.000 xg, Varifuge 3.0 RS). Der Kulturüberstand wurde verworfen und das Bakterien-Pellet in 50 ml STE-Puffer resuspendiert. Anschließend erfolgte eine weitere Zentrifugation (4.000 xg, 10 min, 4 C, Varifuge 3.0 RS) und eine Abnahme des Überstandes. Das so gereinigte Pellet wurde in 4 ml P1-Puffer suspendiert und jeweils 2 ml des Ansatzes in ein 25 ml Kunststoff- Röhrchen überführt. Nach einer Zugabe von jeweils 2 ml P2-Puffer pro Röhrchen wurde der Ansatz unter ständiger Rollbewegung 5 Minuten bei RT vermischt. Anschließend wurden dem Ansatz 2 ml P3-Puffer pro Röhrchen zugefügt und nach einer Durchmischung 20 min auf Eis inkubiert. Danach erfolgte eine Zentrifugation bei 4 C ( xg, 30 min, Biofuge stratos). Eine Tip 100-Säule wurde mit 4 ml QBT-Puffer äquilibriert und der Überstand des Ansatzes daraufgegeben. Nach Durchlauf des Ansatzes wurde die Säulenmatrix zweimal mit jeweils 10 ml QC-Puffer gewaschen. Darauf folgte die Lösung der DNA von der Säule mit 4,5 ml QF-Puffer. Das Eluat wurde in einem 25 ml-röhrchen aufgefangen und zur DNA-Fällung mit 3,5 ml Isopropanol versetzt und vermischt. Die gefällte DNA wurde auf 4 Reaktionsgefäße zu je 2 ml verteilt und abzentrifugiert ( xg, 20 min, 4 C, Biofuge stratos). Der Überstand wurde verworfen, die DNA-Pellets mit je 1,5 ml 70%igem Ethanol gewaschen und wiederum abzentrifugiert ( xg, 5 min, RT, Biofuge pico). Die Plasmidisolate wurden nach Abnahme des Überstandes 10 Minuten vakuumgetrocknet und jeweils in 50 µl 10 mm Tris ph 8,0 aufgenommen. Zur Überprüfung der gewonnenen DNA wurde eine Gelelektrophorese durchgeführt. 2 µl der Probe wurden mit den entsprechenden Restriktionsenzymen geschnitten und anschließend auf ein 0,8%iges Agarosegel aufgetragen. 4.5 Agarose-Gelelektrophorese Zur Auftrennung von DNA-Fragmenten wurde eine Gelelektrophorese in Flachbettkammern durchgeführt. Die Gele besaßen eine Konzentration von 0,8 1,2 % Agarose in 1x TBE-Laufpuffer für analytische Gele bzw. 0,8 % Agarose in 1x TAE- Laufpuffer und 0,05 % Ethidiumbromid für präparative Gele. Die aufzutrennenden DNA- Proben wurden im Verhältnis 1:10 mit DNA-Probenpuffer versetzt. Das Probenvolumen betrug bei DNA aus einer Mini-Plasmid-Präparation 5 µl, aus einer Maxi-Plasmid- Präparation 2 µl und bei präparativen Gelen zwischen 50 und 100 µl. Die Proben wurden in die Geltaschen überführt und eine weitere Tasche wurde mit 5 µl 1 kb-dna-ladder- Marker befüllt. Die Auftrennung erfolgte 1 2 h bei einer Spannung von 10 V/cm. Die 40

44 analytischen Gele wurden zur Färbung der DNA min in ein Ethidiumbromidbad (1 µg/ml) gegeben und danach mit einem UV-Geldokumentationssystem fotografiert. 4.6 DNA-Isolierung aus Agarosegelen (präparatives Gel) mit dem QIAquick Gel Extraction Kit der Firma Qiagen Die Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen erfolgte mit einem QIAquick Gel Extraction Kit der Firma Qiagen. Die benötigte DNA-Bande wurde mit einem sterilen Skalpell aus dem Agarosegel geschnitten und in ein steriles Serumröhrchen gegeben. Das befüllte Röhrchen wurde gewogen und somit das Gewicht des Gelstückes bestimmt. Es konnten maximal 400 mg Agarose über die Säule aufgereinigt werden. Das dreifache Gelvolumen Puffer QG wurde hinzugefügt und der Ansatz bis zur vollständigen Auflösung des Gelstückes in einem auf 50 C temperierten Wasserbad min inkubiert. Danach wurde ein einfaches Gelvolumen Isopropanol dazugegeben und kräftig durchmischt. Der Ansatz wurde auf eine QIAQuick spin column-säule im 2 ml Kollektor-Auffanggefäß gegeben und zentrifugiert ( xg, 1 min, RT, Biofuge pico). Anschließend wurden 500 µl QG-Puffer auf die Säule gegeben und zentrifugiert ( xg, 1 min, RT, Biofuge pico). Zum Waschen der DNA wurden 700 µl PE-Puffer benutzt und erneut 1 min zentrifugiert ( xg, 1 min, RT, Biofuge pico). Die Säulenmatrix wurde mit 50 µl 10 mm Tris ph 8,0 versetzt und 1 min bei RT inkubiert. Abschließend wurde der Ansatz noch einmal zentrifugiert ( xg, 1 min, RT, Biofuge pico) und die DNA somit eluiert. Zur Kontrolle wurden 5 µl der gewonnenen DNA auf ein 0,8%iges TBE-Agarosegel aufgetragen und eine Gelelektrophorese durchgeführt. 4.7 Vektor-Dephosphorylierung mit CIP (calf intestinal phosphatase) Geschnittene Vektor-DNA, die zur Ligation mit einem Insert benutzt werden sollte, wurde mit CIP dephosphoryliert. Die CIP und der dazugehörige Puffer wurden von der Firma Amersham Pharmacia bezogen. Das Gesamtvolumen des Dephosphorylierungsansatzes betrug 50 µl und enthielt 43 µl aufgereinigte Vektor-DNA, 5 µl one-phor-all Puffer (10x) und 2 µl von 1:20 in one-phor-all Puffer (10x) verdünnter CIP. Der fertige Ansatz (Tabelle 5) wurde 30 min bei 37 C inkubiert und anschließend 15 min bei 85 C inaktiviert. Zum Abschluß folgte eine Abkühlphase von 5 min bei RT. 41