Dr. med. vet. habil. Bernd Köhler

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1 Hygienische Probleme von Biogasanlagen unter besonderer TLL Jena Dr. med. vet. habil. Bernd Köhler 0

2 Abbildung 1: Übersicht der Clostridien-Erkrankungen 1. Gasödeminfektionen (Rauschbrand, Pararauschbrand, Gasbrand, Bradsot, Nekrotisierende Hepatitis u.a.) 2. Enterotoxämien (Breiniere, Nekrotisierende Enteritis, Cl. perfringens Typ A- Enterotoxämie, Cl. sordellii- Enterotoxämie u.a.) 3. Intoxikationen durch Neurotoxine (Tetanus, Botulismus) 4. Lokale Infektionen [Ulzerative Enteritis (Cl. colinum), Antibiotikainduzierte Colitis durch Cl. difficile) u.a.] 1

3 Abbildung 2: Bildung von Clostridium botulinum- Toxin Clostridium botulinum - 7 Toxintypen A-G Clostridium barati - Typ F Clostridium butyricum - Typ E Clostridium limosum - Typ C (eigene Untersuchungen) Clostridium barati und Clostridium butyricum- wahrscheinlich durch die Aufnahme von Toxinplasmiden von Clostridium botulinum 2

4 Abbildung 3: Empfindlichkeit von Tieren und dem Menschen gegen die Toxine der Clostridium botulinum- Typen A-G 3

5 Abbildung 4: Vorkommen von C2-Toxin bei Clostridium botulinum Typ C und Typ D 4

6 Abbildung 5: Clostridium botulinum C2- Toxin (Enterotoxin) Binäres Toxin aus Hafttoxin und Enterotoxin, kein Neurotoxin! Bildung während der Sporulation Cytopathogen für viele Zellarten besonders für Enterozyten Erhöhung der Permeabilität der Darmschleimhaut Hochgradige Flüssigkeitsakkumulation im Darm und in der Lunge (Lungenödem) Nekrotisch-haemorrhagische Schäden der Darmschleimhaut bei fortgeschrittenen Erkrankungen Ursache verlustreicher Darmerkrankungen bei Wasservögeln 5

7 Abbildung 6: Kodierung der Toxinbildung von pathogenen Clostridienstämmen 6

8 Abbildung 7: Nachweis Botulinum-Neurotoxin bildender Keime im Boden eines Areals mit akutem Auftreten von Botulismus bei Wasservögeln 7

9 Aus Clostridia Molecular Biology in the Post-genomic Era by Holger Brüggemann and Gerhard Gottschalk Caister Academic Press 2009, Norfolk KK Seite 108 Compared with culture methods, molecular detection techniques are sensitive, specific, and rapid to perform. A disadvantage of molecular detection assays is that they do not detect biologically active neurotoxin or even activity of genes. 8

10 Abbildung 8: Untersuchungen zum Vorkommen von Cl. botulinum- Neurotoxin bildenden Stämmen im Biokompost, in Gärrückständen, in Gülle aus landwirtschaftlichen Betrieben und in Klärschlämmen von Kläranlagen Untersuchungsmaterial Anzahl der geprüften Betriebe Anzahl der Proben Nachweis Toxin-bildender Cl. botulinum Stämme 1) Anzahl % Bemerkungen Kompostproben ) 2 2 Proben schwach toxisch/ Ohne Zuordnung zu speziellem Toxintyp Klärschlamm Gülle aus Rinder- Schwein- und Geflügelbetrieben (ca. 6-wöchige Vergärung) Proben aus Biotonne Biogasanlagen Summe ) 0,7 1) Nachweis mittels Mausbioassay nach 7 tägiger Anreicherung in cooked meat-medium bzw. Maltose Kalbfleischbouillon nach Nishida und Nakagawara (Grenzwert 10 Dlm/ml) 2) zweifelhafter Befund, Toxin nicht typisierbar 9

11 Abbildung 9: Übersicht der Ergebnisse der Untersuchung von Gärrückständen von Biogasanlagen auf Neurotoxin bildende Clostridium botulinum- Stämme nach ihrer Herkunft Bundesland Getestete Anlagen Anz ahl Negativ % Anzahl % Positiv Toxintyp Schleswig-Holstein Mecklenburg-Vorpommern Niedersachsen x Typ C/D, 1 x Typ B Brandenburg Nordrhein-Westfalen Sachsen-Anhalt Sachsen Bayern x Typ A Baden-Württemberg Summe ,2 5 6, 8 2 x Typ A, 2 x Typ C/D, 1 x Typ B 10

12 Abbildung 10: Geografische Verteilung der untersuchten Biogasanlagen Anlagen mit Nachweis Neurotoxin bildender Clostridium botulinum- Stämme in Gärrückständen von Biogasanlagen o Negative Anlagen 11

13 Abbildung 11: Vergleich der Befunde in Rohstoffen und Gärrückständen von Biogasanlagen und Nachweis Neurotoxin bildender Clostridium botulinum-stämme in Gärresten Lachmöwe Larus ridibundus Blesshuhn Fulica atra Stockente Anas platyrhynchos Höckerschwan Cygnus olor 1) Verarbeitung von verdorbener Silage, nach deren Verfütterung ein Botulismusausbruch bei Rindern erfolgte 12

14 Abbildung 11A: Persistenz von Neurotoxin Typ A bildenden Clostridium botulinum- Stämmen in einer positiven Gärrückstandsprobe 1) Nach 7 tägiger Anreicherung im cooked meat medium 2) ca. 25g schwere Mäuse 13

15 Abbildung 12: Ursachen des Nachweises von Neurotoxin bildenden Clostridium botulinum in Gärrückständen von Biogasanlagen 14

16 Abbildung 13: Biogasanlagen mit Nachweis Neurotoxin bildender Clostridium botulinum- Stämme in Rohstoffen mit negativen Befunden von Gärrückständen 1) Mit typenspezifischen Antitoxinen 15

17 Abbildung 2: Beispiel Diagnostik B2 S1 Verdünnung 105 anaerob Hygienische Probleme von Biogasanlagen unter besonderer Abbildung 14: Beispiel Diagnostik B2 S1 Verdünnung 10 5 anaerob 16

18 Abbildung 15: Beispiel Diagnostik B1 S4 Verdünnung 10 6 mikroaerophil 17

19 Abbildung 16: Gesamtübersicht Anlagentyp und Substratverteilung 18

20 Abbildung 17: Vergleich der Clostridienkonzentrationen in Rohstoffen und Gärresten der Anlage A, B und C 19

21 Abbildung 18: Vergleich der anaeroben Gesamtkeimzahlen insgesamt in Rohstoffen und Gärresten der Biogasanlagen A, B und C Alle Anlagen Anlage A Anlage B Anlage C durchschnittliche Gesamtkeimzahl 2,00E+07 1,80E+07 1,60E+07 1,40E+07 1,20E+07 1,00E+07 8,00E+06 6,00E+06 4,00E+06 2,00E+06 0,00E+00 Rohstoffe Gärreste anaerob anaerob Alle Anlagen 1,00E+07 2,74E+06 Anlage A 1,89E+07 3,3E+06 Anlage B 5,50E+06 2,8E+06 Anlage C 5,60E+06 2,1E+06 20

22 Abbildung 19: Vergleich der aeroben und anaeroben Gesamtkeimzahlen 3,50E+07 Vergleich der Gesamtkeimzahlen Alle Anlagen Anlage A Anlage B Anlage C durchschnittliche Gesamtkeimzahl 3,00E+07 2,50E+07 2,00E+07 1,50E+07 1,00E+07 5,00E+06 0,00E+00 Rohstoffe Gärreste Rohstoffe Gärreste Rohstoffe Gärreste aerob aerob anaerob anaerob gesamt gesamt 21

23 Abbildung 20: Vergleich des Spektrums und der Nachweisraten der Clostridia spp. in Rohstoff- und Gärrückstandsproben in Prozent Spezies Clostridium perfringens Clostridium bifermentans Clostridium barati Clostridium butyricum Clostridium sporogenes Neue Clostridia spp. Clostridium tertium Clostridium tyrobutyricum Clostridium sordellii Clostridium glycolicum Clostridium limosum Clostridium septicum Rohstoffe in % Gärrückstände in % Sonstige Clostridia spp. 1) 1) Nicht Differenzierbar mittels MALDI-System 2-22

24 Abbildung 21: Vergleich der Gesamtkeimzahlen für Clostridia spp. alle Anlagen Vergleich der Gesamtkeimzahlen für Clostridia spezies Alle Anlagen KBE/g Untersuchungsmaterial Rohstoffe Gärreste Rohstoffe Gärreste Rohstoffe Gärreste Rohstoffe Gärreste Rohstoffe Gärreste Rohstoffe Gärreste Cl.p. Cl.p. Cl. sporo. Cl. sporo. Cl. bif. Cl. bif. Cl. baratii Cl. baratii Cl. buty. Cl. buty. Cl. sordelii Cl. sordelii 23

25 Abbildung 22: Vergleich der Gesamtkeimzahlen der verschiedenen Clostridia spp. in den Biogasanlagen A, B und C Vergleich der Gesamtkeimzahlen für Clostridia spezies Alle Anlagen Anlage A Anlage B Anlage C KBE/g Untersuchungsmaterial Rohstoffe Gärreste Rohstoffe Gärreste Rohstoffe Gärreste Rohstoffe Gärreste Rohstoffe Gärreste Cl.p. Cl.p. Cl. sporo. Cl. sporo. Cl. bif. Cl. bif. Cl. baratii Cl. baratii Cl. buty. Cl. buty. 24

26 Abbildung 22 A: Hemmung der Vermehrung von Cl. botulinum in Gärrückständen von Biogasanlagen Vergleichsweise lange Generationszeit von Cl. botulinum von Minuten im Verhältnis zu Cl. perfringens (Generationszeit 8-10 Minuten) u.a. schnell wachsenden Bakterienarten Verschiebung des Nährsubstrates in Richtung Zellulose u.a. pflanzlichen Rohstoffen Dominanz Zellulose abbauender Mikroflora Mangel von ausreichenden Nährstoffen für Cl. botulinum, die zudem von schnell wachsenden Keimen vor allem pathogenen Clostridien aufgebraucht werden Konkurrenzmikroflora, die Cl. botulinum durch Bacteriozide hemmt ph-wert (alkalischer ph-wert für pathogene Clostridien) 25

27 Abbildung 22: Vorkommen u. Toxizität von Cl. perfringens in Rohstoffen und in Gärresten der Biogasanlagentypen A, B und C Anlagen- Typ Proben/ Material Anzahl der Proben Cl. perfringens positiv in % Anzahl der Isolate 1) α- Toxin β1- Toxin Majorletale Toxine β2- Toxin Multiplex PCR NetB- Toxin Epsilon- Toxin Jota- Toxin Minorletale Toxine μ-toxin Hyaluronidase α-toxin Nagler-Einheiten (NE) Rohstoffe k. A A 1 -A 5 Gärreste 15 26, k. A Theta- Toxin < 8 NE NE > 64 NE Rohstoffe k. A B 1 -B 5 Gärreste 15 66, k. A Rohstoffe k. A C 1 -C 5 Gärreste 15 86, k. A Σ Rohstoffe 60 68, k. A Gärreste 45 62, k. A ) Ergebnisse mittels PCR k. A. = keine Angaben 26

28 Abbildung 23: Veterinärhygienische Richtlinien/Anforderungen für den Betrieb von Biogasanlagen Regelmäßige Rohstoffkontrolle insbesondere von tierischen Rohstoffen Kein Einsatz von tierischen und pflanzlichen Rohstoffen aus Beständen mit Botulismusausbrüchen Mikrobiologische Untersuchung von Starterkulturen auf Neurotoxin bildende Clostridium botulinum- Stämme Ausstattung aller Biogasanlagen mit 2 Rohstoffsilos, die wechselseitig (etwa 4 wöchiger Rhythmus) bzw. nach Reinigung und Desinfektion betrieben werden sollten Ausstattung aller Biogasanlagen mit 2 Gärrückstandssilos, die abwechselnd in ca. 3 monatigem Abstand zu befüllen sind Sicherung der Gärrückstände vor nachträglichen Kontaminationen (Schwarz-Weiß-Prinzip) Aus veterinärhygienischer Sicht kann die Verbreitung Neurotoxin bildender Cl. botulinum Stämme nicht toleriert werden Jährliche Kontrolluntersuchung der Gärrückstände aller Biogasanlagen hinsichtlich des Vorkommens Neurotoxin bildender Clostridium botulinum- Stämme Freiheit von Cl. chauvoei, Cl. perfringens Typ C und EHEC (Untersuchung bei speziellem Anlaß/ Verdacht) 27

29 Abbildung 24: Verfahrensweisen bei positivem Befund von Neurotoxin bildenden Cl. botulinum- Stämmen in Gärrückständen von Biogasanlagen Rohstoffe Gärrückstände Bewertung/ Schlussfolgerungen - - Keine Beanstandungen + 1) - Keine Beanstandungen - + 1) Stufenkontrolle Bewertung, Hygienische Maßnahmen + 1) + 1) - Stufenkontrolle - Hygienische Maßnahmen - Strukturelle Veränderungen +1) Positiv (Nachweis Toxin bildender Stämme) - Negativ 28

30 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit! RIPAC-LABOR GmbH Am Mühlenberg Potsdam-Golm Tel: +49(0) Fax: +49(0)