Extended-spectrum beta-laktamasen in Enterobacteriaceae auf deutschen Intensivstationen

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1 Aus dem Institut für Umweltmedizin und Krankenhaushygiene der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br. Extended-spectrum beta-laktamasen in Enterobacteriaceae auf deutschen Intensivstationen INAUGURAL DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br. Vorgelegt 2008 von Katharina Brigitte Weidle geboren in Tübingen

2 Dekan: Prof. Dr. C. Peters 1. Gutachter: Prof. Dr. D. Jonas 2. Gutachter: Prof. Dr. M. Kist Jahr der Promotion: 2008

3 I Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG ALLGEMEINES DAS SARI-PROJEKT ZIEL DER ARBEIT MATERIAL UND METHODEN MATERIALIEN Bakterienstämme Material für die mikrobiologischen Arbeiten Material für die molekularbiologischen Arbeiten METHODEN Agardiffusion und Agardilution Transkonjugationsversuche Genotypisierung mittels Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) PCR Nachweis und Sequenzierung der β-laktamasegene ERGEBNISSE ERGEBNIS DER AGARDILUTION MHK-Werte der Kontrollstämme MHK-Werte der getesteten Stämme ERGEBNISSE DER AGARDIFFUSION Hemmhofdurchmesser der Kontrollstämme Hemmhofdurchmesser der getesteten Stämme Mutatoren Übereinstimmung der Agardiffusion mit der Agardilution ESBL-PRODUZENTEN UNTER E. COLI, KLEBSIELLA SPP. UND P. MIRABILIS EFFEKTE DER VULANSÄURE AUF DIE ÜBRIGEN ENTEROBACTERIACEAE Synergismus Antagonismus CHARAKTERISIERUNG VON ISOLATEN MIT ESBL-POSITIVEM PHÄNOTYP Verteilung der ESBL-Produzenten auf den Stationen Genotypisierung ESBL-positiver E. coli und K. pneumoniae Transkonjugationsversuche Charakterisierung der β-laktamasegene DISKUSSION... 62

4 Inhaltsverzeichnis II 5 ZUSAMMENFASSUNG LITERATURVERZEICHNIS ANHANG DANKSAGUNG

5 III Tabellen- und Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis TABELLE 1 FUNKTIONELLE KLASSIFIKATION VON Β-LAKTAMASEN... 2 TABELLE 2 ANTIBIOTIKA-ERREGER KOMBINATIONEN, FÜR DIE RESISTENZDATEN ERFASST WURDEN...10 TABELLE 3 UNTERSUCHTE BAKTERIENSTÄMME...12 TABELLE 4 ORT DER ISOLIERUNG DER BAKTERIENSTÄMME...13 TABELLE 5 ANTIBIOTIKA-REINSUBSTANZEN...13 TABELLE 6 ANTIBIOTIKA-TESTPLÄTTCHEN...13 TABELLE 7 GERÄTE FÜR DIE MIKROBIOLOGISCHEN ARBEITEN...14 TABELLE 8 MATERIALIEN FÜR DIE MIKROBIOLOGISCHEN ARBEITEN...14 TABELLE 9 GERÄTE FÜR DIE MOLEKULARBIOLOGISCHEN ARBEITEN...15 TABELLE 10 MATERIALIEN FÜR DIE MOLEKULARBIOLOGISCHEN ARBEITEN...16 TABELLE 11 BEREICHE DER MHK-TESTUNG...18 TABELLE 12 BREAK-POINTS IN DER AGARDILUTION...20 TABELLE 13 BREAK-POINTS IN DER AGARDIFFUSION...20 TABELLE 14 PCR-PRIMER...25 TABELLE 15 MHK-WERTE DER GETESTETEN STÄMME...29 TABELLE 16 HEMMHÖFE DER KONTROLLSTÄMME AUF MHA- UND CLOXACILLINPLATTE IM MEDIAN...32 TABELLE 17 HEMMHOFDURCHMESSER DER GETESTETEN STÄMME...33 TABELLE 18 HEMMHOFDURCHMESSER DER MUTATOREN...36 TABELLE 19 ÜBEREINSTIMMUNG DER AGARDIFFUSION MIT DER AGARDILUTION ALS REFERENZMETHODE...37 TABELLE 20 ANZAHL DER ESBL-PRODUZENTEN NACH DEN CLSI-STANDARDS...38 TABELLE 21 ANZAHL DER STÄMME MIT SYNERGISMUS IN DEN RESISTENZTESTS...40 TABELLE 22 SYNERGISMUS IN DEN DREI RESISTENZTESTS...42 TABELLE 23 ANZAHL DER STÄMME MIT ANTAGONISMUS IN DEN RESISTENZTESTS...47 TABELLE 24 ANTAGONISMUS IN DEN DREI RESISTENZTESTS...48 TABELLE 25 ESBL-PRODUZENTEN AUF DEN VERSCHIEDENEN STATIONEN...52 TABELLE 26 ERGEBNISSE DER GENOTYPISIERUNG...54 TABELLE 27 ERGEBNISSE VON AFLP UND GENSEQUENZIERUNG ESBL-POSITIVER ENTEROBACTERIACEAE...59 TABELLE 28 TESTEMPFEHLUNGEN ZUM NACHWEIS VON ESBL-PRODUZENTEN...80 TABELLE 29 MHK-WERTE VON E. COLI, KLEBSIELLA SPP. UND P. MIRABILIS...88 TABELLE 30 MHK-WERTE DER NICHT-EKP STÄMME TABELLE 31 HEMMHOFDURCHMESSER DER NICHT-EKP STÄMME Abbildungsverzeichnis ABBILDUNG 1 6-AMINO-PENICILLANSÄURE UND 7-AMINO-CEPHALOSPORANSÄURE... 1 ABBILDUNG 2 MUTATOR ENTSPP0468 MIT EINZEL-KOLONIEN BEI CAZ, CAZ+, CTX UND CTX ABBILDUNG 3 MUTATOR CITRO0045 MIT EINZEL-KOLONIEN BEI CAZ UND CTX...34 ABBILDUNG 4 MUTATOR CITRO0036 MIT AGARDIFFUSION VON EINZELKOLONIEN...35 ABBILDUNG 5 RINGPHÄNOMEN VON ENTSPP0619 BEI CAZ+ UND CTX+ AUF MHA-PLATTE...50 ABBILDUNG 6 DARSTELLUNG DES RINGPHÄNOMENS...69

6 Abkürzungsverzeichnis IV Abkürzungsverzeichnis AFLP ATCC CAZ CIP CLO CLSI CTX ESBL FEP FOX ICARE IUK MHA MHB MHK Nicht-EKP PCR SARI Amplified Fragment Length Polymorphism American Type Culture Collection Ceftazidim Ciprofloxacin Clavulansäure Cloxacillin Clinical and Laboratory Standards Institute Cefotaxim Extended-spectrum β-laktamasen Cefepim Cefoxitin Intensive Care Antimicrobial Resistance Epidemiology Institut für Umweltmedizin und Krankenhaushygiene Mueller-Hinton-Agar Mueller-Hinton-Bouillon Minimale Hemmkonzentration Nicht-E. coli, Nicht-Klebsiella spp. und Nicht-P. mirabilis Enterobacteriaceae Stämme Polymerase-Ketten-Reaktion Surveillance der Antibiotikaanwendung und bakteriellen Resistenzentwicklung auf Intensivstationen

7 1 Einleitung 1 Einleitung 1.1 Allgemeines Enterobacteriaceae sind eine Familie gram-negativer Bakterien, zu denen Escherichia coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Proteus spp., Morganella morganii, Hafnia alvei, Providencia spp. und andere zählen. Ihr natürliches Reservoir ist im Darm und in der Umwelt. Die Familie der Enterobacteriaceae stellt mit ca. 50% die Hauptgruppe der Erreger von Krankenhausinfektionen [Hof, 2002]. Die häufigsten Krankenhausinfektionen sind Harnwegsinfektionen, Infektionen des unteren Respirationstrakts (Pneumonien), Wundinfektionen und primäre Sepsis [Gastmeier, 1998]. Solche nosokomialen Infektionen treten besonders häufig auf Intensivstationen auf, da hier viele invasive therapeutische Maßnahmen erfolgen und die Patienten oft multimorbide sind. In einer deutschlandweiten Studie wurde insgesamt eine Prävalenz nosokomialer Infektionen von 3,5% gefunden, wobei die Prävalenz auf Intensivstationen bei 15,3% lag [Gastmeier, 1998]. Durch das häufige Vorhandensein von Infektionen und dem daraus resultierenden häufigen Gebrauch von Antibiotika entwickeln sich gerade im intensivmedizinischen Bereich vermehrt bakterielle Resistenzen. Antibiotika-Verbrauch sowie Resistenzraten sind in der Regel auf Intensivstationen am höchsten [Fridkin, 1999]. Ein besonderes Problem von Enterobacteriaceae sind die durch Produktion von Extended-spectrum β-laktamasen (ESBL) verursachten Resistenzen [Paterson, 2006]. Penicilline und Cephalosporine sind β-laktam-antibiotika. In ihrer chemischen Struktur besitzen sie einen β-laktam-ring, womit sie durch eine irreversible Blockierung der Transpeptidase die bakterielle Zellwandsynthese hemmen. Der Grundkörper der Penicilline ist die 6-Amino-Penicillansäure, der der Cephalosporine ist die 7-Amino-Cephalosporansäure. Die beiden Grundkörper sind in Abbildung 1 dargestellt. Abbildung 1 6-Amino-Penicillansäure (links) und 7-Amino-Cephalosporansäure (rechts) Cephalosporine werden nach ihrer Entwicklung und ihrer chemischen Struktur in 1. bis 4. Generation eingeteilt. In dieser Arbeit wurden die Cephalosporine Cefoxitin, Ceftazidim, Cefotaxim und Cefepim verwendet. Cefoxitin ist ein Cephalosporin der 2. Generation und von der Struktur ein Cephamycin. Ceftazidim und Cefotaxim zählen zu den Cephalosporinen der 3. Generation und Cefepim zu den

8 Einleitung 2 Cephalosporinen der 4. Generation. Die Cephalosporine der 3. und 4. Generation sind von der Struktur Oxyimino-β-Laktame und gelten als Breitspektrum-Cephalosporine. β-laktamasen sind von Bakterien gebildete Enzyme, die den β-laktam-ring hydrolysieren und dadurch verschiedene β-laktam-antibiotika inaktivieren können. Sie stellen somit einen Resistenzmechanismus der entsprechenden Keime gegenüber β-laktam-antibiotika dar. Die Vielzahl der mittlerweile bekannten β-laktamasen wurden zuerst von Ambler nach ihrer molekularen Struktur [Ambler, 1980], später von Bush et al. nach ihrer Funktion [Bush, 1995] in einer Nomenklatur geordnet. Diese beiden Klassifikationen sind in Tabelle 1 nach Bush et al. dargestellt. Tabelle 1 Funktionelle Klassifikation von β-laktamasen im Vergleich zur molekularen Struktur Bush Gruppe Molekulare Klasse Bevorzugte Inhibiert durch Substrate a EDTA Repräsentative Enzyme 1 C Cephalosporine - - AmpC Enzyme von gramnegtiven Bakterien; MIR-1 2a A Penicilline + - Penicillinasen von grampositiven Bakterien 2b A Penicilline, Cephalosporine + - TEM-1, TEM-2, SHV-1 2be A Penicilline, Schmal- und Breitspektrum Cephalosporine, Monobactame + - TEM-3 bis TEM-26, SHV-2 bis SHV-6, K. oxytoca K1 2br A Penicilline + - TEM-30 bis TEM-36, TRC-1 2c A Penicilline, Carbenicillin + - PSE-1, PSE-3, PSE-4 2d D Penicilline, Cloxacillin + - OXA-1 bis OXA-11, PSE-2 (OXA-10) 2e A Cephalosporine + - Induzierbare Cephalosporinasen 2f A Penicilline, Cephalosporine, Carbapeneme 3 B Die meisten ß-Laktame, inkl. Carbapeneme von P. vulgaris + - NMC-A von E. cloacae, Sme-1 von S. marcescens - + L1 von X. maltophilia, CcrA von B. fragilis 4 ND b Penicilline -? Penicillinase von P. cepacia a, Clavulansäure b ND, nicht definiert Aus Bush et al. Antimicrob Agents Chemother (1995)

9 3 Einleitung Die Breitspektrum-Cephalosporine wurden mit dem Ziel entwickelt, gegen bakterielle β-laktamasen von Enterobacteriaceae und anderen gram-negativen Keimen, welche Penicilline unwirksam machen, unempfindlich zu sein. Doch schon bald nach ihrer Einführung traten β-laktamasen auf, die diese neuen β-laktam-antibiotika abbauen konnten, so dass Bakterien entstanden, die auch gegen diese Antibiotika unempfindlich wurden [Jacoby, 2005]. Die Extended-spectrum β-laktamasen sind solche neuer entstandenen β-laktamasen von gram-negativen Bakterien. Sie besitzen ein erweitertes Spektrum, das heißt, sie hydrolysieren außer Penicillinen auch 3. und 4. Generations-Cephalosporine und das Monobactam Azteonam. In den letzten Jahren sind viele Reviews über β-laktamasen allgemein und besonders über ESBL erschienen [Bradford, 2001; Jacoby, 2005; Livermore, 1995; Paterson, 2005; Pfaller, 2006; Thomson, 2001], was die Aktualität des Themas verdeutlicht. Viele ESBL haben sich aus den β-laktamasen der Bush Gruppe 2b entwickelt, zu der TEM-1, TEM-2 und SHV-1 gehören. Diese hydrolysieren Penicillin und Ampicillin, jedoch nicht Breitspektrum- Cephalosporine oder Aztreonam [Paterson, 2005]. Dabei ist TEM-1 (benannt nach einem Patienten namens Temoniera in Griechenland, von dem ein E. coli Isolat stammte, in dem TEM-1 als erstes beschrieben wurde) die häufigste Plasmid-kodierte β-laktamase in Enterobacteriaceae, während SHV-1 (nach Sulphydryl variabel benannt) in den meisten Klebsiella pneumoniae Stämmen chromosomal vorliegt und in anderen Enterobacteriaceae Spezies Plasmid-kodiert vorkommen kann [Bradford, 2001; Livermore, 1995]. ESBL sind aus diesen β-laktamasen allein durch eine oder wenige Punktmutationen entstanden. So kennt man heute eine ganze Vielzahl von TEM und SHV β-laktamasen, die zu den ESBL zählen und in Bush Gruppe 2be zusammengefasst werden. Eine weitere große Gruppe der ESBL sind die CTX-M β-laktamasen, die so benannt sind, da sie besonders stark Cefotaxim hydrolysieren [Bonnet, 2004]. Sie haben geringere genetische Ähnlichkeit mit den TEM- und SHV β-laktamasen, sondern sind eng verwandt mit chromosomalen β-laktamasen in Kluyvera spp. [Hall, 2004]. Sie können ebenfalls der Bush Gruppe 2be zugeordnet werden. Außerdem gibt es ESBL vom OXA-Typ, die aus OXA β-laktamasen mit einem schmaleren Spektrum entstanden sind, ähnlich wie TEM- und SHV-ESBL. OXA β-laktamasen hydrolysieren Oxacillin (daher der Name) und sind in Bush Gruppe 2d zusammengefasst. ESBL vom OXA-Typ werden hauptsächlich in Pseudomonas aeruginosa und nur selten in Enterobacteriaceae gefunden [Bradford, 2001]. Zudem sind inzwischen noch zahlreiche weitere ESBL bekannt, wie BES-1, FEC-1, GES-1, CME-1, PER, SFO-1, TLA-1, VEB-1 [Bradford, 2001]. Alle bisher charakterisierten ESBL vom TEM-, SHV-, CTX-M- und OXA-Typ sowie von einigen selteneren Typen sind in einer stehenden Nomenklatur auf einer Web-basierten Datenbank von G. Jacoby und K. Bush aufgelistet ( Studies/).

10 Einleitung 4 Mit der isoelektrischen Fokussierung kann man die Bildung von β-laktamasen in einem Isolat nachweisen, wobei die verschiedenen β-laktamasen charakteristische isoelektrische Bereiche haben (TEM: pi 5,2-6,5; SHV: pi 7,0-8,2; CTX-M: pi 7,5-8,9). Allerdings sind inzwischen so viele verschiedene β-laktamasen bekannt, die teilweise die gleichen isoelektrischen Punkte aufweisen, dass zu einer genauen Charakterisierung der β-laktamase eine DNA-Sequenzierung nötig ist [Bradford, 2001]. ESBL sind in der Regel Plasmid-kodiert. Die Resistenzen können sich somit recht gut ausbreiten. Zusätzlich zur Transmission des resistenten Stamms von einem Patienten auf einen anderen, besteht bei Plasmid-kodierten Resistenzen die Möglichkeit zur Übertragung des Plasmids von einem Stamm auf einen anderen [Wiener, 1999]. Oft findet man auf dem gleichen Plasmid, das eine ESBL kodiert, noch weitere Gene, die Resistenzen gegen Aminoglykoside und Sulfonamide kodieren. Außerdem besitzen viele Enterobacteriaceae Spezies Veränderungen, welche zu einer Resistenz gegenüber Chinolonen führt [Paterson, 2006]. Diese chromosomal-codierte Chinolon-Resistenz scheint häufig mit ESBL assoziiert zu sein [Paterson, 2005; Pitout, 2005]. Damit handelt es sich bei ESBLproduzierenden Enterobacteriaceae Isolaten meist um multiresistente Keime. Sie stellen somit eine Bedrohung besonders für schwerkranke Patienten dar, da die therapeutischen Optionen oft limitiert sind. Mittel der Wahl bei der empirischen Therapie von Infektionen durch ESBL-Produzenten sind die Carbapeneme, welche sehr stabil gegenüber ESBL sind. Da ESBL Plasmid-kodiert sind, besteht die Möglichkeit zur Transkonjugation des Plasmids in vitro, d. h. zu einer Übertragung des Plasmids und der Resistenz auf einen Rezipienten. Durch einen erfolgreichen Transkonjugationsversuch kann die Kodierung der gefundenen Resistenz durch ein Plasmid bewiesen werden. Zudem kann das Plasmid in einem Laborstamm als Rezipienten ohne weitere eigene β-laktamase besser untersucht werden, beispielsweise für eine Sequenzierung des Resistenzgens. Besonders in K. pneumoniae Stämmen, welche eine chromosomale SHV-1 β-laktamase und zusätzlich eine Plasmid-kodierte SHV-ESBL besitzen, kann es ansonsten bei der Sequenzierung zu uneindeutigen Ergebnissen kommen. Zwar werden ESBL am häufigsten in Klebsiella spp. und E. coli nachgewiesen, sie können aber auch in vielen anderen gram-negativen Spezies vorkommen [Thomson, 2001]. Zumindest in Enterobacter spp. gibt es inzwischen zahlreiche Berichte über das Vorkommen von ESBL [Crowley, 2003; Hoffmann, 2006; Pitout, 1998; Schlesinger, 2005; Tzelepi, 2000; Varela, 2001]. Eine Studie in den USA aus den Jahren 2001/02 fand eine Prävalenz an ESBL in Enterobacteriaceae von 4,9%. Dabei war die Prävalenz auf Intensivstationen mit 5,6% etwas höher als auf anderen Stationen (3,6%). Insgesamt lag der Anteil an ESBL-positiven Isolaten bei 2,6% in E. coli, bei 11,3% in Klebsiella pneumoniae, bei 13,1% in Klebsiella oxytoca, bei 1,4% in Proteus mirabilis und bei 5,5% in Enterobacter cloacae [Moland, 2006]. Die Paul-Ehrlich-Gesellschaft berichtete in einer Studie mit

11 5 Einleitung Isolaten aus Deutschland, Schweiz und Österreich aus dem Jahr 2004 von einer Prävalenz an ESBLpositiven Stämmen von 5,1% in E. coli, 7,3% in K. pneumoniae, 12,4% in K. oxytoca und 1,9% in P. mirabilis [Paul-Ehrlich-Gesellschaft, 2006]. In E. cloacae wurde in einer Deutschland-weiten Studie aus dem Jahr 2002 eine Prävalenz von 4,2% an ESBL-positiven Stämmen beschrieben [Hoffmann, 2006]. Es gibt zahlreiche Berichte von einer veränderten Prävalenz der verschiedenen ESBL-Typen in Europa und Kanada in den letzten Jahren. Bisher wurden am häufigsten ESBL vom TEM- oder SHV-Typ in Klebsiella spp. bei nosokomialen Infektionen auf Intensivstationen gefunden. Etwa seit dem Jahr 2000 änderte sich dies jedoch dramatisch, indem ESBL vom CTX-M-Typ auch in ambulant erworbenen Infektionen (meist durch E. coli verursachte Harnwegsinfektionen) immer häufiger nachgewiesen wurden [Livermore, 2007; Pitout, 2005]. Bei nosokomialen Infektionen, die, wie bereits erwähnt, häufig durch Enterobacteriaceae verursacht werden, ist es aus epidemiologischen Gesichtspunkten wichtig zu wissen, ob im Fall eines Ausbruchs (d. h. viele in zeitlichem Zusammenhang liegende Infektionen auf einer Station) nur ein oder wenige bakterielle Klone vorliegen. Dies deutet auf eine Übertragung des Keims von einem Patienten auf den anderen und damit auf Mängel in den krankenhaushygienischen Präventionsmaßnahmen hin. Sind dagegen nosokomiale Infektionen durch viele genetisch verschiedene multiresistente Erreger verursacht, kann ein Selektionsdruck durch einen hohen Antibiotika-Verbrauch eine Rolle spielen [Paterson, 2005], etwa das Entstehen von ESBL durch hohen Verbrauch von Cephalosporinen der 3. Generation. Mit der Genotypisierung kann die genetische Klonalität oder Diversität von Isolaten beurteilt werden. Eine Methode der Genotypisierung, die in dieser Arbeit verwendet wurde, ist der Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP). Die Empfehlungen zur Infektionskontrolle bei einem Ausbruch mit ESBL-positiven Keimen können sich an den Ergebnissen der Genotypisierung orientieren. Wert auf Hygiene und Kontaktisolierung sollte besonders gelegt werden, wenn nur einer oder wenige Klone vorliegen, die empirische Antibiotika-Therapie sollte vor allem geändert werden, wenn es sich um einen polyklonalen Ausbruch handelt [Paterson, 2005]. ESBL führen zu Resistenzen gegenüber Cephalosporinen der 3. Generation sowie gegenüber Cefepim, einem Cephalosporin der 4. Generation, jedoch nicht gegenüber Cephamycinen. Sie werden durch β-laktamase-inhibitoren wie Clavulansäure, Sulbactam und Tazobactam gehemmt. Zur phänotypischen Identifizierung von ESBL-Produzenten bestehen für E. coli, K. pneumoniae, K. oxytoca und P. mirabilis Standards des CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute; ehemalig NCCLS genannt) in Form von Screening- und Bestätigungstests. Im Screening wird die Empfindlichkeit gegenüber Cephalosporinen geprüft. Screeningtest positiv sind Isolate mit einer

12 Einleitung 6 minimalen Hemmkonzentration (MHK) von 2 µg/ml bei Ceftazidim, Aztreonam, Cefotaxim oder Ceftriaxon oder einer MHK von 8 µg/ml bei Cefpodoxim oder mit einem Hemmhofdurchmesser von 22 mm bei Ceftazidim, 27 mm bei Azteonam oder Cefotaxim, 25 mm bei Ceftriaxon oder 17 mm bei Cefpodoxim. Der Bestätigungstest beruht auf einer Hemmung der ESBL durch die Clavulansäure, was als Synergieeffekt erkennbar wird. Er wird mit Ceftazidim und Cefotaxim jeweils ohne und mit Clavulansäure kombiniert durchgeführt. Ein positiver Test liegt bei einer Abnahme der MHK eines Antibiotikums um mindestens 3 Titerstufen in der Kombination mit Clavulansäure vor oder bei einer Vergrößerung des Hemmhofdurchmessers um mindestens 5 mm [CLSI, 2005]. Die Ergebnisse der in vitro Resistenztestung für Cephalosporine können jedoch variabel sein. Sie können im sensiblen Bereich liegen, obwohl das entsprechende Antibiotikum bei diesem Keim für eine Therapie einer schwerwiegenden Infektion unwirksam, der Keim also klinisch resistent ist. Zudem weisen die verschiedenen ESBL unterschiedliche Substratspezifitäten auf, so dass sie bei der Testung beispielsweise nur bei Ceftazidim oder nur bei Cefotaxim auffallen. Aus diesen Gründen sind die vom CLSI empfohlenen Screening-Werte für die ESBL-Testung im sensiblen Bereich und es sollten mindestens 2 verschiedene Antibiotika getestet werden. Die CLSI-Standards empfehlen zudem, ESBL-produzierende Isolate gegenüber allen Penicillinen, Cephalosporinen und Aztreonam klinisch als resistent zu kategorisieren ungeachtet der in vitro Testergebnisse. Für andere Spezies der Familie der Enterobacteriaceae als die genannten bestehen jedoch bisher keine Standards des CLSI zur ESBL-Testung. Der Grund dafür ist, dass sich hier die Identifizierung von ESBL als schwieriger erweist. Viele dieser Spezies, wie Enterobacter spp., Serratia spp., Citrobacter freundii, Providencia spp., Morganella morganii und Hafnia alvei, haben eine induzierbare chromosomale AmpC β-laktamase (Ambler Typ C, Bush Gruppe 1), welche wie die ESBL Cephalosporine hydrolysieren kann. Diese AmpC β-laktamase wird durch Cefoxitin, jedoch weniger durch Cephalosporine der 3. Generation induziert, so dass die Stämme resistent gegenüber ersteren sind und sensibel gegenüber Ceftazidim und Cefotaxim. Durch Mutation sind jedoch Stämme entstanden, die die AmpC β-laktamase überexprimieren und dann auch resistent gegenüber Cephalosporinen der 3. Generation sind. In den Spezies mit induzierbarer chromosomaler AmpC β-laktamase sind solche AmpC-Hyperproduzenten häufiger Ursache für Resistenzen gegenüber Breitspektrum-Cephalosporinen als ESBL [Livermore, Brown, 2001]. AmpC β-laktamasen führen im Gegensatz zu ESBL nicht zu einer Resistenz gegenüber Cefepim, dagegen verursachen sie eine Resistenz gegenüber Cephamycinen. Sie werden nicht durch Clavulansäure gehemmt [Jacoby, 2005; Paterson, 2005]. Wenn in einem AmpC-Hyperproduzenten zusätzlich eine ESBL vorliegt, kann diese möglicherweise nicht durch einen Synergieeffekt erkannt werden, da die AmpC β-laktamase unempfindlich gegenüber Clavulansäure ist und diesen Effekt verdeckt. Aber auch in Stämmen mit nur induzierbarer AmpC β-laktamase kann das Erkennen von ESBL schwierig sein. Die Clavulansäure kann die AmpC β-laktamase induzieren, welche dann das

13 7 Einleitung Cephalosporin hydrolysiert und somit ebenfalls den Synergieeffekt verdeckt [Paterson, 2005; Thomson, 2001]. Klebsiella spp. und P. mirabilis haben keine chromosomale AmpC β-laktamase. Bei E. coli wird die chromosomale AmpC β-laktamase kaum exprimiert und ist nicht induzierbar. Nur selten gibt es unter E. coli AmpC-Hyperproduzenten. Jedoch sind aus den chromosomal kodierten AmpC β-laktamasen solche entstanden, die Plasmid-kodiert sind und sich demzufolge auch auf Spezies ohne chromosomale AmpC ausbreiten können. Bei E. coli, Klebsiella spp. und P. mirabilis können diese Plasmid-kodierten AmpC β-laktamasen vorkommen [Philippon, 2002]. Die Stämme weisen dann ein Antibiogramm auf ähnlich dem von AmpC-Hyperproduzenten. Bei diesen Spezies sind allerdings ESBL häufiger Ursache für eine Resistenz gegenüber Cephalosporinen der 3. Generation als AmpC β-laktamasen. Außer den ESBL und den AmpC β-laktamasen gibt es die Carbapenemasen als weitere Gruppe von β-laktamasen, die Breitspektrum-Cephalosporine hydrolysieren. Sie führen zusätzlich zu einer Resistenz gegenüber Carbapeneme. Carbapenemasen sind β-laktamasen, die zu Ambler Typ B gehören (Metallo-β-Laktamasen, welche durch EDTA gehemmt werden), oder β-laktamasen vom Ambler Typ A (KPC Enzyme) oder D (OXA Enzyme mit Carbapenemase-Aktivität) [Jacoby, 2005]. Carbapenemase-bildende Enterobacteriaceae Stämme sind momentan allerdings noch relativ selten. Es besteht jedoch die Gefahr der Ausbreitung dieser Resistenz. Eine weltweite Studie fand Carbapenemasen in Enterobacteriaceae in 0,14%. Dabei lagen in den USA hauptsächlich KPC β-laktamasen vor, in Europa dagegen Metallo-β-Laktamasen [Deshpande, 2006]. In K. oxytoca gibt es noch eine weitere β-laktamase, die phänotypisch den ESBL ähneln kann. Die meisten K. oxytoca Stämme haben diese chromosomal-kodierte K1 β-laktamase. Sie ist wie die TEMund SHV-ESBL in Bush Gruppe 2be eingeteilt, zählt allerdings nicht zu den ESBL. Sie wird jedoch wie die ESBL durch Clavulansäure gehemmt. Hyperproduzenten dieser K1 β-laktamase, die in 10-20% in klinischen Isolaten gefunden werden, können deswegen fälschlicherweise als ESBL- Bildner eingestuft werden. Dabei wird beschrieben, dass die MHK-Werte der K1-Hyperproduzenten im Gegensatz zu den ESBL-Bildnern bei Ceftazidim normalerweise unter 2 µg/ml und auch bei Cefotaxim meist noch im sensiblen Bereich liegen [Paterson, 2005]. Typischerweise haben sie hohe MHK-Werte gegenüber Cefuroxim, Aztreonam und Piperacillin-Tazobactam [Livermore, Winstanley, 2001]. Porin-Veränderungen können zusätzlich zu β-laktamasen eine Rolle spielen in der Resistenz von Enterobacteriaceae gegenüber Cephalosporinen. β-laktam-antibiotika müssen in gram-negativen Bakterien die äußere Membran durch die dort vorhandenen Porine passieren, um an ihren Wirkort zu

14 Einleitung 8 gelangen. Mutationen, die zu einem Defekt oder Verlust von solchen Porinen führen, können die Wirkung von β-laktam-antibiotika vermindern. In Isolaten, die weder ESBL noch AmpC β-laktamasen bilden, kann ein Porin-Verlust zu einer Resistenz gegenüber Cefoxitin führen und die MHK-Werte von Breitspektrum-Cephalosporinen ansteigen lassen [Lee, 2006]. In einem ESBL- Produzenten kann ein zusätzlicher Porin-Verlust die Resistenz gegenüber Breitspektrum- Cephalosporinen verstärken und ebenfalls zu einer Cefoxitin-Resistenz führen [Martinez-Martinez, 1996]. Außerdem können ESBL sowie chromosomale überexprimierte oder Plasmid-kodierte AmpC β-laktamasen in Kombination mit Porin-Defekten zu einer verminderten Empfindlichkeit oder sogar einer Resistenz gegenüber Carbapenemen führen [Fernandez-Cuenca, 2006; Lartigue, 2007; Poirel, 2004]. Zur phänotypischen Identifizierung von ESBL in Spezies, die nicht in den CLSI-Kriterien eingeschlossen sind, müssen aufgrund der genannten Schwierigkeiten besonders durch AmpC β-laktamasen veränderte Ansätze vorgenommen werden als in Spezies, für die die CLSI-Standards gelten. Schwaber et al. zeigten an Enterobacteriaceae außer E. coli und Klebsiella spp., dass für diese Spezies die CLSI-Teststandards nicht als Routinemethode geeignet sind. Das Testverfahren findet wenige ESBL-Produzenten und ist außerdem nicht spezifisch. Unter 690 resistenten Isolaten fielen im Screening 51,4% auf, jedoch waren nur 2,2% (15 Stämme) im Bestätigungstest positiv. Unter diesen 15 Stämmen konnte nur bei 6 Stämmen ein ESBL-kodierendes β-laktamasegen (bla TEM, bla SHV, bla CTX-M oder bla OXA ) mittels PCR nachgewiesen werden [Schwaber, 2004]. Cefepim wird kaum in seiner Aktivität durch eine hohe AmpC-Expression beeinflusst. Es wurde beschrieben, dass dieses Antibiotikum besser ESBL bei Stämmen mit induzierbarer chromosomaler AmpC β-laktamase identifizierten kann als die Cephalosporine der 3. Generation. Cefepim ist kein vom CLSI empfohlenes Antibiotikum zur ESBL-Testung. Tzelepi et al. zeigten eine deutlich verbesserte Sensitivität des Doppeldisk-Synergietest bei ESBL-produzierenden Enterobacter Stämmen beim Verwenden von Cefepim als beim Verwenden von Ceftazidim und Cefotaxim [Tzelepi, 2000]. Stürenburg et al. untersuchten die Sensitivität von Etests. Sie konnten mit dem Cefepim-Clavulansäure Streifen bei allen der 13 untersuchten ESBL-produzierenden Enterobacter Isolaten die ESBL feststellen. Dagegen war der Test mit Ceftazidim oder Cefotaxim nur in 31% der Fälle positiv [Stürenburg, 2004]. Cloxacillin ist ein Penicillin, das nicht gegenüber Enterobacteriaceae wirksam ist. Jedoch hemmt es AmpC β-laktamasen. Bei Non-Fermentern wie Acinetobacter baumannii und Pseudomonas aeruginosa, bei denen ebenfalls ESBL und induzierbare AmpC β-laktamasen vorkommen, konnte gezeigt werden, dass ein Agardiffusionstest auf Cloxacillin-enthaltenden Platten die Sensitivtät der ESBL-Erkennung gegenüber konventionellen Platten erhöht. Poirel et al. führten einen Doppeldisk-

15 9 Einleitung Synergietest auf normalen sowie auf Cloxacillin-enthaltende Platten bei A. baumannii aus. Sie zeigten, dass auf letzteren die Möglichkeit, ESBL zu erkennen, verbessert wird [Poirel, 2003]. Jiang et al. nutzten bei P. aeruginosa ebenfalls Cloxacillin-enthaltende Platten für den Doppeldisk-Synergietest sowie für den kombinierten Disk-Test mit Ceftazidim- und Cefotaxim-Plättchen mit und ohne Clavulansäure. Sie stellten eine erhöhte Sensitivität der Cloxacillinplatten fest [Jiang, 2006]. Zusammenfassend sind wichtige Charakteristika von ESBL, dass sie sich durch eine variable in vitro Resistenz gegenüber den Cephalosporinen der 3. Generation auszeichnen, nicht aber gegenüber Cephamycinen, und dass sie durch β-laktamase-inhibitoren hemmbar sind. Sie weisen in der isoelektrischen Fokussierung charakteristische isoelektrische Punkte auf. Klinisch werden ESBL als resistent gegenüber allen Penicillinen, Cephalosporinen und Aztreonam kategorisiert. Sie sind Plasmid-kodiert und liegen häufig gleichzeitig mit anderen Resistenzen vor. Weitere davon abzugrenzende β-laktamasen mit Aktivität gegenüber Breitspektrum-Cephalosporinen sind die AmpC β-laktamasen, welche im Gegensatz zu den ESBL zu einer Resistenz gegenüber Cephamycinen führen, jedoch nicht gegenüber Cefepim. Sie werden nicht durch β-laktamase- Inhibitoren gehemmt. Außerdem gibt es die bisher selteneren Carbapenemasen, welche eine Resistenz gegenüber Cephalosporinen und Carbapenemen verursachen. Sie sind durch EDTA hemmbar, sofern sie zu Ambler Typ B gehören. 1.2 Das SARI-Projekt Basis dieser Arbeit waren Bakterienisolate der SARI-Studie. SARI (Surveillance der Antibiotikaanwendung und bakteriellen Resistenzentwicklung auf Intensivstationen) ist ein vom Bundesministerium für Bildung und Forschung bis 2006 gefördertes Projekt, das Antibiotikaverbrauch und bakterielle Resistenzen gegenüber Antibiotika auf Intensivstationen erfasst und den Verbrauch mit der Resistenzentwicklung vergleicht [Meyer, 2003; Meyer, 2004]. Das SARI-Projekt wurde in Anlehnung an das ICARE-Projekt (Intensive Care Antimicrobial Resistance Epidemiology) in den USA entworfen, mit dem Unterschied, dass dort Intensiv- sowie andere Stationen beteiligt waren. ICARE zeigte, dass der Antibiotika-Verbrauch sowie auch die Resistenzraten auf Intensivstationen am höchsten sind [Fridkin, 1999], weshalb sich SARI nur mit diesem Hoch-Risiko-Bereich beschäftigt. An SARI nahmen Intensivstationen über ganz Deutschland verteilt teil. Über die Antibiotikaverbrauchsdaten der Stationen wurden von den Apotheken der beteiligten Krankenhäuser monatliche Listen erstellt und an das Institut für Umweltmedizin und Krankenhaushygiene (IUK) Freiburg übermittelt.

16 Einleitung 10 Die beteiligten Laboratorien untersuchten die Erreger, die von Patientenproben wie z. B. Abstrichen, Bronchialsekreten und Blutkulturen gewonnen wurden. Sie ermittelten die Resistenzdaten. Copy strains wurden ausgeschlossen, wobei als copy strain ein Erreger der gleichen Spezies von einem Patienten mit dem selben Antibiogramm innerhalb von 30 Tagen, unabhängig der Lokalisation, definiert wurde. In Tabelle 2 nach Meyer et al. sind die Spezies der Familie der Enterobacteriaceae dargestellt, deren Resistenzdaten gegenüber den aufgeführten Antibiotika erfasst wurden. Diese lehnt sich an die nach dem Infektionsschutzgesetz zu erfassenden resistenten Erregern an. Tabelle 2 Antibiotika-Erreger Kombinationen, für die Resistenzdaten erfasst wurden Spezies Antibiotika E. coli, K. pneumoniae: Cefotaxim, Ceftazidim, oder Ceftriaxon; Imipenem; Amikacin; Piperacillin + Tazobactam; Ampicillin + Sulbactam; Amoxicillin + Clavulansäure; Ciprofloxacin E. cloacae, Citrobacter, S. marcescens : Imipenem; Amikacin ; Ciprofloxacin Aus Meyer et al. Infection (2003) Die Laboratorien übermittelten die Anzahl aller von der Intensivstation getesteter sowie die Anzahl der resistenten Erreger an das IUK Freiburg und schickten resistente Keime zur weiteren Untersuchung ein. Zweimal sollten einen Monat lang alle isolierten Bakterien an das IUK Freiburg zur genaueren Überprüfung eingeschickt werden. In Freiburg wurden die Isolate als Stammsammlung bei -70 C in defibriniertem, sterilem Pferdeblut eingefroren. 1.3 Ziel der Arbeit In der vorliegenden Arbeit sollten Enterobacteriaceae Stämme aus der SARI-Studie auf ihre Empfindlichkeit gegenüber Breitspektrum-Cephalosporinen und auf das Vorhandensein von Extended-Spectrum β-laktamasen untersucht werden. Es sollten 904 Stämme untersucht werden, die seit Beginn der Studie im Februar 2000 bis Ende 2004 entnommen worden waren und spätestens bis Ende März 2005 im IUK Freiburg eingetroffen waren und von 34 verschiedenen Intensivstationen stammten. Dabei sollten sowohl klinische Isolate der Spezies E. coli, Klebsiella spp. und P. mirabilis untersucht werden, für die allgemein akzeptierte CLSI-Teststandards existieren, als auch andere, meist resistentere Enterobacteriaceae, wie Enterobacter spp., Citrobacter spp. oder Serratia spp. Für diese existieren bislang keine Resistenzteststandards zum ESBL-Nachweis, da hier die Überlagerung mit anderen Resistenzmechanismen häufig zu falsch-positiven wie auch falsch-negativen Testergebnissen führt. Deshalb sollten bei Isolaten dieser Bakterienspezies zusätzliche phänotypische Methoden zur Anwendung kommen.

17 11 Einleitung Bei den 696 E. coli, Klebsiella spp. und P. mirabilis Isolaten sollten die MHK-Werte von Cefoxitin, Ceftazidim ± Clavulansäure, Cefotaxim ± Clavulansäure und Ciprofloxacin mittels Agardilution bestimmt werden. Die Stämme, die sich nach CLSI-Standard als ESBL-Produzenten herausstellten, sollten mittels PCR auf Vorhandensein von bla TEM, bla SHV und bla CTX-M untersucht und die E. coli und K. pneumoniae Isolate mittels AFLP genotypisiert werden. Pro Station und Genotyp sollte dann in jeweils einem Stamm die β-laktamasen charakterisiert werden. Durch Transkonjugation sollte versucht werden, das angenommene ESBL-kodierende Plasmid zu mobilisieren. Gelang die Transkonjugation, sollte der übertragene Genabschnitt sequenziert werden. Konnten keine Transkonjuganten generiert werden, sollte der Genabschnitt des Ausgangsstammes sequenziert werden. Die 208 Nicht-E. coli, Nicht-Klebsiella spp. und Nicht-P. mirabilis Enterobacteriaceae Isolate (im Folgenden als Nicht-EKP abgekürzt) sollten im Rahmen dieser Arbeit noch einmal mittels VITEK GNI+ (gramnegative Identifizierungskarte) auf die Richtigkeit der Identifizierung überprüft werden. Es sollten die MHK-Werte von Cefoxitin, Ceftazidim ± Clavulansäure, Cefotaxim ± Clavulansäure, Ciprofloxacin sowie von Cefepim ± Clavulansäure mittels Agardilution bestimmt werden. Ebenso sollten die Hemmhöfe von Ceftazidim ± Clavulansäure, Cefotaxim ± Clavulansäure und Cefepim ± Clavulansäure mittels Agardiffusion sowohl auf einer herkömmlichen Mueller-Hinton-Agarplatte bestimmt werden, als auch auf einer Agarplatte, die Cloxacillin enthielt. Durch die Beigabe von Cloxacillin sollten eventuell vorhandene AmpC β-laktamasen gehemmt werden [Jiang, 2006; Poirel, 2003]. Alle Nicht-EKP Stämme sollten mittels PCR auf das Vorliegen von bla TEM, bla SHV oder bla CTX-M untersucht werden. Transkonjugationsversuche und eine DNA-Sequenzierung der gefundenen Genabschnitte sollten bei den Stämmen vorgenommen, die in mindestens einem der MHK-Werte eine Abnahme des Titers um mindestens 3 Stufen in Anwesenheit von Clavulansäure zeigten, sowie bei Stämmen, die eine Hemmhofvergrößerung um mindestens 5 mm in Anwesenheit von Clavulansäure aufwiesen und in der PCR für bla TEM, bla SHV oder bla CTX-M positiv waren. In dieser Arbeit sollte somit einerseits untersucht werden, in welchen Enterobacteriaceae Spezies ESBL auf deutschen Intensivstationen verbreitet sind und welche ESBL-Typen vorliegen, und andererseits, wie sich ESBL in Spezies, für die bisher keine CLSI-Teststandards existieren, mit verschiedenen phänotypischen Testmethoden im Vergleich zum Nachweis der entsprechenden β-laktamasegene nachweisen lassen.

18 Material und Methoden 12 2 Material und Methoden 2.1 Materialien Bakterienstämme Es wurden die Enterobacteriaceae Stämme der SARI-Studie untersucht, die seit Beginn der Studie im Februar 2000 bis Ende 2004 entnommen worden waren und spätestens bis Ende März 2005 im IUK Freiburg eingetroffen waren. Beim Eingang wurden die Stämme nach Angaben des einsendenden Labors mit einem Spezieskürzel und einer Nummer versehen, die auch beibehalten wurde, wenn sich im Folgenden die Speziesangeben als falsch erwiesen. Insgesamt wurden 904 Stämme untersucht. Darunter befanden sich insgesamt 696 E. coli, Klebsiellen und P. mirabilis Isolate, für die es CLSI- Kriterien zur ESBL-Testung gibt, und 208 weitere Stämme, für die diese Kriterien nicht existieren. Alle 208 Stämme mit einer anderen Einsenderangabe zur Spezies als E. coli, P. mirabilis, K. pneumoniae und K. oxytoca wurden mittels VITEK GNI+ erneut identifiziert. Bei Unklarheiten des VITEK wurde zusätzlich API 20 E zur Speziesidentifizierung verwendet. Die Stämme stammten von 34 verschiedenen Intensivstationen aus 21 Kliniken in 16 Städten in Deutschland. In Tabelle 3 sind die untersuchten Stämme nach Spezies aufgeteilt. In Tabelle 4 sind die Isolationsorte nach Spezies getrennt dargestellt. Tabelle 3 Untersuchte Bakterienstämme Anzahl Spezies Zuordnung nach VITEK-Identifizierung (Anzahl) 477 E. coli 207 Klebsiella spp. K. pneumoniae (167), K. oxytoca (40) 14 Proteus spp. P. mirabilis (12), P. vulgaris (2) 121 Enterobacter spp. E. cloacae (109), E. aerogenes (10), E. hormaechei (1), E. intermedius (1) 38 Citrobacter spp. C. freundii complex (24), 10 C. koseri (10), C. braakii (3), C. amalonaticus (1) 41 Serratia spp. S. marcescens (40), S. plymutica (1) 3 Morganella morganii 2 Hafnia alvei 1 Providencia stuartii

19 13 Material und Methoden Tabelle 4 Ort der Isolierung der Bakterienstämme Spezies Anzahl der Stämme mit folgenden Isolationsorten: Atemwege Urogenitaltrakt Wunden Blutkultur/ Venenkatheter Sonstiges Ohne Angabe E. coli Klebsiella spp Proteus spp Enterobacter spp Citrobacter spp Serratia spp Übrige Spezies Gesamt Material für die mikrobiologischen Arbeiten In Tabelle 5 werden die verwendeten Antibiotika, in Tabelle 6 die Antibiotika-Testplättchen, in Tabelle 7 die benutzten Geräte und in Tabelle 8 sonstige Materialien jeweils mit dem Hersteller aufgeführt. Tabelle 5 Antibiotika-Reinsubstanzen Antibiotikum Abkürzung Hersteller Firmensitz Cefoxitin FOX MSD Haar, Deutschland Cefepim FEP Bristol-Myers Squibb New York, USA Ceftazidim CAZ Glaxo Smith Kline München, Deutschland Cefotaxim CTX Aventis Pharma Frankfurt am Main, Deutschland Ciprofloxacin CIP Bayer Leverkusen, Deutschland Clavulansäure Glaxo Smith Kline München, Deutschland Cloxacillin CLO Sigma-Aldrich Chemie GmbH Steinheim, Deutschland Rifampicin - Sigma-Aldrich Chemie GmbH Steinheim, Deutschland Tabelle 6 Antibiotika-Testplättchen Antibiotikum-Plättchen Hersteller Firmensitz FEP 30 µg; FEP 30 µg + 10 µg; Mast Group Merseyside, England CAZ 30 µg; CAZ 30 µg + 10 µg; CTX 30 µg; CTX 30 µg + 10 µg CIP 5 µg Oxoid Hampshire, England

20 Material und Methoden 14 Tabelle 7 Geräte für die mikrobiologischen Arbeiten Gerät Hersteller Firmensitz Kühlschrank -20 C Bosch Stuttgart, Deutschland Kühlschrank +5 C Bosch Stuttgart, Deutschland Kühlschrank -80 C Heraeus Hanau, Deutschland Brutschrank 37 C Heraeus Hanau, Deutschland Feinwaage: max. 210 g; min. 1 mg; Sartorius Göttingen, Deutschland d=0,05mg Waage (Nr.2353): max. 3000g; Sartorius Göttingen, Deutschland d=0,1g Mikro Scan Turbidity Meter Dade Behring West Sacramento, USA Multipoint Inoculator Mast Group Merseyside, England Spectrophotometer (Junior Model Perkin-Elmer Überlingen, Deutschland 35) Schüttelinkubator: Certomat Braun Melsungen, Deutschland VITEK biomérieux Marcy l Etoile, Frankreich API 20 E biomérieux Marcy l Etoile, Frankreich Enterotube Becton, Dickinson GmbH Heidelberg, Deutschland Tabelle 8 Materialien für die mikrobiologischen Arbeiten Material Hersteller Firmensitz Columbia-Blutagar-Platten heipha Dr. Müller GmbH Heidelberg, Deutschland CPS3-Agar-Platten biomérieux Marcy l Etoile, Frankreich Mueller-HintonII-Bouillon, Becton, Dickinson GmbH Heidelberg, Deutschland Kationen optimiert Mueller-Hinton-Agar nach NCCLS Merck Darmstadt, Deutschland Bacto-Tryptone Becton, Dickinson GmbH Heidelberg, Deutschland Bacto-Yeast-Extract Becton, Dickinson GmbH Heidelberg, Deutschland Natriumchlorid Sigma-Aldrich Chemie GmbH Steinheim, Deutschland Natriumacid Merck Darmstadt, Deutschland Wägepapier Macherey-Nagel Düren, Deutschland Schalen 94/16 mm (Petrischalen) Greiner bio-one Frickenhausen, Deutschland PS-Abdeckplatten Greiner bio-one Frickenhausen, Deutschland PS-Microplate, 96K Greiner bio-one Frickenhausen, Deutschland (Mikrotiterplatte) 10 ml Gefäß: Cellstar Greiner bio-one Frickenhausen, Deutschland 50 ml Gefäß: Cellstar Greiner bio-one Frickenhausen, Deutschland Pipetten Eppendorf Hamburg, Deutschland Pipetten Gilson Bad Camberg, Deutschland Fortsetzung auf folgender Seite

21 15 Material und Methoden Tabelle 8 - Fortsetzung Material Hersteller Firmensitz Pipettenspitzen Greiner bio-one Frickenhausen, Deutschland Sterile Wattestäbchen Applimed SA Chatel-St.-Denis, Schweiz Aqua ad iniectabilia (dh 2 O) Braun Melsungen, Deutschland Filter (0,22 µm, 25 mm, White Millipore Corporation Billerica, MA, USA GSWP) Spritze 5 ml Braun Melsungen, Deutschland Injektionskanüle Braun Melsungen, Deutschland Material für die molekularbiologischen Arbeiten In Tabelle 9 werden die benutzten Geräte und in Tabelle 10 die verwendeten Materialien jeweils mit dem Hersteller aufgeführt. Tabelle 9 Geräte für die molekularbiologischen Arbeiten Gerät Hersteller Firmensitz Thermocycler: GeneAmp PCR PE Applied Biosystems Foster City, CA, USA System 9700 Kühlzentrifuge: Centrifuge 5403 Eppendorf Hamburg, Deutschland Thermomixer 5436 Eppendorf Hamburg, Deutschland Sequenzierautomat: ALF-Express Amersham Biosciences Freiburg, Deutschland DNA-Sequencer GelComparII-Software (Version Applied Maths BV Kortrijk, Belgien 2,5) Elektrophoresekammer: Biomed. Analytik GmbH Göttingen, Deutschland Biometra Agagel Mini / Maxi Spannungsgerät: Biometra Power Biomed. Analytik GmbH Göttingen, Deutschland Pack P25 Polaroidkamera: Polaroid MP-4 Land Camera Polaroid GmbH Dreieich-Sprendlingen, Deutschland UV-Transilluminator 312 nm H. Saur, Laborbedarf Reutlingen, Deutschland GenQuant-Photometer Amersham Biosciences Freiburg, Deutschland Vacuum Concentrator Bachofer Reutlingen, Deutschland

22 Material und Methoden 16 Tabelle 10 Materialien für die molekularbiologischen Arbeiten Material Hersteller Firmensitz 0,2 ml Gefäß: PCR-Softstrips Biozym Scientific GmbH Hess. Oldendorf, Deutschland 0,5 ml Eppendorfgefäß Eppendorf Hamburg, Deutschland 1,5 ml Eppendorfgefäß Eppendorf Hamburg, Deutschland Mikrotestplatten Greiner bio-one Frickenhausen, Deutschland Oligonucleotide (Adapter, Primer) MWG-Biotech Ebersberg, Deutschland High Pure PCR Template Roche Diagnostics GmbH Mannheim, Deutschland Preparation Kit Restriktionsenzym EcoRI Roche Diagnostics GmbH Mannheim, Deutschland Restriktionsenzym MseI + 10fach New England Biolabs Ipswich, MA, USA Mse-Puffer T4 DNA Ligase + 10fach Ligase- Roche Diagnostics GmbH Mannheim, Deutschland Puffer DNA-Polymerisationsmix (dntps) Amersham Biosciences Freiburg, Deutschland Taq-Polymerase + 10fach PCR- Roche Diagnostics GmbH Mannheim, Deutschland Puffer Long Ranger PreMix Gel Cambrex Bio Science Rockland, USA Solution Amoniumpersulfat (APS) Amersham Biosciences Freiburg, Deutschland TEMED Amersham Biosciences Freiburg, Deutschland Dextranblau Sigma-Aldrich Chemie GmbH Steinheim, Deutschland Formamid Merck Darmstadt, Deutschland Marker 100 bp: ALF-Express Sizer Amersham Biosciences Freiburg, Deutschland Marker 651 bp Laborinterne Herstellung 100 bp-leiter, Cy5-gelabelt Amersham Biosciences Freiburg, Deutschland Tris: Trisma base Sigma-Aldrich Chemie GmbH Steinheim, Deutschland Dinatriumsalz Dihydrat (EDTA) Carl Roth GmbH Karlsruhe, Deutschland Borsäure Baker Deventer, Holland Natronlauge (NaOH) Merck Darmstadt, Deutschland Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) Sigma-Aldrich Chemie GmbH Steinheim, Deutschland Gold-Taq-Polymerase + 10fach Roche Diagnostics GmbH Mannheim, Deutschland PCR-Puffer MgCl 2 Roche Diagnostics GmbH Mannheim, Deutschland Agarose Invitrogen Paisley, Schottland 6x Loading Dye Fermentas GmbH St. Leon-Rot, Deutschland 100 bp-leiter Fermentas GmbH St. Leon-Rot, Deutschland Ethidiumbromid Sigma-Aldrich Chemie GmbH Steinheim, Deutschland High Pure PCR Product Purification Kit Roche Diagnostics GmbH Mannheim, Deutschland

23 17 Material und Methoden 2.2 Methoden Agardiffusion und Agardilution Herstellen der Nährmedien Zur Herstellung von Mueller-Hinton-Bouillon (MHB) wurden 22 g MHB-Pulver in 1 l entmineralisiertem Wasser aufgelöst und 20 min bei 120 C autoklaviert. Zur Herstellung von Platten aus Mueller-Hinton-Agar (MHA) wurden 38 g MHA-Pulver in 1 l entmineralisiertem Wasser auflöst und 20 min bei 120 C autoklaviert. Der Agar wurde nach Abkühlen mit einem Dispenser in die Petrischalen gegossen, wobei pro Schale 14 ml Agar verwendet wurde. Zur Herstellung von MHA- Platten mit Cloxacillin wurden 100 mg Cloxacillin abgewogen und diese in 1 ml aqua dest. aufgelöst. Die Lösung wurde zu 1 l autoklaviertem Agar hinzugefügt, so dass die Platten eine Cloxacillin- Konzentration von 100 µg/ml aufwiesen. Keimzahleinstellung der Bakterien Die in sterilem Pferdeblut eingefrorenen Enterobacteriaceae der SARI-Stammsammlung wurden auf Blutagar ausgestrichen und über Nacht bei 37 C bebrütet. Am folgenden Tag wurden die Bakterien in MHB in Reagenzröhrchen suspendiert. Die Konzentration der Suspension wurde mit Hilfe eines Micro Scan Turbidity Meters auf 10 8 KBE/ml eingestellt. Dabei entsprechen 10 8 KBE/ml den Extinktionswerten 0,14 bei E. coli, 0,15 bei sonstigen gram-negativen Stäbchen, 0,16 bei Pseudomonas aeruginosa und 0,11 bei Staphylococcus aureus. Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration mittels Agardilution Die wie oben beschrieben auf 10 8 KBE/ml eingestellten Bakteriensuspensionen wurden in eine Mikrotiterplatte pipettiert. Dabei wurden pro Stamm 2 Kavitäten mit jeweils ca. 220 µl gefüllt. Die Mikrotiterplatten wurden bei -70 C eingefroren. Nach dem Einfrieren entsprach die Bakterienkonzentration noch der für die Beimpfung der Agarplatten geforderten Konzentration von ca KBE/ml. Für die Antibiotikum-Verdünnungsreihen wurden 100 mg Antibiotikum entsprechend seiner Aktivität in MilliQ auf eine Konzentration von µg/ml eingestellt (=Stammlösung). Die Stammlösungen wurden proportioniert eingefroren und am jeweiligen Verwendungstag wieder aufgetaut. Die Verdünnungsreihen mit geometrisch abfallenden Konzentrationen der Antibiotika (128 µg/ml, 64 µg/ml, 32 µg/ml, ) wurden in den in Tabelle 11 aufgelisteten Bereichen hergestellt.

24 Material und Methoden 18 Tabelle 11 Bereiche der MHK-Testung Antibiotikum Cefoxitin Ceftazidim ± 4 µg/ml Clavulansäure Cefotaxim ± 4 µg/ml Clavulansäure Cefepim ± 4 µg/ml Clavulansäure Ciprofloxacin Getesteter Bereich 128 µg/ml 0,5 µg/ml 128 µg/ml 0,03 µg/ml 128 µg/ml 0,015 µg/ml 64 µg/ml 0,004 µg/ml 64 µg/ml 0,002 µg/ml Die Verdünnungsreihen wurden in Erlenmeyerkolben pipettiert. Da die Antibiotikums-Lösung im Agar im Verhältnis 1:10 vorlag, wurden die Verdünnungsreihen auf die 10fache Endkonzentration eingestellt. Aus der Stammlösung wurde eine Ausgangskonzentration von 1280 µg/ml bzw. 640 µg/ml hergestellt. In den ersten Kolben der Verdünnungsreihe wurden 3 ml der Ausgangslösung pipettiert, in den zweiten bis letzten Kolben wurden 3 ml MilliQ-Wasser vorgelegt. Dann wurden zum zweiten Kolben 3 ml der Ausgangslösung dazugegeben, so dass diese hier um die Hälfte verdünnt wurde. Aus dem zweiten Kolben wurden in den dritten Kolben wieder 3 ml pipettiert usw. Aus dem letzten Kolben wurden 3 ml verworfen. Nach Erstellen der Verdünnungsreihen wurde ggf. Clavulansäure zugesetzt, so dass die Agarplatten alle die Konzentration von 4 µg/ml Clavulansäure enthielten. Dafür wurde aus der Stammlösung eine Lösung mit der Konzentration von 40 µg/ml hergestellt. Von dieser Lösung wurde jedem Kolben 3 ml zugesetzt. Der Agar wurde wie oben beschrieben hergestellt, jedoch wurden für die Verdünnungsplatten, anders als für die Petri-Schalen, 42 g MHA-Pulver in 1 l entmineralisiertem Wasser gelöst, um die Verdünnung mit der Antibiotikums-Lösung auszugleichen. Für die Antibiotikum-Agarplatten wurde die 3 ml Antibiotikums-Lösung mit 27 ml MHA (50 C) in dem Erlenmeyerkolben vermischt und in Abdeckplatten gegossen. Zu den Kolben, die zusätzlich Clavulansäure enthielten, wurde nur 24 ml Agar dazugegeben. Die Platten ließ man nun abkühlen und trocknen. Das Beimpfen der Platten mit der aufgetauten Mikrotiterplatte wurde mit Hilfe eines Multipoint- Inokulators durchgeführt. Dieser entnimmt je Kavität 0,0015 ml der Suspension, was zu einer Keimzahl von 1,5 x 10 4 KBE auf der Platte führt. Nach Stunden Bebrütung bei 37 C wurden die MHK-Werte abgelesen. Als MHK-Wert galt die niedrigste Verdünnungsstufe ohne sichtbares Wachstum (bzw. <5 Einzelkolonien). Zur Qualitätssicherung nach den CLSI-Standards wurden auf jeder Platte die ATCC-Referenzstämme mit bekannten MHK-Werten E. coli und P. aeruginosa mitgeführt. Diese dienten gleichzeitig als Negativ-Kontrolle für die ESBL-Testung. Außerdem wurden E. coli UA 1526 (enthält eine CTX-M β-laktamase) und E. coli UA 1528 (enthält eine TEM β-laktamase) als zwei ESBLpositive EARSS-Kontroll-Stämme mitgeführt (QA ex EARSS DE 105). Das European

25 19 Material und Methoden Antimicrobial Resistance Surveillance System (EARSS) ist ein europäisches Netzwerk nationaler Systeme mit dem Ziel, vergleichbare Daten über bakterielle Resistenzen zu sammeln [Bronzwaer, 1999]. Vor und nach einer Plattenserie wurde als Wachstumskontrolle eine wirkstofffreie Agarplatte mitbeimpft. Bestimmung der MHK mittels Mikrodilution Bei den Proteus Isolaten (P. vulgaris und P. mirabilis) wurde die MHK mittels Mikrodilution bestimmt, da sie Schwärmverhalten auf MHA zeigten. Die geometrisch abfallenden Verdünnungsreihen wurden hierbei in einer Mikrotiterplatte in MHB hergestellt. Die wie oben beschrieben auf 10 8 KBE/ml eingestellten Bakteriensuspensionen wurden 1:100 verdünnt. Da sie in den Mikrotiterplatten nochmals um die Hälfe verdünnt wurden, lagen sie dort in einer Konzentration von 5*10 5 KBE/ml vor. Die Antibiotikum-Stammlösung wurde mit MHB auf die Ausgangskonzentrationen verdünnt. Da diese Ausgangskonzentration in der Mikrotiterplatte jedoch nochmals halbiert wurde, wurde z.b. aus der Ausgangskonzentration von 128 µg/ml die Konzentration von 64 µg/ml. In die Mikrotiterplatten wurde mit einer 8-Kanal-Pipette ab der zweiten Reihe 100 µl MHB in jede Kavität vorgelegt. In die erste und zweite Reihe wurden dann 100 µl der Ausgangskonzentration pipettiert und dann aus der zweiten Reihe wieder 100 µl in die dritte Reihe übertragen usw. Zuletzt wurden in jede Kavität 100 µl der Bakteriensuspension gegeben, wobei für jeden Bakterienstamm zur Doppelbestimmung zwei Reihen beimpft wurden. Die Platten ließ man dann Stunden bebrüten. Als MHK galt die niedrigste Wirkstoffkonzentration, bei der ein makroskopisch sichtbares Wachstum verhindert wurde, d.h. keine Trübung auftrat. Bei der Mikrodilution wurden die gleichen Kontrollstämme wie bei der Agardilution mitgeführt. In jeder Verdünnungsreihe wurde Wachstumskontrolle, d.h. Nährmedium + Bakterieninokulum, sowie eine Bouillonkontrolle, d.h. nur Nährmedium, angelegt. Bestimmung der Hemmhofdurchmesser mittels Agardiffusion Mit einem sterilen Wattetupfer wurde die wie oben beschrieben hergestellte Inokulumsuspension jeweils auf eine MHA-Platte sowie auf eine Cloxacillinplatte aufgetragen. Dabei wurde mit dem Wattetupfer dreimal über die gesamte Plattenoberfläche gestrichen, wobei diese jeweils um 60 gedreht wurde. Danach wurden auf jede Platte die 6 verschiedenen Antibiotika-Testplättchen aufgelegt: Cefepim ± Clavulansäure, Ceftazidim ± Clavulansäure und Cefotaxim ± Clavulansäure.