Einleitung. Abstract. Material und Methoden. Bakterienisolate DIAGNOSTIK
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- Rosa Kirchner
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1 DIAGNOSTIK Grenzwerte der Kombination Penicillin-G/ Sulbactam für die Empfindlichkeitsprüfung von Bakterien mit dem Reihenverdünnungstest und dem Agar- Diffusionstest gemäß DIN Johannes Brauers 1, Dietmar Pfründer 2, Michael Kresken 1 1 Antiinfectives Intelligence, Gesellschaft für klinisch-mikrobiologische Forschung und Kommunikation mbh 2 Pfizer GmbH Abstract Im Rahmen einer multizentrischen Studie wurden unter Beteiligung von 10 mikrobiologischen Laboratorien in Deutschland frische klinische Isolate auf ihre Empfindlichkeit gegenüber Penicillin G (PEN-G) und PEN-G/ Sulbactam (SBT) mit der Mikrodilution- und dem Agar- Diffusionstest untersucht. Die Ergebnisse wurden dazu verwendet, Grenzwerte nach der DIN-Norm für die Bewertung von Hemmhofdurchmessern (HHD) bei Durchführung des Agar-Diffusionstestes mit PEN-G/SBT festzulegen. Die Empfindlichkeitsdaten (MHK- und HHD- Werte) von Isolaten (352 Staphylococcus aureus, 77 Streptococcus spp., 173 Enterococcus faecalis, 35 Acinetobacter spp., 275 Escherichia coli, 91 K. pneumoniae, 67 E. cloacae, 53 P. mirabilis, 26 M. morganii, 25 Serratia, 22 C. freundii sowie 128 sonstige Enterobacteriaceae- Stämme) standen zur Verfügung. Die verwendeten Testblättchen waren mit 10 µg PEN-G und 10 µg SBT beschickt. Die MHK-Bestimmung von SBT in Kombination mit PEN-G erfolgte unter Verwendung einer Verdünnungsreihe von 0,25 bis 128 mg/l für PEN-G mit einer fixen Konzentration von 8 mg/l SBT. Gemäß der DIN-Norm gelten für die Kombination aus einem Beta-Lactam-Antibiotikum mit einem Beta- Lactamase-Inhibitor dieselben MHK-Grenzwerte wie für das Beta-Lactam-Antibiotikum alleine. Somit wurden für die Regressionsanalyse mit PEN-G/SBT die für PEN-G gültigen MHK-Grenzwerte (sensibel 0,125 mg/l, intermediär 0,25-1 mg/l, resistent 2 mg/l) verwendet. Der Korrelationskoeffizient (I r I) errechnete sich mit 0,5597. Da I r I < 0,85 betrug, wurde entsprechend der DIN-Norm die Fehlerminimierungsmethode ( error rate-bounding method ) nach Metzler und DeHaan (J Infect Dis 1974; 130: ) für die Festlegung von Grenzwerten für den Agar-Diffusionstest angewandt. Mit diesem Verfahren wurden die folgenden Grenzwerte für PEN-G/SBT ermittelt: 20 mm (resistent), mm (intermediär) und 26 mm (sensibel). Die Fehlerrate betrug insgesamt 24,2%, davon waren nur 0,6% sehr schwere Fehler, 2,5% schwere Fehler und 21,1% geringe Fehler. Der Normenausschuss Medizin im DIN hat erwartungsgemäß die derzeit für PEN-G gültigen MHK-Grenzwerte für PEN-G/SBT übernommen und den oben genannten HHD-Grenzwerten zugestimmt. Einleitung Penicillin G (PEN-G) besitzt hohe intrinsische Aktivität gegenüber einer Vielzahl klinisch wichtiger aerober und anaerober Bakterienspezies einschließlich Staphylococcus aureus und Koagulase-negative Staphylokokken (Beta- Lactamase-negative Stämme), Streptococcus pneumoniae (Penicillin-sensible Stämme), Streptococcus pyogenes, Streptokokken der Gruppen C und G und der Viridans- Gruppe sowie Beta-Lactamase-negativen Stämmen von Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis und Moraxella catarrhalis, Clostridien, Peptokokken und Peptostreptokokken. Die Resistenz bei Methicillin-sensiblen Stämmen von S. aureus (MSSA) sowie bei den Spezies der Bacteroides fragilis- und Prevotella-Gruppen gegenüber PEN-G beruht üblicherweise auf dem Vorhandensein von Penicillinasen (z. B. Gruppen 2a-2f gemäß dem Klassifikationssystem von Bush et al. [1]). In Anwesenheit von Beta-Lactamase- Inhibitoren wie Sulbactam (SBT) werden Beta-Lactamaseinstabile Penicilline und Cephalosporine vor der Hydrolyse durch diese Penicillinasen weitgehend geschützt [2]. In Deutschland steht SBT in der fixen Kombination mit Ampicillin zur Verfügung. Darüber hinaus besteht eine Zulassung von SBT für die freie Kombination mit Mezlocillin, Piperacillin, Cefotaxim sowie PEN-G (seit August 2002). Die klinische Anwendung eines Beta-Lactam- Antibiotikums in Kombination mit SBT ist indiziert, wenn sie eine größere Therapiesicherheit bietet als die Gabe des Beta-Lactam-Antibiotikums alleine. Dies trifft dann zu, wenn Beta-Lactamase-bildende Erreger nachgewiesen oder vermutet werden, deren Beta-Lactamasen durch SBT hemmbar sind [3]. Auf der Grundlage von Daten aus einer multizentrischen Studie zur In-vitro-Aktivität von PEN-G/SBT gegenüber klinischen Isolaten aerober Bakterienspezies (siehe [4]) wurden Grenzwerte für die Bewertung von Hemmhofdurchmessern (HHDs) bei der Durchführung des Agar- Diffusionstestes mit PEN-G/SBT ermittelt. Material und Methoden Bakterienisolate Die Studie wurde unter Beteiligung von 10 mikrobiologischen Laboratorien in Deutschland durchgeführt. Jedes Zentrum wurde gebeten, über einen Zeitraum von drei Monaten 150 Isolate von ausgewählten aeroben Bakterien MIKROBIOLOGE 14.Jg
2 zu sammeln (35 S. aureus, davon 5 Methicillin-resistente Stämme, 20 E. faecalis, 10 Streptococcus spp., 30 E. coli, 50 sonstige Enterobacteriaceae und 5 Acinetobacter spp.). Mehrfachisolate eines Patienten sollten nicht eingeschlossen werden. Empfindlichkeitsprüfung Die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration der Isolate erfolgte mit der Mikrodilution gemäß DIN unter Verwendung von Mueller-Hinton-Bouillon und vorgefertigten Mikrotitrationsplatten (Hersteller: Merlin Diagnostika, Bornheim-Hersel) [5]. Der untersuchte Konzentrationsbereich von PEN-G (mit und ohne SBT) betrug 0, mg/l. Die Konzentration von SBT in Kombination mit PEN-G lag konstant bei 8 mg/l. Für den Agar- Diffusionstest wurden Testblättchen verwendet, die mit 10 µg PEN-G / 10 µg SBT beschickt waren (Hersteller: Mast Diagnostics, Merseyside, UK). Zur Qualitätskontrolle wurden die Referenzstämme Staphylococcus aureus ATCC 29213, Staphylococcus aureus ATCC 43300, Escherichia coli ATCC 25922, Escherichia coli ATCC 35218, Enterococcus faecalis ATCC und Pseudomonas aeruginosa ATCC mit in die Empfindlichkeitsprüfungen einbezogen. Regressionsanalyse Die Vorgehensweise bei der Durchführung einer Regressionsanalyse zur Korrelation von HHD und MHK ist in Teil 9 der DIN-Norm festgelegt [6]. Ergebnisse und Diskussion Erregerkollektiv und Empfindlichkeit gegenüber PEN- G und PEN-G/SBT Das untersuchte Erregerkollektiv umfasste insgesamt klinische Isolate. Art und Häufigkeit der Bakterien, die absolute Verteilung der MHK-Werte gegenüber PEN- G und PEN-G/SBT sowie die MKH 50/90 -Werte für die häufigsten Bakterienarten sind in der Tabelle zusammen gestellt. Von Bakterienstämmen standen sowohl die MHK-Werte als auch die zugehörigen HHD-Werte zur Verfügung. MHK-Grenzwerte Als MHK-Grenzwerte für PEN-G/SBT wurden die für PEN-G gültigen und die seit der 58. Sitzung des Normenausschusses Medizin (NAMed) Chemotherapeutische Untersuchungsmethoden im DIN vom für PEN-G/SBT akzeptierten Grenzwerte (sensibel 0,125 mg/l, intermediär 0,25 1 mg/l, resistent 2 mg/l) zu Grunde gelegt [5]. Diese wurden auch für die Grenzwertfindung bei Staphylokokken herangezogen. Die zur Zeit gültigen Grenzwerte von PEN-G für Staphylokokken betragen 0,125 mg/l (sensibel) und 0,25 mg/l (resistent). Mit diesem Grenzwert können Beta-Lactamasepositive von Beta-Lactamase-negativen Stämmen unterschieden werden. Dieser Grenzwert macht für die Kombination PEN-G/SBT jedoch keinen Sinn, da SBT die Beta- Lactamase von Staphylokokken hemmt. Aufgrund der Verteilungen der MHK-Werte von PEN-G und PEN- G/SBT bei Methicillin-sensiblen (n=292) und Methicillinresistenten Stämmen (n=60) von S. aureus (MSSA, MRSA) (s. Tabelle) erschien es für die Grenzwertfindung sinnvoll, die für andere Bakterienspezies geltenden MHK- Grenzwerte auch für MSSA zu übernehmen. Erwartungsgemäß zeigte die Kombination gegenüber MRSA keine Wirkung. Die MHK-Werte von 6 Stämmen (10%) lagen im intermediären Bereich. Die übrigen 54 Isolate (90%) wurden als resistent bewertet. In keinem Fall wurde ein MRSA-Stamm als falsch sensibel bewertet. Scattergramm und Regressionsanalyse Das Scattergramm zur Korrelation von HHD und MHK geht aus Abbildung 1 hervor. Die Korrelation wurde auf der Basis der Daten von 821 (von 1.324) Isolaten berechnet. Hierbei wurden nur die Datensätze berücksichtigt, deren HHD- und MHK-Werte innerhalb der Messbereiche lagen, d. h. die Stämme mit Extremwerten wie HHD 6 mm und MHK-Werte 0,125 mg/l bzw. 256 mg/l wurden von der Analyse ausgeschlossen. Die ermittelte Regressionsgleichung lautete y = -1,336 x + 20,503. Der Korrelationskoeffizient (I r I) betrug 0,5597. Entsprechend der DIN-Norm [6] wird bei einem Korrelationskoeffizienten < 0,85 empfohlen, die Grenzwerte der HHD nicht aus der Regressionsgleichung, sondern mit Hilfe der Fehlerminimierungsmethode ( error rate-bounding method ) nach Metzler und DeHaan [7] zu ermitteln. HHD [mm] n = 821 (ohne Extremwerte) r = 0, y = - 1,336x + 20, x = - 0,235y + 6, Abb. 1: 0,25 0, MHK [mg/l] Scattergramm zur Korrelation von Hemmhofdurchmesser (HHD) mit minimaler Hemmkonzentration (MHK) und Regressionsgerade bei Verwendung von Testblättchen mit einer Beschickungsmenge von PEN-G 10µg/SBT 10µg bei 821 Isolaten 58 MIKROBIOLOGE 14.Jg. 2004
3 Tabelle: Verteilung der Erreger nach den MHK-Werten von PEN-G und PEN-G/SBT MIKROBIOLOGE 14.Jg
4 Fehlerminimierungsmethode Das Ziel des Verfahrens ist es, die HHD-Grenzwerte so abzuleiten, dass möglichst wenige Isolate mit dem Agar- Diffusionstest falsch klassifiziert werden. Nach Metzler und DeHaan sollten nicht mehr als 5% der sensiblen Erreger als falsch resistent (d. h. anstelle von S: R, schwerer Fehler) und nicht mehr als 1% der resistenten Stämme als falsch sensibel (d. h. anstelle von R: S, sehr schwerer Fehler) eingestuft werden [7]. Das US-amerikanische National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) fordert, dass die Rate der als falsch resistent bewerteten Stämme ( major discrepancies ) 3% und die der als falsch sensibel bewerteten Stämme 1,5% nicht überschreiten darf ( very major discrepancies ) [8]. HHD-Grenzwerte Mit der Fehlerminimierungsmethode wurden die folgenden Grenzwerte für den Agar-Diffusionstest abgeleitet: resistent 20 mm, intermediär mm und sensibel 26 mm (Abbildung 2). Abb. 2: Ableitung der Grenzwerte für den Agar-Diffusionstest bei Verwendung von Testblättchen mit einer Beschickung von PEN-G 10µg/ SBT 10µg nach der Fehlerminimierungsmethode von METZLER & DeHAAN [7] bei Isolaten 60 MIKROBIOLOGE 14.Jg. 2004
5 Die Fehleranalyse ergab, dass es bei der Wertepaare (75,8%) in Bezug auf die Bewertung der Testergebnisse ( sensibel, intermediär oder resistent ) zu einer vollständigen Übereinstimmung zwischen den Ergebnissen der MHK-Bestimmung und denen des Agar- Diffusionstestes kam. In 24,2% der Fälle (n= 320) kam es zu einer falschen Bewertung mit dem Agar-Diffusionstest (Abbildung 3). Hemmhofdurchmesser [mm] Abb. 3: S I R A 13,14% (n=174) D 3,54% (n=47) G 2,49% (n=33) B 2,49% (n=33) E 7,47% (n=99) H 7,85% (n=104) C 0,6% (n=8) F 7,17% (n=95) I 55,21% (n=731) Minimale Hemmkonzentration [mg/l] Fehleranalyse bei der Verwendung von Testblättchen mit der Beschickung PEN-G 10µg / SBT 10µg Bedeutung der Felder: Übereinstimmung (A, E und I), geringe Fehler (B, D, F und H), schwere Fehler (G) und sehr schwere Fehler (C); Abkürzungen: S, sensibel; I, intermediär; R, resistent - In 21,1% der Fälle (n= 279) handelt es sich um geringe Fehler (anstelle von R oder S: I oder anstelle von I: R oder S). Diese traten bei S. aureus (107 Stämme, davon 6 MRSA), Enterokokken (84 Stämme, davon 71 E. faecalis), Enterobacteriaceae-Isolaten (85 Stämme) sowie Streptococcus spp. (n=3) auf. - In 2,5% der Fälle (n=33) traten schwere Fehler (anstelle von S: R) auf. Hiervon waren insbesondere Methicillin-sensible S. aureus (25 Stämme) betroffen. - In 0,6% der Fälle (n=8) traten sehr schwere Fehler (anstelle von R: S) auf. Sie betrafen 3 mal E. faecalis, 2 mal S. aureus und je 1 mal E. coli, P. mirabilis und M. morganii. Bei den 352 getesteten S. aureus-stämmen kam es in 61,9 % (n=218) der Fälle zu einem übereinstimmenden Testergebnis zwischen Agar-Diffusionstest und Mikrodilution. In 38,1% der Fälle (n=134) kam es zu Abweichungen und zwar handelte es sich in 30,4% der Fälle um geringe (101 MSSA, 6 MRSA), in 7,1% der Fälle um schwere (25 MSSA) und in 0,6% der Fälle (2 MSSA) um sehr schwere Fehler. Sehr schwere Fehler bei der Bewertung von MRSA traten jedoch nicht auf. Wie bei allen anderen Beta-Lactam/Beta-Lactamaseinhibitor-Kombinationen sollte auch hier das Testergebnis von Oxacillin berücksichtigt werden. S I R Zusammenfassung - Testblättchen mit der Beschickungsmenge Penicillin G 10 µg/sulbactam 10 µg erwiesen sich für die Durchführung des Agar-Diffusionstestes nach DIN als geeignet. - Die Grenzwerte für den Agar-Diffusionstest bei Testung der Kombination PEN-G/SBT lauten: resistent 20 mm, intermediär mm und sensibel 26 mm. - Die für PEN-G als Monosubstanz gemäß DIN geltenden MHK-Grenzwerte (sensibel 0,125 mg/l, intermediär 0,25 1 mg/l, resistent 2 mg/l) besitzen nunmehr auch Gültigkeit für die Kombination PEN-G/SBT. - MRSA sind als resistent gegenüber PEN G-SBT anzusehen. Die Autoren danken den folgenden Studienteilnehmern für die Überlassung der Daten: R. R. Reinert (Aachen); U. Goebel, E. Halle (Berlin); B. Wiedemann, S. Bagel (Bonn); H. Eiffert, U. Groß (Göttingen); D. Mack, I. Sobottka (Hamburg); E. Kniehl, A. Becker (Karlsruhe); W. Solbach, M. Maass (Lübeck); J. Focht (Moers); H. Blaufuß, R. Böhmer (München); N. Lehn, W. Schneider (Regensburg). Literatur 1. Bush K, Jacoby G, Medeiros A. A functional classification scheme for β-lactamases and its correlation with molecular structure. Antimicrob Agents Chemother 1995, 39: Retsema J, English A, Girard A, Lynch J, Anderson M, Brennan L, Cimochowski C, Faiella J, Norcia W, Sawyer P. Sulbactam/ampicillin: in vitro spectrum, potency, and activity in models of acute infection. Rev Infect Dis 1986; 8 (Suppl 5): Fachinformation Combactam 0,5 g/1,0 g, Stand der Information Oktober Bagel S, Kresken M, Schmalreck A, Beck G, Pfründer D. In-vitro activity of new sulbactam combinations against aerobic and anaerobic bacteria: results of a German multicentre study. 12 th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), Milan, Italy, April 24-27, 2002, Abstract Deutsches Institut für Normung, Normenausschuss Medizin (NA- Med). Methoden zur Empfindlichkeitsprüfung von bakteriellen Krankheitserregern (außer Mykobakterien) gegen Chemotherapeutika. Teil 4: Bewertungsstufen der minimalen Hemmkonzentration MHK- Grenzwerte von antibakteriellen Wirkstoffen. Beiblatt 1 zu DIN , Januar DIN Deutsches Institut für Normung e. V. Methoden zur Empfindlichkeitsprüfung von bakteriellen Krankheitserregern (außer Mykobakterien) gegen Chemotherapeutika. Regressionsanalyse zur Korrelation von Hemmhofdurchmesser (HHD) und minimaler Hemmkonzentration (MHK). DIN Teil 9 (Januar 2002) 7. Metzler C, DeHaan R. Susceptibility tests of anaerobic bacteria: statistical and clinical consideration. J Infect Dis 1974; 130: National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Development of in vitro susceptibility testing criteria and quality control parameters; approved guideline 2nd edition. M23-A2. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Wayne, Pa., 2001 Korrespondenzadresse: Dr. Johannes Brauers Antiinfectives Intelligence Gesellschaft für klinisch-mikrobiologische Forschung und Kommunikation mbh Immenburgstraße 20, Bonn Tel/Fax: / johannes.brauers@antiinfectives-intelligence.de MIKROBIOLOGE 14.Jg
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