Pankreatitis bei Patienten mit Hyperparathyreoidismus: Assoziation mit Mutationen im SPINK1 und CFTR Gen

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1 Aus der Medizinischen Klinik I des St. Josef Hospital Bochum -Universitätsklinikder Ruhr-Universität Bochum Prof. Dr. med. W.E. Schmidt Pankreatitis bei Patienten mit Hyperparathyreoidismus: Assoziation mit Mutationen im SPINK1 und CFTR Gen Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Tilman Horn aus Essen 2008

2 Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr Referent: Prof. Dr. med. W.E. Schmidt Koreferent: Prof. Dr. med. J. T. Epplen Tag der mündlichen Prüfung:

3 Abstract / Kurzzusammenfassung Tilman Horn Pankreatitis bei Patienten mit Hyperparathyreoidismus: Assoziation mit Mutationen im SPINK1 und CFTR Gen Problem: Die Hyperkalzämie bei Patienten mit primärem Hyperparathyreoidismus (phpt) gilt als Auslöser für die Entstehung einer Pankreatitis. Dieser Zusammenhang scheint nur milde ausgeprägt, denn die Prävalenz-Raten der Pankreatitis in großen Kollektiven liegen zwischen 1,5 und 3,5 %. Im Rahmen dieser Dissertation sollte überprüft werden, erstens: wie häufig eine Pankreatitis in einer der größten Kohorten Deutschlands von Patienten mit einem primären Hyperparathyreoidismus auftritt und zweitens: ob die Entstehung einer Pankreatitis möglicherweise durch andere bekannte genetische Risikofaktoren für eine Pankreatitis wie PRSS1, SPINK1 und CFTR Mutationen bedingt sein könnte. Methode: In einer Kohorte von 826 Patienten mit phpt, die prospektiv in den Jahren 1987 bis 2002 charakterisiert worden waren, wurde bei 38 Patienten eine Pankreatitis diagnostiziert (4,6 %). Von 25 dieser Patienten (12 Frauen und 13 Männern) konnte DNA gewonnen und auf Mutationen im Serin Protease Inhibitor Kazal Typ I Gen (SPINK1, N34S), sowie dem kationischen Trypsinogen (PRSS1, N29I und R122H) mittels Schmelzpunktanalyse untersucht werden. Zur Analyse der CFTR Mutationen (36 Mutationen/Tn-Polymorphismus) wurde ein Hybridisierungskit benutzt. Als Kontrolle dienten 50 Patienten mit einem phpt ohne Pankreatitis. Ergebnis: Das Pankreatitisrisiko ist bei Patienten mit einem phpt um ein 10- faches erhöht. Bei 4 von 25 Patienten mit phpt und Pankreatitis konnte eine N34S Mutation im SPINK1-Gen identifiziert werden (16 %) (OR 8,0; Konfidenzintervall 1,0-15,2; p < 0,001), wohingegen keine der 50 Kontrollen eine Mutation aufwies. Bei 4 Patienten wurden CFTR-Mutationen detektiert (OR 4,2; Konfidenzintervall 0,4-7,9; p 0,002) und bei einem Patienten das 5T Allel. Ein Patient war transheterozygot für eine SPINK1 (N34S) und CFTR (R553X)

4 Mutation. PRSS1 Mutationen fanden sich bei keinem der analysierten phpt Patienten mit Pankreatitis. Diskussion: Die Auftretenshäufigkeit einer Pankreatitis in der Kohorte mit 4,6 % ist vergleichbar mit dem Auftreten in zuvor publizierten Studien und gegenüber der Normalbevölkerung erhöht. Dabei lassen die hier erhobenen Daten erneut vermuten, dass die phpt vermittelte Hyperkalzämie nur eine untergeordnete Rolle bei der Entstehung einer Pankreatitis spielt. Erstmalig wurden zudem additive Risikofaktoren identifiziert und es konnte gezeigt werden, dass es bei Patienten mit phpt und Pankreatitis eine starke Assoziation mit Mutationen im SPINK1- und CFTR-Gen gibt, als Anhalt für eine multifaktorielle Ursache der Pankreatitis bei Hyperparathyreoidismus.

5 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Hyperparathyreoidismus Pankreatitis Akute Pankreatitis Chronische Pankreatitis Genetische Ursachen für eine Pankreatitis Hereditäre Pankreatitis Pankreatitis assoziierte und modifizierende Gene Serinproteaseninhibitor Kazal-Typ I (SPINK1 : GenBank #AF ) Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) Pankreatitis und phpt Fragestellung Patienten phpt-kohorte Patienten mit phpt und Pankreatitis phpt Kontroll-Gruppe ohne Pankreatitis Ethikvotum Material und Methoden: DNA-Extraktion Schmelzkurvenanalyse und Real-Time-PCR am LightCycler für SPINK1- (N34S) und PRSS1-(N29I und R122H) Mutationen Master Mix Ansätze für PRSS1 (N29I, R122H) und SPINK1 (N34S) DNA-Sequenzierung CFTR-Analyse Verbrauchsmaterialien Geräte Statistik Ergebnisse Klinische Daten der Gesamtkohorte Klinische Daten der Patienten mit phpt und Pankreatitis Mutationsanalyse PRSS 1-Gen-Mutationen SPINK 1-Gen-Mutationen CFTR-Gen-Mutationen Transheterozygoter Patient (SPINK1: N34S/ CFTR: R553X) mit phpt und Pankreatitis... 34

6 5 Diskussion Literaturverzeichnis Abkürzungsverzeichnis: ACP alkoholisch bedingte chronische Pankreatitis AP akute Pankreatitis CaSR Calcium Sensing Rezeptor CF zystische Fibrose CFTR cystic fibrosis transmembrane conductance regulator Cl Chlorid-Ion CP chronische Pankreatitis DNA Desoxyribonukleinsäure FRET fluorescence resonance energy transfer H2O Wasser HP hereditäre Pankreatitis ICP Idiopathisch chronische Pankreatitis LC LightCycler MgCl2 Magnesiumchlorid NaCl Natriumchlorid OMIM Online Mendelian Inheritance in Man ((OMIM): PCR Polymerasekettenreaktion phpt primärer Hyperparathyreoidismus PRSS1 Serinprotease 1 (kationisches Trypsinogen) PTH Parathormon SPINK1 Serinproteinaseinhibitor Kazal Typ 1 TP tropische Pankreatitis Ferner wurden im Text der international gültige Einbuchstaben-Code der Aminosäuren und die Abkürzungen der Fachzeitschriften verwendet. 5

7 Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Ursachen der akuten Pankreatitis modifiziert nach Greenberger und Toskes [33] Tabelle 2:TIGAR-O-Klassifikation (Ursachen der chronischen Pankreatitis) modifiziert nach Etemad und Whitcomb [29] Tabelle 3 : Mutationen auf dem INNO-LiPA CFTR 19-Teststreifen Tabelle 4: Mutationen und Tn polymorphismen auf dem INNO-LiPA CFTR 17+Tn- Teststreifen Tabelle 5: Charakteristik der Gesamtkohorte und der Patienten mit phpt und Pankreatitis Tabelle 6: Ergebnis der (PRSS1, SPINK1 und CFTR) Mutationsanalysen bei Patienten mit phpt und Pankreatitis Tabelle 7: Häufigkeitswahrscheinlichkeit der N34S SPINK1 und CFTR Mutationen bei phpt und Pankreatitis Tabelle 8: Charakterisierung der Patienten mit phpt und Pankreatitis Tabelle 9:Studien zur Korrelation phpt/pankreatitis Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Beispiel einer Schmelzkurvenanalyse für eine SPINK1 N34S Mutation Abbildung 2: CFTR Testkarte Abbildung 3: SPINK1-(N34S)-Schmelzkurvenanalyse für phpt/pankreatitis Patienten.. 32 Abbildung 4: INNO LIPA CFTR 19 Testkarte für Patienten mit phpt und Pankreatitis

8 1 Einleitung 1.1 Hyperparathyreoidismus Der Hyperparathyreoidismus ist eine Erkrankung der Nebenschilddrüse mit einer generalisierten Störung des Kalzium-, Phosphat- und Knochenstoffwechsels infolge einer vermehrten Parathormonproduktion. Die Erhöhung des zirkulierenden Parathormons (PTH) führt zu einer Hyperkalzämie und Hypophosphatämie. Der primäre Hyperparathyreoidismus (phpt) gehört zu den häufigen endokrinologischen Erkrankungen mit einer Prävalenz von ca. 0,2 bis 0,4 %. Frauen sind zwei- bis dreimal häufiger betroffen als Männer [41]. Meistens wird die Diagnose nach dem 40. Lebensjahr gestellt. Bei mehr als 80 % der Patienten mit phpt ist ein singuläres Adenom der Nebenschilddrüse die Ursache [83]. Weitere Ursachen für einen Hyperparathyreoidismus sind multiple Adenome der Nebenschilddrüse (5 %), Hyperplasie der Epithelkörperchen (15 %) und Karzinome der Epithelkörperchen (<1 %). Selten wird ein Hyperparathyreodismus im Rahmen einer multiplen endokrinen Neoplasien (MEN, autosomal dominante Vererbung) beobachtet. Die MEN-1 (Wermer-Syndrom) weist neben dem Hyperparathyreoidismus Tumoren der Hypophyse und des Pankreas auf und ist mit einer Magensäurehypersekretion und einem Ulkusleiden (Zollinger-Ellison- Syndrom) assoziiert. Die MEN-2A (Sipple-Syndrom) ist durch ein Phäochromozytom, ein medulläres Schilddrüsenkarzinom und einen Hyperparathyreoidismus charakterisiert, bei der MEN-2B (Gorlin-Syndrom) treten zusätzlich Neurinome auf, meist jedoch kein Hyperparathyreoidismus [34]. Die Störung der Kalziumhomöostase resultiert aus der vermehrten PTH Sekretion und seiner Wirkung im physiologischen Regelkreis. Dieser ist durch die Steuerungselemente der ossären Kalzium-Mobilisierung, Steigerung der intestinalen Kalzium-Resorption und Steigerung der tubulären Kalzium- Reabsorption gekennzeichnet. Die klassische Symptomtrias "Stein-, Bein- und Magenpein" im Sinne einer Nephrolithiasis, der Osteitis fibrosa cystica sowie Dyspepsie oder Ulcera ventriculi findet man heute eher selten [2, 13]. Die Diagnose des phpt ist daher oft eine Zufallsdiagnose bei erhöhtem Kalziumspiegel. Bei genauerer Befragung der 7

9 Patienten mit phpt gibt die Mehrzahl der Patienten jedoch Beschwerden wie Abgeschlagenheit, Müdigkeit, Reizbarkeit und Mangel an sexuellem und emotinalem Interesse an [36, 37, 54]. Die initiale Verdachtsdiagnose kann laborchemisch bestätigt werden. Es imponiert ein erhöhtes Kalzium (Serumkalzium > 2,6 mmol/l (Normwert: 2,2-2,6 mmol/l) bei normaler Nierenfunktion und normalem Gesamteiweiß), ein erniedrigtes Phosphat und ein erhöhtes intaktes PTH im Serum. Im Urin lässt sich ein erhöhter Kalzium und Phosphatspiegel nachweisen. Im Rahmen der Lokalisationsdiagnostik spielt die Sonographie des Halses zur Diagnostizierung vergrößerter Nebenschilddrüsen, bei eingeschränkter Sensitivität, eine wichtige Rolle. Sensitiver scheinen Computertomographie oder Szintigraphie. Die Erfolgsquote der bilateralen explorativen Parathyreoidektomie durch einen erfahrenen, endokrinen Chirurgen liegt bei ca. 95 Prozent [46]. Die kurative Therapie der Wahl ist eine Entfernung der vergrößerten Epithelkörperchen, wobei die Indikation zur Operation dann vorliegt, wenn es sich um einen symptomatischen phpt handelt. Durch rechtzeitige Entfernung der vergrößerten Epithelkörperchen ist die Erkrankung heilbar. 1.2 Pankreatitis Die Pankreatitis ist eine abakterielle entzündliche Erkrankung der Bauchspeicheldrüse. Bereits 1896 wurde von Chiari die Hypothese postuliert, dass das entscheidende Ereignis für die Entstehung einer Pankreatitis die Selbstverdauung durch die eigenen Verdauungsenzyme ist [17]. Bei der Pankreatitis kann man die akute, die akut rekurrierende und die chronische Form unterscheiden (siehe und 1.2.2). Die alterspezifische Häufigkeit in den westlichen Industrieländern zeigt einen Gipfel in der Altersgruppe zwischen 35 und 44 Jahren. Die Inzidenz der akuten Pankreatitis beträgt ca. 10 Neuerkrankungen pro Einwohnern und Jahr 8

10 [8, 79], die Inzidenz der chronischen Pankreatitis beträgt zwischen 3,5 bis 10 Neuerkrankungen pro Einwohner und Jahr [4, 15, 48, 88] Akute Pankreatitis Die akute Pankreatitis zeigt einen weit differierenden klinischen Verlauf. Von der klinisch milde verlaufenden, interstitiell-ödematösen Form (70-80 %) [8] bis zur hämorrhagisch-nekrotisierenden Form (20-30 %) [14, 44] mit generalisierter Sepsis und Multiorganversagen sind alle Ausprägungen möglich und werden im klinischen Alltag gesehen [76]. Bei der milden Form beträgt die Letalität weniger als 2 % [9], wohingegen bei schwerem Verlauf die Letalität % [32] beträgt. Symptome einer akuten Pankreatitis sind plötzlich einsetzende Oberbauchschmerzen, Übelkeit, Erbrechen und Fieber. Diagnosekriterien sind neben den klinischen Symptomen die Erhöhung der pankreatischen Enzyme: Amylase und Lipase (über das Dreifache des oberen Grenzwertes) und bildmorphologische Kriterien im transabdominellen Ultraschall oder Abdomen-CT wie z.b. ein peripankreatisches Ödem oder Nekrosen. Auch die Kalzium-, Magnesium-, Natrium-, Kalium-, Bikarbonat-, Glukose- oder Fettwerte im Blut können erhöht sein. Pathophysiologische Modelle zeigen, dass sich die akute Pankreatitis in drei Phasen entwickelt [35]. Die erste Phase ist charakterisiert durch die intrapankreatische Aktivierung von Verdauungsenzymen mit darauf folgender Schädigung der Azinuszellen. Trypsin spielt hierbei eine entscheidende Rolle, denn neben der Fähigkeit zur Aktivierung anderer Zymogene wie Proelastase, Chymotrypsinogen besteht die Fähigkeit zur Autoaktivierung. Die zweite Phase beinhaltet eine proinflammatorische Reaktion unterschiedlicher Ausprägung mit Aktivierung, Chemoattraktion und Sequestration von Neutrophilen im Pankreas, sowie der Ausschüttung unterschiedlicher Zytokine. Die dritte Phase umfasst die lokalen und systemischen Auswirkungen der aktivierten proteolytischen Enzyme und der freigesetzten proinflammatorischen Mediatoren. 9

11 Vielfältige Auslöser für eine akute Pankreatitis sind bekannt. Die beiden häufigsten Ursachen sind Gallensteine und Alkoholkonsum (ca. 90 %) [12, 86]. Weitere Ursachen zeigt Tabelle 1, wobei in diesem Zusammenhang auch die Hyperkalzämie als mögliche Ursache einer akuten Pankreatitis aufgeführt wird. Tabelle 1: Ursachen der akuten Pankreatitis modifiziert nach Greenberger und Toskes [33] häufige Ursachen - Gallensteine (einschließlich Mikrolithiasis) (30-60 %) - Alkohol (akuter und chronischer Alkoholismus (15-30 %) - Hypertriglyceridämie - Endoskopisch retrograde Cholangiopankreatikographie (ERCP), besonders nach Papillen-Manometrie - Trauma (besonders stumpfes abdominelles Trauma) - postoperativ (abdominelle und nicht abdominelle Operationen) - Arzneimittel (z.b. Azathioprin, 6-Mercaptopurin, Sulfonamide, Östrogene,Tetrazykline, Valproat, antiretrovirale Substanzen) - Sphinkter-Oddi-Dysfunktion seltene Ursachen - vaskuläre Veränderungen und Vaskulitis - (Ischämie nach Herzoperationen) - Kollagenosen und thrombotisch thrombozytopenische Purpura (TTP) - Pankreaskarzinom - Hyperkalzämie - Periampulläre Divertikel - Pankreas divisum - hereditäre Pankreatitis - mit Pankreatitis assoziierte Mutationen (z.b. SPINK1, CFTR) - Zystische Fibrose - Niereninsuffizienz sehr seltene Ursachen - Infektionen ( Mumps, Coxsackie-Viren, Zytomegalievirus, Echovirus, Parasiten) - Autoimmunerkrankungen ( z.b. Sjögren-Syndrom) 10

12 Die Therapie der akuten Pankreatitis ist überwiegend auf supportive Maßnahmen beschränkt, wie intensivmedizinische Überwachung bei schwerem Verlauf, analgetische Therapie, ggf. Nahrungskarenz, ausreichende Flüssigkeitssubstitution, eventuell Antibiotika-Gabe und ggf. eine chirurgische Intervention bei Komplikationen [25]. Circa 90 % der AP-Fälle heilen ohne Residuen aus, wohingegen es in etwa 10 % zu einem allmählichen Übergang von der akuten in eine chronische Pankreatitis kommt Chronische Pankreatitis Bei der chronische Pankreatitis (CP) handelt es sich um eine rekurrierende oder kontinuierliche entzündliche Erkrankung des Pankreas. Sie ist durch irreversible morphologische Veränderungen charakterisiert und mündet bei einem Teil der Patienten in einem exokrinen und endokrinen Funktionsverlust [84]. Im Verlauf der Erkrankung kann es durch die exokrine und/oder endokrine Pankreasinsuffizienz zu Maldigestion, Gewichtsverlust, Steatorrhoe und Insulinmangeldiabetes kommen. Weitere Komplikationen sind Pankreaspseudozysten, Milz- und Pfortaderthrombosen, Stenosen des Pankreasgangsystems oder des distalen Ductus choledochus. Die Patienten leiden insbesondere an chronischen Oberbauchschmerzen, Gewichtsverlust und Steatorrhoe. Mit zunehmender Dauer der Erkrankung kann es zu einer malignen Entartung des Pankreas kommen, wobei das relative Risiko um fünf Prozent innerhalb von 20 Jahren zunimmt [49]. In bis zu % der Fälle ist die Ursache für eine CP bei Erwachsenen äthyltoxisch [3, 28]. Weitere Ursachen können metabolische Störungen und anatomische Anomalien sein (Ursachen/Risiko-Klassifikationssystem der chronischen Pankreatitis siehe Tabelle 2), wobei auch in diesem Zusammenhang die Hyperkalzämie und der phpt erwähnt werden. Genetische Ursachen werden als hereditäre Pankreatitis und modifizierende Gene bezeichnet. 11

13 Tabelle 2:TIGAR-O-Klassifikation (Ursachen der chronischen Pankreatitis) modifiziert nach Etemad und Whitcomb [29] Toxischmetabolisch Idiopathisch Genetisch Autoimmun Rezidivierende akute Pankreatitis alkoholisch early onset autosomal isolierte postnekrotische dominant autoimmune (schwere akute (Mutationen des chronische Pankreatitis) kationischen Pankreatitis Trypsinogen im Codon 29 und 122) Rauchen late onset modifizierende syndromassozierte wiederkehrende Gene (z.b. CFTR; akute Pankreatitis SPINK1- autoimmune Mutationen; chronische kationisches Pankreatitis (z.b. Trypsinogen, Sjögren- Codon 16, 22, 23) Syndrom; PBC) Hyperkalzämie, tropische (teils Gefäßerkrankungen z.b. bei phpt auch genetisch oder Ischämien bedingt) Hyperlipidämie nach Ganzkörperbestrahlung Chronische Niereninsuffizienz medikamentös Obstruktive Pankreatitis Pankreas divisum Sphinkter Oddi Dysfunktion Gangobstruktion duodenale ampulläre Zyste posttraumatische Pankreasgangnarbe Vergiftungen 12

14 1.3 Genetische Ursachen für eine Pankreatitis Hereditäre Pankreatitis Die hereditäre Pankreatitis (HP) als Unterform der CP wurde zum ersten Mal 1952 von Comfort und Steinberg beschrieben [22]. Die genaue Charakterisierung der HP ist eng verbunden mit der Identifizierung einer amerikanischen Familie im mittleren Westen. Bereits 1972 publizierten McElroy und Christiansen in einer Arbeit im American Journal of Medical Genetics [57] den Stammbaum einer Familie, deren betroffene Familienmitglieder bereits im Kindesalter an einer Pankreatitis mit chronischem Verlauf erkrankten. Im Jahr 1996 gelang es unabhängig voneinander drei Arbeitsgruppen den Genort für die hereditäre Pankreatitis auf Chromosom 7 (7q35) [51, 67, 103] zu lokalisieren, auf dem auch wichtige pankreatische Verdauungsenzyme lokalisiert sind (z.b. Carboxypeptidase A1, Trypsinogen Familie). Whitcomb et al. identifizierten daraufhin, im selben Jahr, mit Hilfe der DNA der erkrankten Familie, eine Punktmutation im Exon 3 des kationischen Trypsinogen (PRSS1; OMIM ) als Erkrankungsursache für die hereditäre Pankreatitis [103]. Es handelte sich dabei um den Austausch eines Arginin durch Histidin an Position 122 der Proteins (R122H). In rascher Folge wurden weitere Mutationen im PRSS1 Gen beschrieben, z.b. N29I, A16V, D22G oder K23R, wobei die N29I und R122H Mutationen mehr als 90 % ausmachen. Bis zum heutigen Zeitpunkt sind mehr als 25 PRSS1 Gen Varianten beschrieben worden (für die komplette Übersicht: Die Definition der HP umfasst ein autosomal dominantes Krankheitsbild (Penetranz ca. 80 %) mit meist schon im Jugendalter (13,9 ± 12,2 Jahren) [52] rezidivierenden akuten Pankreatitiden und der Entwicklung einer chronischen Pankreatitis mit zwei Betroffenen einer Generation oder drei Betroffenen in mehr als einer Generation [56, 82, 85]. Als Spätkomplikation zeigt sich bei Patienten mit einer HP eine deutlich erhöhte Inzidenz für das Auftreten von Pankreaskarzinomen (bis zu 40 % im Alter von 70 Jahren) [52], so dass neben der funktionellen Bedeutung ein wichtiger klinischer Grund besteht die Patienten mit einer HP zu identifizieren. Die Entdeckung der PRSS1 Mutationen unterstützte zudem die Hypothese, dass Trypsin eine Schlüsselrolle in der Pankreatitisentstehung spielt. 13

15 1.4 Pankreatitis assoziierte und modifizierende Gene Serinproteaseninhibitor Kazal-Typ I (SPINK1 : GenBank #AF ) Der Serinprotease-Inhibitor Kazal Typ I (SPINK1; OMIM ) ist ein wichtiger intrapankreatischer Trypsin-Inhibitor, der Trypsin durch kovalente Bindung zwischen dem katalytischen Serin der Protease und einem Lysin im reaktiven Zentrum von SPINK1 inhibiert [7]. Lokalisiert ist das SPINK1-Gen auf dem Chromosom 5 [40]. Die SPINK1-vermittelte Inhibition des Trypsin ist allerdings temporär, da der Typsin-SPINK1-Komplex selbst als Substrat für Trypsin dient. Somit kommt es im Verlauf zu einer Reduktion der SPINK1 Aktivität und zur dadurch vermittelten Wiederherstellung der ursprünglichen Trypsinaktivität. Dies wird als Phänomen der temporären Inhibition bezeichnet [50]. Chen et al. beschrieben im Jahre 2000 als erste bei Patienten mit einer idiopathischen chronischen Pankreatitis (ICP) N34S SPINK1 Mutationen [16], wobei eine Assoziation erstmals von Witt et al. bei 23 % der untersuchten Patienten mit einer ICP aufgezeigt werden konnte [104] Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) Bei der zystischen Fibrose handelt es sich um eine Erkrankung, die insbesondere durch eine chronische Lungenerkrankung charakterisiert ist, wobei im Verlauf auch Komplikationen des Pankreas auftreten können [61, 89]. Sie ist die häufigste autosomal rezessiv vererbte Erkrankung. Der Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR; OMIM ) ist 1989 als Krankheitsgen der zystischen Fibrose (CF) (OMIM ) identifiziert worden [42, 70] und befindet sich auf dem langen Arm von Chromosom 7 (7q31). In Deutschland sind 4 % der Bevölkerung asymptomatische heterozygote Genträger [5, 24]. Bei 1-2 % der Patienten mit CF tritt im Rahmen der Erkrankung eine rezidivierende Pankreatitis auf [81]. Das CFTR-Gen kodiert für einen camp-abhängigen Chloridkanal [71] und besitzt eine bedeutende Rolle in der Sekretion von Bikarbonat und Chlorid. Aktuell sind bereits mehr als 1500 Mutationen im CFTR-Gen beschrieben worden, wobei die kodierende Sequenz 27 Exons beinhaltet. In Deutschland sind ca. 72 % 14

16 der Patienten mit zystischer Fibrose homozygot oder compound heterozygot für acht Mutationen des CFTR-Gens ( 508F, G542X, R553X, W1282X, N1303K, 621+1G T, G A und R117H) [93]. Die häufigste Mutation des CFTR- Gens mit einer Frequenz von 66 % stellt die 508F-Deletion dar [93]. Die Erstbeschreibung von CFTR Mutationen bei Patienten mit einer CP bzw. ICP erfolgte 1998 durch zwei unterschiedliche Arbeitsgruppen aus England und den USA [18; 80]. Sharer et al. konnten bei Patienten mit einer CP heterozygote CFTR Mutationen nachweisen [80], wohingegen Cohn et al. bei Patienten mit einer ICP CFTR Mutationen diagnostizierten [18]. 1.5 Pankreatitis und phpt Im Rahmen des phpt steht die Hyperkalzämie als mögliche Ursache der Pankreatitis und weitgehend akzeptierter Pathomechanismus im Vordergrund [29]. Die Trypsinaktivierung ist kalziumabhängig, wobei der Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration eine entscheidende Rolle spielt. Es ist beschrieben worden, dass ein erhöhter zytosolischer Kalziumspiegel, ein klassisches Symptom eines primären Hyperparathyreoidismus, eine akute Pankreatitis auslösen kann [87]. In den größten Studien zum phpt ist allerdings nur eine Auftretenshäufigkeit von einer Pankreatitis zwischen 1,5 % [10, 99] und 6,8 % [1] beschrieben worden. 15

17 1.6 Fragestellung Durch die Kooperation mit der chirurgischen Klinik des Universitätsklinikums Gießen-Marburg gelang es eine der weltweit größten Kohorten von Patienten mit einem phpt zu untersuchen. Dabei konzentriert sich diese Dissertation auf folgende wesentlichen bisher nicht beantworteten Fragestellungen: 1) Wie hoch ist die Prävalenz einer Pankreatitis bei Patienten mit einem primären Hyperparathyreoidismus in Deutschland? 2) Gibt es zusätzliche genetische Risikofaktoren bei Patienten mit einem primären Hyperparathyreoidismus und Pankreatitis? Neben der Auswertung der Datenbank zur Feststellung der Prävalenz wurde die identifizierte phpt/pankreatitis Kohorte auf Mutationen in den SPINK1, PRSS1 und CFTR Genen untersucht. Letztere sind bekannte genetische Risikofaktoren für eine Pankreatitis. Methodisch wurden dazu PCR, DNA-Sequenzierung und Hybridisierungskits benutzt. 16

18 2 Patienten 2.1 phpt-kohorte Über einen Zeitraum zwischen April 1987 und Dezember 2002 wurden 826 Patienten mit Hyperparathyreoidismus in der chirurgischen Klinik des Universitätsklinikums Gießen-Marburg untersucht und behandelt. Erfasst wurden Alter und Geschlecht der Patienten, Parathormonspiegel, Phosphat, Kalzium, Lipase, Amylase und klinische Symptome wie Nierensteine, peptische Ulcera und Knochenschmerzen. Lag eine Pankreatitis vor, wurde hier unterschieden zwischen einer akuten, akut hämorrhagischen, akut wiederkehrenden und chronisch kalzifizierenden Form der Pankreatitis. Die Behandlung des Hyperparathyreoidismus in der chirurgischen Klinik des Universitätsklinikums Gießen-Marburg bestand aus einer bilateralen Exploration und Identifikation von allen vier Epithelkörperchen (Glandulae parathyreoideae), sowie der Entfernung von vergrößerten Drüsen, sowohl bei sporadischen Fällen als auch im Falle einer multiplen endokrinen Neoplasie (MEN). 2.2 Patienten mit phpt und Pankreatitis Die Diagnose der akuten Pankreatitis wurde anhand folgender Kriterien gestellt: 1) akute abdominelle Schmerzen; 2) laborchemisch erhöhte Pankreasenzyme (Lipase oder Amylase des 3-fachen des oberen Grenzwertes); 3) sonografische oder radiologische Kriterien für eine AP (Pankreasnekrose, ödematöse Pankreatitis, interstitielle Kalzifizierung im CT). Die Diagnose der chronischen Pankreatitis wurde in Anlehnung an die Marseille-Rom-Klassifikation gestellt [77]. In der phpt-gesamtkohorte wurden 38 Patienten (4,6 %) mit Pankreatitis identifiziert, wobei von 25 Patienten DNA gewonnen und auf die spezifischen Mutationen untersucht werden konnte. Auf die spezifische Zusammensetzung dieser Patientengruppe wird in Tabelle 5 sowie im Ergebnisteil dezidiert eingegangen. 17

19 2.3 phpt Kontroll-Gruppe ohne Pankreatitis Die Kontroll-Gruppe bestand aus Patienten mit einem primären Hyperparathyreoidismus ohne Nachweis einer Pankreatitis und wurde aus der Gesamtkohorte rekrutiert. Es wurde DNA von 50 Patienten aus dieser Population untersucht. Dabei handelte es sich um 50 Patienten (25 Frauen, 25 Männer; das Durchschnittsalter bei Operation betrug 60 ± 13 Jahre) mit einem isolierten primären Hyperparathyreoidismus ohne Hinweise auf eine akute Pankreatitis oder abdominelle Beschwerden in der Vorgeschichte. Ein Patient aus der Kontroll- Gruppe wies ein MEN-Syndrom auf. Eine detaillierte klinische, laborchemische und symptomatische Auflistung der Patienten zeigt Tabelle Ethikvotum Die vorliegende Studie wurde von der Ethikkommission der Ruhr-Universität- Bochum als unbedenklich eingestuft (Ethikvotum 2436). Alle Patienten wurden über die wissenschaftlichen Ziele und Durchführung molekulargenetischer Untersuchungen aufgeklärt. Die Entnahme von venösem Blut erfolgte nach Aufklärung und Zustimmung der Patienten. 18

20 3 Material und Methoden: 3.1 DNA-Extraktion Die genomische DNA wurde einerseits in der Abteilung für Allgemeinchirurgie des Universitäts-Klinikum Gießen-Marburg in Marburg aus Nebenschilddrüsengewebe, welches kryokonserviert war, und im Weiteren in der Medizinischen Klinik I der Universitätsklinik St. Josef-Hospital in Bochum aus EDTA-Vollblutproben gewonnen. Die DNA-Extraktion der Proben erfolgte mittels "QIAmp Mini Kit" nach Anweisungen des Herstellers (Qiagen, Hilden, Deutschland). Zu Beginn werden 20 µl Qiagen Protease (oder Proteinase K) in ein 1,5 ml großes Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. Dann gibt man 200 µl EDTA-Blut von den Patientenproben und 200 µl Puffer AL (Lysepuffer) hinzu und das Ganze wird ca. 15 Sekunden auf dem Vortexer gut durchmischt. Nach 10 Minuten Inkubation im Wasserbad bei 56 C werden 200 µl Ethanol ( %) hinzugegeben und auf dem Vortexer für 15 Sekunden durchmischt. Das Gemisch wird nun vorsichtig in einen Säulenfilter (QIAamp Spin Column), der in einem 2 ml Auffangröhrchen steckt, gegeben und für 1 Minute bei 8000 rpm zentrifugiert. Die DNA ist jetzt an das Filtermaterial der Säule gebunden und diese wird auf ein neues Auffangröhrchen gesetzt, während das alte mit dem Filtrat verworfen wird. Auf die Säule gibt man 500 µl Puffer AW1 (Waschpuffer 1) und man zentrifugiert erneut für 1 Minute bei 8000 rpm. Die Säule wird erneut in ein neues Auffangröhrchen gesetzt, und dann mit 500 µl Puffer AW2 (Waschpuffer 2) erneut gewaschen und für 3 Minuten bei rpm zentrifugiert. Um noch kleine Reste des Puffers aus dem Filter zu lösen, zentrifugiert man diesen in einem neuen Röhrchen ohne Zugabe eines Puffers für eine weitere Minute bei rpm. Nach diesem Schritt gibt man dann nach dem Umsetzen der Säule auf ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen 200 µl des Elutionspuffers Puffer AE oder H2O dd hinzu und zentrifugiert nach 1 Minute Inkubation bei Raumtemperatur (15-25 C) für 1 Minute bei 8000 rpm. Die vorher am Filter gebundene DNA befindet sich nun im Eluat. 19

21 3.2 Schmelzkurvenanalyse und Real-Time-PCR am LightCycler für SPINK1-(N34S) und PRSS1-(N29I und R122H) Mutationen Zum Nachweis der von uns untersuchten Mutationen haben wir Polymerasekettenreaktionen (PCR) mit dem LightCycler System der Firma Roche Molecular Biochemicals durchgeführt. Es handelt sich dabei um eine Real- Time-PCR. Grundidee der PCR ist es DNA durch zwei flankierende Primer mit Hilfe der DNA-Polymerase durch wiederholte Verdoppelung in mehreren Zyklen zu vervielfältigen. Man verwendet die PCR dabei um kurze, genau definierte Teile eines DNA-Stranges zu vervielfältigen, wobei nur kurze DNA-Abschnitte bis zu ca. 10 kbp ( Basenpaare) kopiert werden können. Ein PCR-Prozess besteht aus einer Serie von Zyklen. Jeder Zyklus besteht aus drei Schritten. Zuerst werden durch Erhitzen auf 96 C die Wasserstoffbrückenbindungen, die die DNA-Stränge zusammenhalten aufgebrochen. Dies bezeichnet man als Melting = Schmelzen. Man senkt dann die Temperatur ab und die Primer können sich an die Einzelstrang-DNA anlegen, hierbei handelt es sich um das so genannte Annealing = Anlagern. Die benötigte Temperatur (Annealing-Temperatur) hängt vom jeweiligen Primer ab. Man wählt die Temperatur bei der Standard PCR so, dass sie ca. 3 C unter der errechneten Schmelztemperatur von Primer und Zielsequenz liegt. Im letzten Schritt füllt dann die DNA-Polymerase von dem Primer aus beginnend die fehlenden Stränge mit Nukleotiden auf. Diese bezeichnet man als Elongation = Verlängerung. Die hierbei benötigte Temperatur (68-72 C) hängt von der DNA-Polymerase ab. Die für die Vervollständigung benötigte Zeit heißt Extensionszeit, diese muss entsprechend der zur erwartenden Amplifikationsgrösse gewählt werden und errechnet sich wie folgt: Größe des Amplifikates in bp/25. Wählt man die Extensionszeit zu kurz, kann die Polymerase das Amplifikat nicht während eines Zyklus komplett synthetisieren. Die so in einem Zyklus entstandenen DNA-Stränge bilden dann die Vorlage für den nächsten Zyklus. Die Schmelzkurvenanalyse ist ein Verfahren, das auf dem Prinzip der herkömmlichen PCR beruht und zusätzlich die Möglichkeit der Identifizierung von Mutationen bietet. 20

22 Man erreicht die Identifizierung dadurch, dass sich zwei Hybridsonden (Anchorund Sensor-Sonde) an das Produkt binden. Man markiert die Sonden mit zwei Fluorochromen, die sich während der Zyklen an das PCR-Produkt binden. Einer der Fluorochrome, das Donator-Fluorochrom wird dann durch eine Lichtquelle angeregt und gibt einen Teil seiner Energie an das Akzeptor-Fluorochrom ab. Diese Messmethoden benötigen den Gebrauch von spezifischen Sequenz- Sonden, wie bereits oben beschrieben. Eine dieser Methoden ist die so genannte Hybridisations-Sonden-Methode. Diese Methode wird benutzt zur DNA-Detektion und Quantifizierung und hat eine maximale Spezifität zur Identifikation des gesuchten Produktes. Man ergänzt zu den Reaktionskomponenten, die auch bei der konventionellen PCR benötigt werden, zwei speziell entwickelte sequenzspezifische Oligonukleotide (zwei Sonden), welche mit zwei verschiedenen Fluoreszenz-Farben versehen werden. Die Anchor-Sonde erhält an der 5 -Position einen Farbstoff z.b. LC Red 640 (Acceptorfarbstoff/ z.b. LightCycler Red 640) und an der 3 -Position ein p (phosphoryliertes Ende). Die Sensor-Sonde erhält am 3 -Ende eine Markierung mit z.b. Fluorescein einem Donorfarbstoff. Die Erkennung basiert auf der Emittierung von einem Fluoreszenz-Signal mit einer spezifischen Wellenlänge durch den so genannten Fluoreszein-Resonanz-Energie-Transfer (fluorescence resonance energy transfer = FRET) zwischen den beiden Sonden, nachdem sie sich an der Zielsequenz angebunden haben. Je größer die Übereinstimmung mit der Ziel-Sequenz, desto höher ist das Signal. Führt man im Anschluss daran eine Schmelzkurven-Analyse durch, lassen sich Mutationen anhand von Schmelztemperaturen identifizieren. Dabei bedient man sich des Mechanismus, dass jede ds-dna ihre spezifische Schmelztemperatur hat. Diese ist definiert als die Temperatur, bei der 50 % der DNA als Einzelstrang vorliegen. Erreicht man die Schmelztemperatur, kommt es zu einem Knick in der Kurve (X-Achse: Temperatur; Y-Achse: Fluoreszenz). Trägt man nun die Temperatur (X-Achse) gegen die df/dt (Y-Achse) auf, bekommt man in der Kurve einem Peak, hier liegt genau die Schmelztemperatur (siehe Abbildung 1). Handelt es sich bei dem bei der PCR entstandenen Produkt um den Wildtyp, hybridisiert die Sensor-Sonde, bei Wahl der entsprechenden Sonden, zu 100 % mit dem Template und schmilzt bei höheren Temperaturen ab. Handelt es sich aber um 21

23 eine Mutation hybridisiert die Sensor-Sonde zu einem geringeren Prozentsatz und hat einen niedrigeren Schmelzpunkt. Als Kontrolle laufen Wildtyp- und Mutationskontrollen im Ansatz mit. Abbildung 1: Beispiel einer Schmelzkurvenanalyse für eine SPINK1 N34S Mutation Zur Durchführung der Real-Time-PCR und Schmelzkurvenanalyse mit Hilfe des LightCycler der Firma Roche Diagnostics, Mannheim wurde jeweils ein Master Mix Ansatz für die Mutationen N29I (PRSS1-Gen), R122H (PRSS1-Gen) und N34S (SPINK1-Gen) entworfen. 22

24 3.3 Master Mix Ansätze für PRSS1 (N29I, R122H) und SPINK1 (N34S) PRSS1 (N29I) Master Mix Zusätze 1x H2O steril (farblos) 6,2 µl MgCl2 (blau)(25 mm) 0,4 µl N29I-Fw (10 µm) 0,5 µl N29I-Rv (10 µm) 0,5 µl N29I-Sensor (4µM) 0,2 µl N29I-Anchor (4µM) 0,2 µl FAST DNA Master HYBR 1,0 µl Gesamtvolumen 9,0 µl Eingesetzte Primer für N29I: N29I-Fw (5 -ACATGCTATTGACTTGCC) N29I-Rv (5 -GGCCTGCTGATACCAC) Eingesetzte Hybridisierungssonden für N29I: N29I-Sensor (5 -GGGCTACAACTGTGAGGAGAA-FL) N29I-Anchor (5 -LC Red640-CTGTCCCCTACCAGGTGTCC-p) PRSS1 (R122H) Master Mix Zusätze 1x H2O steril (farblos) 6,4 µl MgCl2 (blau)(25 mm) 0,2 µl R122H-Fw (10 µm) 0,5 µl R122H-Rv (10 µm) 0,5 µl R122H-Sensor (10 µm) 0,2 µl R122H-Anchor (10 µm) 0,2 µl FAST DNA Master HYBR 1,0 µl Gesamtvolumen 9,0 µl Eingesetzte Primer für R122H: R122H-Fw (5 -CCCCCAATACGACAGG) R122H-Rv (5 -ACTAAGGGTCCCACTCA) Eingesetzte Hybridisierungssonden für R122H: R122H-Sensor neu (5 -CAACGCCCACGTGTCCACCA-FL) R122H-Anchor neu (5 - LC Red640-TCTCTGCCCACCGCCCCTCCAGCC-p) 23

25 SPINK1 (N34S) Master Mix Zusätze 1x H2O steril (farblos) 8,8 µl MgCl2 (blau) 1,2 µl PSTI / Fw (10 µm) 1,0 µl PSTI / Rv (10 µm) 1,0 µl PSTI-3FL (10 µm) 1,0 µl PSTI-3LC (10 µm) 1,0 µl Fast Start DNA Master HYBR 2,0 µl Gesamtvolumen 16,0 µl Eingesetzte Primer für N34S: PSTI-F3 (5 -ccaatcacagttattccccagag) PSTI-R3 (5 -gtttgcttttctcggggtgag) Eingesetzte Hybridisierungssonden für N34S: PSTI-3FL Sensor (5 - ccaaatgttacaatgaacttaatggatgc-fl) PSTI-3LC Anchor (5 - LC Red640-ccaagatatatgaccctgtctgtgggac-p) Die verwendeten Primer und Hybridisierungssonden wurden von der Firma TIB MOLBIOL (Berlin, Deutschland) hergestellt. 3.4 DNA-Sequenzierung Die DNA-Sequenzanalyse wurde mit dem Capillary Electrophoretic Genetic Analysis System (CEQTM 8000) der Firma Beckman-Coulter im Zentrum für klinische Forschung der Ruhr-Universität durchgeführt. Eine DNA-Sequenzierung wurde nur bei Messproblemen mit dem LightCycler und sehr begrenzter DNA Konzentration und Menge durchgeführt. Dies war in einem Fall nötig, bei dem die Schmelzkurvenanalyse für N34S SPINK1 unsaubere Ergebnisse ergab. Es wurden dazu die bereits genannten Primer benutzt und in 2 Ansätzen forward und reverse Strang sequenziert. 24

26 3.5 CFTR-Analyse Aufgrund der begrenzten Menge an DNA und der großen Anzahl an bekannten Mutationen (> 1500 in 27 Exons) mussten wir uns auf eine Analyse mit der INNO- LiPA-CFTR-Testmethode beschränken. Dies ist eine validierte Testmethode, (INNO-LiPA CFTR 19 und INNO-LiPA CFTR 17 + Tn polymorphism Innogenetics N.V., Gent, Belgien), mit welcher simultan 36 der häufigsten Mutationen und die Tn-Polymorphismen identifiziert werden können. Die Testmethode basiert auf dem Prinzip der reversen Hybridisierung mit Hilfe von allel-spezifischen Oligonukleotiden (ASO). ASO, die die verschiedenen Mutations- Allele sowie den Wildtyp repräsentieren, sind hier als parallele Banden auf eine Nitrozellulosemembran aufgebracht und fixiert. Der interessante Bereich eines Gens wird mit Hilfe von genomischer DNA und biotinylierten Primern in einer PCR- Reaktion amplifiziert. Das biotinylierte Amplifikat hybridisiert nach chemischer Denaturierung unter definierten Temperaturbedingungen mit den membranfixierten Oligonukleotidsonden. Die spezifischen Hybride werden in einer Folgereaktion sichtbar gemacht. An Strepavidin gekoppelte alkalische Phosphatase bindet das Biotin der Hybride und katalysiert im Anschluss eine Farbreaktion, bei der ein unlösliches violett-braunes NBT/BCIP-Präzipitat entsteht. Dieses Präzipitat schlägt sich an der Stelle der Hybride auf dem Nitrozellulosestreifen nieder (siehe Abbildung 2: CFTR Testkarte). 25

27 Abbildung 2: CFTR Testkarte Mittels dieser Methode können folgende Mutationen detektiert werden: Tabelle 3 : Mutationen auf dem INNO-LiPA CFTR 19-Teststreifen M.F508del M.G542X M.N1303K M.W1282X M.G551D M G A M.R553X M.CFTRdele2,3(21kb) M.I507del M.711+1G T M A G M.3905insT M.R560T M G A M.S1251N M.I148T M.3199del6 M G A M.Q552X 26

28 Tabelle 4: Mutationen und Tn polymorphismen auf dem INNO-LiPA CFTR 17+Tn- Teststreifen M.621+1G T M kbC T M.2183AA G M.394delTT M G A M.R1162X M.3659delC M.R117H M.R334W M.R347P M.G85E M.1078delT M.A455E M.2143delT M.E60X M.2184delA M.711+5G A 5T 7T 9T 3.6 Verbrauchsmaterialien QIAmp DNA Mini Kit Oligonukleotide Ampli Taq Gold DNA-Polymerase Qiagen, Hilden TIB Molbiol, Berlin Perkin Elmer, Überlingen GeneAmp 10xPCR-Puffer, MgCl2, dntps Perkin Elmer, Überlingen LightCycler-Kapillaren LightCycler Fast Start DNA Master HYBR Polymerase ELUCIGENE CF29 Primer für Exon 1-5 des PRSS1 Gen Primer für Exon 1-4 des SPINK1 Gen Primer und FRET Sonden Standardtips 2,5; 100; 1000 µl Sequenzing Kit CEQ Roche Diagnostics,Mannheim Roche Diagnostics,Mannheim Roche Diagnostics,Mannheim Orchid Diagnostics, UK TIB Molbiol, Berlin TIB Molbiol, Berlin TIB Molbiol, Berlin Eppendorf Beckman-Coulter 27

29 3.7 Geräte Zentrifuge Labofuge 400 (DNA-Extraktion) LightCycler (Schmelzkurvenanalyse) LightCycler-Zentrifuge Vortexer Heraeus Roche Diagnostics Roche Diagnostics IKA Zentrifuge 5417R (Aufreinigung für Sequenzierung) Eppendorf CEQ 8000 (DNA-Sequenzierung) Beckman-Coulter 3.8 Statistik Die statistische Analyse wurde mit Hilfe des SPSS-Programm, Version 11.0 für Windows (Chicago, USA) durchgeführt. Für die statistische Auswertung der Daten der SPINK1 Mutationen (phpt mit Pankreatitis versus phpt ohne Pankreatitis), wurde der Fisher s exact Test verwendet. P Werte < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Zur Analyse der beobachteten versus den zu erwartenden Häufigkeiten der CFTR Mutationen und des SPINK1/CFTR transheterozygoten Zustandes wurde ein binominaler Test verwendet. Die erwartete Häufigkeit der SPINK1 Mutation wurde festgelegt unter der Annahme, dass die Häufigkeit einer heterozygoten N34S SPINK1 Mutation in der Kontrollgruppe identisch mit der Häufigkeit in der Normalbevölkerung ist, welche mit bis zu zwei Prozent angegeben wird [16, 26, 68, 90, 94, 96]. Die erwartete Häufigkeit einer CFTR Mutation von 1/25 gesunder heterozygoter Mutations-Träger in der Normalbevölkerung wurde unter der Annahme getroffen, dass die Häufigkeit des Auftretens einer zystischen Fibrose auslösenden schweren CFTR Mutation 4 % in der deutschen Bevölkerung beträgt [53]. 28

30 4 Ergebnisse 4.1 Klinische Daten der Gesamtkohorte In der Gesamtkohorte von 826 Patienten trat insgesamt 38-mal eine Pankreatitis auf. Davon hatten 16 Patienten eine akute, 2 Patienten eine akut hämorrhagische, 6 Patienten eine akut wiederkehrende und 14 Patienten eine chronische kalzifizierende Pankreatitis. Bei 24 der 826 Patienten wurde ein MEN-Syndrom diagnostiziert. Bei der Geschlechterverteilung gab es fast doppelt so viele Frauen wie Männer (581 Frauen / 245 Männern), dies entspricht der allgemeinen Geschlechterverteilung des Auftretens eines phpt, wovon Frauen zwei bis dreimal häufiger betroffen sind als Männer [41]. Sowohl der PTH (212 ± 11 pg/ml) als auch der Kalziumspiegel (3 ± 0,1 mmol/l) waren deutlich erhöht. Die ebenfalls bestimmten Werte für Phosphat, Lipase, Amylase und alkalische Phosphatase lagen im Durchschnitt im Normbereich. Als klinische Hauptsymptome imponierten bei 45 % der Patienten Nierensteine und bei 35 % Knochenschmerzen, peptische Ulcera traten nur bei 9 % der Patienten auf. 4.2 Klinische Daten der Patienten mit phpt und Pankreatitis Von 25 der 38 Patienten mit Pankreatitis konnte DNA gewonnen werden. Die Verteilung in der Gruppe zeigte sich wie folgt: 13 Frauen, 12 Männer; Durchschnittsalter bei Operation von 57 ± 2,5 Jahren, davon 10 Patienten mit akuter, 1 Patient mit akut hämorrhagischer, 5 Patienten mit akut wiederkehrender und 9 Patienten mit chronisch kalzifizierender Pankreatitis. Anamnestisch ergab sich kein Hinweis auf eine andere Genese der Pankreatitis: wie Alkoholmissbrauch, biliäre Pankreatitis, Trauma, Hyperlipidämien oder medikamentös toxische Ursachen. Lediglich bei einem Patienten waren Gallensteine beim Auftreten der Pankreatitis diagnostiziert worden. Eine biliäre Genese der Pankreatitis konnte aber ausgeschlossen werden. Bei zwei Patienten 29

31 trat die Pankreatitis Jahre nach einer Cholecystektomie auf. Bei zwei weiteren Patienten wurde ein begrenzter Alkoholkonsum angegeben. Mit Berücksichtigung des Durchschnittsalters bei der Operation (60 ± 13 versus 57 ± 2,5 Jahren) und der Geschlechterverteilung (25 versus 12 Männern und 25 versus 13 Frauen) unterschied sich die Gruppe der Patienten mit Pankreatitis nicht signifikant von der Kontrollgruppe ohne Pankreatitis. Der Kalzium- und PTH-Spiegel war sowohl in der Gruppe der Patienten mit einer Pankreatitis und einem phpt, als auch in der phpt-kontrollgruppe deutlich erhöht, wobei sich auch hier im Vergleich der beiden Gruppen kein signifikanter Unterschied zeigte. Der Kalziumspiegel betrug 3,1 ± 0,1 mmol/l und der PTH- Spiegel 226 ± 71 pg/ml bei den Patienten mit phpt und Pankreatitis versus einem Kalziumspiegel von 3,0 ± 0,33 mmol/l und einem PTH-Spiegel von 210 ± 82 pg/ml in der phpt-kontrollgruppe (siehe Tabelle 5) Mutationsanalyse PRSS 1-Gen-Mutationen PRSS1-Gen-Mutationen (N29I und R122H) konnten weder in der phpt und Pankreatitis Gruppe noch in der Kontrollgruppe nachgewiesen werden (siehe Tabelle 6) SPINK 1-Gen-Mutationen Insgesamt vier der 25 Patienten (16 %) mit phpt und Pankreatitis waren Träger einer heterozygoten N34S Mutation (siehe Abbildung 3). Dagegen wies kein Patient der phpt-kontrollgruppe eine N34S Mutation auf (P< 0,001) (siehe Tabelle 7). Hinsichtlich ihrer Laborparameter ergaben sich keine signifikanten Unterschiede. Alle 4 Patienten wiesen ähnliche Kalziumwerte im Vergleich zu den Wildtyp-Patienten auf, (3.2 versus 3.1 mmol/l; siehe Tabelle 8). Der Mittelwert des PTH-Spiegel war niedriger im Vergleich zu den Patienten mit dem Wildtyp (123 versus 243 pg/ml; siehe Tabelle 8), bei breiter Streuung jedoch ohne statistische Signifikanz. Keiner der Patienten mit N34S Mutation berichtete über eine Familienanamnese, welche eine hereditäre Ursache der Erkrankung nahe legte. 30

32 Lediglich ein Patient berichtete über einen maßvollen Alkoholkonsum. Das durchschnittliche Alter für das Auftreten der ersten Pankreatitis-Episode betrug 48 Jahre. Bei den 4 Patienten mit der N34S SPINK1 Mutation diagnostizierten wir 2-mal eine akute Pankreatitis (50 %) und 2-mal eine chronische Pankreatitis (50 %). In der SPINK1-Widtyp-Kohorte trat 8-mal eine akute Pankreatitis (38 %) auf, 1-mal eine akut hämorrhagische (5 %), 5-mal eine akut wiederkehrende (24 %) und 7-mal eine chronische Pankreatitis (33 %). Dokumentierte Nierensteine hatten 3 von 4 Patienten (75 %) mit der N34S Mutation, hingegen nur 12 von 21 (57 %) der Patienten mit dem SPINK1 Wildtyp. Ein peptisches Ulcus hatte einer der 4 (25 %) Patienten mit der N34S Mutation. Im Vergleich dazu hatten 4 von 21 Patienten (19 %) mit dem SPINK1 Wildtyp peptische Ulcera. Knochenschmerzen wurden von den Patienten mit der N34S Mutation nicht angegeben, wohingegen bei den Patienten mit dem SPINK1 Wildtyp 10 der 21 Patienten (48 %) über Knochenschmerzen klagten (siehe Tabelle 8). 31

33 Die bei einer Schmelztemperatur von 58,4 C gezeigten Kurven zeigen zwei heterozygote N34S SPINK1 Mutationsträger (blaue und graue Kurve). Die grüne Kurve entspricht der heterozygoten Kontrolle. Abbildung 3: SPINK1-(N34S)-Schmelzkurvenanalyse für phpt/pankreatitis Patienten CFTR-Gen-Mutationen Aufgrund der zuvor durchgeführten PRSS1 und SPINK1 Analysen waren für die CFTR Mutationsanalyse nur noch eingeschränkte DNA Mengen vorhanden und es konnten nicht alle Patienten untersucht werden. Es gelang von den 25 Patienten mit phpt und Pankreatitis 24 Patienten mit dem INNO-LiPA CFTR 19-Teststreifen und 20 Patienten mit dem INNO-LiPA CFTR 17+Tn-Teststreifen zu untersuchen (siehe Tabelle 6). Vier von den untersuchten 24 Patienten (17 %) wiesen eine schwere heterozygote CFTR-Gen-Mutation auf (P=0,002; im Vergleich zu der normalen Bevölkerung; siehe Tabelle 7). Es konnte 2-mal die 508F- und 2-mal die R553X-Mutation 32

34 nachgewiesen werden (siehe Abbildung 4). Bei einem Patienten wurde das 5T Allel gefunden (siehe Tabelle 6). Es ergaben sich keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Laborwerte zwischen den Kohorten mit CFTR Mutation und CFTR Wildtyp (siehe Tabelle 8). Von den Mutationsträgern berichtete kein Patient über eine zystische Fibrose oder pulmonale Erkrankung in der Familie. In der Patientenkohorte mit einer CFTR Mutation wiesen 3 Patienten (60 %) eine akute Pankreatitis auf und 2 Patienten (40 %) eine chronische Pankreatitis. In der Kohorte mit dem CFTR Wildtyp trat 7-mal eine akute Pankreatitis (37 %), 1-mal eine akut hämorrhagische (5 %), 5-mal eine akut wiederkehrende (26 %) und 6-mal eine chronische Pankreatitis (32 %) auf. Nierensteine traten bei 3 von 5 (60 %) Patienten mit einer CFTR Mutation auf, hingegen bei 11 von 19 Patienten (58 %) mit dem CFTR Wildtyp. Peptische Ulcera traten bei keinem der Patienten mit einer CFTR Mutation auf, im Vergleich dazu bei 5 von 19 Patienten (26 %) mit dem CFTR Wildtyp. Knochenschmerzen wurden von einem der 5 Patienten (20 %) mit einer CFTR Mutation angegeben, bei den Patienten mit dem CFTR Wildtyp gaben 8 von 10 Patienten (42 %) Knochenschmerzen an (siehe Tabelle 8). 33

35 Die Hybridisierungskitkarte zeigt in Probe 1 den Wildtyp und in Probe 2 eine heterozygote R553X Mutation bei einem Patienten mit phpt und Pankreatitis Abbildung 4: INNO LIPA CFTR 19 Testkarte für Patienten mit phpt und Pankreatitis Transheterozygoter Patient (SPINK1: N34S/ CFTR: R553X) mit phptund Pankreatitis Insgesamt wurde ein transheterozygoter Patient mit einer Kombination aus SPINK1 N34S Mutation und CFTR R553X Mutation identifiziert. Bei diesem Patienten trat die erste Episode einer Pankreatitis bereits mit 18 Jahren auf. Im Alter von 28 Jahren wurde bereits eine Pankreaskopfresektion durchgeführt. Die abdominellen Symptome persistierten jedoch weiterhin. Der phpt wurde im Alter von 28 Jahren diagnostiziert und 4 Jahre später operiert. 34

36 Tabelle 5: Charakteristik der Gesamtkohorte und der Patienten mit phpt und Pankreatitis phpt- Gesamtkohorte phpt- Kontrollgruppe phpt- und Pankreatitis- Gruppe Patienten MEN-Syndrom Alter bei Operation 59±0.5 60±13 57±2.5 Geschlecht (m/w) 245/581 25/25 12/13 Parathormon 212±11 210±82 226±71 [<80 pg/ml] Phosphat 0.76± ± ±0.15 [ mmol/l] Kalzium * 3± ± ±0.1 [ mmol/l] Nierensteine Peptische Ulzera Knochenschmerzen Pankreatitis: -akute -akut hämorrhagische -akut wiederkehrende -chronisch kalzifizierende # Lipase [<190 U/l] ± ± ±61 [Lipase bei AP] [1593±759] Amylase 32±1 33±15 143±43 [8-65 U/l] Alkalische Phosphatase [ U/l ] 141±9 139± ±23 * Der Kalziumspiegel war bei 753 der 826 Patienten dokumentiert. # Die akute Pankreatitis wurde überwiegend in peripheren Krankenhäusern diagnostiziert; aufgeführt sind die Laborparameter des Aufnahmetags zur OP, sowie die peripher dokumentierten Werte (Lipase bei AP). 35

37 Tabelle 6: Ergebnis der (PRSS1, SPINK1 und CFTR) Mutationsanalysen bei Patienten mit phpt und Pankreatitis Patient PRSS1 SPINK1 CFTR CFTR N29I / R122H N34S Mutation Poly T # - - 7T/7T - - F508del 9T/7T T/7T T/7T - N34S - 7T/7T - N34S - 7T/7T T/7T T/7T - - ND a ND a T/7T T/7T T/5T T/7T T/7T T/7T - N34S - 7T/7T - - F508del 9T/7T - - R553X 7T/7T T/7T T/7T - N34S R553X 7T/7T NDª NDª NDª NDª NDª: nicht durchgeführt bei zu wenig DNA-Material #: wies zwei Wildtyp-Allele auf 36

38 Tabelle 7: Häufigkeitswahrscheinlichkeit der N34S SPINK1 und CFTR Mutationen bei phpt und Pankreatitis Häufigkeiten Genotypen a erwartete beobachtete O/E ratio 95% CI P-value SPINK1 (N34S) 2/100 4/25 8,0 1,0-15,2 <0,001 CFTR Mutation 1/25 4/24 4,2 0,4-7,9 0,002 5T Allel 5/100 1/20 1,0 0,02-2,0 1,0 CF schwer CFTR heterozygot +N34S heterozygot 1/ / ,3-1295,6 <0,001 ª Das Vorkommen der N34S SPINK1 Mutation in der normalen deutschen Population ist geringer als 2 % (0.36 % [104] % [90]). Die erwartete Häufigkeit von schweren Mutationen welche eine CF verursachen wurde mit 1/25 angenommen [53]. Das erwartete Auftreten für das 5T Allel beträgt 5 % [23]. Die erwartete Allel Häufigkeit für die N34S SPINK1 Mutationen und für die Kombination von beiden, CFTR und SPINK1, ist zitiert nach Noone et al. [63] 37