1. Fixation. 2015_FJT_OEGPath Anforderungen bei der Bearbeitung von KM-Biopsien

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1 Anforderungen bei der Bearbeitung von KM-Biopsien Standardisierte Aufarbeitung von Knochenmarkbiopsien zur histomorphologischenund immunhistochemischen Diagnostik H.M. Kvasnicka, Frankfurt kurze Laborzeiten, einfache Techniken differenzierende Färbungen qualitativ hochwertige Immunhistologie Möglichkeit der molekularbiologischen Analyse (FISH, PCR, NGS) Standardisierte Techniken (Qualität) Kosten der eingesetzten Verfahren 1 schnellere Befundung (Liegezeiten) 2 Qualität in der Präanalytik! Bearbeiten von KM-Biopsien 1. Fixation 2. Entkalkung 3. Einbettung 4. Schneiden 5. Färbungen 6. Immunhistologie Zeitaufwand standardisierte, einfache Technik Qualität (Morphologie) Kosten 3 NaCl 4 Zeitaufwand bei der Bearbeitung von KM-Biopsien Fixation EDTA 6-12 Std. 5-6 Std. Einbettung Std. Gießen Nachentkalkung Schneiden 2 Std. Färben Eindecken 2-3 Std. Immunhistologie 1. Fixation Std. +12 Std. +18 Std. +24 Std. (t) Laboreingang Laborausgang Laborzeit ca Std. Befundung 5 6 1

2 Fixation von KM-Biopsien Formalin: Gesättigte, wässrige Lösung von Formaldehyd mit einem Formaldehydgehalt von % 10% Formalin: Verdünnte Formalin-Lösung (1:10) mit einem Formaldehydgehalt von 4,0 % Formaldehyd denaturiert und maskiert Eiweißverbindungen und degradiert Nukleinsäuren (Konzentrationsabhängig!) ungepufferte Formaldehydlösung neigt unter Lichteinwirkung zur Bildung von Ameisensäure (Absenkung des ph!) 7 8 Fixation von KM-Biopsien neutral gepufferte Formaldehydlösung 4% fertig verfügbare Lösungen erhältlich Fixationszeit 6-12 Std. optimale Morphologie Möglichkeit der Molekularanalyse Fixation von KM-Biopsien für eine ausreichende Fixation muss das Volumen der Formalinlösung mindestens 10 x dem Volumen des Gewebes entsprechen Unter- und Überfixation wirken sich negativ auf die Qualität der Morphologie und Immunhistologie aus Verwendung vorgefertigter Probengefäße mit 25 ml Fixationslösung pro Stanze 9 10 ungenügende Fixation ungenügende Fixation

3 Entkalkung von KM-Biopsien 2. Entkalkung saure Entkalker Salzsäure,Trichloressigsäure, Ameisensäure, Salpeter- Formolgemisch Kommerzielle Schnellentkalker RDO (Salzsäure) Decal (Ameisensäure) Surgipath Decalcifier (Ameisensäure) Redecal (12.5% Salzsäure + EDTA) 13 kurze Entkalkungszeit (ca. 1-2 Std.) schlechte Morphologie eingeschränkte molekulare Analyse 14 Entkalkung von KM-Biopsien neutral Tris gepufferte EDTA Lösung Entkalkung unter ständiger Bewegung (z.b. Magnetrührer) und Erwärmung (45 C) pro Stanze ca ml EDTA Lösung täglich erneuern neutraler ph-wert!! keine sauren Entkalkungsmedien verwenden 18 3

4 Entkalkung von KM-Biopsien Entkalkungszeit 5-6 Std. Kostengünstig durch einfachen Magnetrührer aber manelle Interaktion notwendig (Wochenende, Feiertage) Einbetten von KM-Biopsien Vakuum Infiltrations Prozessor Zeitbedarf Std. 3. Einbettung keine Kurzprogramme, da bei kompaktem (kortikalen) Knochengewebe (z.b. bei tangential entnommenen Stanzen) eine optimale Durchdringung nicht gewährleistet ist Nachfixation nicht notwendig 21 22! Einbetten von KM-Biopsien Standard-Einbettungsprogramm 50% Isopropanol 1 Stunde 70% Isopropanol 1 Stunde 70% Isopropanol 1 Stunde 96% Isopropanol 1 Stunde 96% Isopropanol 1 Stunde 100% Isopropanol 1 Stunde 100% Isopropanol 1 Stunde 100% Isopropanol 1 Stunde Xylol 1 Stunde Xylol 1 Stunde Paraffin 1 Stunde Paraffin 1 Stunde Paraffin 1 Stunde Paraffin 1 Stunde 23 Standardisiertes Fixieren, Entkalken und Prozessieren der KM-Biopsien mit dem Thermo Shandon Excelsior Vorteile: All-in-One Solution: Fixation Entkalkung Gewebeeinbettung Eingebaute Agitation und Vakuum Verwendung standardisierter Reagenzien Zeitersparniss! 24 4

5 Standardisiertes Fixieren, Entkalken und Prozessieren der KM-Biopsien mit dem Thermo Shandon Excelsior Fixation Entkalkung 3h 6h 4. Nachentkalkung Schneiden Gewebeeinbettung 7:05h Gesamtzeit 16:05h Paraffineinbettung der KM-Biopsien immer diagonal zur Schnittrichtung einbetten Paraffineinbettung der KM-Biopsien gleichmäßige Verteilung der Schneidekräfte, weniger Stauchungsartefakte Paraffineinbettung der KM-Biopsien Nachentkalken der KM-Biopsien FALSCH RICHTIG angeschnittene Blöcke in warmer EDTA Lösung (45 C) für etwa Minuten nachentkalken Zeitbedarf abhängig von der Härte (Anteil des kortikalen Knochens) Stauchungsartefakte durch punktuell zu hohe Schneidekräfte schlechte Schnittqualität Gleichmäßige Verteilung der Schneidekräfte bessere Schnittqualität

6 Nachentkalken der KM-Biopsien Probleme der langen Nachentkalkung Unzureichende Entkalkung des Knochens Nachentkalkung des Knochens EDTA Entkalkung der gesamten Biopsie in ca. 5-6 Std. Nachentkalkung der Schnittfläche in EDTA (30-60 Min.) Vorteil: kürzere Entkalkungszeit bessere Schnittqualität Probleme der langen Nachentkalkung Schneiden der KM-Biopsien Rotationsmikrotome verwenden kürzere Entkalkungszeiten im Vergleich zum Schlittenmikrotom 3 µm dünne Serienschnitte Schneiden der KM-Biopsien Messerwinkel beachten! optimale Morphologie bei 3 Zu steile Messerwinkel führen fast immer zum Zerreissen der Schnitte!!

7 2015_FJT_OEGPath 5. Färbungen Routinefärbungen für KM-Biopsien Standardfärbungen (bei jeder Biopsie) Giemsa / HE hämatologische Übersichtsfärbung Fe Eisennachweis (Berliner-Blau-Reaktion) PAS Perjod-Acid-Schiff s-reaction ASDCl ASD-Chloracetatnachweis Gitter Gitterfasernachweis nach Gomorri Zusatzfärbungen (je nach Fragestellung) Methlypyronin (MP) Plasmozytom (monoklonale Gammopathie, MGUS, malignes Myelom) und Morbus Waldenström Granatechtrot (GER) Osteoiddarstellung (Osteomalazie, Osteoporose) Biebricher Scharlach Eosinophilie, Eosinophilenleukämie 7

8 Immunhistologie Probleme der Immunhistologie Gewebevorbehandlung Standardisierte Antigendemaskierung (Puffer, Methode) Primärantikörper Detektionssystem Standardisierung durch Kitsystem (z.b. Polymer) Automatisierte/manuelle Färbeprozedur 47 Einsatz der Immunhistologie in der hämatologischen Routinediagnostik Blasteninfiltrate Plasmazellen lymphoide Infiltrate Differenzierung Anzahl, Topographie Monoklonalität Dignität Subtypisierung Infiltrationsgrad Therapie-Monitoring hämatologische (morphologische) Remission 8

9 Routinemarker für die Immunhistologie Myeloische Zellen Myeloperoxidase (MPO) CD43 (MT1) Lysozym CD15, CD33 Erythropoiese Megakaryozyten CD61 CD42, CD31 Monozyten / Makrophagen Blasten / Progenitorzellen GlycophorinC (Ret40f), CD71 Lysozym,CD163, CD33, CD68 (PGM1) CD34 CD117 (c-kit) Tdt CD99 (MIC2) Routinemarker für die Immunhistologie Plasmazellen Kappa, Lamba, CD138, CD56 IgG, IgA, IgM, IgD, CyclinD1 Lymphoide Zellen CD3, CD5, CD10, CD19, CD20, CD23, CD79a, PAX5 CyclinD1, Annexin A1 CD43 (MT1) CD45RO (UCHL) Proliferation Mastzellen Ki67 PCNA (PC10) Tryptase CD25 CD117 Einfluß von Fixation und Entkalkung auf die Immunhistologie Formaldehydlösung 4%,gepuffert Formaldehydlösung 7%,gepuffert? Formaldehyd denaturiert und maskiert Eiweißverbindungen und degradiert Nukleinsäuren (Konzentrationsabhängig!) ungepufferte Formaldehydlösung neigt unter Lichteinwirkung zur Bildung von Ameisensäure (Absenkung des ph zerstört Epitope) ungepufferte oder saure Entkalkung führt zu einer Zerstörung benachbarter Epitope (Kreuzreaktion der Antikörper) CAS CAS Formaldehydlösung 4%,gepuffert Formaldehydlösung 7%,gepuffert? saure Entkalkung 53 Giemsa Giemsa 54 CD61 9

10 saure Entkalkung Falsche Nachentkalkung (3 Std.) 55 CD34 56 CD20 Falsche Nachentkalkung (3 Std.) Standardisierte Antigendemaskierung proteolytische Enzyme Proteinase K, Trypsin Target Retrieval-Puffer (verschiedene ph) Citratpuffer, Tris-HCl, EDTA hitzeinduzierte Demaskierung Wasserbad, Autoklav, Dampfgarer, (Mikrowelle) gebrauchsfertige Lösungen benutzen 57 Lysozym 58 Immunhistologie an KM-Biopsien einfache und standardisierte Methoden zur Antigendemaskierung verwenden Wasserbad Proteolytische Andauung Antigendemaskierung mit Puffer ph 9.0 Enzymatische Antigendemaskierung Lysozym 10

11 Vorbehandlung Kappa: schlechte Vorbehandlung Die Vorbehandlung hat einen entscheidenden Einfluss auf das Ergebnis nur wenige Methoden benutzen Welche Methode/Gerät? Welche Lösung für welches Antigen? Wie lange? Kappa Temperaturverlauf bei der Vorbehandlung Positivkontrollen Temperatur ( C) Antigendemaskierung 95 C min 10 min standardisierte und kurze Abkühlphase im Eiswasser!! Zeit (Minuten) einfachste Maßnahme zur Qualitätssicherung On-slide Control Tonsille, LK, Appendix CD3 CD5 CD10 CD19 CD20 CD23 CD25 CD30 CD34 CD45RO CD68 CD79a Bcl2 Cyclin D1 CD117 Kappa, Lambda IgG, IgM, IgD Ki67 Mastzelltryptase Myeloperoxidase Pax-5 DBA44 CD20 CD3 64 Problem: unspezifischer Hintergrund falsche Vorbehandlung (am häufigsten) Primärantikörper falsch verdünnt Eingesetztes Detektionssystem im Knochenmark: oft unspezifische Anfärbung von Eosinophilen Anfärbung von extrazellulären Immunglobulinen 65 Problem: unspezifischer Hintergrund Inkubationszeit zu lang Inkubationstemperatur zu hoch (Antikörper abhängig, zu hohe Außentemperaturen) Antikörperkonzentration zu hoch Ungeeignete Objektträger (Poly-L-Lysin Beschichting) Ungenügende Blockierung des endogenen Enzyms Abschwächung des Chromogens durch die endogene Peroxidase 66 11

12 Problem: schwache Färbung unzureichende Entparaffinierung zu kurze Inkubationszeit falsche Demaskierung (zu kurz, zu lang, Temperatur!) Problem: Gegenfärbung zu starke Gegenfärbung kann eine schwach positive Immunreaktion überdecken gewählter Farbstoff sollte sich gut von einer positiven Immunhistochemie abgrenzen lassen Antikörper durch Pufferreste verwässert" Antikörperkonzentration zu niedrig / zu hoch Herauslösen des Chomogens durch Alkohol CD Ret40f (1:50 + UltraVision LP) CD Kappa 12

13 73 Lambda 74 IgA CD CD20 (RTU + UltraVision LP) Zusammenfassung kurze Laborzeiten bei Anwendung einfacher Techniken sind möglich (Kostensenkung) standardisierte Fixation und EDTA Entkalkung routinemäßiger Einsatz differenzierender Färbungen erlaubt eine rationelle und schnelle Befundung 77 Cyclin D1 (RTU + UltraVision LP) 13