Low-Level-Laser Wirkung auf Zellen

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1 Laser in der Medizin Low-Level-Laser Wirkung auf Zellen Dr.-Ing. Christiane Wetzel page 1

2 Gliederung 1 Lasersysteme steme in der Medizinin 1.1 Eigenschaft von Laser-Licht 1.2 Grundprinzip und Funktionsweise 1.3 Anwendungsbeispiele Einsatzfelder - Diagnostik Einsatzfelder - Therapie Zusammenfassung 2 Low-Level-Lasertherapie (LLLT) 2.1 Einleitung 2.2 Klinische Anwendung und Wirkungsmechanismus 2.3 Eigene Experimente Material, Methoden und Geräte Vorgehensweise, eise Versuchsanordnung ng Erste Ergebnisse 3 Zusammenfassung page 2

3 1. Lasersysteme in der Medizin 1.1 Eigenschaft von Laser-Licht Laser erzeugt monochromatisches Licht kohärentes Licht. Zwischen den einzelnen Teilen des Lichtfeldes bestehen feste Phasenbeziehungen weißes Licht monochromatisches Licht Abb. 1: Licht bestimmter Wellenlängen page 3

4 1. Lasersysteme in der Medizin 1.1 Eigenschaft von Laser-Licht Zeitliche Kohärenz, Ausbreitung des monochromatischen h Lichtes entlang der Zeitachse: - kurze Pulse, hohe Zeitauflösungen, - hohe Intensitäten Interferierende Wellenzüge Phasendifferenz kohärentes Licht Abb. 2b: Kohärenz zweier Wellen mit zeitlich stabilem Interferenzmuster, d. h. vollständige Verstärkung oder auslöschen Abb. 2a: Inkohärenz: Phasendifferenz zweier Wellenzüge (schwarz), d. h. mittlere Intensität page 4

5 1. Lasersysteme in der Medizin 1.2 Grundprinzip und Funktionsweise Räumliche Kohärenz - Ausbreitung entlang der Raumachse erlaubt es: - Laser-Licht auf sehr kleine Durchmesser zu fokussieren. - hohe Intensitäten zu erreichen. Abb. 3: einfacher Laborlaser page 5

6 1. Lasersysteme in der Medizin 1.2 Grundprinzip und Funktionsweise Grundprinzip = stimulierte Emission Photon trifft auf Elektron in angeregtem Zustand, Abb. 4: stimulierte Emission wird dazu anregt wieder in den Grundzustand überzugehen. freiwerdende Energieportion wird in Form eines Photons emittiert. Photon: gleiche Frequenz, gleiche Phase wie das ankommende Photon, es wird praktisch geklont. Durch Resonator erfolgt Verstärkung. page 6

7 1. Lasersysteme in der Medizin 1.2 Grundprinzip und Funktionsweise Abb. 5: Wellenlängenbereich ausgewählter Lasersysteme γ-strahlg. Röntgen- Strahlung UV-Strahlg. IR-Strahlg. Mikrowellen Radar TV Radio Excimer Argon Rubin; Nd/YAG CO 2 G page 7

8 1. Lasersysteme in der Medizin 1.3 Anwendungsbeispiele Laserart Entwicklung Med. Medizinischer Bereich Einsatz Rubin-Laser Ophthalmologie 1963 Dermatologie He-Ne-Laser Biostimulanz CO 2 -Laser Chirurgie Ar + -Laser Nd/YAG-Laser Nd/YAG-Laser gütegeschaltet Ophthalmologie Onkologie Gastroenterologie Angioplastie Endoskopie Urologie 1977 Ophthalmologie Excimer-Laser Ophthalmologie Abb. 6: Geschichtlicher Abriss des medizinischen Einsatzfeldes page 8

9 1. Lasersysteme in der Medizin 1.3 Anwendungsbeispiele Laserart Entwicklung Med. Medizinischer Bereich Einsatz Rubin-Laser Ophthalmologie 1963 Dermatologie He-Ne-Laser Biostimulanz CO 2 -Laser Chirurgie Ar + -Laser Nd/YAG-Laser Nd/YAG-Laser gütegeschaltet Ophthalmologie Onkologie Gastroenterologie Angioplastie Endoskopie Urologie 1977 Ophthalmologie Excimer-Laser Ophthalmologie Abb. 6: Erster medizinischer Einsatz ausgewählter Laser Koagulation der Netzhaut page 9

10 1. Lasersysteme in der Medizin Einsatzfelder - Diagnostik Fluoreszenz : - gezielte Anregung durch Markersubstanzen Abb. 7: Beispiel: Neuron, mit exprimiertem Markerprotein GFP (green fluorescent protein) durch Bestrahlung mit ultraviollettem ll tt Licht wird grünes Licht emittiert. Anwendung: Laboranalytik, Forschung (htt:// page 10

11 1. Lasersysteme in der Medizin Einsatzfelder - Diagnostik Optische Pinzette - Bewegung von transparenten Teilchen durch fokussierten Laserstrahl im elektrischen Feld (z. B. zur Untersuchung von Muskelfaserbewegungen, Manipulation von Zellbestandteilen) page 11 Laser beam Abb. 8: Optische Pinzette (links); Kraftmessung an Haarzelle (oben) Biophysical J.82,1386 (2002).

12 1. Lasersysteme in der Medizin Einsatzfelder - Diagnostik Optische Kohärenztomographie (OCT) dreidimensionale Bilder im 1µm Bereich, durch Lichtstreuung im menschlichen Körper Tiefe: nm-bereich, Positionierung durch Referenzspiegel, axiale Auflösung = f(spektralen Breite der Quelle) Abb. 9: OCT Bild einer altersbedingter Makuladegeneration mit Strukturveränderungen _ diagnose _3d_ oct.htm page 12

13 1. Lasersysteme in der Medizin Einsatzfelder - Diagnostik Optische Kohärenztomographie (OCT) Abb. 10: OCT Bild einer diabetischen Retinopathie, zeigt Flüssigkeitseinlagerung in der Netzhaut (Menge und Lokalisation bestimmbar) page 13

14 1. Lasersysteme in der Medizin Einsatzfelder - Therapie Grundlage: Laserstrahl Licht wird absorbiert, reflektiert (gestreut) und ein Teil durchgelassen (Transmission). Reflexion Absorption Gewebe Transmission Abb. 11: Weg Laserstrahl bei Gewebekontakt page 14

15 1. Lasersysteme in der Medizin Einsatzfelder - Therapie Beachten: Absorptionskoeffizienten Da der menschliche Körper zum großen Teil aus Wasser besteht, ist dessen Absorptionskoeffizient i t besonders wichtig (Molekülschwingungen im UV).. Ar- Abb. 12: Absorptionskoeffizient und Eindringtiefe für Wasser und Blut page 15

16 1. Lasersysteme in der Medizin Einsatzfelder - Therapie a) Photodynamische Therapie: lange Einwirkzeiten, i it niedrige Leistungsdichte, keine Gewebeveränderung, Photochemische Prozesse, Schmerztherapie, Beschleunigung g Wundheilung, Allergiebehandlung g gewisse Grauzone page 16

17 1. Lasersysteme in der Medizin Einsatzfelder - Therapie b) Photothermik - Gewebeveränderung durch Wärme: Makromoleküle, Wasserstoffbrückenbindungen werden aufgebrochen Abb. 13: Wärmeleitung = f (Dichte, Wassergehalt, Wärmekapazität, Wärmeleitfähigkeit) page 17

18 1. Lasersysteme in der Medizin Einsatzfelder - Therapie Temperatur Optischer Eindruck Biologische, chemische und physikalische ( C) Auswirkung < 37 keine keine keine Enzymschädigung, Ödeme, Membranauflockerung, erster Zelltod f(t) () weißgraue Färbung, erhöhte Streuung Proteindenaturierung, Beginn Koagulation und Nekrose 80 Kollagendenaturierung, Membrandefekte Zellwasser verdampft, Austrocknung > 150 Schwarzfärbung, erhöhte Absorption Karbonisierung > 300 Rauch, Gas Verdampfung, Vergasen Abb. 14: Temperaturbedingte Gewebeveränderung (z.b. um Blutgefäße zu verschließen, Gewebe zu veröden; Beispiel: Lebergewebe page 18

19 1. Lasersysteme in der Medizin Einsatzfelder - Therapie c) Photomechanik Gewebeabtrag: hohe Intensität, Gewebe verdampft, wird bewusst abgetragen, Kraterinnenseite: schwarze Kohlenstoffschicht, karbonisiertes Gewebe, darunter Nekroseschicht mit koaguliertem Gewebe, Ödembereich mit Wasseransammlung, Verkohlter Bereich Nekrose Ödembereich Abb. 15: Typische Schädigungszonen um lasererzeugten Krater im Gewebe (links), Laserkrater im menschlichen Zahn (unten) page 19

20 1. Lasersysteme in der Medizin Einsatzfelder Therapie (Nichtlineare Effekte) d) Photoablation durch Laserdissoziation: viel Energie, kurze Impulse Aufbrechen molekularer Verbindungen, diese absorbieren unverbrauchte Photonen und werden so entfernt Eindringtiefe wenige nm Umliegendes Gewebe ohne Schädigung Anwendung: Hornhautkorrektur k e) Photodisruption : Vorteil: kurze Wellenlängen, lä kurze intensive i Pulse bei hoher Leistungsdichte (10 9 W/cm²) entsteht Mikrofragmentierung durch sogen. Schockwellen = Druckwellen. Die durch Plasma absorbierten Laserstrahlen zerstören das Gewebe geringe thermische Schäden Anwendung: Nachoperation bei grauem Star page 20

21 1. Lasersysteme 1.4 Zusammenfassung von Wasser Abb. 16: Wechselwirkungsarten von Laserstrahlen auf Gewebe aus physikalischer Sicht Kaschke, M.: Optische Systeme; Anwendungen in Medizintechnik/lifeSciences (Carl Zeiss AG); KSOP Universität Kalrsruhe (TH) page 21

22 1. Lasersysteme 1.5 Zusammenfassung Abb. 17: Überblick über den Einsatz von Licht-Gewebe-Therapien (links) Erfolgreiche Behandlung einer gutartigen Geschwulst der Blutgefäße (oben) Lasertechnik in der Medizin; Institut tut für Lasertechnologien og e in der Medizin und Messtechnik, Universität Ulm/Denkschrift zum Jahr der Physik (2002) page 22

23 2. Low-Level-Lasertherapie Level Lasertherapie (LLLT) 2.1 Einleitung Low-Level-Lasertherapie (LLLT): ist eine medizinische Behandlung, um zellulare Funktionen zu ändern/zu verbessern. Arbeitet mit Laser-Licht im mw-bereich Wirkung = f (Dosis, Wellenlänge, Zeit, Pulsierung, Art des Lasers) /1,2/ nebenwirkungsfreie Regulationstherapie Allerdings teilweise umstritten in der Schulmedizin Forschungsarbeiten notwendig, um die idealen Parameter zur Behandlung zu bestimmen. Vorteil: schmerzfrei, von Patienten gut vertragen /1/ Huang, Y.; Chen, A.; Carroll, J.; Hamblin, M. (2009). Biphasic Dose Response in Low level Lichtherapie. Dose-Response 7 (4): 358. /2/ Bjordal, J. M.; Lopes-Martins, R. A.; Joensen, J.; Couppe, C.; Ljunggren, A. E.; Stergioulas, A.; Johnson, M. I. (2008). A systematic review with procedural assessments and meta-analysis of LoweLevel Laser Therapy. BMC Musculoskeletal Disorders 9: 75. page 23

24 2. Low-Level-Lasertherapie Level Lasertherapie (LLLT) 2.2 Klinische Anwendung und Wirkungsmechanismus Anwendungsgebiete Dermatologie Orthopädie /3/ HNO-Bereich Sportmedizin Wundbehandlung /6/ Schmerztherapie /7/ Gynäkologie, Urologie Zahnmedizin /4,5/ Ophthalmologie Anwendungsmöglichkeiten Beingeschwüre, Wundliegen, Gürtelrose Arthrose (rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis), Gelenkentzündungen Schnupfen, Mittelohrentzündungen, Tinnitus Muskelverletzungen, Prellungen, Zerrungen Bei schlechtheilenden Wunden Neurologische Schmerzen, Migräne, Rückenschmerzen Kaiserschnittnarben, Dammschnitt Zahnfleischentzündungen, Dentalimplantate Zellstoffwechsel verbessern, Makulatherapie Abb. 18: Klinische Anwendung der LLLT /3/.; Christie, A.; Moe, R. H.; Haavardsholm, E.; Holm, I.; Hagen, K. B. (2007). "Physical Therapy Interventions for Patients with Osteoarthritis of the Knee: an Overview of Systematic Reviews". Physical Therapy. /4/ Cobb, C. M. (2006). "Lasers in Periodontics: A Review of the Literature". Journal of Periodontology 77 (4): /5/ Sculean, A.; Schwarz, F.; Becker, J. (2005). "Anti-infective i therapy with an Er:YAG laser: influence on peri-implant i healing". Expert Review of Medical Devices 2 (3): 267. /6/ Da Silva, J. P.; Da Silva, M. A.; Almeida, A. P. F.; Junior, I. L.; Matos, A. P. (2010). "Laser Therapy in the Tissue Repair Process: A Literature Review". Photomedicine and Laser Surgery 28: 17. /7/ Yousefi-Nooraie, R.; Schonstein, E.; Heidari, K.; Rashidian, A.; Pennick, V.; Akbari-Kamrani, M.; Irani, S.; Shakiba, B. et al. (2008). Low level laser therapy for nonspecific low-back pain. page 24

25 2. Low-Level-Lasertherapie Level Lasertherapie (LLLT) 2.2 Klinische Anwendung und Wirkungsmechanismus Was passiert: Vom Laser induzierte Photonen werden vom menschlichen Gewebe absorbiert, durchdringen die Unterhaut und stimulieren den Stoffwechsel. 3.Schritt Wie passiert es: 2.Schritt schnellere, verbesserte Zellteilung Steigerung biochemischer boc e Heilungsprozesse 1.Schritt fördert Synthese von ATP- Molekülen /8,9/ (Cytochrom-C-Oxidase) /8/ Bjordal, J. M.; Johnson, M. I.; Iversen, V.; Aimbire, F.; Lopes-Martins, R. A. B. (2006). "Low-Level Laser Therapy in Acute Pain: A Systematic Review of Possible Mechanisms of Action and Clinical Effects in Randomized Placebo-Controlled Trials". Photomedicine and Laser Surgery 24 (2): 158. /9/ Tafur, J.; Mills, P. J. (2008). "Low-Intensity Light Therapy: Exploring the Role of Redox Mechanisms". Photomedicine and Laser Surgery 26 (4): 323. page 25

26 2. Low-Level-Lasertherapie Level Lasertherapie (LLLT) 2.3 Eigene Experimente Ermittlung des Dosis-Wirkungs-Verhältnisses beim Einsatz eines BioPhoton Prophymed Großflächenlasersystems. Inhalt: In einer Studie werden systematische Untersuchungen bezüglich Revitalisierung bzw. Reparatur nach Schädigung signifikanter Zelltypen in Kulturmedien unter statistischer Absicherung der Messdaten realisiert. i page 26

27 2. Low-Level-Lasertherapie Level Lasertherapie (LLLT) Material, Methoden und Geräte Materialien: Alle Untersuchungen werden mit in vitro-kulturen von retinalen Zellen (ARPE-19) und humanen Fibroblasten durchgeführt. Abb. 21: Matrix der Testzyklen (statistische Sicherheit n = 5) page 27

28 2. Low-Level-Lasertherapie Level Lasertherapie (LLLT) Material, Methoden und Geräte Abb. 19: Messung am MTP-Reader Methoden/Testzyklus-T1: Resazurintest zur Bestimmung des energetischen Zustandes der Zellen: In Abhängigkeit von der Aktivität intrazellulärer Redoxsysteme erfolgt durch Resazurin ein Farbumschlag von blau nach pink. Intensität ist proportional p der metabolischen Aktivität der Zelle. Messgerät: MTP-Reader-Assays; gemessen in der Fluoreszenz page 28

29 2. Low-Level-Lasertherapie Level Lasertherapie (LLLT) Material, Methoden und Geräte Abb. 19: Messung am MTP-Reader Methoden/Testzyklus-T2: Arbeiten mit dem Fluoreszenzmarker JC-1, zur frühzeitigen und sicheren Indikation der Leistungsfähigkeit der Mitochondrien, Farbumschlag von rot nach grün bei Leistungsabfall der Organellen, indirekte Aussagen über den intrazelluären ph-wert. Messgerät: MTP-Reader-Assays; gemessen in der Fluoreszenz page 29

30 2. Low-Level-Lasertherapie Level Lasertherapie (LLLT) Material, Methoden und Geräte Abb. 20: Messung am FACS Methoden/Testzyklus-T3: Bestimmung der Zellvitalität durch Bestimmung der Apoptose/ Nekrose Messgerät: Durchflußzytometer (FACS): Farbumschlag durch Reduktion führt zu Anstieg einer spezifischen Fluoreszenzfrequenz im Vergleich zur konstanten Kontrolle. Aussagen über Parameterveränderungen möglich, z. B. intrazellulärer ph-wert, Potenzial der mitochondrialen Membranen, Apoptose, Nekrose. page 30

31 2. Low-Level-Lasertherapie Level Lasertherapie Material, Methoden und Geräte Methoden/Testzyklus-T4: Abb. 21: Arbeitsplatz Mikroskopie k i (links) und Zellfärbung nach DAPI (oben) Bestimmung der Morphologie der Zellen, Ermittlung des Markereinflusses, Auswirkung des Zellstress auf die Morphologie Messgerät: Licht- und Fluoreszenzmikroskop page 31

32 2. Low-Level-Lasertherapie Level Lasertherapie (LLLT) Vorgehensweise, Versuchsanordnung Wachstumskurve Zellzahlbestimmung Aufnahme des Temperaturverhaltens der Dioden Passagieren / Kultivieren der Zellen Ermittlung Testregimes zur gezielten Vorschädigung Behandlung mit dem Großflächenlasersystem Versuchsregime 1. Zellansatz -ARPE-19-Zellkonzentration: 3 x 10 4 Zellen/ml -Fibroblasten-Zellkonzentration: 3 x 10 4 Zellen/ml 2. Vorschädigung der Zellen 3. 1h + 12 h Laser-Behandlung (intervallartig 4. Zellstoffwechseltests (Resazurintest,.) Versuchsergebnis Zellen vital: Letale Dosis noch nicht erreicht Zellen letal: Letale Dosis erreicht page 32

33 2. Low-Level-Lasertherapie Level Lasertherapie (LLLT) Vorgehensweise, Versuchsanordnung Abb. 22: Versuchsstand 1 Großflächenlaser, 2 nicht laserbehandelte Zellkulturplatte, 3 IR-Thermometer, 4 laserbehandelte Zellkulturplatte, 5 Raster [Anmerkung: Der Abstand zwischen dem Großflächenlaser und Zellkulturgefäß beträt 9,5 cm] page 33

34 2. Low-Level-Lasertherapie Level Lasertherapie (LLLT) Erste Ergebnisse Abb. 23: Temperaturverlauf page 34

35 2. Low-Level-Lasertherapie Level Lasertherapie (LLLT) Erste Ergebnisse 6,000 Wachstumskurve Abb. 24: Beispiel einer Wachstumskurve Ze ellzahl log10 0/ml 5,000 Zellzahl 4*10^4 Zellzahl 3*10^4 Zellen/ml Zellen/ml 4, Zeit (t ) in Tagen page 35

36 2. Low-Level-Lasertherapie Level Lasertherapie (LLLT) Erste Ergebnisse Abb. 25: Fluoreszenzintensität von ARPE- Zellen nach 1h Laserbehandlung (zyklisch: 8 min bestrahlen, 30 min Brutschrank, additive Gesamtsumme der Laserbehandlung: 1h) page 36 Abb. 26: Fluoreszenzintensität von ARPE-Zellen nach 12h Laserbehandlung g( (zyklisch)

37 2. Low-Level-Lasertherapie Level Lasertherapie (LLLT) Erste Ergebnisse Abb. 27: Fluoreszenzintensität von ungeschädigten und vorgeschädigten ARPE- Zellen nach 1h Laserbehandlung (zyklisch) page 37

38 2. Low-Level-Lasertherapie Level Lasertherapie (LLLT) Erste Ergebnisse Abb. 28: Fluoreszenzintensität unterschiedlich vorgeschädigter ARPE-Zellen nach 1h Laserbehandlung (zyklisch) page 38

39 2. Low-Level-Lasertherapie Level Lasertherapie (LLLT) 2.4 Zusammenfassung a) Die Low-Level-Lasertherapie aktiviert den Stoffwechsel gesunder ARPE-19- Zellen. b) Die Low-Level-Lasertherapie steigert den biochemischen Heilungsprozess geschädigter Zellen. c) Die Low-Level-Lasertherapie ist eine ernst zunehmende Therapie. d) Einem Grauzonenruf kann man nur mit systematischen, wissenschaftlichen Untersuchungen begegnen. wobei der experimentelle Ansatz recht unterschiedlich sein kann!!!! page 39