Molekulare Biophysik. NMR-Spektroskopie (Teil 3)

Transkript

1 Molekulare Biophysik NMR-Spektroskopie (Teil 3)

2 Das NMR-Spektrometer

3 Das NMR-Spektrometer 3/102 Probenwechsler Magnet Hardware-Schrank Probenkopf

4 Das NMR-Spektrometer 4/102 Magnet B 0 [Tesla] 0 [MHz] Das Erdmagnetfeld hat eine Stärke von T ( Gauss)

5 Das NMR-Spektrometer 5/102 Magnet Bohrung des Magneten: 54 mm narrow bore 89 mm wide bore flüssiger Stickstoff flüssiges Helium Supraleitende Spule

6 Das NMR-Spektrometer 6/102 Magneten sind faszinierend aber auch gefährlich

7 Das NMR-Spektrometer 7/102

8 Das NMR-Spektrometer 8/102 Cryo-Probenkopf RT-Probenkopf ATM-Probenkopf

9 Das NMR-Spektrometer 9/102 Der Probenkopf

10 Das NMR-Spektrometer 10/102 Die Probe im Probenkopf Helmholtz-Spule

11 Das NMR-Spektrometer 11/102 Der Shim, das Problem der Homogenität a,b,c,d t a b c d a,b,c,d c d a,b,c,d a a,b,c,d b c d b a

12 Das NMR-Spektrometer 12/102 Die Hardware, d.h. die Elektronik

13 Das NMR-Spektrometer 13/102 Hardware

14 Das NMR-Spektrometer 14/102 Hardware

15 Das NMR-Spektrometer 15/102 Software ;zgdc ;avance-version (03/04/17) ;1D sequence with decoupling #include <Avance.incl> "d11=30m" 1 ze d11 pl12:f2 2 30m do:f2 d11 cpd2:f2 d1 p1 ph1 go=2 ph31 30m do:f2 mc #0 to 2 F0(zd) exit ph1= ph31=

16 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie

17 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 17/102 Ein Problem der eindimensionalen NMR- Spektroskopie ist, dass selbst recht einfach Moleküle oft nicht oder nur mit hohem Aufwand eindeutig zugeordnet werden können O O Zimtsäureethylester Ethyl-3-phenylprop-2-enoat (IUPAC)

18 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 18/102 Ein Zuordnung mit Datenbanken ist oft nicht sicher genug ppm H O O H PPM

19 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 19/102 Mit 13 C oft noch besser als mit 1 H ppm O O PPM

20 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 20/102 Der entscheidende Vorteil der mehrdimensionalen NMR-Spektroskopie ist: Magnetisierungstransfer Es entstehen Signale, die auf eine Wechselwirkung zwischen den Kernen hinweisen. Das können WW durch die Bindung (via J-Kopplung) oder durch den Raum (via NOE) sein. Diese Signale werden auf einer Fläche oder in einem mehrdimensionalen Raum verteilt, was eine gute Auflösung ermöglicht.

21 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 21/102 1D-NMR 2 Achsen: Intensität vs. Frequenz 2D-NMR 3 Achsen: Intensität vs. Frequenz (1) vs. Frequenz (2)

22 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 22/102 1D-NMR schematisch Preparation Detektion

23 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 23/102 1D- 1 H-Spektrum C 11 H 13 N 2 O 3 Br

24 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 24/102 2D-NMR Sequenzen enthalten zwei neue Elemente: Evolutionszeit und Mischzeit Preparation Evolution Mischung Detektion (t 1 ) (t 2 ) Evolution: Erzeugen einer weiteren Frequenzachse durch indirekte Detektion Mischung: Transfer von Magnetisierung von Spin zu Spin über Wechsel- Wirkungen zwischen Spins

25 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 25/102 Die Evolutionszeit Mit der Evolutionszeit wird 90 x k t 1 90 y k t2 90 x k t 1 90 y k t2 90 x k t 1 90 y k t2 90 x k t 1 90 y k t 2 eine indirekte Dimension erzeugt, man bewerkstelligt das durch die systematische Veränderung einer Zeitspanne in einer Sequenz von Pulsen, man braucht also mindestens zwei Pulse.

26 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 26/102 Die Evolutionszeit Die Aufzeichnung des FIDs 90 x k t 1 90 y k t2 90 x k t 1 90 y k t2 90 x k t 1 90 y k t2 90 x k t 1 90 y k t 2 haben wir uns schon im Detail angeschaut, sie wird jetzt für jeden neuen Zeitwert wiederholt. Auch in der indirekten Dimension müssen die Zeiten ganzzahlige Vielfache eines Intervalls t sein

27 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 27/102 Das schauen wir uns wieder näher an und nutzen die gleichen drei Linien wie beim 1D z y x 90 -x z y x 2000 Hz -500 Hz Hz 90 -x 90 Y k t k t 2 1

28 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 28/102 (k t 1 = t 1 ) Man erkennt dass die Anfangsintensität in t 2 von der Frequenz abhängt

29 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 29/102 y y y y x x x x t 1 = 0 sec t 1 = 166 sec t 1 = 332 sec t 1 = 498 sec t 1 = 498 sec t 1 = 332 sec t 1 = 166 sec t 1 = 0 sec [Hz] [ppm]

30 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 30/102 Entlang der indirekten Zeitachse entsteht das gleiche Bild wie entlang der direkten 1 Iy t [msec] t 1 = 498 sec t 1 = 332 sec t 1 = 166 sec t 1 = 0 sec [Hz] [ppm]

31 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 31/102 Insgesamt also ein zweidimensionaler FID

32 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 32/102 Eine erste FT ergibt ein Interferogram.

33 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 33/102 Eine zweite FT ergibt ein zweidimensionales Spektrum.

34 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 34/102 Zur Auswertung betrachtet man Contour-Plots, die Peakintensität als Höhenlinien darstellen.

35 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 35/102 In mehrdimensionalen Experimenten wird gute Auflösung durch mehr Werte für k t 1 erreicht. 90 x k t 1 90 y k t2 90 x k t 1 90 y k t2 90 x k t 1 90 y k t2 90 x k t 1 90 y k t 2 Die Zeit für die Messung ist aber der Anzahl der aufgezeichneten FIDs direkt proportional, gute Auflösung bedeutet also lange Messzeit. Daher ist in mehrdimensionalen Experimenten die Auflösung in den indirekten Dimensionen immer begrenzt.

36 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 36/102 Preparation Evolution Mischung Detektion (t 1 ) (t 2 ) Gäbe es nur Evolution und Detektion dann würde in beiden Zeitdimensionen immer die gleichen Frequenzen detektiert, ganz entscheidend ist also die Mischzeit, in der es zur Übertragung von Magnetisierung von einem Kern zum nächsten kommt.

37 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 37/102 Diese Übertragung von Magnetisierung während der Mischzeit kann durch verschiedene Mechanismen geschehen. Der am meisten verwendete Mechanismus ist die J-Kopplung, von großer Bedeutung ist aber auch der NOE-Effekt, die Übertragung durch den Raum.

38 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 38/102 Wichtig ist auch ob die Übertragung zwischen gleichen Spins der gleichen Kernsorte oder andersartigen Spins erfolgt. Man unterscheidet daher homonukleare und heteronukleare Experimente.

39 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 39/102 homonukleare Experimente Transfer von Magnetisierung findet zwischen gleichartigen Kernen statt. Beide Frequenzachsen zeigen die chemischen Verschiebungen des gleichen Kerns. Findet Transfer statt, ergibt sich in beiden Dimensionen eine unterschiedliche Verschiebung: Kreuzsignal Findet kein Transfer statt, dann ergibt sich in beiden Dimensionen die gleiche Verschiebung: Diagonalsignal

40 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 40/102 heteronukleare Experimente Transfer von Magnetisierung findet zwischen unterschiedlichen Kernsorten statt. Beide Frequenzachsen zeigen die chemischen Verschiebungen unterschiedlicher Kerne. Findet Transfer statt, ergibt sich ein Signal am Schnittpunkt der chemischen Verschiebungen der involvierten Kerne. Findet kein Transfer statt, dann ergibt sich kein Signal.

41 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 41/102 3D-NMR Ein dreidimensionales Experiment entsteht formal durch Kombination von zwei zweidimensionalen Experimenten, solche Experimente sind vor allem bei Proteinen wichtig. Preparation Evolution Mischung Detektion Preparation Evolution Mischung Detektion Preparation Evolution (1) Mischung (1) Evolution (2) Mischung (2) Detektion

42 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 42/102 Das Spektrum ist dann keine Fläche mit Signalen mehr sondern ein Würfel, mit drei Achsen mit chemischer Verschiebung. Intensität zeigt sich als vierte Dimension

43 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 43/102 Mit einem Satz homo- und heteronuklearer 2D- Experimente sollte eine Zuordnung aller Resonanzen von kleinen Molekülen möglich sein, oft braucht man nur ein COSY, ein HMQC und ein HMBC O O Zimtsäureethylester Ethyl-3-phenylprop-2-enoat (IUPAC)

44 Das COSY-Experiment

45 COSY 45/102 Die einfachste denkbare zweidimensionale Sequenz besteht aus zwei Pulsen, das ist das homonukleare COSY: 90 x t 1 90 Y t 2 Preparation Evolution Mischung Detektion

46 COSY 46/102 Wenn wir nur die Evolution betrachten haben wir aber auf beiden Achsen die gleiche Information. Wir haben mit der Evolutionszeit eine zweite Dimension erzeugt aber das 2D Spektrum hat nur eine Diagonale. H (ppm) H 1 H 2 H (ppm)

47 COSY 47/102 Wenn wir in der Mischzeit aber Transfer haben dann ist etwas neues entstanden: Es gibt Signale, die in den Transfer H 1 H 2 H (ppm) beiden Dimensionen mit unterschiedlichen 2 chemischen Verschiebungen markiert worden sind: 1 die Kreuzsignale. H (ppm) 1 2

48 COSY 48/102 Ein Anwendungsbeispiel:? J 12 J 34 H H H H J 12 ~J 34 Eine Zuordnung ist im 1D nicht möglich...

49 COSY 49/102...aber im 2D ganz leicht.

50 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 50/102 Im COSY ist die Ethylgruppe leicht, Aromat und Olefin nicht komplett zuzuordnen H H O ppm H O 1 2 H H H H 3 ppm H O O 1.30 H ppm ppm

51 Das HMQC/HMBC-Experiment

52 HMQC/HMBC 52/102 Bislang haben wir ein homonukleares Experiment betrachtet, man kann aber auch in natürlicher Häufigkeit heteronuklearen Experimente machen, entweder basierend auf der direkten 1 H-X- Kopplung (HMQC) oder der Weitbereichskopplungen (HMBC). 1 H HMQC 1 H HMBC n X X X X X n X

53 HMQC/HMBC 53/102 Ob ein Transfer stattfindet hängt von der Größe der Kopplungskonstanten ab und kann auch durch die Pulssequenz beeinflusst werden. Mit Kopplungen < 1 Hz ist kein Transfer möglich. Kopplungen über eine Bindung sind größer als über mehrere Bindungen. 1 J HH = 276 Hz 2 J HH = Hz 3 J HH = Hz 4 J HH = Hz 1 J HC = Hz 2 J HC = Hz 3 J HC = Hz 4 J HC = Hz 1 J HN = Hz 2 J HN = Hz 3 J HN = Hz 4 J HN = Hz

54 HMQC/HMBC 54/102 Man kann sich zwei Varianten von heteronuklearen zweidimensionalen Experimenten überlegen, je nachdem welchen Kern man detektiert und welchen man in der indirekten Dimension hält. Das hat Einfluss auf die Auflösung, die erreichbar ist, und auf die Empfindlichkeit der Messung. In der indirekten Dimension erfordert doppelte Auflösung doppelte Zeit, in der direkten Dimension ist das kein Problem.

55 HMQC/HMBC 55/102 Die Empfindlichkeit der Messung hängt von mehreren Faktoren ab: Magnetic Moment Spin Angular Momentum S/N ~ ( p B 0 ) ( d )( d B ) 0 H ~ 4 C, die Detektion auf Protonen bringt also einen Faktor 8!!

56 HMQC/HMBC 56/102 HMQC = Heteronuclear MultipleQuantum Correlation X Ein Signal zeigt die direkte Bindung zwischen H und X an. H Die Kopplung zwischen H und X ist nicht zu sehen, während der Evolution und der Acquisition wird entkoppelt.

57 Das NMR-Spektrometer 57/102 Im HMQC unseres kleinen Moleküls bekommen wir 5 Korrelationen von Wasserstoffen zu Kohlenstoff im Aromaten / Olefin-Bereich ppm H H O 20 H O ppm 130 H H H H O O ppm ppm 100% Zuordnung haben wir aber noch nicht

58 HMQC/HMBC 58/102 Um die Spektren ganz zweifelsfrei zuzuordnen brauchen wir dann das HMBC in dem Signale durch die kleinen, über mehrere Bindungen reichenden Kopplungen erzeugt werden. Im allgemeinen sind 2 J und 3 J Kopplungen groß genug um eine Korrelation zu ergeben, in bestimmten Situationen können aber auch Kopplungen über mehrere Bindungen Signal ergeben. Signale durch direkte Kopplung versucht man zu unterdrücken um das Spektrum zu vereinfachen.

59 HMQC/HMBC 59/102 HMBC = Heteronuclear MultipleBond Correlation Es bleiben nicht unterdrückte Signale von den 1 J HC übrig als kleine Doubletts, andere Signale zeigen Weitbereichskopplung an. HMQC HMBC Transfer via 1 J HX X Transfer via n J HX = via 1 J HX H H

60 Das NMR-Spektrometer 60/102 Im HMBC sind die Signale der Ethylgruppe wieder eindeutig und man findet auch leicht das CO der Säuregruppe ppm H H O H H H H H H O CH 3 80 H O O ppm

61 Das NMR-Spektrometer 61/102 Um mit Aromaten und Olefinen klar zu kommen muss man sehr genau hinschauen ppm H H O H H H H H H O CH H O O grün = HMQC, rot = nicht unterdrückte Signale ppm

62 Ein Beispiel

63 Ein Beispiel: Brivudin 63/102 Das Molekül: Brivudin C 11 H 13 N 2 O 3 Br Desoxythymidin Brivudin wird bei Herpes zoster angewendet

64 Ein Beispiel: Brivudin 64/102 Die Experimente 1D- 1 H 1 min 1D- 13 C 1 h DEPT COSY 10 min 10 min 13 C-HMQC 10 min 13 C-HMBC 50 min 15 N-HMQC 3 h 15 N-HMBC 35 h

65 Ein Beispiel: Brivudin 65/102 1D- 1 H-Spektrum C 11 H 13 N 2 O 3 Br H/D H 2 O H/D DMSO

66 Ein Beispiel: Brivudin 66/102 1D- 13 C-Spektrum C 11 H 13 N 2 O 3 Br

67 Ein Beispiel: Brivudin 67/102 DEPT-Spektrum C 11 H 13 N 2 O 3 Br 1D- 13 C-Spektrum

68 Ein Beispiel: Brivudin 68/102 COSY Zuckerbereich oder 8, nicht unterscheidbar Korrelation von Frequenzen via 1 H- 1 H- Kopplung, i.a. nur zwei oder drei Bindungen.

69 Ein Beispiel: Brivudin 69/102 DMSO H 2 O 2 COSY H/D 5 OH OH 1

70 Ein Beispiel: Brivudin 70/ C-HMQC Zuckerbereich /8 6 Basenbereich Korrelation von Frequenzen via 1 H- 13 C-Kopplung, man korreliert nur direkt aneinander gebundene Kerne.

71 Ein Beispiel: Brivudin 71/ D- 13 C-Spektrum 6 7/8 7/

72 Ein Beispiel: Brivudin 72/ C-HMBC 1 Zuckerbereich Basenbereich Korrelation von Frequenzen via 1 H- 13 C-Kopplung, man korreliert über bis zu 4 Bindungen ( 2 J HC bis 4 J HC ), 1 J HC gibt ein Dublett.

73 Ein Beispiel: Brivudin 73/102 = via 1 J HC 7/ C-HMBC (Basenbereich) 7/ Korrelation ausgehend von H1 Korrelation zu 5 ist schwach und 5 ist von 7/8 aus zu sehen.

74 Ein Beispiel: Brivudin 74/ C-HMBC (Basenbereich) 5 Hier muss 7 sein Korrelation ausgehend von H3 C2 fehlt!!

75 Ein Beispiel: Brivudin 75/ C-HMBC (Basenbereich) Korrelation ausgehend von H7, das via H3 zugeordnet ist.

76 Ein Beispiel: Brivudin 76/ C-HMBC (Basenbereich) Korrelation ausgehend von H8, das via H3/H7 zugeordnet ist.

77 Ein Beispiel: Brivudin 77/ C-HMBC (Basenbereich) Korrelation ausgehend von H6, alles ist zu sehen, das hilft nicht beim Zuordnen, es passt aber alles.

78 Ein Beispiel: Brivudin 78/102 ppm N-HMQC ppm

79 Ein Beispiel: Brivudin 79/102 ppm N-HMBC ppm

80 Ein Beispiel: Brivudin 80/102 Zuordnung 1 H [ppm] 13 C [ppm] 15 N [ppm] 1' 6,16 84,5-2' 2,17 39,8-3' 4,27 69,9-4' 3,79 87,5-5' 3, , ,2-3 11,92-157, , ,7-6 8,09 139,4-7 6,87 129,9-8 7,25 106,5-13 C [ppm] 13 C [ppm] 15 N [ppm] predicted dt dt 1' 77,8 ± 8,2 85,1-2' 39,9 ± 5,1 40,4-3' 68,7 ± 1,6 71,7-4' 74,8 ± 9,2 88,4-5' 63,8 ± 0,3 62, , ,8 ± 10,6 151, , ,7 ± 6,9 137, ,5 ± 3,1 110, ,7 ± 11,4 164, ,6 ± 6, ,4 ± 15,8 - -

81 DOSY

82 DOSY 82/102 Das DOSY (Diffusion Ordered SpectrocopY) ist eine besondere Art von Spektroskopie, das es zweidimensionale Spektren erzeugt, die auf einer Achse die Diffusionrate des Moleküls anzeigen. Die Diffusionsrate kann für unterschiedliche Untersuchungen von Bedeutung sein, z.b. für eine Bestimmung von Größe oder Aggregation. Sie kann aber auch zur Untersuchung von Stoffgemischen eingesetzt werden, wobei die Spektren der im Gemisch enthaltenen Stoff nach deren Größe getrennt aufgetragen werden. Das Experiment nutzt die Tatsache das die Diffusion die Moleküle durch das Probenvolumen bewegt, dessen Magnetfeld durch Gradienten beeinflusst werden kann.

83 DOSY 83/102 Ohne Diffusion können zwei Gradienten durch einen 180 -Puls aufgehoben werden. Den 180 -Puls kann man auch in zwei Hälften teilen und dazwischen einfach warten das Diffusion passiert, z- Magnetisierung ist langlebiger als x,y-magnetisierung 1 H G z /2

84 DOSY 84/102 Das Experiment wird nun mehrfach durchgeführt und dabei die Gradientenstärke zwischen 0 und maximal variiert. Man erzeugt also eine indirekte Dimension mit Gradientenstärke statt Zeit. Die Zeit für die Diffusion bleibt dabei konstant. 1 H G z /2

85 DOSY 85/102 Die zu erwartenden Intensitäten ergeben sich aus den Diffusionsgleichungen: I = I o exp [- D 2 g 2 2 ( - /3 - /2)] I g [T/m] Das ist eine Gauss-Kurve: I = I o exp x g 2

86 DOSY 86/102 Die kann linearisiert werden: I = I o exp [- D 2 g 2 2 ( - /3 - /2)] T = 2 ( - /3 - /2) - ln (I/I o ) = D 2 T * g 2 -ln(i/i o ) y = -0, ,129x R= 0,99998 Damit kann die Diffusionskonstante aus der Steigung ermittelt werden g 2 [T 2 /m 2 ]

87 DOSY 87/102 Ein praktisches Beispiel ist die Untersuchung zweier Komplexbildner in D 2 O, es sollte festgestellt werden ob die beiden eine Komplex miteinander bilden 1 H-1D-Spektrum 100 % Gradient 80 pseudo-2d-spektrum Gauss-Kurve 20 0

88 DOSY 88/102 Zur Auswertung wurde neben der linearisierten Gausskurve. auch eine andere Art der Darstellung gewählt

89 DOSY 89/102 Man kann die Gausskurven durch eine inverse Laplace- Transformation in ein Spektrum mit Diffusionskonstante auf der indirekten Achse verwandeln. Diffusionskonstante log(m 2 /s) CB6 CS HDO log(m 2 /s) Diffusionskonstante

90 That s it Fragen: schmieder@fmp-berlin.de Scripte: schmieder.fmp-berlin.info/teaching/vorlesung_mbph.htm