β 2 -Adrenozeptor-Stereoisomere: Neue pharmakologische und klinische Erkenntnisse zu alten Arzneistoffen

Transkript

1 β 2 -Adrenozeptor-Stereoisomere: Neue pharmakologische und klinische Erkenntnisse zu alten Arzneistoffen Fortbildung für Apotheker Regensburg Roland Seifert Institut Prof. für Dr. Pharmakologie med. Roland Seifert 13.

2 Themen β 2 AR: Funktion, Aktivierung, Signaltransduktion Interaktion des β 2 AR mit Stereoisomeren Klinische Implikationen

3 β 2 -Adrenorezeptor G-Protein gekoppelter Rezeptor (GPCR) Rezeptor mit sieben Transmembrandomänen (7TMR) Katecholamine als endogene Liganden Potenz: Adrenalin (Hormon) > Noradrenalin (Neurotransmitter) > Dopamin (Neurotransmitter) Neben Rhodopsin bestuntersuchter GPCR Kopplung an G s -Proteine (kanonisch) Kopplung an G i -Proteine, G q -Proteine und β-arrestin (nicht-kanonisch)

4 Kanonische und nicht-kanonische Signaltransduktion über den β 2 AR A2 A1 A3 β 2 AR G 16 G i G s β-arrestin PLC AC ERK

5 Expression, Funktion und pharmakologische Bedeutung des β 2 AR Expression Funktion Pharmakologische Bedeutung Glatte Gefäßmuskulatur Vasodilatation Schutz vor exzessiver Kontraktion (α 1 AR) bei LA mit Adrenalin Glatte Muskulatur, Uterus Relaxation Tokolyse bei vorzeitigen Wehen (β 2 AR-Agonisten) Leber Glykogenolyse Verhinderung von Hypoglykämie (endogenes Adrenalin) Glatte Muskulatur, Bronchien Mastzellen, eosinophile und neutrophile Granulozyten Bronchodilatation Hemmung der Mediatorfreisetzung Asthma bronchiale, COPD (β 2 AR-Agonisten) Asthma bronchiale, COPD (β 2 AR-Agonisten)

6 Agonist β 2 AR 1 GDP G-Proteinzyklus 6 γ β GDP G sα 6 γ β 2 G sα β 2 AR Agonist GTP 3 Agonist GDP G sα γ β γβ GTP G sα β 2 AR P i 5 GTP G sα AC 4 ATP camp

7 Methoden zur Analyse der GPCR/G-Protein-Kopplung GTP(γS)-sensitive hochaffine Agonistbindung Proximal Steady-state-Hydrolyse von [γ- 32 P]GTP [ 35 S]GTPγS-Bindung Effektorsystemaktivierung Kinaseaktivierung Genexpression Distal

8 GPCR-G α -Fusionsproteine Definierte 1 : 1-Stöchiometrie der Signalpartner Enge Nachbarschaft der Signalpartner (Transduzisom) Vergleich der Kopplung von GPCR-Isoformen an ein G α Vergleich der Kopplung eines GPCRs an verschiedene G α Exakte Potenzen (EC 50 ) und Maximaleffekte (E max ) von Liganden

9 Zweizustandsmodell der GPCR-Aktivierung (Two-state model) inverser Agonist neutraler Antagonist Agonist R R* G E G-Protein- und Effektorsystem- Aktivität (relative Einheiten) 100 voller Agonist partieller Agonist Ligand (log M) neutraler Antagonist partieller inverser Agonist voller inverser Agonist

10 Aktivierung des β 2 -Adrenozeptors durch Rotation von TM5 und TM6 + reversibler inverser Agonist (R) + reversibler Agonist + Nanobody (G-Protein-Substitut) + irreversibler Agonist (R*) Rasmussen et al., Nature 2011;469:175 Rosenbaum et al., Nature 2011;469:236

11 Ligand-spezifische G-Protein-Aktivierung Ligand β 2 AR-G sαs β 2 AR-G iα2 β 2 AR-G 16α (R)-ISO rac-sal rac-dob rac-eph rac-dci E max -Werte Wenzel-Seifert & Seifert, Mol Pharmacol 2000;58:954

12 Mutiple aktive Zustände (Multiple-state model) Agonist 1 Agonist 2 Agonist 3 Agonist n R* 1 R* 2 R* 3 R* n G 1 G 2 G 3 G n E 1 E 2 E 3 E n

13 Ligand-spezifische Rezeptorkonformationen ligand-directed trafficking of receptor signalling ligand-biased efficacy conformational selectivity collateral efficacy functional selectivity biased agonism differential engagement pluridimensional efficacy Ligand-specific receptor conformation

14 Herausforderung Funktionale Selektivität Neue pharmakologische Möglichkeiten Reduktion von unerwünschten Wirkungen Zelltyp/Organ-spezifische Wirkungen Neue Strategien für High-Throughput-Lösungen in der Arzneistoffentwicklung nötig kein universeller HTS-Assay Berücksichtigung multipler Signalwege/Effektoren rekombinante und native Systeme dennoch ökonomisch

15 Themen β 2 AR: Funktion, Aktivierung, Signaltransduktion Interaktion des β 2 AR mit Stereoisomeren Klinische Implikationen

16 Isoproterenol-Stereoisomere * * keine Selektivität für β 2 AR im Vergleich zum β 1 AR aber bis vor kurzem einziges erhältliches Stereoisomerenpaar für die meisten Liganden nur Razemate verfügbar Manchmal reines (R)-, aber kein (S)-Stereoisomer verfügbar

17 Konstitutiv aktivierte Mutante des β 2 AR (β 2 AR CAM ) β 2 AR L A K H EK A K L C F R S

18 β 2 AR versus β 2 AR CAM inverser Agonist β 2 AR Agonist R R* G inverser Agonist β 2 AR CAM Agonist R R* G Erhöhte basale G-Proteinaktivierung Erhöhte Potenz/Affinität von Agonisten Erhöhte Effektivität von inversen Agonisten und partiellen Agonisten

19 Unterschiedlich potente GTPase-Aktivierung durch ISO-Stereoisomere an β 2 AR und β 2 AR CAM GTPase activity (% of maximum) β 2 AR-G sα β 2 AR CAM -G sα A B (-)-R (+)-S Isoproterenol stereoisomer (log M) Seifert et al., J Pharmacol Exp Ther 2001;297:1218

20 Isoproterenol-Stereoisomere an β 2 AR und β 2 AR CAM Parameter (-)-(R)-Isoproterenol (+)-(S)-Isoproterenol Chemische Bezeichnung Eutomer Distomer Affinität (Bindung) Hoch Niedrig Potenz (funktioneller Assay) Hoch Niedrig Maximale Wirkstärke (E max ) ~1,0 (voller Agonismus) ~1,0 (voller Agonismus) Aktiver Zustand R* R*

21 Differentielle ternäre Komplex-Bildung mit ISO-Stereoisomeren an β 2 AR und β 2 AR CAM 100 A B 75 [ 3 H]DHA bound (% of basal) control GTPγS β 2 AR-G sα C β 2 AR-G sα D 25 0 β 2 AR CAM -G sα (-)-R-ISO (log M) β 2 AR CAM -G sα (+)-S-ISO Seifert et al., J Pharmacol Exp Ther 2001;297:1218

22 Funktionell inaktive ternäre Komplexe mit R-ISO an β 2 AR CAM Parameter (-)-R-ISO (+)-S-ISO K h (nm) K l (nm) R h (%) K hgtpγs (nm) K lgtpγs (nm) R hgtpγs (%) 66 0 (-)-R-ISO (-)-S-ISO R* CAM-(-)-R-ISO R* CAM-(-)-S-ISO Seifert et al., J Pharmacol Exp Ther 2001; 297:1218 G sα G sα

23 β 2 AR-Agonist-Stereoisomere: Endlich verfügbar! OH SABA = Short Acting Beta2 Agonist HO * NH * Fenoterol (RR, RS, SR, SS) OH OH OH Salbutamol (R, S) HO * NH LABA = Long Acting Beta2 Agonist Formoterol (RR, RS, SR, SS) O HO NH OH * NH * HO OH O Salmeterol (R, S) * NH O HO O OH O OH Olodaterol (R, S) NH * NH O OH

24 Die vier Fenoterol-Stereoisomere Enantiomere Diastereomere Enantiomere Jozwiak et al., J Med Chem 2007;50:2903

25 Fenoterol-Stereoisomer-spezifische Signaltransduktion in Kardiomyozyten Woo et al., Mol Pharmacol 2009;75:158 Seifert & Dove, Mol Pharmacol 2009;75:13

26 Distinkte Interaktion von Fenoterol-Stereoisomeren mit dem β 2 AR: Größere Flexibilität von (S,R)-Fenoterol (R,R)-Fenoterol (S,R)-Fenoterol Seifert & Dove, Mol Pharmacol 2009;75:13

27 Differentielle Stabilisierung des ternären Komplexes durch Fenoterol-Stereoisomere an β 2 AR-G sα (R,R)-Fenoterol (R,S)-Fenoterol (S,R)-Fenoterol (S,S)-Fenoterol

28 Differentielle GTPase- und AC-Aktivierung durch Fenoterol-Stereoisomere an β 2 AR-G sα GTPase activation / % of (R) ISO AC activation / % of (R) ISO log (c fenoterol / (mol/l)) log (c fenoterol / (mol/l)) (R,R)-Fenoterol (R,S)-Fenoterol (S,R)-Fenoterol (S,S)-Fenoterol

29 Humane neutrophile Granulozyten als β 2 AR-Modell PTX FPR G iα β γ PIP 2 PLC P ER IP 3 DAG ERK Ca 2+ PKC G iα β γ Ca 2+ camp G s α β γ NOX ROS β 2 AR AC 9 β 2 AR

30 HL-60-Promyelozyten als Modell für den β 2 AR PTX PIP 2 PLC P ERK ER Ca 2+ IP 3 DAG PKC G 16α β γ β 2 AR G iα β γ Ca 2+ camp G s α β γ β 2 AR AC 9 β 2 AR

31 S49 Lymphomzellen als Modell für den β 2 AR PTX SSTR G iα β γ P ERK G iα β γ camp G s α β γ β 2 AR AC 5/6 β 2 AR

32 S49 cyc - Zellen als Modell für den β 2 AR PTX SSTR G iα β γ P ERK G iα β γ camp G s α β γ β 2 AR AC 5/6 β 2 AR

33 Multiplexanalyse von β 2 AR-Stereoisomeren Koppelungspartner Binding GTPase AC O.- 2 G i α G s α G 16 α + β-arrestin Sf HL [Ca 2+ ] i ERK camp PTX Internalisierung Zellsysteme HEK β2 AR (+) S Neutrophile Membran Intakte Zellen

34 Differentielle camp-akkumulation durch Fenoterol- Stereoisomere in humanen neurophilen Granulozyten und HL-60-Promyelozyten human neutrophils HL-60 promyelocytes c camp / % of (R)-ISO c camp / % of (R)-ISO log (c fenoterol / (mol/l)) log (c fenoterol /(mol/l)) (R,R)-Fenoterol (R,S)-Fenoterol (S,R)-Fenoterol (S,S)-Fenoterol

35 Differentielle Stimulation der camp-akkumulation und Hemmung der O 2- Produktion durch Fenoterol- Stereoisomere in neutrophilen Granulozyten Inhibition of ROS production / % of (R)-ISO 1 μm fmet-leu-phe log(c fenoterol /(mol/l)) c camp / % of (R)-ISO log (c fenoterol / (mol/l)) (R,R)-Fenoterol (R,S)-Fenoterol (S,R)-Fenoterol (S,S)-Fenoterol

36 Analyse von ERK-Signalwegen an HL-60-Promyelozyten mit dem Proteome Profiler TM Human Phospho-MAPK Array Kit Kontrolle ATP (R,R)-Fenoterol (S,R)-Fenoterol

37 Analyse von ERK-Signalwegen an HL-60-Promyelozyten mit dem Proteome Profiler TM Human Phospho-MAPK Array Kit 100 Normalisierte auf höchstes Signal 50 Kontrolle ATP 10 µm RR-FEN 1 µm SR-FEN 1 µm 0 p38alpha CREB ERK1 ERK2 Akt2 GSK-3beta GSK3alpha/beta RSK1 JNKpan MKK3 MKK6 MSK2

38 Web of Potencies and Efficacies von Fenoterol- Stereoisomeren am β 2 AR: Evidenz für Ligand-spezifische Rezeptorkonformationen pki,low Ratio high affinity agonist binding IC50,ROS pec50,ac Emax ROS Emax AC 0 0 pec50,camp RR RS SR SS pec50,gtpase Emax camp RR RS SR SS Emax GTPase Web of Potencies Web of Efficacies

39 Weitere Hinweise für Stereoisomer-spezifische Rezeptorkonformationen Rezeptor Ligand- Stereoisomere Effekt β 2 AR Noradrenalin Schnelle Konformationsveränderung (kein G-Protein) α 1 AR Adrenalin Kontraktion von Blutgefäßen (G q ) α 2A AR Medetomidin [Ca 2+ ] i -Anstieg (G i ) H 1 R Chiraprodifene GTPase-Aktivierung (G q )

40 Strukturelle Evidenz für Ligand-spezifische β 1 AR-Konformationen partielle Agonisten volle Agonisten Bisher nur R-Stereoisomere analysiert Warne et al., Nature 2011;469:241

41 Zukünftige Untersuchungen Komplettierung der Multiplexanalyse mit allen β 2 AR- Stereoisomerpaaren β 2 AR-G iα2 -Kopplung β 2 AR-β-Arrestin-Kopplung Molecular Modelling mit 7TMR-active-state-Modellen Zielgerichtete Mutagenese zur Identifikation von Stereoisomer-Switches Vergleich β 2 AR und H 2 R (Rezeptor-spezifische G-Proteinund Effektoraktivierung)

42 Themen β 2 AR: Funktion, Aktivierung, Signaltransduktion Interaktion des β 2 AR mit Stereoisomeren Klinische Implikationen

43 Vergleich (R)-Salbutamol versus (S)- Salbutamol beim Asthma bronchiale Parameter (R)-Salbutamol (S)-Salbutamol Klassifikation Eutomer Distomer β 2 AR-Affinität hoch niedrig Paradoxe proinflammatorische Effekte in vitro Paradoxe proinflammatorische Effekte in vivo nein nein? Ja

44 Paradoxe Wirkungen von β 2 AR-Stereoisomeren Ligand System Effekt (R)-Salbutamol (S)-Salbutamol (S)-Salbutamol Glatte Muskelzellen der Atemwege Glatte Muskelzellen der Atemwege Mastzellen, T-Zellen, Granulozyten Dilatation Kontraktion Histamin, IL-13, ROS (R,R)-Formoterol Mastzellen Mediatorfreisetzung (S,S)-Formoterol Mastzellen Mediatorfreisetzung

45 (R,S)- versus (R)-Salbutamol beim Asthma bronchiale Parameter (R,S)-Salbutamol (R)-Salbutamol Internationaler Freiname Salbutamol, Albuterol Levosalbutamol, Levalbuterol Handelname Klinische Wirksamkeit Salbubronch, Salbulair, SalbuHEXAL,. vorhanden Xopenex (USA) vorhanden, Überlegenheit bislang nicht nachgewiesen Relative Kosten

46 β 2 AR-Rezeptorpolymorphismen

47 Wichtigste Eigenschaften von β 2 AR-Polymorphismen Parameter Arg16Gly Gln27Glu Thr164Ile Agonistbindung unverändert unverändert G-Protein- und Effektorkopplung erniedrigte Affinität unverändert unverändert vermindert Desensitisierung verstärkt vermindert vermindert Assoziation mit Erkrankungen Asthma bronchiale Asthma bronchiale, vorzeitige Wehen, kardiovaskuläre Erkrankungen Kardiovaskuläre Erkrankungen β 2 AR-Polymorphismen funktionell nur unvollständig charakterisiert

48 Einfluss von β 2 AR-Polymorphismen auf die klinische Wirksamkeit von β 2 AR-Agonisten Israel et al., Am J Respir Crit Care Med 2000;162:5

49 Rolle von neutrophilen Granulozyten beim Asthma bronchiale Bakterien Zellen in BAL-Flüssigkeit von Asthmatikern Formylpeptide β 2 AR Neutrophile Granulozyten Infektion Hypersekretion Remodelling Makrophagen Neutrophile Atemwegskonstriktion β 2 AR Epithelialzellen Eosinophile Lymphozyten

50 Hemmung der O 2- Produktion in humanen neutrophilen Granulozyten über den β 2 AR: Keine paradoxen Effekte von Distomeren 1 μm fmet-leu-phe Δ A 550 nm Isoproterenol RR-Fenoterol SS-Fenoterol R-Salbutamol S-Salbutamol Ligand (log M) 8 ml venöses Vollblut, 96 Proben, Mutiplate-reader

51 Interindividuelle Variabilität der IC 50 -Werte für Fenoterol-Stereoisomere an neutrophilen Granulozyten (O 2- Produktion) gesunder Spender -4 log(ic50/m) RR-FEN RS-FEN SR-FEN SS-FEN R-ISO

52 Zukünftige Untersuchungen Korrelation zwischen β 2 AR-Pharmakologie in neutrophilen Granuloyten und β 2 AR-Genotyp in gesunden Spendern Korrelation zwischen β 2 AR-Pharmakologie und β 2 AR- Genotyp in neutrophilen Granulozyten von Asthmatikern Analyse der Wirkungen von LABAs an gesunden Spendern und Asthmatikern

53 Implikationen für zukünftige klinische Studien mit β 2 AR-Agonisten bei Asthma bronchiale und COPD β 2 AR-Genotypisierung der Probanden Funktionelle β 2 AR-Charakterisierung in Immunzellen Vergleich Razemat, Eutomere und Distomere Mögliche Nicht-Äquivalenz verschiedener SABAs Mögliche Nicht-Äquivalenz verschiedener LABAs

54 Take-Home Messages Funktionelle Selektivität in rekombinanten Systemen und nativen Zellen GPCR-Stereoisomere als Werkzeuge zur Exploration funktioneller Selektivität Analyse der Wirkungen von β 2 AR- Stereoisomeren beim Asthma bronchiale als Strategie zur Therapieoptimierung

55 , MHH Michael Reinartz Solveig Kälble Heike Burhenne, Volkhard Kaever Kooperationspartner Brian Kobilka, Ulrik Gether (Stanford University) Katharina Wenzel-Seifert (Stanford University; University of Kansas) Michael Kabesch (Pädiatrie, MHH) Irena Brunskole, Armin Buschauer, Stefan Dove (Medizinische Chemie, Universität Regensburg) Peter Gmeiner (Medizinische Chemie, Erlangen) Irving Wainer (NIH, Bethesda) DFG, AHA, NIH, US Army Research Office