1. Isolierung von E. coli-stämmen mit selektionierbaren Markergenen

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1 1. Isolierung von E. coli-stämmen mit selektionierbaren Markergenen Versuchsziele: 1. Markierung von Bakterienstämmen mit einer Antibiotikum-Resistenz 2. Konzept kryptischer Gene

2 Warum isoliert man Bakterienstämme mit selektiven Markern? 1. Genetische Markierung von Wildtyp- Stämmen 2. Kreuzungsexperimente

3 Mutagenese - spontane Mutagenese - induzierte Mutagenese

4 Spontane Mutationen entstehen durch: - Replikationsfehler - tautomere Umlagerungen der Basen - oxidative Schädigungen der Basen - spontane Desaminierung von 5-Methylcytosin zu Thymin - Error-Prone Repair

5 Mispairing Because of the Rare Tautomeric Forms

6 Induzierte Mutationen können ausgelöst werden durch: - energiereiche Strahlung, z. B. UV - bestimmte Chemikalien, z. B. Methylmethansulfonat (MMS), Nitrosoguanidin(NG) - Mutatorstämmen, z. B. E. coli mutd

7 Streptomycin Produzent: Streptomyces griseus Aminoglycosid-Antibiotikum hemmt die Translation Target: ribosomales Protein S12 Gen: rpsl; 73 min Mutationsfrequenz pro cfu: 1.5x10-8 bis 4.4x10-11 Plasmid-codierte Resistenz: Modifikation durch Adenylierung oder Phosphorylierung

8 Nalidixinsäure synthetisches Produkt hemmt DNA-Replikation Target: DNA-Gyrase Gene: gyra, 48 min gyrb, 58 min Mutanten in gyrb zeigen Wachstum bis zu 4 µg/ml Mutanten in gyra zeigen Wachstum bei >20 µg/ml Mutationsfrequenz pro cfu: 1.1x10-9 bis 3.0x10-9

9 Rifampicin Produzent: Nocardia mediterranei hemmt die Transkription Target: β - Untereinheit der RNA-Polymerase Gen: rpob, 90 min Mutationsfrequenz pro cfu: 1.0x10-7 bis 2.3x10-9

10 Untereinheiten der bakteriellen RNA- Polymerase Core Enzym: α 2 ββ' ω Holoenzym: α 2 ββ' ω σ

11 Funktion der einzelnen Untereinheiten α 2 : - α NTD: Interaktion mit β und β ' - α CTD: Interaktion mit UP-Element oder Transkriptions-Aktivator β : - bindet rntps - Katalyse β ': - bindet unspezifisch an DNA ω: - Funktion beim Zusammenbau σ: - erkennt Promotor

12 Initiation der Transkription 1. unspezifische Bindung an die DNA (β ') 2. Translokation 3. Promotor-Erkennung (σ) 4. Bildung des geschlossenen Komplexes 5. Bildung des offenen Komplexes 6. abortive Transkription 7. Promotor-Clearance (Rifampicin)

13 Kryptische Gene: 1. Produzieren in der Regel kein nachweisbares Protein oder (selten) ein nicht-funktionelles Protein 2. Benötigen eine Mutation zur Aktivierung

14 Valin-'Resistenz' Valinsynthese in E. coli Pyruvat α - Acetolactat α, β - Dihydroxyisovaleriansäure α - K etoisovalerinsäure Acetohydroxysäure- Synthase = AHAS Endprodukt-Hemmung α - Ketobutyrat α - Acetohydroxybutyrat L-Isoleucin L-Valin

15 AHAS-Gene bei E. coli Gene Eigenschaften Bezeichnung ilvbn konstitutiv; Val-sensitiv AHAS I ilvgm kryptisch; Val-resistent AHAS II ilvih konstitutiv; Val-sensitiv AHAS III ilvj kryptisch; Val-resistent AHAS IV ilvf kryptisch; Val-resistent AHAS V ilvgm: α - Untereinheit kryptisch: 300 Aminosäuren α - Untereinheit dekryptifiziert: 521 AS

16 How to detect degradation of certain sugars by enteric bacteria? Streak bacteria on McConkey agar plates containing the appropriate sugar If the cells cannot degrade the sugar, they will form white colonies If cells can degrade the sugar, they will form red colonies Why? During degradation acid is formed which is detected by ph indicators within the plates

17 Naturally Occuring β -Glucosides

18 Can E. coli cells degrade salicin? 1. Prepare McConkey plates with salicin 2. Plate E. coli cells and incubate overnight 3. Record the colour of the colonies 4. Keep the plates for a few days on the bench and inspect every morning 5. What will happen after a few days?

19 Dekryptifizierung des bgl-operons bgl = beta-glucoside Escherichia coli kann die aromatischen ß-Glucoside (z.b. Salicin) nicht verwerten MacConkey Medium: Vollmedium mit ph Indikator Zusatz eines best. Zuckers (z.b. Lactose) Verwertung des Zuckers: rote Kolonien kein Abbau des Zuckers: weiße Kolonien MacConkey + Salicin: 2-3 Tage über Nacht Spontanmutationen ermöglichen E. coli den Abbau von Salicin rote Papillen

20 Bakterienkolonien mit roten Papillen

21 Bakterienkolonien mit roten Papillen

22 H-NS: histone-like nucleoidstructuring protein eine der Hauptkomponenten des bakteriellen Chromatins beeinflusst Struktur der DNA und die Genexpression inhibiert die Expression bestimmter Gene in der exp.phase H-NS Bindestellen H-NS bgl keine Transkription des bgl Operons

23 Dekryptifizierung des bgl-operons durch Insertionvon IS-Elementen IS-Element Insertion von IS1 und IS5 im Bereich der H-NS Bindestelle (bglr) IS-Elemente: Insertionssequenzen bewegliche genetische Elemente bp bgl inverted repeats an den Enden codieren für Transposase

24 Experimentelle Durchführung: Selektion Resistenzen ÜNK auf Selektivplatten ausplattieren Kolonien zählen Mutationsrate berechnen; auf Ausgangs-cfu beziehen Nachweis Salicinverwertung Kolonien auf McConkey + Salicin Platten auf dem Labortisch stehen lassen Anzahl der roten Papillen pro Kolonie auszählen