Überblick. Wie kommt ein Fladianer nach Norwegen? Was kennzeichnet circadiane Rhythmen? Wie wurden sie entdeckt? Wo finden wir sie?

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1 Die molekularen Prozesse der circadianen Uhr Prof. Dr. Peter Ruoff Universität Stavanger Stavanger, Norwegen Überblick Wie kommt ein Fladianer nach Norwegen? Was kennzeichnet circadiane Rhythmen? Wie wurden sie entdeckt? Wo finden wir sie? Welche molekularen Prozesse finden bei der circadianen Uhr statt? Der rote Brot-Schimmelpilz Neurospora crassa als Modellorganismus im Studium von circadianen Rhythmen. 1

2 Stavanger ( Einwohner) Uni Lysefjord Altstadt Kjerag Wie kommt ein Fladianer nach Norwegen? : kam nach Mittlerer Reife an das Chemische Institut Dr. Flad (LG XX) : Technische Oberschule Stuttgart (1972: Frau in England getroffen!) : Wehr- und Zivildienst : Studium der Chemie und 4 Jahre wiss. Assistent an der Uni Oslo. Erfahrung als CTA war sehr hilfreich! seit 1984: Uni Stavanger (Professor für Physikalische Chemie)

3 Historische Einführung. Eigenschaften der circadianen Uhr. Beispiele. Was sind circadiane Rhythmen? Der Name circadian ist hergeleitet aus dem Lateinischen circa (ungefähr) und dies (Tag). Der Name soll darauf hindeuten, daß circadiane Rhythmen eine Periodenlänge von ungefähr 24 Stunden haben wenn sie als freilaufende Rhythmen (in Dauerdunkel oder Dauerlicht) auftreten.

4 400 vor Christus: Androsthenes beobachtet das Schlafen bei Pflanzen Tamarindus indica Tag Nacht Der französische Astronom De Mairan findet 1729 Blattbewegungen im Dauerdunkel Blätter offen (Tagstellung) Blätter geschlossen (Nachtstellung) Mimosa pudica

5 Linné s Blumenuhr CARL von LINNÉ ( ) QuickTime and a Sorenson Video decompressor are needed to see this picture. Tigerrachen (Faucaria tigrina, Südafrika, Blüten offen 17 Uhr, geschlossen 20 Uhr)

6 Die circadiane Uhr Circadiane Rhythmen haben Eigenschaften einer Uhr und spielen in der Regulierung von tagesperiodischen Vorgängen wie Schlaf, Öffnung von Blüten, Sporenbildung bei Schimmelpilzen, und jahresperiodischen Vorgängen wie Blütenentwicklung, Winterschlaf, Reproduktion, Vogelzug,... eine entscheidende Rolle. Sonnenuntergang Sonnenaufgang Sonnenuntergang MEZ MEZ ( ) gleichseitige Rechteck-Projektion EarthDesk Die circadiane Uhr hat sich entwickelt, um Organismen an die durch die Erdrotation verursachte periodische Licht-Dunkel-Umwelt anzupassen.

7 Wir finden die circadiane Uhr in praktisch allen höheren Organismen Eigenschaften von circadianen Rhythmen Circadiane Rhythmen entstehen endogen in der einzelnen Zelle und sind nicht das Resultat eines Licht-Dunkel Wechsels. Man kann sie unter konstanten Bedingungen (Licht oder Dunkel) sehen mit einer Periodenlänge von ca. 24 Stunden.

8 Circadiane Blattbewegungen QuickTime and a Sorenson Video decompressor are needed to see this picture. Phaseolus coccineus. Typischer Zeitverlauf von Blattbewegungen bei einer Bohnenpflanze unter konstantem Schwachlicht. Die Periodenlänge ist ca. 28 Stunden (E. BÜNNING and M. TAZAWA, 1957). Zeitrafferaufnahme der Blattbewegungen bei einer Bohnenpflanze (Phaseolus) von Roger P. Hangarter, Indiana University. Eigenschaften von circadianen Rhythmen (Synchronisation, Phasenverschiebung) Circadiane Rhythmen synchronisieren auf äußere periodische Licht/Dunkel Signale. Durch einmalige Einwirkung von Licht, Temperatur oder bestimmten Stoffen kann man die Phase circadianer Rhythmen verändern.

9 Temperaturkompensation Die circadiane Periode wird durch gewisse noch nicht ganz geklärte Kompensationsmechanismen gegen Umweltveränderungen, zum Beispiel gegenüber Temperaturveränderungen, konstant gehalten. Beispiele temperaturkompensierter Rhythmen (E. Bünning: The Physiologcal Clock, Berlin, 1964)

10 Flashing and glow circadian rhythms in Gonyaulax (Prof. Dr. Ludger Rensing, Uni Bremen) Die Panzeralge zeigt einen circadianen Glimm-Rhythmus und ein circadianes Aussenden von Lichtblitzen (Bioluminescens). Gonyaulax polyedra (Panzeralge) Circadiane Veränderung von Blutdruck und Anzahl von Herzinfarkten Circadiane Variation des Blutdruckes Circadiane Variation von Herzinfarkten 10

11 Die molekularen Prozesse bei der circadianen Uhr Die Zelle Alle Organismen sind aus Zellen aufgebaut. Die Zellgröße liegt normalerweise im µm Bereich. Bei Eukaryoten besteht die Zelle aus einem Zellkern der das Erbmaterial, d.h. die DNA mit Genen enhält. Um den Zellkern haben wir das Cytoplasma wo u.a. die Proteinsynthese stattfindet.

12 Information/Bauplan für einen Organismus ist in der DNA (im Zellkern) gelagert Genbegriff Bestimmte Bereiche in der DNA kodieren für Proteine. Diese Bereiche nennt man Gene. DNA (deoxyribonucleic acid) Zwei Stränge von DNA werden durchwasserstoffbrückenbindungen zwischen komplementären Basen zusammengehalten H 3C O N N O sukker H H H N N N N N sukker N sukker H N N O H O N H N N N sukker H N H Tymin Adenin Cytosin Guanin T A C G Die Information wird mit Hilfe von den 4 Basen T, A, C und G beschrieben. DNA (deoxyribonucleic acid)

13 5 Ende adenin A cytosin C DNA hat Richtung Die Basensequenz wird definitionsmäßig in Richtung 5'-3' geschrieben: guanin G T 5'.ACGT... 3' Ende Von Gen zu Protein Katalyse DNA (Gen) messenger RNA (mrna) Protein Transport Transkription Translation (Proteinsynthese) Aufbau

14 Export ins Cytoplasma 5 AAAAAAA... 3 Splicing polya mrna 5 3 pre-mrna Transkription 3 5 Promoter Exon1 Intron1 Exon2 DNA-Strang Proteine (Transkriptionfaktoren) und RNA-polymerase binden am Promoter um die Transkription (mrna Synthese) zu starten. Mit Hilfe von Ribosomen findet die Proteinsynthese (Tanslation) statt CH COOH NH 2 CH 2 NH 2 CH COOH NH 2 CH COOH + CH 3 + CH CH 2 S CH 3 M A -H 2 O -H 2 O F Peptidbindung N-terminales Ende NH 2 CH CO NH CH CO NH CH CONHCH CH CH 2 3 CH 2 R N-terminal ende CH av proteinet 2 S C-terminal ende av C-terminales proteinet Ende CH 3 MAF...

15 Die Translation (Proteinsynthese) findet im Cytosol statt QuickTime and a Animation decompressor are needed to see this picture. Transkription, Splicing und Translation QuickTime and a Animation decompressor are needed to see this picture.

16 Modellorganismus Neurospora crassa (roter Brotschimmelpilz) Modellorganismus Neurospora crassa: eukaryotischer Schimmelpilz wächst schnell nicht pathogen leicht zu handhaben viele Mutanten zugänglich der circadiane Rhythmus (Sporenbildung) ist leicht zu verfolgen

17 Neurospora in der Natur wächst in den Tropen/Subtropen auch gefunden in: New Mexico, Alaska, Spanien, Portugal, Schweitz. findet man nach Waldbränden. Genom in 2003 sequenziert 39,225,835 bp 9,826 Gene 7 Chromosomen Neurospora s drei Zelltypen DAPI-gefärbte Kerne (Ingunn Jolma, UiS) QuickTime and a TIFF (LZW) decompressor are needed to see this picture. (DAPI: 4',6-diamidino-2-phenylindol, dihydrochlorid)

18 photo: Bodil Aase UiS photo: Bodil Aase, UiS Sporenbildung photo: Bodil Aase UiS 18

19 Warum hat Neurospora eine circadiane Uhr? Um (DNA) Schäden bei der Sporenbildung durch Licht/UV Einfluß und hohen Temperaturen minimal zu halten, werden die Sporen (Konidien) am frühen Morgen gebildet. Dieser Prozess ist durch die circadiane Uhr reguliert. Der circadiane Rhythmus der Sporenbildung wird mit Hilfe von Race Tubes verfolgt P. Ruoff

20 Das Race Tube Experiment: Bestimmung der Periodenlänge Jason C. Thoen and Van Gooch: Time Lapse Video Showing an Internal Circadian Clock in Mold (Neurospora) Growth Gene bestimmen die Eigenschaften der circadianen Uhr Mit Hilfe von UV Strahlung hat man Neurospora s DNA verändert und festgestellt, daß man Periodenlänge und Temperaturkompensation verändert kann. Mit Hilfe von UV Strahlung wurde Neurospora s DNA verändert. Es wurde festgestellt, daß man Periodenlänge (und andere Eigenschaften) dadurch beeinflußen kann. Es har sich weiterhin herausgestellt, daß diese veränderten Eigenschaften sich weitervererbt hatten. Die veränderten circadiane Eigenschaften sind vererbbar (Mutantenbildung). Man kam daher zu dem Schluß, daß die Eigenschaften der circadiane Uhr durch Gene bestimmt werden. Man kam daher zu dem Schluß, daß die circadiane Uhr bei Neurospora durch Gene bestimmt wird.

21 Das frequency (frq) Gen definiert Neurospora s circadiane Uhr

22 Das FREQUENCY (FRQ) Protein >sp P19970 FRQ_NEUCR FREQUENCY CLOCK PROTEIN - Neurospora crassa. MADSGDKSQGMRPPPFDSRGHPLPRRASPDKSITLENHRLARDTSSRVTS start of long FRQ SSALGVTESQPQLKSSPTRRNSSGESEPTNWFNQSNRNPAAAFHDESHI M start of short FRQ EVDPPFYQKETDSSNEESRYPPGRNPVHPPGGVQLPGFRPVA AHSTAADD YRSVIDDLTVENKRLKEELKRYKQFG SDVMRKEKLFEIKVHGLPRRKKRE coiled-coil LEATLRHFAASLGDSSESTSQRRKTGRHGTAVYSSGVSLSKHDSSSSSRS RPVDSAYNSMSTGRSSHAPHSSGPSLGRPSLTRAKSVGTQKVENYLRDTP DGLLPHHIVMTDKEKKKLVVRRLEQLFTGKISGRNMQRNQSMPSMDAPLA PEGTNMAPPRPPPEGLREACIQLQDGDNPRKNRSSKDNGSASNSGGDQTE LGGTGTGSGDGSGSGGRTGNNTSPPGAIAPDQRP TRPRDLD PDRVQIPSE potential GSK-3 P-site NMDYIRHL GLVSPEFLQGSRTSYQDVAPDAE GWVYLNLLCNLAQLHMVNV frq[7]:g D frq[1]:g S TPSFIRQAVSEK STKFQLSADGRKIRWRGGTDGTKFSSDSSED KSQQSPM S513 PEST-1 TEDTEDGSDK NGRRKKRKTQ QASSEIGRFGPSRSPSDTFHYKPMFVHRNS PEST-1 NLS SSIETSLEESMSQGSEDAVDESNMGNSKWDFSGSGTTQQRRKRRYDGAIV YYTGAPFCTDLSGDPGDMSPTAQMTAGREVEGSGSGDEVEHVLQRTLSGS SLPIRPLSDDRARVAEVLDFDPGNPPELVADDGSSPNDEDFVFPWCEDPA KVRIQPIAKEVMEPSGLGGVLPDDHFVMLVTTRRVVRPILQRQLSRSTTS EDTAEFIAERLAAIRTSSPLPPRSHRLTVAPLQVEYVSGQFR RLNPAPLP PEST-2 PPAIFYPPFSTDSSWDDGDDLASDDEEVEEVEEDSYSEGQISR RANPHFS PEST-2 DNNTYMRKDDLAFDTETDVRMDSDDNRLSDSGHNMRAMMPRAEAVDGDDS PLAAVTGKEVDIVHTGSSVATAGGAESGYSSSMEDVSSS Circadiane Oszillationen in frq-mrna and FRQ-protein 38 C Methoden FRQ: Western blots mrna: Northern, RT-PCR Liu et al., Science 281 (1998)

23 Wie kommt der circadiane Rhythmus zustande? Negative Rückkopplung: Das FRQ Protein inhibiert die eigene Transkription frq: frequency Gen Mathematische Modelle helfen Fragen zu stellen, und Vorhersagen zu machen die man experimentell prüfen kann QuickTime and a TIFF (LZW) decompressor are needed to see this picture.

24 Modellberechnungen und Experimente zeigen, daß die Stabiliät von FRQ-Protein bestimmend ist für circadiane Periode und deren Temperaturkompensation Ruoff et al. PNAS, 2005, 102, Ausblick - Weitere Fragen wie inhibiert FRQ die eigene Transkription? wie sind andere Prozesse an den FRQ Oszillator gekoppelt, z. B. die Sporenbildung? gibt es mehrere miteinander-gekoppelte Transkriptions- Translations Oszillatoren? Ähnliche Entwicklung mit anderen Modellorganismen: Bananfliege (Drosophila), Maus, Zebrafisch, und Schaumkresse (Arabidopsis).

25 Model der circadian Uhr in der Bananfliege (Drosophila) k 13 PDP1 c k 25 k 6 k 4 k 26 Pdp1- mrna Pdp1-positive feedback Pdp1 k 14 k 5 PDP1 k 9 n k k 2 k 22 1 dclk dclk-mrna dclk c dclk n k 24 k 23 VRI n k3 k 12 vri vri-negative feedback vri-mrna k 21 k 10 k 8 k 7 per/tim-mrna per/tim k 19 PER/TIM dclk n k k 17 k k 16 PER/TIM + dclk n VRI c k 20 k 11 Ruoff, et al. (2004), Biophys. Chem. Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!

26 Circadian clock properties are inherited Das Model der circadianen Uhr bei Säugern Leloup & Goldbeter (2004), PNAS.

27 Chromosomen kann man im Lichtmikroskop sehen, besonders bei Zellteilung QuickTime and a Sorenson Video decompressor are needed to see this picture. Zellteilung bei einer Tierzelle (Zeitraffer, Alberts et al.) Menschliche Zelle: 2 m DNA passen in einen 6 mm großen Zellkern QuickTime and a Animation decompressor are needed to see this picture.