Mutagene Wirkung des Zerfalles von radioaktivem Phosphor nach Einbau in Zellen von Escherichia coli

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1 MUTAGENE WIRKUNG DES ZERFALLS VON RADIOAKTIVEM PHOSPHOR 793 Mutagene Wirkung des Zerfalles von radioaktivem Phosphor nach Einbau in Zellen von Escherichia coli Von F. K a u d e w i t z, W. V ie l m e t t e r und H. F r i e d r i c h -Fr e k s a Aus dem Max-Planck-Institut für Virusforschung, Tübingen (Z. Naturforschg. 13 b, [1958] ; eingegangen am 1. August 1958) Cells of E. coli B/r labelled with 32P undergo inactivation during storage in liquid nitrogen ( 196 C). Thawing the samples after storage and plating them immediately on complete medium yields colonies of uniform appearance. However, replica plating them on minimalmedium demonstrates, that during 32P decay there occured a significant increase in nutritionally deficient (auxotrophic) mutants. When 10~4 is the survival-rate, 0.67% of surviving cells give rise to auxotrophic colonies, 40 50% of which have prototrophic sectors. During storage the increase of mutants is linear with respect to inactivation of bacteria and to the fraction of 32P decayed. The experiments carried out show, that inactivation and mutation are due to the decay of 32P atoms incorporated in cellular structures and not do effects of freezing, toxicity of contaminants present in the 32P solution, or ionization of /^-electrons. An increase of mutants by positive selection in the course of inactivation was excluded experimentally. In einer früheren Arbeit wurden die letalen Folgen des Einbaues von 32P bei Amoeba proteus untersucht1,2. Es ergab sich, daß zwei verschiedene Arten von letaler Wirkung zu unterscheiden sind: erstens die ionisierende Wirkung der /^-Strahlung und zweitens die Wirkung der Strukturänderungen am Ort des Zerfalls, die durch Umwandlung des 32P in Schwefel und die beim Zerfall auftretenden Compton- Rückstöße hervorgerufen werden. In den Versuchen mit A. proteus konnte gezeigt werden, daß die Strahlungswirkung nur für einen geringen Prozentsatz der Gesamtletalität verantwortlich ist und sich in anderer Weise auf die der Behandlung mit 32P folgenden Generationen verteilt, als die letalen Folgen der Elementarumwandlung des in die Zellstruktur eingebauten 32P. Die Abtrennung der Strahlenwirkung des radioaktiven Phosphors von der Wirkung des strukturgebundenen Zerfalles wurde zuerst von H e r s h e y und Mitarbb. 3 an Phagen vorgenommen und später insbesondere von F u e r s t und S t e n t 4 bei E. coli eingehend untersucht. Übereinstimmend mit den Versuchen an A. proteus zeigte sich, daß die Inaktivierung bzw. Abtötung durch Strahlung gegenüber der W irkung des Zerfalles verhältnismäßig gering ist. W ir hatten seinerzeit angenommen, daß die Letalwirkung des radioaktiven Phosphors auf Letalmuta tionen beruht, die durch Zerfall des Phosphors in der genetischen Substanz entstehen. Wenn das zutrifft, so ist zu erwarten, daß auch vitale Mutationen durch Phosphor-Zerfall hervorgerufen werden können. Zum Nachweis solcher Mutationen eignet sich A. proteus wegen der beträchtlichen Schwierigkeiten einer genetischen Analyse nicht. An Epilobium 5 und Drosophila 6 wurden Mutationen als Folge der Verabreichung von 32P beschrieben. In diesen Fällen erfolgte aber keine Trennung der Strahlenwirkung von der Einbauwirkung, so daß sie für unser Problem ausscheiden. Als Objekte zur Untersuchung der Erzeugung von Mutationen durch 32P-Einbau erscheinen Bakterien dagegen geeigneter, da z. B. bei E. coli eine große Anzahl von Stoffwechselmutanten bekannt sind und in kurzer Zeit große Individuenzahlen geprüft werden können. Die W irkung des Zerfalles des strukturgebundenen radioaktiven Phosphors läßt sich erst untersuchen, wenn eine genügende Anzahl von Atomen zerfallen sind. Falls die spezifische Aktivität nicht extrem hoch ist, muß deshalb etwa eine Halbwertszeit des Phosphors abgewartet werden. Wenn nach erfolgter Markierung die Zellen sich weiter vermehren, würde durch Neuaufnahme von unmarkiertem Phosphor mit der Zahl der Zellgenerationen eine ständige Verdünnung der spezifischen Aktivität eintreten und dadurch die W irkung abgeschwächt werden. Deshalb 1 H. F r i e d r i c h -Fr e k s a u. F. K a u d e w it z, Verh. dtsch. zool. Ges. 1951, H. F r i e d r i c h -Fr e k s a u. F. K a u d e w it z, Z. Naturforschg. 8 b, 343 [1953]. 3 A. D. H e r s h e y, M. D. K a m e n, J. W. K e n n e d y u. H. G e s t, J. gen. Physiol. 34, [ ]. 4 C. R. F u e r s t u. G. S. S t e n t, J. gen. Physiol. 40, 7 3 [ ]. 5 P. M ic h a e l is, Naturwissenschaften 41, 2 2 [ ]. 6 J. K i n g, J. exp. Zoology [ ].

2 F. K A U D EW IT Z. W. V IELM ETTER UND H. FRIED RICH-FREKSA 794 ist es nötig, die Zellteilung zu sistieren, am einfach sten durch Kälte, bis genügend Phosphor-Atome zer fallen sind. S t e n t 4 hat Einfrieren in flüssigem Stick stoff als eine Methode eingeführt, bei der annähernd alle Bakterien überleben. Sie wurde von uns über nommen und hat sich bewährt. Die Untersuchung der Mutationsauslösung durch radioaktiven Phosphor erschien uns deshalb wichtig, weil vermutlich der Einbau in die Nucleinsäuren Vorbedingung für die mutagene W irkung ist. Material und Methoden Als Versuchsstamm diente E. coli Stamm B/r, eine von W i t k i n isolierte, gegen UV- und ionisierende Strah len im Vergleich zu E. coli B unempfindlichere Mutante. Als flüssiges Vollmedium diente Nutrient Broth (Difco). Das flüssige Minimal-Medium setzte sich zu sammen aus: 3,5 g K 2H P 0 4: 1,5 g K H 2P 0 4; 0,5 g Nacitrat 5 H20 ; 0,1 g M gs04; 1 g (NH4) 2S 0 4; 2 g Glu cose in 1000 ml H 20 gelöst. Einbauversuche mit 32P erforderten zur Erzielung hoher spezifischer Aktivitäten der Bakterien ein Medium niedrigen Phosphat-Gehaltes. In ihm ( Tris-Medium ) war das Puffer-Phosphat des Minimal-Mediums durch 0,05-m. Tris-Maleinsäure-Puffer ersetzt. Der Phosphat-Gehalt wurde durch Zugabe von Nutrient Broth auf 0,8 y/ml eingestellt (Phosphor bestimmung nach F i s k e - S u b b a r o w ). Aminosäuren, Purine und Pyrimidine (California Foundation for Bio chemical Research, Los Angeles, U.S.A.) wurden M ini mal-medium oder Minimal-Agar, wenn erforderlich, in Höhe von 20 y/ml, Vitamine (E. Merck, Darmstadt) in Höhe von 10 y/ml zugesetzt. Für Versuche mit Penicil lin verwandten wir Penicillin G Göttingen als NaSalz. 32P wurde als sterile Ortho-Phosphat-Lösung (pn 4 5, Phosphat-Gehalt <C0,04 7P/mC) mit Aktivitäten von 5 10mC/ml (Genauigkeit der Angabe über Akti vität/ml: + 10%) von der Kernreaktor-Bau- und Be triebsgesellschaft, Isotopen-Laboratorium, Göttingen, be zogen. Züchtung der Zellen und ihre Aufbewahrung in flüs sigem Stickstoff: Zuchttemperatur war 37 C. Flüssig keitskulturen wurden, wenn nicht anders vermerkt, be lüftet. Ausgangspunkt eines jeden Versuches bildeten Ca-Panthotenat A lanin R iboflavin Ascorbinsäure Nicotinsäuream id P henvlalanin Serin T rvptophan Tyrosin p-aminobenzoesäure T hiam in Cystein Threonin Pyridoxalphosphat Methionin Arginin Asparaginsäure Prolin Glutaminsäure Inositol Leucin Glycin Isoleucin H istidin Lysin Valin A denin Cytosin Thymin G uanin Uracil auf Minimal-Agar gewachsene Einzelkolonien des prototrophen B/r-Stammes. Jeweils eine Kolonie wurde in Minimal-Medium überimpft und bis zum Wachstums stillstand (3 109 Zellen/ml) bebrütet Zellen/ml dieser Kultur wurden sodann in Vollmedium hineinver dünnt, weiterbebrütet und nach Erreichen eines Zell titers von 108 Zellen/ml in der exponentiellen Wachs tumsphase abzentrifugiert und durch zweifaches Waschen mit Tris-Medium von überschüssigem Phosphor befreit. 1,5 10 Zellen dieser Zellsuspension dienten als Ein saat für jeweils 15 ml Tris-Medium. Diese Ansätze wur den mit 32P-Zusatz als radioaktive Kultur (RA) sowie als Kontrollen ohne 32P oder mit anderen Zusätzen für die eigentlichen Versuche verwendet. Die Bebrütung der RA-Kultur und der Kontrollen erfolgte parallel unter jeweils gleichen Bedingungen 2 5 Stdn. lang. Danach wurden die Zellen der einzelnen Kulturen bei +4 C durch zweimaliges Zentrifugieren gewaschen und in eis kaltem Vollmedium auf genommen. Anschließend wurde durch Plattieren unverdünnter Proben auf Nähragarplatten, die mit dem für E. coli B/r lytischem Phagen Tj beschickt waren, die Reinheit der Kulturen nachge wiesen. 0,1-ml-Portionen der Kulturen wurden in eis gekühlten, dünnwandigen Reagenzröhrchen verteilt, je des Röhrchen mit einem Glasstab-Stück beschwert, zu geschmolzen und dann in flüssigem Stickstoff ( 196 C) rasch eingefroren. Die Aufbewahrung der Proben er folgte in flüssigem Stickstoff, ihr Auftauen bei Zimmer temperatur. Auf suchen und Klassifizieren auxotropher Mutanten: Auxotrophe Mutanten wurden mit Hilfe der Stempel technik von L e d e r b e r g 7 isoliert. Ihre Klassifizierung er folgte mit Hilfe eines nach H o l l i d a y 8 modifizierten Verfahrens. Dabei wurde eine Einzelkolonie jeder M u tante auf einer Nähragar-Platte über einem durch Zah len gekennzeichneten, auf einer untergelegten Glasplatte gezeichneten Punktmuster aufgetüpfelt. Nach 8-stdg. Bebrütung erfolgte durch Stempeln Übertragung des Tüpfelmusters auf eine Minimalagar-Platte und auf 11 Testplatten. Letztere enthielten in Minimalagar Aminosäuren, Purine, Pyrimidine und Vitamine in einer in Tab. 1 eingetragenen und erläuterten Grup pierung. Nach 6-stdg. Bebrütung konnte entschieden werden, auf welcher Testplatte jede Mutante zu wach sen vermochte. Jede Mutante wurde anschließend durch den Tr Test geprüft. Tab. 1. Anordnung der Testgruppen 1 11, die in der Zusammensetzung der Horizontal- und Vertikalgruppen Minimal-Agar platten zugesetzt sind. Bedarf mehrerer Substanzen bekannter Mutationstypen ist in der Anordnung möglichst berücksichtigt. (Auswertungsbeispiel: Tryptophan-Mutanten vermögen auf Testplatte 3 und 9 zu wachsen.) 7 J. L ederberg u. E. M. L ederberg, J. Bacteriol R. H o l l id a y, Nature [London] [1956]. [1952],

3 MUTAGENE W IRKUN G DES ZERFALLS VON RADIOAKTIVEM PHOSPHOR 795 Penicillin-Behandlung9: Zur Anreicherung von Stoffwechsel-Mutanten wurden Probeninhalte aufgetaut und in 10 ml Nährmedium über Nacht bis zur Sättigung (4 109 Zellen/ml) kultiviert. Nach dreifachem Zentrifugieren und Waschen in glucose-freiem Minimal-Medium wurden die Zellen im gleichen Medium durch halb-stdg. Bebrüten ausgehungert und anschließend 108 Zellen/ml in Minimal-Medium + Glucose und 300 i.e. Penicillin G/ml 13 Stdn. ohne Belüftung bebrütet. Die Zellzahl sank dabei auf 1 bis Zellen pro ml. Ergebnisse 1. Inaktivierung durch 32P -Zerfall RA-Kultur: Die spezifische Aktivität der Kulturen variierte in verschiedenen Versuchen von 8 16 mc pro mg P, die Bebrütungsdauer von 2,5 bis 5 Stunden. Eingefrorene Proben wurden unmittelbar und in Abständen von mehreren Tagen nach dem Einfrieren aufgetaut und die Anzahl überlebender Zel- Die Gültigkeit der Gl. (1) für biologische Objekte bei Inaktivierung mit 32P war erstmals in Untersuchungen von H e r s h e y und Mitarbb. 3 an Phagen der T-Serie nachgewiesen worden. Dabei gilt für den Anstiegsfaktor der Geraden K = l,48 10~6 a A0 -N, (2) wobei A0 die spezifische Aktivität des 32P, N die Anzahl Phosphor-Atome/inaktivierbare Einheit und a die Abtötungswirksamkeit bedeuten. Der Zahlenfaktor enthält den Modul zum Übergang von ln zu lg10 und das absolute Gewicht (in g) der in 1 Curie enthaltenen 32P-Atome. Aus Gl. (2) ergibt sich, daß K der spezifischen Aktivität A0 proportional sein muß. Sieht man in der Kurve 2 der Abb. 1 (A0 = 8 mc/mg P) von der Anfangskrümmung zunächst ab, so beträgt der Anstieg des linearen Kurventeiles entsprechend der halben spezifischen Akti- A0 [mc/mgp] K Ci II o Fraktion der überlebenden Zellen 8 3,75 0, ,90 0, ,53 0, ,00 0,50 Tab. 2. Abhängigkeit des Überlebensfaktors K von der spezifischen Aktivität A0 des Kulturmediums. Bebrütungsdauer [Stdn.] n 2,5 2,5 2,5 2,5 4,5 1,5 5,0 1,0 Tab. 3. Abhängigkeit der durchschnittlichen Anzahl inaktivierbarer Einheiten pro Zelle (n) von der Bebrütungsdauer. Abb. 1. Ab tötungskurven von 32P-markierten Zellen. Kurve 1 (weiße Kreise) : spezifische Aktivität 16 mc/mg P, 4,5 Stdn. bebrütet. Kurve 2 (schwarze Kreise) : spezifische Aktivität 8 mc/mg P, 2,5 Stdn. bebrütet. len ermittelt. Das Ergebnis zweier Versuche ist in Abb. 1 dargestellt. Dabei ist der Anteil der überlebenden Bakterien S/S0 (S0 Anzahl der Bakterien zur Zeit t = 0 und S zur Zeit J) logarithmisch gegen den Anteil / = 1 e~xt (A Zerfallskonstante für 32P) der zerfallenen 32P-Atome aufgetragen. Die Kurve 1 (spezifische Aktivität A0 = 16 mc/mg P, Bebrütungsdauer 5 Stdn.) verläuft in dieser Darstellung linear und kann durch die Gleichung beschrieben werden. lg.0 - f = K-/ (1) vität gegenüber dem 1. Versuch die Hälfte des A n stiegs der ersten Kurve. K ist für verschiedene weitere Versuche graphisch ermittelt und in Tab. 2 eingetragen worden. Die Größe c = K /A 0 = 1, ' ct N ist innerhalb der Fehlergrenzen als konstant anzusehen und bestätigt somit Gl. (2). Eine Anfangskrümmung, wie sie Kurve 2 der Abb. 1. zeigt, war bei Inaktivierungs-Versuchen durch Einbau von 32P in Bakterienzellen von F u e r s t und S t e n t 4 schon gefunden worden. Die Kurven wurden als Mehrtreffer-Kurven interpretiert. Demnach besitzt eine Bakterienzelle n inaktivierbare Einheiten, deren letzte inaktiviert sein muß, um die 9 J. L e d e r b e r g, Math. Med. Res. 3, 5 [1950].

4 796 F. KAUDEWITZ, W. VIELMETTER UND H. FRIEDRICH-FREKSA Versuch Nr. Spez.Aktiv. [mc/mg] Zeit in flüss. N 2 [Tage] Anteil 32P zerfallen Anteil der Überlebenden in den Kontrollen A B C I ,0 1,0 1,0 2,7 0,12 0, ,98 4,8 0,21 0, ,89 6,5 0,27 0,98 0,84 0,84 9, , ,0 Kontrolle 1.0 0,05 1,02 (B) u. (C) 12,7 0,46 0,98 zusammen- 38,0 0,85 0,94 gelegt Tab. 4. Überleben der Kontrollen (A). (B) und (C) in flüssigem Stickstoff. Teilungsfähigkeit der Zelle aufzuheben. Die Autoren deuteten die empfindlichen Einheiten als Kerne einer mehrkernigen Bakterienzelle. Für diesen Fall gilt oben genannten Hypothese, die Kernzahl pro Zelle bei längerer Züchtung in Tris-Medium von durchschnittlich 2 3 auf 1 reduziert wird. Die Wachstumskurve von E. coli B/r in Tris-Medium (Abb. 2) zeigt, daß bei 2,5 stdg. Bebrütung die Grenze exponentiellen Wachstums nahezu und bei 4 5 stdg. i - i i - f (3) f o *^0 wenn S Qbzw. S die Zellzahl zur Zeit = 0 bzw. t für Zellen mit n empfindlichen Einheiten ist. Die Gl. (3) in (1) eingesetzt, ergibt in der graphischen Darstellung Kurven des Typs der Kurve 2 aus Abb. 1. Dabei läßt sich die Trefferanzahl n graphisch durch Extrapolation des linearen Astes der Kurve auf die Ordinate ermitteln. Die für viele verschiedene Versuche gefundenen Werte für n sind in Abhängigkeit von der Bebrütungsdauer in Tab. 5 eingetragen. Sie ergeben, daß n und damit nach der Versuch Nr. spez. Akt. [mc/mg] Zeit in flüss. N2 [Tage] Anteil 32P zerfallen Anz. getesteter Kolonien RA-Kultur Mutanten gefunden Mutanten [%] Anz. getesteter Kolonien j : /, / J / i... S tu n d e n---*- Abb. 2. Wachstumskurve in Tris-Medium (Mikroskopische Zählungen). A) Kontrolle ohne 32P Mutanten gefunden g a «c c«3 B) Strahlungs- Kontrolle Anz. getesteter Kolonien Mutanten gefunden Mutanten [%] C) Kontrolle für 32P-Lösung I 16 9,5 0, , , ,05 I I , , , ,5 0, , ,2 273 Ö , ,5 0, , , I I I ,5 Kontrolle (B) 9,5 0, , und (C) , , zusammengelegt Anz. getesteter Kolonien Tab. 5. Anzahl der in RA-Kultur und Kontrollen gefundenen Mutanten nach Penicillin-Behandlung. Mutanten gefunden Mutanten \%\

5 797 MUTAGENE W IR K U N G DES ZERFALLS VON R A D IO A K T IV E M PH O SPH O R Bebrütung Wachstumsstillstand erreicht ist. Kern färbungen und genetische Untersuchungen W i t k i n s 10 an E. coli zeigten, daß bei Übergang von der Phase exponentiellen Wachstums in die des Wachstums stillstandes einer Kultur jede Zelle nur noch durch schnittlich ein Kernäquivalent aufweist. Sie unter stützten damit die Annahme, daß durch 32P-Zerfall tatsächlich einzelne Kerne ein- bis mehrkerniger Zel len inaktiviert werden, wobei sich die ursprüngliche mittlere Kernzahl in der Trefferzahl der Abtötungskurve spiegelt11. Kontrollen: Um letale W irkungen der Kälte behandlung, der /^-Strahlung des 32P und schließlich toxische Beimengungen der 32P-Lösung feststellen zu können, wurden zusammen mit der RA-Kultur drei Kontrollen unter jeweils gleichen Versuchsbedingun gen mitgeführt und die Überlebensrate der Zellen festgestellt. Bei der nicht radioaktiven Kontrolle (A ) erfolgte die Bebrütung ohne 32P oder sonstigen Zusatz. In gleicher Weise wurde bei der Strahlungs kontrolle (B ) verfahren, jedoch unmittelbar vor dem Einfrieren pro Volumen diejenige 32P-Menge zu gesetzt, welche in der RA-Kultur nach Waschen der Zellen pro Flüssigkeitsvolumen gemessen worden war. Die maximale Aktivität betrug dabei 0,015 mc/ml. Abgesehen von der im Vergleich zur Dauer des Gesamtversuches zu vernachlässigenden Bebrütungsperiode waren somit in B und in der RAK ultur die Zellen der gleichen Bestrahlungsdosis ausgesetzt. Dabei bleibt ohne Einfluß, ob sich die Zerfallszentren innerhalb der Bakterien oder im Kulturmedium befinden, da die mittlere Reichweite von /? -Teilchen ( max = 1,7 MeV) des 32P für die Dichte des Mediums bzw. der Zellen bei etwa 1 cm liegt. In einer dritten Kontrolle (C ) wurde vor Be brüten das gleiche Volumen 32P-Lösung wie in der RA-Kultur zugesetzt. Die Radioaktivität dieser L ö sung war nach 3/4-jähriger Aufbewahrung auf das 10~6-fache abgesunken. Die Kontrolle (C) diente damit der Prüfung etwaiger toxischer Wirkungen von Schwermetall-Beimengungen, die in früheren Untersuchungen in 32P-Lösungen gefunden worden ruht daher ausschließlich auf Zerfall von 32P-Atomen, die zuvor in die Molekularstruktur der Zelle eingebaut wurden. 2. M u t a g e n e W i r k u n g e n 32P - Z e r f a l l e s des waren2. W ie Tab. 4 für zwei repräsentative Versuche zeigt, konnte in keiner der drei Kontrollen auch bei Kom bination (Versuch IV) der Kontrollen (B) und (C) in einer Kultur eine signifikante Letalwirkung fest gestellt werden. Die Letalität in der RA-Kultur be Versuche mit Penicillin-Behandlung: In einem weiteren Versuch (spez. Aktivität = 16 mc/mg P) wurden nach 9,5-tägiger Aufbewahrung in flüssigem Stickstoff, während der die Zellen der RA-Kultur um einen Faktor von 1,2 -IO-3 abgetötet waren, Pro ben aufgetaut und je 104 überlebende Zellen/ml der RA-Kultur und Kontrollen in Nährm edium über impft. Dabei wurde die ursprüngliche 32P-Aktivität/ ml in der RA-Kultur 10 -fach und in den Kontrollen 103-fach verdünnt. Wegen des hohen Phosphor gehaltes des Nährmediums (ungefähr 150 ^g/m l) war die Verdünnung der spezifischen Aktivität (m C/mg P) etwa 200-fach stärker und damit eine letale oder mutagene W irkung während der weiteren Behandlung nicht mehr nachweisbar. Nach Bebrü tung bis zur Sättigung wurden die Zellen, um die Anzahl der Mutanten gegenüber den Prototrophen anzureichern, der Pencillin-Behandlung unterwor fen. Das Ergebnis (Tab. 5, Versuch I) zeigt, daß in Proben der RA-Kultur etwa 80-mal mehr Stoffwechsel-Mutanten enthalten waren, als in den Kon trollen. Zwei weitere Versuche (Tab. 5, Versuch II, I I I ) bestätigten diesen Befund qualitativ. Weiterhin ergab sich, daß die m it 32P gefütterten Zellen und die Kontrollen (A ) (C) zur Zeit = 0 im Rahmen der statistischen Schwankung die gleich niedrige A n zahl auxotropher Mutanten aufwiesen. M it zuneh mendem 32P-Zerfall stieg die Mutantenzahl unter den Zellen der RA-Kultur bei einer in der letzten Probe festgestellten Abtötung auf 5 * 10-3 (Versuch II) und 2,4 10~3 (Versuch I I I ) auf das 15- bis 17fache an. Währenddessen änderte sich jedoch in allen Kontrollen die Anzahl der Mutationen nicht signifikant. Die Behandlung m it Penicillin enthält schwer kontrollierbare experimentelle Schritte, die zum in dest eine quantitative Betrachtung der Ergebnisse unmöglich machen. Einm al durchlaufen die Zellen im Vollmedium ein Wachstum von mehr als 18 Generationen, bei dem merkliche Populations-Ver schiebungen zugunsten der Prototrophen auftreten 10 E. M. W i t k i n, Cold Spring Harbour Sympos. quantitat. Biol. 16, 357 [1951]. 11 E. M c F a l l, A. B. P a r d e e u. G. S. S t e n t, Biochim. biophy sica Acta [Amsterdam] 27, 282 [1958].

6 798 F. KAUDEW ITZ. W. VIELMETTER UND H. FRIEDRICH-FREKSA können. Zum anderen ist unbekannt, inwieweit die Abtötung durch Penicillin bestimmte Mutationstypen selektiv erfaßt. Ferner ist die Abtötung durch Penicillin stark von geringen Dosisunterschieden und dem Grad des vorherigen Aushungerns der Zellen abhängig. Die Vorversuche mit Penicillinbehandlung zeigen demnach nur. daß analog der Abtötung eine Erhöhung der Mutantenzahl ausschließlich durch intrazellulären 32P-Zerfall erfolgt. In weiteren Versuchen soll im folgenden daher bewiesen werden, daß die beobachtete Mutabilität allein durch den intrazellulären 32P-Zerfall hervorgerufen wird. Versuche ohne Penicillin-Behandlung: Um ohne Penicillin-Anreicherung genügend Mutanten finden zu können, kamen in den folgenden Versuchen bis zu 300 Platten pro Versuchspunkt, jeweils mit 100 bis 300 überlebenden Zellen beschickt, zum Einsatz. Vor dem Plattieren wurden die Zellen in Nährmedium gezüchtet, bis sie etwa drei Generationen durchlaufen hatten. Damit sollte eine etwaige Ausprägung :J2P-induzierter Mutationen überbrückt werden. Auf eine Kontrolle (A) wurde verzichtet und Kontrolle (B) und (C) in einer Kultur vereinigt. Die der RA- Kultur (spez. Aktivität = 10 mc/mg P) eines Versuches sind in Tab. 6 wiedergegeben. Bei einer Überlebensrate von 10-4 steigt die Anzahl der Mutanten von der Zeit t = 0 bis zum Versuchsende auf das 340-fache an. In der kombinierten Kontrolle (B und C) war der Wert für die Anzahl der Mutanten aus Zeit f = 0 identisch (0,2 10-4) mit dem der RA-Kultur und blieb bis zum Versuchsende unverändert. In einem zweiten, gleichartigen Versuch konnten bei Anwendung einer spezifischen Aktivität von 21 mc/mg P (Bebrütungsdauer 4,5 Stdn.) ein quantitativ vergleichbarer Anstieg der Mutanten gefunden werden. Entsprechend der höheren spezifischen Aktivität war die Überlebensrate 10~4 bereits nach 11 Tagen erreicht. Zu diesem Zeitpunkt wurden unter 2, Prototrophen 169 Mutanten gefunden. entsprechend dem Zahlenverhältnis 64/104 Mutanten/Prototrophe. Es gleicht nahezu vollständig dem entsprechenden Wert des vorangegangenen Versuchs (Tab. 6, Nr. 7). Zum Zeitpunkt t = 0 lagen zwei Mutanten innerhalb 1, Prototrophen vor ( = 1,3/104 Mutanten/Prototrophen), ein Wert, der etwas höher als der Vergleichswert des vorangegangenen Versuches liegt. Die Übereinstimmung der Ergebnisse beider Versuche ist aus Abb. 3 erkennbar, in welcher das Ergebnis des zweiten Versuchs sinngemäß eingefügt Abb. 3. Zunahme der Mutanten in Abhängigkeit vom 32P-Zerfall. O spez. Akt. 10 mc/mg P, spez. Akt. 21 mc/mg P. wurde: Unter Berücksichtigung der 2,1-fachen spezifischen Aktivität sind die Abszissen-Werte durch 2,1 dividiert (untere Abszissen-Skala). Das D iagramm zeigt ferner, daß der Anstieg der Mutanten sehr wahrscheinlich einer linearen Funktion folgt. Dieser Sachverhalt erlaubt die Kinetik der Mutationsauslösung analog zur Abtötungskinetik abzuhandeln. Es gilt analog Gl. (1) ln f l - M Z M ) = Km f, (4) Nr. Zeit [Tage] Anteil des zerfallenen 32p Anteil der überlebenden Zellen Anzahl der untersuchten Prototrophen X lo 4 Anzahl Mutanten Mutanten pro 104 Prototrophe 1 0,0 0,0 1,0 6,0 1 0,2 2 0,8 0,04 0,6 3,9 9 2,3 3 6,5 0,27 6, ,3 0,47 5, , ,0 0,66 9,2 IO ,5 0, , ,0 0,85 1,0 io-4 1, Tab. 6. Experimentelle Daten für die RA-Kultur von Versuch I ohne Penicillin-Behandlung.

7 799 MUTAGENE W IR K U N G DES ZERFALLS VON R A D IO A K T IV E M P H O SP H O R wobei M die Anzahl der Mutationen nach der Zeit t, M 0 die Mutationen zur Zeit t = 0, P die Anzahl der Prototrophen, K m den Zerfallsfaktor der NichtM utanten und / wieder den zerfallenen 32P-Anteil bedeuten. P und M 0 ^ M gilt Für M ln und daher (5) M = K m f. (6) Analog zu c (S. 795) ergibt sich nach Übergang von ln zu lg10 cm= 0,434 M P-A0-f (7) Aus den Werten der Abb. 3 errechnet sich für c t = 3, Ein Vergleidi mit den c-werten der Tab. 2 lehrt, daß die Auslösung einer durch un sere Methode erkennbaren Mutation durch ein zer fallendes 32P-Atom etwa 1,5'10*-fach seltener ist, als ein letaler Treßer. Durch die Untersuchungen von F u e r s t und S t e n t 4 konnte wahrscheinlich gemacht werden, daß die Abtötungswirkung des intrazellulären 32P-Zerfalls vor wiegend auf Treffern innerhalb der Desoxyribonucleinsäure (DNS) beruht. Bei einer Anzahl von / V = l,2 IO 7 Phosphor-Atomen pro DNS-Phosphor eines Bakterienkernes verursacht demnach jeder fünfzigste4 bzw. nach unseren Versuchen jeder drei ßigste Zerfall die Inaktivierung eines Bakterienker nes. W ird angenommen, daß auch die Mutations auslösung durch 32P-Zerfälle in der DN S erfolgt, so würde dies bedeuten, daß jeder 5 * 10x-te Zerfall die Auslösung einer durch die angewandte Versuchstech nik erkennbar werdenden auxotrophen Mutanten zur Folge hat. Ausschluß einer Mutanten-Anhäufung durch Se lektions-begünstigung: Die beschriebene Zunahme der Anzahl mutierter Zellen ist stets von der A b tötung eines wachsenden Prozentsatzes der übrigen Zellen begleitet. Hierdurch besteht die Möglichkeit, daß eine solche Zunahme nicht durch MutationsAuslösung sondern durch Selektion bereits vorhan dener Mutanten bewirkt wird. Dies könnte dadurch geschehen, daß in die RA-Kultur eingeschleppte Mutanten dort langsamer wachsen als die Prototro phen, somit auch weniger 32P aufnehmen und dem entsprechend in der Folge in geringerem Prozent satz abgetötet werden. Diese Möglichkeit mußte experimentell nachgeprüft werden. In einem Rekonstruktions-Experiment wurde ein Gemisch aus Prototrophen und Mutanten, die in den vorhergehenden Versuchen isoliert worden waren, in radioaktivem Tris-Medium (spezifische Aktivität l 6 m C /m gp ) 3,5 Stdn. bebrütet. Für das Gemisch kamen zur Auswahl: 3 H istidin. 2 A rginin. 1 Cystein-, 1 Cyst. -Meth._, 1 Methionin und 1 Tryp tophan^, Mutanten also, die besonders häufig auf getreten waren (vgl. Tab. 8 ) und dementsprechend hätten am stärksten einer Selektion unterworfen sein müssen. Dem Tris-Medium waren die Mangel substanzen Histidin, Arginin, Cystein + Methionin und Tryptophan zugesetzt. Die prozentuale Vertei lung der Typen wurde vor und nach der Bebrütung und nach 15 Tagen Aufenthalt in flüssigem Stickstoff durch Plattieren auf Nähragar und Stempeln auf verschiedene Minimal-Agarplatten m it Zusatz je einer der Mangel-Aminosäuren getestet. Das Ergeb nis (Tab. 7) zeigt, daß sich das prozentuale Verhält- Vor Bebrütung Anteil i2p zerfallen Zellen/ml Protrophe HistidinA rginincystein- un d MethioninTryptophan 0 Nach Bebrütung 0,08 Nach 15 Tagen in flüssig. N, 22,6 0,52 2, % 16,6 22,4 20,2 18,1 19,3 20,5 18,8 16,2 23,0 22,9 25,5 1,1 10«% 12,5 21,0 1,33-10«0/ /o 17,6 Tab. 7. Rekonstruktions-Experiment. Konstanz in der Zu sammensetzung eines Mutantengemisches bei Bebrütung in der RA-Kultur und folgender Aufbewahrung in flüssigem Stickstoff. nis der Mutanten untereinander und zu den Proto trophen während der Bebrütung als RA-Kultur (6 Generationen) und nach 15-tägiger Aufbewah rung in flüssigem Stickstoff (Abtötung 1,8 * 10~3) nur sehr geringfügig verschiebt. Dam it ist erwiesen, daß die Mutanten in gleicher Weise wie die Proto trophen abgetötet werden. Ferner geht aus dem Be fund hervor, daß sich die Mutanten nach Zugabe ihrer Mangelsubstanzen in Tris-Medium m it fast gleicher Geschwindigkeit wie die Prototrophen ver mehren. Im ersten Experiment ohne Penicillin-Behandlung (S. 798) waren dem Tris-Medium keine Mangelsub stanzen. im zweiten Experiment (S. 798) dagegen alle

8 800 F. KAUDEW ITZ. W. VIELMETTER UND H. FRIEDRICH-FREKSA Versuch I I I spez. Akt. [mc/mgp] Versuchspunkt Nr Tage in flüss. Stickstoff 0 0,8 13,3 28,5 28,5 38,0 0 11,2 Generationen Wachstum zwischen Auftauen und Plattieren Nicotinsäuream id 5 _ Pyridoxin Adenin _ 2 Adenin oder Guanin Guanin Cytosin oder Uracil Thymin 1 1 i Glycin Glycin oder Serin Serin _ Lysin Leucin Isoleucin oder Valin Valin Arginin H istidin _ 6 Prolin Prolin od. Glutaminsäure 1 4 _ Glutaminsäure Asparaginsäure 1 2 Threonin Cystein Cystein oder Methionin _ 6 Methionin Phenylalanin 3 i 2 Phenylalanin od. Tyrosin 1 1 Tryptophan Aromaten nicht näher analysiert Tab. 8. In Versuchen ohne Penicillin-Behandlung gefundene Mutantentypen. in Tab. 1 aufgeführten Mangelsubstanzen außer den phosphorhaltigen Vitaminen zugesetzt. Da das Ergebnis beider Experimente gut übereinstimmt, darf geschlossen werden, daß der Zuwachs der Mutanten nicht durch Selektion, sondern allein durch M utations-auslösung bewirkt wird. Das Mutanten-Spektrum nach 32P-Zerfall Bei den Versuchen ohne Penicillin-Behandlung konnten unter rund 800 isolierten Mutanten 57 verschiedene Stoffwechsel-Mangeltypen unterschieden werden. Eine Übersicht der verschiedenen Typen ist in Tab. 8 zusammengestellt. Unter die als nicht näher analysiert summarisch zusammengefaßten Mutanten fallen 27 Typen, deren jede durch mehrere voneinander verschiedene Wuchsstoff-Zusammenstellungen (Tab. 1) zum Wachsen veranlaßt werden konnte, des weiteren solche, die entweder auf keiner der in Tab. 1 aufgeführten Gruppen, oder auf allen Gruppen gleichmäßig sehr langsam wuchsen. Die Analyse der Tryptophan -Mutanten ergab, daß diese hinsichtlich ihrer Wachstumseigenschaften in 5 verschiedene Untergruppen aufzuspalten sind. Die unter den Mutanten tatsächlich vorhandene A n zahl der sich durch die Lage ihres genetisch bedingten Blockes einer bestimmten Synthesekette unterscheidenden Mutanten ist daher sicher weit höher als die Anzahl der oben genannten Stoffwechseltypen. Eine weitere Differenzierung der Mutanten, die einen Beweis für ihr unabhängiges Entstehen liefern könnte, müßte durch genetische Analyse erfolgen, die jedoch mit dem B/r-Stamm nur schwer durchgeführt werden kann. Das Typenspektrum folgt im wesentlichen einer Häufigkeitsverteilung, wie sie bei Isolation spon-

9 M U TAGENE W IR K U N G DES ZERFA LL S VON RA D IO A K T IV EM PH O SPH O R taner oder durch uv-induzierter Mutanten erhalten wird. Hier wie dort treten besonders häufig nach 32PBehandlung Mangelmutanten für schwefelhaltige Aminosäuren und Histidin-Mutanten auf. Ausnah men dagegen bilden der spontan und nach UVBestrahlung relativ seltene Arginin~-Typ und der als Spontanmutante häufig isolierte Glycin-Serin Typ. Der erstere ist nach 32P-Einbau unverhältnis mäßig häufig, der letztere dagegen überraschend selten. Sektorierte Kolonien In dem durch Tab. 6 wiedergegebenen Versuch wurden bei Nr. 6 Proben in der schon beschriebenen Weise nach dem Auftauen während dreier Zellgene rationen bebrütet (I ), aber auch gleichzeitig solche ohne Bebrütung unmittelbar nach dem Auftauen plattiert ( I I ). Die relative Anzahl der für II gefundenen auxotrophen Kolonien gleicht mit 215/3,5 104 Mutanten/Prototrophe innerhalb der Fehlergrenzen derjenigen nach vorheriger Bebrü tung. A uf den Platten von II, also nach direkter Plattierung, wiesen etwa 40% aller auxotrophen Kolonien Sektoren auf, die aus prototrophen Zellen bestanden. Sie wurden bei Stempeln dieser Kolonien auf Minimal-Medium sichtbar. In einem zweiten gleichartigen Versuch wurden 50% sektorierte K olo nien gefunden. 30% davon bestanden aus je einem prototrophen und auxotrophen Halbsektor (Abb. 4*). Die auxotrophen Anteile der übrigen dagegen waren kleiner oder größer als die Hälfte der jeweiligen Kolonie. Gelegentlich traten Zwillingssektoren oder noch stärker aufgeteilte Sektorenbezirke auf. Die vorliegenden Versuche erlauben keine Aussage über derartige Abweichungen vom Halbsektortyp. In allen Proben, die zwischen Auftauen und Plattieren 3 Zellgenerationen durchliefen ( I ), wurden bei einer Gesamtzahl von 438 beobachteten auxotrophen M u tanten nur 2 sektorierende Kolonien gefunden. Die Ursache für die Sektorenbildung verschwindet damit wenige Zellgenerationen nach Auftauen und da mit wie unten dargelegt nach Stattfinden des zur Mutation führenden Ereignisses. Sektorenbildung innerhalb einer Kolonie, die aus einer Zelle entstand, kann verschiedene Ursachen haben: 1. Findet die Mutation in einem von zwei Kernen einer Bakterienzelle statt, so führt deren Degeneration in der folgenden Zellteilung zu zwei genetisch verschiedenen Tochterzellen, deren eine * Abb. 4 s. Tafel S. 812 a. 801 auxotroph, die andere prototroph ist. Die daraus hervorgehende gemeinsame Kolonie wird dann je einen auxotrophen und prototrophen Sektor auf weisen. Arbeiten von W i t k i n 10 haben an bestimm ten Beispielen eine solche Kernsegregation als U r sache der Sektorenbildung wahrscheinlich gemacht. Im vorliegenden Falle kann ein solcher Typ der Sektorenbildung ausgeschlossen werden. Im Augen blick des Einfrierens nach beendeter 32P-Markierung wiesen die Zellen maximal 2 Kerne auf. M it einer Überlebensrate von 10~4 überstanden sie die W ir kung des 32P-Zerfalls. Das bedeutet, daß in jeweils 104 Zellen nur ein einziger Kern nicht inaktiviert wurde, d. h. die überlebende Zellpopulation ist ein kernig. Zweikernige Zellen werden nur noch mit einer Wahrscheinlichkeit von 10~4 angetroffen. Es sind aber nicht sehr wenige, sondern rund 50% aller auxotrophen Zellen enthaltenden Kolonien sektoriert. Solche Kolonien gehen damit auf Zellen zurück, welche im Augenblick des Auftauens nur einen nicht inaktivierten Kern beherbergten. Segregation zweier genetisch verschiedener Kerne einer Zelle als Ursache der Sektorenbildung ist damit ausgeschlossen. Sie muß vielmehr auf bestimmte Zustände zurückgeführt werden, welche jeweils in einem, und zwar dem ein zigen Kern einer Zelle vorliegen. D afür bieten sich in der Hauptsache zwei grund sätzlich verschiedene Möglichkeiten an. 1. Bei der verzögerten Manifestation des mutier ten Zustandes führt das mutative Ereignis zur B il dung einer potentiell mutierten Zelle. Überdauert der instabile Zustand mit einer gegebenen W a h r scheinlichkeit die erste Zellteilung, so können aus einer solchen Zelle zwei potentiell mutierte Tochter zellen hervorgehen. Manifestiert sich die Mutation nur in einer von ihnen, so entstünden zwei genetisch verschiedene Tochterzellen und aus ihnen eine aus zwei Halbsektoren aufgebaute Kolonie. Eine weitere Möglichkeit läge in der linearen Weitergabe zur Manifestation des durch Mutation neu auftretenden auxotrophen Zustandes an nur eine von zwei Schwe sterzellen, wie sie bei der Mutanten lys. 1 von Sal monella typhimurium beobachtet w urde Segregation zweier in einem Kern befindli chen a) homologen oder b) zueinander sich wie Po sitiv und Negativ verhaltender, die genetische In formation tragender Einheiten. Für a könnten diese vergleichbar den für A. proteus wahrscheinlich ge machten1,2 Einheiten gedacht werden. Für b könnte 12 F. K a u d e w it z, Z. Naturforsehg. 10 b, 562 [1955],

10 802 MUTAGENE W IRKUNG DES ZERFALLS VON RADIOAKTIVEM PHOSPHOR jeweils einer der beiden DNS-Stränge des Watson- Crick- Modelles in Frage kommen. Die Mutation als Folge des Zerfalles eines 32P-Atoms würde dann nur in einem der beiden komplementären Stränge vor sich gehen. In der nachfolgenden identischen Duplikation entstünden dann zwei Doppelstränge, wobei das eine Paar der Fadenmoleküle in jedem der beiden Fäden mutiert, das andere Fadenpaar dagegen nicht mutiert wäre und damit die Wildtyp- Konfiguration aufwiese. Diskussion der Ergebnisse Das Ziel vorliegender Untersuchungen war die Beantwortung der Frage, ob der radioaktive Zerfall von 32P-Atomen nach deren Einbau in die lebende Substanz von Bakterienzellen unter Ausschluß der Wirkung, der dabei auftretenden /^-Strahlung zu Mutationen führt. Die Versuchsergebnisse zeigen eindeutig, daß dies zutrifft. Sie beweisen, daß unter den gegebenen Versuchsbedingungen die mutative ebenso wie die kern-inaktivierende (abtötende) Wirkung der auf tretenden /^-Strahlung auf Grund der niedrigen Dosierung experimentell überhaupt nicht nachweisbar wird. Dagegen treten beträchtliche mutative und kern-inaktivierende Einflüsse der Elementumsetzung der 32P- in 32S-Atome auf. Dabei beweisen die beschriebenen Rekonstruktions-Versuche, daß die Akkumulation von Mutanten nicht auf positive Selektion bereits vorher vorhandener mutierter Zellen während der zur 32P-Aufnahme notwendigen Zellvermehrung zurückgeht. Ursache der Mutationen ist vielmehr die radioaktive Umsetzung des eingebauten 32P. Dies wird weiterhin durch das häufige Auftreten sektorierter Kolonien bewiesen. Zellen, aus denen solche Kolonien entstehen, besitzen in ihrem Genom nebeneinander prototrophe und auxotrophe Charaktere des gleichen Allels, die nach spätestens 2 3 Zellgenerationen durch Segregation voneinander getrennt sind (vgl. S. 801). Dementsprechend können die Mutationsereignisse in diesen Zellen höchstens in den letzten beiden Generationen des Wachstums in der RA-Kultur stattgefunden haben. Davor waren aber bereits 4 5 Generationen Zellwachstum in der RA-Kultur durchlaufen worden, wobei die Zellen 32P aufgenommen hatten. Aus auf S. 799 erörterten Gründen ist damit ein weiteres Argument geliefert, das eine positive Selektion der Mutanten streng ausschließt. In den vorliegenden Untersuchungen bleibt die Frage unberührt, ob solche mutativen Wirkungen nur dann bei 32P-Zerfall auftreten, wenn dieser in die DNS der Zelle eingebaut wurde. Untersuchungen von S t e n t und F u e r s t 4 können in diesem Zusammenhang zu Aanalogieschlüssen herangezogen werden. Die Autoren wiesen nach, daß die Kerninaktivierung nach 32P-Einbau bei E. coli nur dann auftritt, wenn sich dieser in der DNS der Zelle befindet. Wie die vorliegenden Untersuchungen zeigen, weisen Kern-Inaktivierung und Mutations-Auslösung durch radioaktiv zerfallende in die Zelle eingebaute 32P-Atome die gleiche Kinetik auf. Die Annahme ist naheliegend, daß auch die Mutations-Auslösung nur nach vorherigem Einbau des 32P in die zelluläre DNS erfolgt.