Belastungsprofile in Nanopartikel und Nanotubes herstellenden und bearbeitenden Industriebranchen sowie Auswirkungen auf menschliche Zellen

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1 REPORT NR. 58 Nanotechnologie Belastungsprofile in Nanopartikel und Nanotubes herstellenden und bearbeitenden Industriebranchen sowie Auswirkungen auf menschliche Zellen Ein Forschungsprojekt der Seibersdorf Labor GmbH im Auftrag der Allgemeinen Unfallversicherungsanstalt

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4 INHALTSVERZEICHNIS BELASTUNGSPROFILE IN NANOPARTIKEL, NANOTUBES HERSTELLENDEN UND BEARBEITENDEN INDUSTRIEBRANCHEN.4 AUSWIRKUNGEN AUF MENSCHLICHE ZELLEN ZIELSETZUNG DES PROJEKTES ZUSAMMENFASSUNG PHASE PHASE MATERIAL UND METHODEN ZELLKULTUR Medien Zelllinien CoKultivierung EXPOSITION Partikelgenerator Aerosolgenerator Herstellerfirma MULTIWALLED CARBON NANOTUBES UNTERSUCHUNGEN DER MITOCHONDRIALEN AKTIVITÄT MIT DEM WST1 ASSAY DIHYDRORHODAMIN ASSAY ZUM NACHWEIS OXIDATIVER RADIKALE MESSUNG VON PROINFLAMMATORISCHEN ZYTOKINEN FlowCytomix Assay (BenderMed Systems; Human Th1/Th2 11plex Kit) CBA Assay (BD TM Cytometric Bead Array Human Inflammation Kit) COMETASSAY ZUM NACHWEIS VON DNASCHÄDIGUNGEN Messungen durch die ÖSBS Probenahmegeräte Probenträger Auswerteverfahren ERGEBNISSE ZELLVIABILITÄT Modellexposition mittels Partikelgenerator Arbeitsplatzexposition bei der Herstellerfirma Exposition mittels Aerosolgenerator OXIDATIVER STRESS Modellexposition mittels Partikelgenerator Arbeitsplatzexposition bei der Herstellerfirma Exposition mittels Aerosolgenerator PRODUKTION PROINFLAMMATORISCHER ZYTOKINE COMETASSAY MESSUNGEN DURCH DIE ÖSBS INTERPRETATION DER ERGEBNISSE LITERATUR

5 BELASTUNGSPROFILE IN NANOPARTIKEL, NANOTUBES HERSTELLENDEN UND BEARBEITENDEN INDUSTRIEBRANCHEN Als Nanopartikel wird der Verbund von wenigen bis einigen tausend Atomen oder Molekülen bezeichnet. Der Name bezieht sich auf ihre Größe, die bei 1 bis 100 Nanometern liegt. Nanopartikel können sowohl auf natürlichem Wege als auch durch anthropogene Einflüsse, wie Kfz und Industrieabgase, in die Umwelt gelangen. Im Gegensatz dazu sind synthetische Nanopartikel künstlich hergestellte Teilchen, die gezielt mit neuen Eigenschaften und Funktionalitäten ausgestattet sind, wie z. B. elektrische Leitfähigkeit oder chemische Reaktivität. Synthetische Nanopartikel können entsprechend ihrer chemischen und physikalischen Eigenschaften untergliedert werden und sind in Tabelle 1 gemäß ihrer spezifischen Eigenschaften und ihrer aktuellen Verwendung aufgelistet. Das hohe Nutzpotenzial hat einen drastischen Anstieg in Herstellung und Anwendung der unterschiedlichsten Arten von Nanopartikeln zur Folge, doch es eröffnet sich auch ein breites Spektrum an möglichen Gefahren für uns und unsere Umwelt. Nanopartikel können auf Grund ihrer Größe über die Haut, die Atemwege und über den MagenDarmTrakt in den Körper aufgenommen werden und verteilen sich dort über den Blutkreislauf im gesamten Organismus. Die Ablagerung von Nanopartikeln in bestimmten Geweben und Organen und deren potenzielle Fähigkeit Radikale zu bilden kann zu akuten Zell und Organschäden führen. Der Kontakt mit synthetischen Nanopartikeln erfolgt entweder über die Verwendung nanopartikelhältiger Produkte (z. B. Sonnencreme, Farben und Lacke, usw.) oder durch Exposition bei deren Herstellung. Dies kann entweder auf Grund von Unfällen oder mangelnder Sicherheitsvorschriften geschehen. Die Gefahr des Eintrags von Nanopartikeln in die Natur und somit in die Nahrungskette birgt Risiken für alle Lebewesen. Die Partikelbelastung ist auf Grund des hohen Sicherheitsstandards (Geräte sind hinter Abschirmungen verborgen, Nanomaterial wird in Suspension verwendet usw.) sehr gering, weswegen keine Risikostratifizierung durchgeführt wurde. 3

6 Tabelle 1: Überblick über verschiedene Nanopartikel, deren Eigenschaften und ihre aktuelle Verwendung. Nanopartikel Spezifischen Eigenschaften Anwendungsbeispiele Titandioxid Nanopartikel Silber Nanopartikel Kohlenstoff Nanoobjekte SWCNT MWCNT Fullerene Siliziumdioxid Nanopartikel Zinkoxid Nanopartikel Ceroxid Nanopartikel Aluminium Nanopartikel Ton Nanopartikel Keramik Nanomaterial Nanoskalige Mizellen Wasserabweisend, schmutzabweisend, selbstreinigend, UVSchutz UVSchutz Farbstoff Antimikrobielle Wirkung Hemmung der Geruchsentwicklung Struktur verstärkende Wirkung Quanteneffekte Antioxidanzien Verbesserung der Rieselfähigkeit und Sämigkeit, verringerte Haftfähigkeit Abnutzungsbeständigkeit Stabilität, Isolation, hohe Dichte, geringes Gewicht, Altersbeständigkeit, Feuerfestigkeit, Öl und Wasserabweisende Beschichtungen, Selbstreinigung UVSchutz Erhöhte Verbrennungseffizienz, Senkung der Schadstoffbildung Träger für Edelmetalle Oberflächenversiegelung Oberflächenveredelung Hohe Dichte Stabilitäts und Geschmacks Erhaltung Kratzfestigkeit, Glanzeffekt, Stabilität erleichterte Resorption Baumaterial, Holzfarben und Lacke, Reinigungsmittel Kosmetika, Sonnenschutzpräparate, Textilien Nahrungsmittel Wundpflaster, Verbandsmaterial, Kosmetika Crèmes und Zahnpasten, KlimaanlagenFilter, Kühlschränke, Luftreinigungssprays, Staubsauger, Textilien, Waschmaschinen Carbon Black in Autoreifen Nanotubes in Sportartikeln Knochenaufbau und Knochenverstärkung nach Frakturen, orthopädische Implantate Prozessoren, Speichereinheiten Fullerene in Kosmetika und als Medikamententräger Lebensmittel Textilien Baumaterialien, Füllmaterialien Beschichtete Glasfenster, Anti GraffitiAnstrich, Versiegelungen, Imprägnierungen Sonnenschutzpräparate Dieselmotoren, Katalysatoren Abgaskatalysatoren Putzmittel Sanitärkeramik gas und feuchtigkeitsdichte Folien Bierfässer Sanitärbereich, Autolackierungen, Baumaterial Lebensmittel, Nahrungsergänzungsmittel 4

7 AUSWIRKUNGEN AUF MENSCHLICHE ZELLEN 1 ZIELSETZUNG DES PROJEKTES Ziel des vorliegenden Projektes ist die Erweiterung des etablierten Testsystems zur Erfassung möglicher toxischer Belastungen durch partikelhältige Atemluft am Arbeitsplatz. Hierzu kommt die Expositionseinrichtung CULTEX zum Einsatz, die es erlaubt, Zellkulturen anzulegen, die von der Unterseite aus permanent mit Nährstoffen versorgt werden, während die aerosolhältige Atmosphäre über die Oberfläche der Kulturen geführt wird. Die Zuleitungen der Arbeitsplatzatmosphäre zu dem Zellkultursystem erfolgen in Parallelschaltung zum Scanning Mobility Particle Sizer (SMPS). Als Untersuchungsmaterial werden folgende menschliche Zelllinien verwendet: CoKulturen aus Lungenepithelzellen (A549) und immunologisch kompetenten Zellen (U937). Das Projekt gliedert sich in 2 Phasen Phase 1 in house: Exposition der Zellen mit Partikeln, die in ihrer Menge, Größe und Art genau definiert sind. Phase 2 am Arbeitsplatz: 4 Messungen bei einer Nanotubesproduzierenden Firma 4 Expositionen mit Material denselben Firma mittels Aerosolgenerator, da sich die Anlage länger als geplant im Umbau befindet. 5

8 2 ZUSAMMENFASSUNG 2.1 PHASE 1 Um Expositionen an Zellen mit Partikeln, die in ihrer Menge, Größe und Art genau definiert sind durchführen zu können wurde die Expositionseinrichtung um einen Partikelgenerator erweitert. In Folge wurden uns für die Experimente der Phase 1 zwei verschiedene Carbon Nanotubes Proben von der Herstellerfirma zur Verfügung gestellt. Die Nanotubes wurden in 2 verschiedenen Versuchsansätzen getestet: Exposition in Suspension im Brutschrank (BS) Exposition mit Partikelgenerator in der Expositionseinrichtung CULTEX 2.2 PHASE 2 Ein wichtiges Kriterium für die Auswahl einer geeigneten Firma in der Messungen in Phase 2 durchgeführt werden können war die sehr aktuellen Thematik, aber auch die Nähe zur Seibersdorf Labor GmbH, da mit lebenden Zellen gearbeitet wird. Aus diesen Gründen wurden die Messungen in Phase 2 bei einer naheliegenden Herstellerfirma von Multiwalled Carbon Nanotubes (MWCNTs) durchgeführt. Da sich die Anlage länger als geplant im Umbau befindet konnten nur 4 der geplanten 8 Messungen bei der Herstellerfirma durchgeführt werden. Weitere 4 Messungen wurden mit Material der Herstellerfirma mittels Aerosolgenerator durchgeführt. Der Aerosolgenerator hat gegenüber dem Partikelgenerator den Vorteil, dass die zu Agglomeraten neigenden Nanotubes gleichmäßiger ohne Klumpenbildung zerstäubt werden können. Eine Übersicht über alle Durchgeführten Expositionen ist in Tabelle 2 zu finden. 6

9 Tabelle 2: Übersicht über alle Versuche Versuch Expositionsart untersuchte Parameter Ergebnisse 1 BS NT1 + NT2 Zytokine / 2 BS NT1 + NT2 Zytokine / 3 BS NT1 + NT2 Zellviabilität Zytokine + +/ 4 BS NT2 Zellviabilität Oxidativer Burst Zytokine +/ 5 Partikelgenerator NT1 + NT2 Zellviabilität Zytokine + 6 Partikelgenerator NT1 Zellviabilität Zytokine +/ 7 Partikelgenerator NT1 Zellviabilität Oxidativer Burst Zytokine Partikelgenerator NT2 Zellviabilität Oxidativer Burst Zytokine 9 Partikelgenerator NT1 Zellviabilität Oxidativer Burst Zytokine + +/ 10 Partikelgenerator NT2 Zytokine 7

10 11 Herstellerfirma Einschaufeln Zellviabilität Oxidativer Burst Zytokine +/ 12 Herstellerfirma Betrieb Trockenofen Zellviabilität Oxidativer Burst Zytokine 13 Herstellerfirma Einschaufeln Zellviabilität Oxidativer Burst Zytokine + 14 Herstellerfirma Betrieb Trockenofen Zellviabilität Oxidativer Burst Zytokine 15 Aerosolgenerator NT3 Zellviabilität Oxidativer Burst COMETAssay Aerosolgenerator NT4 Zellviabilität Oxidativer Burst COMETAssay +/ 17 Aerosolgenerator NT3 Zellviabilität Oxidativer Burst COMETAssay + 18 Aerosolgenerator NT4 Zellviabilität Oxidativer Burst COMETAssay 8

11 3 MATERIAL UND METHODEN 3.1 ZELLKULTUR Medien Komplettmedium o RPMI 1640 mit LGlutamine o 10 % fötales Kälberserum o 1 mm Natriumpyruvat o 10 mm Hepes o 1 % Penicillin/Streptomycin Expositionsmedium o RPMI 1640 mit LGlutamine o 10 % fötales Kälberserum o 1 mm Natriumpyruvat o 25 mm Hepes o 1 % Penicillin/Streptomycin o 0,2 % Normocin o 0,1 % Gentamicin Zelllinien A549 Zellen A549 Zellen sind eine permanent wachsende Zelllinie, die aus einem menschlichen Lungenkarzinom gewonnen wurde. Für das vorliegende Projekt wurden die Zellen von Promochem, ATCC Katalog Nr. CCL185, bezogen. Für die Stammhaltung wurden die Zellen in einer Dichte von 1,2 x 10 4 Zellen / cm 2 kultiviert U937 Zellen Diese Zelllinie ist eine in Suspension wachsende histiozytische LymphomaLinie (Promochem, ATCC Katalog Nr. CRL1593.2). Für die Stammhaltung wurden die Zellen in einer Dichte von 0.7 x 10 5 Zellen / ml kultiviert. Gewinnung von Makrophagenähnlichen Zellen: Unter der Einwirkung von PhorbolmyristatAcetat (PMA) differenzieren U937 Zellen zu phagozytierenden, makrophagenähnlichen Zellen aus. Als optimal erwies sich eine 2472 h dauernde Behandlung mit 60 ng/ml PMA CoKultivierung Es wurden zwei Varianten von CoKulturen verwendet. 9

12 Variante 1 Zur Züchtung von Makrophagen wurden U937 Zellen in einer Konzentration von 2 x 10 5 Zellen / ml auf Inserts ausgesät und mit 60 ng/ml PMA für 24 h behandelt. Dadurch konnte eine Enddifferenzierung dieser Zellen zu funktionsfähigen Makrophagen induziert werden. Nach der Exposition wurden die makrophagenähnlichen Zellen in die mit A549 Zellen bewachsenen Kulturplatten transferiert (siehe Abbildung 1). makrophagen ähnliche U937 Membran A549 Abbildung 1: Variante1: Schematische Darstellung der Zellkulturplatte mit einem Insert, das von Zellen bewachsen ist Variante 2 Zur Züchtung von Makrophagen wurden U937 Zellen in einer Konzentration von 2 x 10 5 Zellen / ml in 6 well Platten ausgesät und mit 60 ng/ml PMA für 24 h behandelt. Dadurch konnte eine Enddifferenzierung dieser Zellen zu funktionsfähigen Makrophagen induziert werden. Durch Trypsinbehandlung wurden die Zellen von der Kulturplatte abgelöst und am Vortag des Expositionsexperiments in der Dichte von 5 x 10 5 Zellen / ml auf mit A549 subkonfluenten bewachsenen Kulturinserts pipettiert (siehe Abbildung 2). makrophagen ähnliche U937 A549 Medium Membran Abbildung 2: Variante 2: Schematische Darstellung der Zellkulturplatte mit einem Insert, das von Zellen bewachsen ist. 10

13 3.2 EXPOSITION Die Expositionen erfolgten entweder mittels Partikelgenerator, direkt bei der Herstellerfirma oder mittels Aerosolgenerator mit vorher beschriebenen Zellkulturen und dem unter Abbildung 3 dargestellten Versuchsaufbau. Variante 1 oder Variante 2 Abbildung 3: Expositionsaufbau. 11

14 3.2.1 Partikelgenerator Modell: PALAS Feststoffdispergierer, RGB1000 Einstellungen: Vorschub: mm/h Bürstenrotation: 1200 Upm Strömungsgeschwindigkeit: 1 m 3 /h Abbildung 4: PALAS Feststoffdispergierer, RGB Aerosolgenerator Modell: AGF 2.0 Einstellungen: Vordruck: 2 bar MWCNTs suspendiert in destilliertem Wasser, Trockenstrecke Abbildung 5: Versuchsaufbau mit Aerosolgenerator AGF 2.0 und SMPS Herstellerfirma Expositionsdauer: max. 2 Stunden / Tag 12

15 Vorhandene Staubschutzmaßnahmen: Die Halle verfügt über ein Umluftsystem. Beim Einschaufeln trägt der Arbeitnehmer eine partikelfiltrierende Halbmaske, Typ P1. Untersuchte Gefahrenstoffe: Einatembarer Staub, Alveolengängiger Staub, elementarer Kohlenstoff, ultrafeine Partikel. Arbeitsvorgang: In einem Drehrohrofen werden CarbonNanotubes in einem kontinuierlichen Prozess hergestellt und in Metallbehälter abgefüllt. Ein Mitarbeiter ist mit der Betreuung und Wartung sowie mit dem weiteren prozesstechnischen Ablauf (händisches Manipulieren des Materials, Bedienen des Trockenofens, etc.) beschäftigt. Weitere Tätigkeiten des Mitarbeiters: Materialdisposition, Sichtkontrolle, Reinigung. Abbildung 6: Versuchsaufbau bei der Herstellerfirma. Links: Einschaufeln, rechts: Maschine mit Einhausung. 3.3 MULTIWALLED CARBON NANOTUBES Die Herstellerfirma produziert mittels eines voll kontinuierlichen CCVDVerfahrens Multiwalled Carbon Nanotubes und arbeitet diese in polymere Matrixmaterialien ein. Uns wurden für Versuche mit dem Partikel bzw. Aerosolgenerator folgende Fasern mit einer Spez. Oberfläche von m 2 /g und einem mittlerer Filamentdurchmesser von zur Verfügung gestellt: Probe 1 (NT1): gereinigte MWCNT, CGehalt > 95 Gew.%. Probe 2 (NT2): MWCNT as grown, CGehalt 3040 Gew.%. Probe 3 (NT3): gereinigte MWCNT Probe 4 (NT4): MWCNT as grown 13

16 3.4 UNTERSUCHUNGEN DER MITOCHONDRIALEN AKTIVITÄT MIT DEM WST1 ASSAY Der Assay beruht auf der Bildung von Formazan aus dem Tetrazoliumsalz WST1 durch mitochondriale Dehydrogenasen Durchführung: Die Inserts wurden mit PBS gewaschen, die Zellen trypsiniert und die Zellzahl auf 2 x 10 5 eingestellt. Je 100 µl Zellsuspension wurden auf einer 96well Platte mit 10 µl WST1 versetzt. Als Blank diente nur Medium + WST1. Die Platten wurden bei 37 C für mindestens 30 Minuten inkubiert und anschließend bei 450 und 630 im Plattenreader gemessen. 3.5 DIHYDRORHODAMIN ASSAY ZUM NACHWEIS OXIDATIVER RADIKALE Der durch Radikale ausgelöste oxidative burst von Zellen kann durch die Oxidation des fluorogenen Substrates Dihydrorhodamin zu Rhodamin durchflusszytometrisch bestimmt werden. Durchführung: Die Inserts wurden mit PBS gewaschen, die Zellen trypsiniert und die Zellzahl auf 2 x 10 5 eingestellt. 2 x 10 5 Zellen wurden auf je 2 PPMessröhrchen aufgeteilt, zentrifugiert und in 100 µl PBS resuspendiert. Nach Zugabe von Dihydrorhodamin wurde je ein Ansatz auf 37 C und einer im Eisbad für 20 min inkubiert. Danach wurde mit PBS gewaschen und die durchflusszytometrische Analyse durchgeführt 3.6 MESSUNG VON PROINFLAMMATORISCHEN ZYTOKINEN FlowCytomix Assay (BenderMed Systems; Human Th1/Th2 11plex Kit) Dieser Kit ermöglicht die Bestimmung der Zytokine IFNγ, IL1β, IL2, IL4, IL5, IL6, IL8, IL10, IL12p70, TNFα und TNFβ. Der Kit enthält 11 Bead Populationen, die mit primären Antikörpern gegen diese Zytokine konjugiert sind (Bead mixture; capture antibody). Die Beads können anhand ihrer Größe und Fluoreszenz unterschieden werden. Ein sekundärer Biotinkonjugierter Antikörper (BiotinConjugate) wird zugesetzt, welcher die Zytokine, gebunden an den primären Antikörper spezifisch bindet. Zur Detektion wird Streptavidin Phycoerythrin, welches an die BiotinKonjugate bindet zugesetzt. Durchführung: Die Durchführung erfolgte in einer 96well Platte. 25 µl Probe bzw. Standard, 25 µl Bead mixture und 50 µl BiotinConjugate wurden gemischt, 2 h bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Nach dem Waschen wurden 50 µl StreptavidinPE zugesetzt und 1 h bei 14

17 Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Nach erneutem Waschen wurde die durchflusszytometrischen Analyse durchgeführt. Durch eine entsprechende Software (BenderMedSystems) wurden die Konzentrationen der Zytokine in den Proben ermittelt CBA Assay (BD TM Cytometric Bead Array Human Inflammation Kit) Dieser Kit ermöglicht die Bestimmung der proinflammatorischen Marker IL1 ß, IL6, IL8, IL10, IL12 und TNFα. Er enthält 6 Bead Populationen, die mit primären Antikörpern gegen diese Zytokine konjugiert sind (=Capture Beads) und diskrete Fluoreszenzen zeigen, sodass sie durchflusszytometrisch detektiert werden können. Nach Bindung der spezifischen Zytokine wird ein sekundärer Antikörper (=PEDetection reagent) zugesetzt, dessen Fluoreszenz ein Maß für die Menge des in der Lösung vorhandenen Zytokine darstellt. Durchführung: 50 µl Probe bzw. Standard, 50 µl Capture Beads und 50 µl Detection Reagent wurden gemischt, 3 h bei Raumtemperatur inkubiert, gewaschen und der durchflusszytometrischen Analyse zugeführt. Durch eine entsprechende Software (BectonDickinson) wurden die Konzentrationen der Zytokine in den Proben ermittelt. 3.7 COMETASSAY ZUM NACHWEIS VON DNASCHÄDIGUNGEN Der COMETAssay ist eine elektrophoretische Technik, die es erlaubt, DNASchädigungen in einzelnen Zellen zu detektieren. Entwickelt wurde der Assay 1984 von Östling und Johanson [1] zum Nachweis von DNADoppelstrangbrüchen. Mit der Weiterentwicklung durch Singh im Jahre 1988 [2], konnten durch die Verwendung von basischen Puffern zusätzlich auch DNAEinzelstrangbrüche detektiert werden. Das Prinzip des COMETAssays beruht darauf, dass Zellen in Agarose eingebettet, lysiert und einem elektrischen Feld ausgesetzt werden. Während der Elektrophorese trennen sich hierbei DNAFragmente ihrer Größe nach auf, bzw. wandern im elektrischen Feld [3]. Nur geschädigte bzw. fragmentierte DNA ist hier in der Lage aus dem Kernverband herauszuwandern. So bildet sich eine Form, die unter dem Mikroskop wie ein Komet erscheint und der Technik ihren Namen gegeben hat (siehe Abbildung 7 und Abbildung 8. Die DNA wird mit Fluoreszenzfarbstoffen wie Ethidiumbromid, SyberGreen oder DAPI angefärbt und hinsichtlich der Kometgröße und Ausdehnung unter dem Fluoreszenzmikroskop bewertet. 15

18 Abbildung 7: Beispiel für eine ungeschädigte Zelle. Abbildung 8: Beispiel für eine Zelle mit geschädigter DNA (Kometbildung). Durchführung: Die Inserts wurden mit PBS gewaschen, die Zellen trypsiniert und die Zellzahl auf 3 x 10 6 Zellen / ml eingestellt. 40 µl der Zellsuspension wurden mit 0,5 %iger Low Melting Point Agarose gemischt, auf einen Objektträger mit getrockneter 1,5 %iger Agaroselösung pipettiert und mindestens 10 min gekühlt. Nach der Lyse (1 h, 4 C) wurde die Elektrophorese (300mA, 0,96 V/cm, 20 min, 4 C, dunkel) durchgeführt. Anschließend wurden die Objektträger für 10 min bei Raumtemperatur in Netralisationspuffer inkubiert, gewaschen und getrocknet. Die Färbung erfolgte mit 4,6Diamidino2phenylindol (DAPI), welches selektiv an DNA bindet und stark fluoreszierende DNADAPIKomplexe bildet. Zur Auswertung wurde die Software Comet Assay IV der Firma Perceptive Instruments Ltd verwendet. 3.8 Messungen durch die ÖSBS An jedem Experimenttag der Phase 2 wurde durch die ÖSBS eine Partikelmessung vorgenommen Probenahmegeräte o PM4 (Gravikon PM4, Fa. GSM) o SMPS 3936L22 (Scanning Mobility Particle Sizer, Fa. TSI) Probenträger o G70 (Glasfilter, 70 Durchmesser) 16

19 3.8.3 Auswerteverfahren Gefahrstoff Arbeitsanweisung/Testnorm Messgerät Einatembarer Staub La 012 Präzisionswaage Alveolengängiger Staub La 012 Präzisionswaage Mettler Elementarer Kohlenstoff La 007 Coulomat Laut der Verordnung BGBl. II Nr. 243/2007 des Bundesministeriums für Wirtschaft und Arbeit vom 11. September 2007 über Grenzwerte für Arbeitsstoffe und über krebserzeugende Arbeitsstoffe (Grenzwerteverordnung 2007 GKV 2007) gelten für die untersuchten luftverunreinigenden Stoffe folgende Grenzwerte: Gefahrstoff Konzentration [mg/m 3 ] Aerkungen Einatembarer Staub 10 E Alveolengängiger Staub 5 A Elementarer Kohlenstoff 0,1 A TRKWert Erläuterungen: E A TRK Messtechnische Festlegung einatembarer Staub Messtechnische Festlegung alveolengängiger Staub Technische Richtkonzentration (Nach dem Stand der Wissenschaft gibt es keine als unbedenklich anzusehende Konzentration) 4 ERGEBNISSE 4.1 ZELLVIABILITÄT Die metabolische Aktivität wurde mit dem WST1 Assay bestimmt. Dabei wird das Tetrazoliumsalz WST1 durch mitochondriale Dehydrogenasen in den aktiven Zellen zu Formazan umgewandelt. Dieser Farbstoff kann anhand seiner Absorption in einem ELISA Reader quantifiziert werden Modellexposition mittels Partikelgenerator OD [450] NT1 IC OD [450 ] NT2 IC 0.0 KW26_1 KW45_1 KW45_2 KW47_1 0.0 KW26_2 KW46_1 KW46_2 KW46_3 Abbildung 9: Messung der mitochondrialen Aktivität nach Exposition mittels Partikelgenerator. 17

20 In allen Experimenten mit NT1 wurde nach Exposition eine zum Teil deutliche Abnahme der Zellviabilität in der exponierten Probe gegenüber der Negativkontrolle registriert. Wohingegen es nach Exposition mit NT2 zu keiner Abnahme der Zellviabilität kam Arbeitsplatzexposition bei der Herstellerfirma Der WST1 Assay wurde mit Zellen, die exponiert (=E), mit gefilterter Luft exponiert (=C) bzw. im Brutschrank inkubiert (=IC) worden waren, durchgeführt. Es konnte an keinem der Experimenttage eine Wirkung der Partikelexposition auf die Vitalität der Zellen in diesem Assay nachgewiesen werden, was auf die sehr geringe Partikelbelastung (siehe 4.5) zurückzuführen ist. 1.5 OD [450 ] E C IC 0.0 KW13_1 KW13_2 KW13_3 KW13_4 Abbildung 10: Messung der mitochondrialen Aktivität nach Exposition bei der Herstellerfirma KW13_1 + 3: Einschaufeln, KW13_2 + 4: Betrieb Trockenofen Exposition mittels Aerosolgenerator OD [450] NT3 C IC OD [450 ] NT4 C IC 0.0 KW38_1 KW38_3 0.0 KW38_2 KW38_4 Abbildung 11: Messung der mitochondrialen Aktivität nach Exposition mittels Aerosolgenerator. Es konnte an keinem der Experimenttage eine Wirkung der Partikelexposition auf die Vitalität der Zellen in diesem Assay nachgewiesen werden. 18

21 4.2 OXIDATIVER STRESS Das Auftreten von Sauerstoffradikalen wurde durch die Oxidation von Dihydrorhodamin zum fluoreszierenden Rhodamin in den Zellen verfolgt Modellexposition mittels Partikelgenerator Fluoreszenz % IC KW45_2 KW46_2 KW47_1 E C Abbildung 12: Nachweis oxidativer Radikale. Die Werte geben die Fluoreszenz von Rhodamin in den exponierten (E) und mit Partikelfilter exponierten Proben (C) in % der Brutschrankkontrolle (IC) wieder Arbeitsplatzexposition bei der Herstellerfirma Es wurden die intrazellulär auftretenden freien Radikale durch den fluorogenen Farbstoff Dihydrorhodamin, der nach Oxidation zu Rhodamin grün fluoresziert, durchflusszytometrisch nachgewiesen. Bei Messungen während des Einschaufelns (KW13_1+3) ließ sich ein erhöhter "oxidativer burst" in den exponierten Zellen (= E) im Vergleich zu den Proben, die mit Partikelfilter exponiert wurden (= C) analysieren, der auf die Induktion von Radikalen durch die Partikelexposition hinweist. Bei Messungen während des Betriebs des Trockenofens kam es zu keinem Anstieg des "oxidativer burst" (siehe Abbildung 13). Dies ist auf die niedrigere Partikelbelastung im Vergleich zum Einschaufeln zurückzuführen (siehe 4.5). Fluoreszenz % IC KW13_1 KW13_2 KW13_3 KW13_4 E C Abbildung 13: Nachweis oxidativer Radikale. Die Werte geben die Fluoreszenz von Rhodamin in den exponierten (E) und mit Partikelfilter exponierten Proben (C) in % der Brutschrankkontrolle (IC) wieder. KW13_1 + 3: Einschaufeln, KW13_2 + 4: Betrieb Trockenofen. 19

22 4.2.3 Exposition mittels Aerosolgenerator An Tag 1 (KW38_1 + 2) konnte nach Exposition mit NT3 (gereinigte CNT) ein z.t. deutlicher Anstieg an oxidativen Radikalen festgestellt werden, wohingegen nach Exposition mit NT4 (CNT as grown) kein erhöhter oxidativer burst messbar war. An Tag 2 konnte weder nach Exposition mit NT3 noch mit NT4 ein Anstieg an oxidativen Radikalen festgestellt werden. (siehe Abbildung 14). Dies ist auf die niedrigere Partikelbelastung im Vergleich zum Vortag zurückzuführen (siehe 4.5). Fluoreszenz % IC KW38_1 KW38_2 KW38_3 KW38_4 E C Abbildung 14: Nachweis oxidativer Radikale. Die Werte geben die Fluoreszenz von Rhodamin in den exponierten (E) und mit Partikelfilter exponierten Proben (C) in % der Brutschrankkontrolle (IC) wieder. KW38_1 + 3: NT3, KW38_2 + 4: NT PRODUKTION PROINFLAMMATORISCHER ZYTOKINE Es konnte weder bei der Modellexposition mittels Partikelgenerator, noch bei den Messungen am Arbeitsplatz proinflammatorische Zytokine nachgewiesen werden. Da auf Grund des Expositionssetups nur eine begrenzte Anzahl an Endpunkten untersucht werden konnte, wurde nach Exposition mittels Aerosolgenerator auf den Nachweis proinflammatorischer Zytokine zugunsten eines anderen Endpunkts verzichtet. 4.4 COMETASSAY Eine mögliche gentoxische Wirkung der Nanotubes wurde mittels COMETAssay untersucht. Diese elektrophoretische Technik, erlaubt es, DNASchädigungen in einzelnen Zellen zu detektieren. Diese Untersuchung konnte auf Grund von technischen Problemen erst bei den Versuchen mit Aerosolgenerator angewandt werden. An beiden Tagen (KW38) konnte nach Exposition mit NT3 (gereinigte CNT) ein sehr leichter Anstieg an DNA Schädigung festgestellt werden, wohingegen nach Exposition mit NT4 (CNT as grown) der Median von % Tail Intensitiy im Bereich der Kontrolle liegt (siehe Tabelle 3, Abbildung 15 und Abbildung 16). 20

23 Tabelle 3: Zusammenfassung der Ergebnisse des COMETAssays. Title Count Mean % Tail Intensity Median % Tail Intensity Upper 90% of % Tail Intensity SD % Tail Intensity C NT NT C NT NT

24 % Tail Intensity Frequency Intensity (%) Abbildung 15: Diagramm über % Tail Intensity beider Messtage ( und ). NT4 NT3 C NT4 NT3 C C NT3 NT4 C NT3 NT4

25 % Tail Intensity Box Chart Intensity (%) Source C xls Source C xls Source E xls Source E xls Source E xls Source E xls Abbildung 16: Diagramm mit % Tail Intensity Box Plots beider Messtage ( und ).

26 4.5 MESSUNGEN DURCH DIE ÖSBS Aufgrund der durchgeführten Erhebungen und Messungen ergeben sich die nachfolgenden Konzentrationswerte für die Messungen am Arbeitsplatz: Arbeitsplatz / Referenzperson Untersuchter Gefahrstoff Konzentration [mg/m 3 ] Einschaufeln, Betrieb Trockenofen, Einschaufeln, Betrieb Trockenofen, Einatembarer Staub Alveolengängiger Staub Elementarer Kohlenstoff Einatembarer Staub Alveolengängiger Staub Elementarer Kohlenstoff Einatembarer Staub Alveolengängiger Staub Elementarer Kohlenstoff Einatembarer Staub Alveolengängiger Staub Elementarer Kohlenstoff 0,99 0,13 0,11 < 0,08 < 0,08 0,016 1,10 0,23 0,16 < 0,08 < 0,08 0,021 Neben den gravimetrischen Konzentrationsmessungen wurden mittels eines Scanning Mobility Particle Sizer (SMPS) der Fa. TSI die Anzahlverteilungsdichten der ultrafeinen Partikel im Bereich des Trockenofens während der beiden Betriebszuständen (Einschaufeln und Betrieb Trockenofen) ermittelt. An den Messtagen und wurden auf Grund des Expositionsaufbaus keine gravimetrischen Konzentrationsmessungen durchgeführt, sondern nur mittels des SMPS der Fa. TSI die Anzahlverteilungsdichten der ultrafeinen Partikel während der drei Expositionsszenarien (Kontrolle, NT3 und NT4) ermittelt. Aus den Daten lassen sich folgende charakteristische Parameter für das vorgefundene Teilchenkollektiv (Messbereich 14,8 673 ) anführen (siehe auch Abbildung 17 bis 24

27 Seibersdorf Labor GmbH, Toxikologie Raum EI 15 TOX14, E E+06 Partikelkonz. / N cm 3 1.0E E E E Messserie (9:53 Uhr 10:53 Uhr) 2. Messserie (11:00 Uhr 12:00 Uhr) Nullmessung (8:45 Uhr 9:45 Uhr) Raumhintergrund 1.0E d / Abbildung 20): Einschaufeln, : Median Mean Mode Anzahlkonzentration N/cm 3 48,34 64,16 43,36 7,17E+03 Betrieb Trockenofen, : Median Mean Mode Anzahlkonzentration N/cm 3 52,82 73,16 46,07 2,68E+03 Einschaufeln, : Median Mean Mode Anzahlkonzentration N/cm 3 54,67 72,59 54,12 5,44E+03 Betrieb Trockenofen, : Median Mean Mode Anzahlkonzentration N/cm 3 55,49 79,59 49,54 1,91E+03 25

28 NT3, : Median Mean Mode Anzahlkonzentration N/cm 3 42,80 53,49 40,85 7,37E+06 NT4, : Median Mean Mode Anzahlkonzentration N/cm 3 42,68 53,64 41,33 6,08E+06 NT3, : Median Mean Mode Anzahlkonzentration N/cm 3 41,61 51,48 40,61 6,30E+06 NT4, : Median Mean Mode Anzahlkonzentration N/cm 3 25,23 33,16 18,97 4,69E+05 Erläuterungen: Median (Medianer Anzahldurchmesser d 50 ): Durchmesser d 50, bei dem die Anzahlverteilungssumme 50 % beträgt. Mean (Mittlerer Anzahldurchmesser d): Durchmesser d ist der mit der zugehörigen Anzahl gewogene arithmetische Mittelwert aller Partikeldurchmesser. Mode (Modale Durchmesser d ): Durchmesser d, bei dem die Anzahlverteilungsdichtefunktion ihr absolutes Maximum erreicht. 26

29 Herstellung und Verarbeitung von Carbon Nanotubes E E+04 Hintergrundmessung Einschaufeln Betrieb Trockenofen Partikelkonz. / N cm 3 1.0E E E E d / Abbildung 17: Graphische Darstellung der Anzahlverteilungsdichten der ultrafeinen Partikel E+04 Herstellung und Verarbeitung von Carbon Nanotubes E+03 Partikelkonz. / N cm 3 1.0E+02 Einschaufeln Betrieb Trockenofen 1.0E E d / Abbildung 18: Graphische Darstellung der Anzahlverteilungsdichten der ultrafeinen Partikel

30 Seibersdorf Labor GmbH, Toxikologie Raum EI 15 TOX14, E E Messserie (10:34 Uhr 11:34 Uhr) 2. Messserie (12:29 Uhr 13:29 Uhr) Partikelkonz. / N cm 3 1.0E E E Abbildung 19: Graphische Darstellung der Anzahlverteilungsdichten der ultrafeinen Partikel d / Seibersdorf Labor GmbH, Toxikologie Raum EI 15 TOX14, E E+06 Partikelkonz. / N cm 3 1.0E E E E Messserie (9:53 Uhr 10:53 Uhr) 2. Messserie (11:00 Uhr 12:00 Uhr) Nullmessung (8:45 Uhr 9:45 Uhr) Raumhintergrund 1.0E d / Abbildung 20: Graphische Darstellung der Anzahlverteilungsdichten der ultrafeinen Partikel

31 5 INTERPRETATION DER ERGEBNISSE Ziel dieses Projekts war die Erfassung möglicher toxischer Belastungen durch Multiwalled Carbon Nanotubes (MWCNTs) am Arbeitsplatz. Dazu wurden Expositionen von CoKulturen aus Lungenepithelzellen und immunologisch kompetenten Zellen mittels Partikelgenerator, Zuleitung der Arbeitsplatzatmosphäre oder mittels Aerosolgenerator durchgeführt. Anschließend wurden die mitochondriale Aktivität, die Bildung oxidativer Radikale und proinflammatorischer Zytokine sowie eine mögliche DNASchädigung untersucht. Expositionen mittels Partikelgenerator ergaben bei allen Messungen mit NT1 eine Beeinträchtigung der mitochondrialen Aktivität und eine vermehrte Bildung von oxidativen Radikalen wobei bei die Messungen mit NT2 keine Effekte zeigten. Diese Ergebnisse deuten auf eine höhere Toxizität der gereinigten MWCNTs hin, die durch den etwa doppelt so hohen Anteil an Kohlenstoff und somit auch an CNTs in dem gereinigten Material erklärt werden kann. Expositionen durch Zuleitung der Arbeitsplatzatmosphäre hingegen führte zu keiner Beeinträchtigung der Viabilität weder durch die Exposition beim Einschaufeln noch durch die Exposition beim Betriebs des Trockenofens. Es konnte jedoch bei einem Experiment ein deutlicher Anstieg an oxidativen Radikalen durch die Exposition beim Einschaufeln, nicht aber beim Bebtrieb des Trockenofens festgestellt werden. Das ist auf die deutlich höhere Partikelbelastung während des Einschaufelns zurückzuführen. Dieser Umstand sollte sich aber nach Auskunft der Herstellerfirma in naher Zukunft ändern, da das Einschaufeln nicht mehr manuell sondern automatisiert durchgeführt werden soll. Die Bildung von proinflammatorischen Zytokinen wurde an beiden Expositionssetups überprüft und lieferte weder nach Exposition mittels Partikelgenerator noch nach Exposition am Arbeitsplatz eine messbare Erhöhung. Zwar zeigte Muller J. et al 2005 [4] das Potential von MWCNTs Entzündungsreaktionen in in vivo Versuchen mit SpragueDawley Ratten hervor zu rufen, konnte im in vitro Versuch aber nur Effekte mit zerkleinerten MWCNTs zeigen. Dies könnte an der unterschiedlichen Verfügbarkeit in der in vivo und in vitro Situation liegen, sowie an der Eigenschaft der MWCNTs Aggregate zu bilden. Da auf Grund des Expositionssetups nur eine begrenzte Anzahl an Endpunkten untersucht werden konnte, wurde nach Exposition mittels Aerosolgenerator statt der Bildung pro 29

32 inflammatorischer Zytokine ein weiterer Endpunkt, nämlich eine mögliche Gentoxizität untersucht. Expositionen mittels Aerosolgenerator hatten den Vorteil, dass durch Suspension der MWCNTs in destilliertem Wasser sowie durch Einsatz einer Trockenstrecke eine deutlich bessere Zerstäubung erreicht werden konnte. Es waren daher auch keine Agglomerate aus MWCNTs auf den Zellen sichtbar. Eine Erhöhung der oxidativen Radikale konnte nur an Messtag 1 ( ) gemessen werden, was auf die niedrigere Partikelbelastung an Messtag 2 ( ) zurückzuführen ist. Trotz eines relativ hohen Belastungsprofils war keine Beeinflussung der Viabilität feststellbar, was den Einsatz des COMETAssays zur Bestimmung von DNASchädigungen ermöglichte. Dieser Assay liefert nur aussagekräftige Ergebnisse wenn ausgeschlossen werden kann dass DNASchädigungen auf Grund von Beeinträchtigung der Viabilität vorliegen. Mittels COMETAssay konnte an beiden Messtagen ein sehr leichter Anstieg an DNASchädigung nach Exposition mit gereinigten MWCNTs (NT3) nachgewiesen werden, wohingegen sich die Werte nach Exposition mit NT4 im Bereich der Kontrollen bewegten. Auch Muller J. et al [5] sowie Lindberg H. et al [6] konnten sowohl in vivo als auch in vitro mittels Mikronukleus Test bzw. COMETAssay gentoxische Effekte von MWCNTs nachweisen. Es konnte gezeigt werden dass es nur durch relativ hohe Partikelbelastung zu einer Beeinträchtigung der Viabilität und zu einem Auftreten von DNASchäden kommt. Auch die Erhöhung oxidativer Radikale hängt mit einer erhöhten Partikelbelastung zusammen. Bei den Arbeitsplatzmessungen waren aber auf Grund der Sicherheitsvorkehrungen (Einhausungen der Maschinen) relativ geringe Belastungen vor: so war die Exposition am Arbeitsplatz um etwa das 1000 fache niedriger als in den Experimenten mit dem Aerosolgenerator. Ein hohes Maß an Arbeitnehmerschutz sowie die Weiterentwicklung der Sicherheitsstandards (Einhausungen der Maschinen, Filter der Abluft) ist zur Aufrechterhaltung dieser geringen Belastungen unerlässlich. 30

33 6 LITERATUR [1] Östling O., Johanson K.J., Microelektrophoretic study of radiationinduced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun, 1984, 123(1): [2] Singh, N.P., McCoy, MT., Tice, R.R., Schneider, E.L., A simple technique for quantitation of low lewels of DNA damage in individual cells,exp Cell Res, 1988, 175, [3] Martin R. Elektrophorese von Nukleinsäuren; Reihe Labor im Fokos, 1996, Spektrum Verlag. [4] Muller J., Huaux F., Moreau N., Misson P., Heilier J.F., Delos M., Arras M., Fonseca A., Nagy J. B., Lison D., Respiratory toxicity of multiwall carbon nanotubes. Toxicology and Applied Pharmacology, 207 (2005) [5] Muller J., Decodier I., Hoet P. H., Lombaert N., Thomassen L., Huaux F., Lison D., Kirsch Volders M., Clastogenic and aneugenic effects of multiwall carbon nanotubes in epithelial cells. Carcinogenesis (2): [6] Lindberg H., Falck G., Suhonen S., Savolainen K., Norppa H., Genotoxicity of nanomaterials: DNA damage and micronuclei induced by carbon nanotubes and graphite nanofibres in human bronchial epithelial cells in vitro. Toxicology Letters Volume 186, Issue 3, 8 May 2009, Pages

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36 Nanotechnologie Belastungsprofile in Nanopartikel und Nanotubes herstellenden und bearbeitenden Industriebranchen sowie Auswirkungen auf menschliche Zellen Ein Forschungsprojekt der Seibersdorf Labor GmbH im Auftrag der Allgemeinen Unfallversicherungsanstalt Medieninhaber und Hersteller: Allgemeine Unfallversicherungsanstalt Verlags und Herstellungsort: AdalbertStifterStraße Wien DVR: Abbildungen: daniel700/fotolia.com