Auswirkung von Infusionslösungen mit Hydroxyethylstärke (HES) auf humane proximale Tubulusepithelzellen der Niere in vitro
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1 Aus der Klinik und Poliklinik für Anästhesiologie der Universität Würzburg Direktor: Professor Or. Dr. hc. Norbert Roewer Auswirkung von Infusionslösungen mit Hydroxyethylstärke (HES) auf humane proximale Tubulusepithelzellen der Niere in vitro Inaugural Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Julius - Maximilians - Universität Würzburg vorgelegt von Raphael Romano Bruno aus Wuppertal Erlangen, Dezember
2 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Infusionstherapie Überblick über verschiedene Infusionslösungen Definition der kristalloiden Lösungen Definition der kolloidalen Lösungen Definition des kolloidosmotischen Druckes Physiologische Grundlagen der Volumentherapie mit Kolloiden Infusionslösungen in der Volumentherapie Kristalloide 10 0,9% NaCI - Lösung 10 Die Ringer - Lösung und ihre Weiterentwicklungen 14 Balancierte Vollelektrolytlösungen Kolloide 21 Humanalbumin 22 Hydraxyethylstärke (HES) 25 Dextrane 42 Gelatine Infusionstherapie und das akute Nierenversagen Die Wirkung der Infusionstherapie auf die Nierenfunktion Exkurs: Die Niere beim kritisch Kranken Hinführung zur Fragestellung Fragestellung 52 2 Methoden Herstellung der Versuchslösungen Einstellung des ph - Wertes und Bestimmung der Osmolalität Auftrennung von HES in einzelne Fraktionen Trocknung der HES - Moleküle Lösung der HES im Zellmedium Dialyse Herstellung einer 2% HES - Lösung der einzelnen Fraktionen Zellkultur 67 IV
3 2.3 APTS - Markierung von HES EZ4U - Versuche Funktionsprinzip des EZ4U: Durchführung Vorteile des EZ4U Aussaat der HK - 2 Zellen für den EZ4U Weitere EZ4U - Versuche 75 Messung der Interaktion zwischen HES und XTT - Farbstoff 75 Messung der Interaktion zwischen HES und Tetrazoliumsalz 75 Messung der Interaktion zwischen HES und Formazan 76 Stimulation der Zellen mit inflammatorischen Mediatoren 78 Reversibilitätsversuch Photometrische Messung der Extinktion Auswertung des EZ4U LDH - Versuche Funktionsprinzip des LDH - Tests Vorbereitung des LDH - Tests Durchführung des LDH - Tests Auswertung des LDH - Tests Die real-time quantitative RT-PCR Funktionsprinzip der real-time quantitative RT-PCR Aussaat und Lysis der HK - 2 Zellen für eine qrt - RT - PCR Extraktion der RNA Gewinnung der cdna Durchführung der qrt - RT - PCR Auswertung der qrt - RT - PCR Verwendete Software 96 3 Ergebnisse Die Aufnahme von HES in HK - 2 Zellen Bestimmung der Bedeutung der Inflammation Auswirkung von TNFa und LPS auf die Zellviabilität Die Auswirkung von TNFa auf die Expression inflammatorischer Markerl Auswirkung von Infusionslösungen in der qrt - RT-PCR 106 Auswirkung von Infusionslösungen auf ICAM Auswirkung von Infusionslösungen auf CCL Zusammenfassung der Bedeutung der Inflammation Die Auswirkungen von HES auf die Zellviabilität 113 V
4 3.3.1 Validierung des EZ4U - Tests 113 Interaktion zwischen HES und dem Reaktant 114 Interaktion zwischen den anderen Versuchslösungen und dem Reaktant 116 Interaktion zwischen HES und dem Produkt 117 Dynamik der Messwerte nach verschiedenen Messintervallen Die Auswirkungen der einzelnen Infusionslösungen auf die Zellviabilität 122 EZ4U von Voluven nach 21h 123 EZ4U von Gelafundin nach 21h 125 EZ4U von Humanalbumin nach 21h 127 EZ4U von Sterofundin ISO nach 21h. 129 Zusammenfassung: EZ4U der Versuchslösungen nach 21h ph - Werte und Osmolalität der Versuchslösungen Auswirkungen ph - korrigierter Infusionslösungen auf die Zellviabilität 135. EZ4U ph - korrigiertes Voluven nach 21h 136 EZ4U ph - korrigiertes Gelafundin nach 21h 138 EZ4U ph - korrigiertes Humanalbumin nach 21h 140 EZ4U ph - korrigiertes Sterofundin ISO nach 21h 142 Koinkubation der kolloidalen Lösungen im EZ4U 143 Zusammenfassung: EZ4U ph - korrigierte Versuchslösungen nach 21h Der Einfluss von Trägerlösung und Ursprung von HES auf die Zellviabilität EZ4U mit balanciertem und 0,9% NaCI - HES 130 / 0,4 nach 21h EZ4U mit balanciertem und 0,9% NaCI - HES 130 / 0,42 nach 21h EZ4U mit in Medium gelöstem HES nach 21h EZ4U mit 0,9% NaCI - HES 130 ( 0,42 und 0,42 nach 21h EZ4U mit balanciertem HES 130 j 0,42 und 0,4 nach 21h Der Einfluss von HES-Molekiilgröße und -Generation auf die Zellviabilität Untersuchung der Viabilität einzelner Fraktionen von 4% Voluven Untersuchung des prozentualen Anteils der einzelnen HES - Fraktionen Untersuchung der Viabilität der einzelnen Fraktionen, die jeweils 2% Voluven enthalten Vergleich verschiedener HES - Generationen Zusammenfassung: Einfluss von MolekülgröBe und HES - Generation auf die Zellviabilität Der Einfluss der Inkubationsdauer auf die Wirkung von HES Der Anteil der direkten Zytotoxizität bei der HES - Wirkung Die direkte Zytotoxizität von Volulyte 177 LDH - Test von Volulyte nach 4h 177 VI
5 LDH - Test von Volulyte nach 24h Die direkte Zytotoxizität der anderen untersuchten Infusionslösungen. 180 LDH - Test von Gelatine nach 24h 181 LDH - Test von Humanalbumin nach 24h 183 LDH - Test von Sterofundin ISO nach 24h Untersuchung der potentiellen Reversibilität der HES - Wirkung 186 Diskussion Inkorporation von HES in die proximale Tubulusepithelzelle HES schädigt die Zeilen nicht durch Induktion von Inflammation ICAM-1 und MCP-1 als inflammatorische Marker TNFa und LPS wirken auf HK Im EZ4U ist der Einfluss der Inflammation nicht messbar HK-2 Zellen können inflammatorisch stimuliert werden HES führt bei HK-2 nicht zur Hochregulation inflammatorischer Marker Die negativen Auswirkungen von HES auf proximale TubulusepHhetzellen in vitro sind nicht durch Inflammation zu erklären HES schädigt die proximale Tubulusepithelzelle in vitro Exkurs: Osmotische Nephrose Die aktuelle Lehrmeinung EZ4U ist geeignet für die Viabilitätsbestimmung von HK-2 Zellen nach Inkubation mit HES HES beeinträchtigt die Zellviabilität proximaler Tubulusepithelzellen in vitro Mitochondriale Funktion als Schlüssel beim kritisch Kranken Die Koinkubation von HES mit Humanalbumin oder Gelafundin hat keinen Einfluss auf die HES - Wirkung Die Viabilitätsreduktion ist ein gemeinsamer Effekt aller HES - Präparate Die verwendeten HES-Konzentrationen sind klinisch relevant Auswirkungen des ph - Werts und der Osmolalität auf den HES - EfFekt221 Der ph - Wert ist nicht ausschlaggebend 221 Die Osmolalität ist nicht ausschlaggebend Trägerlösung hat keine relevante Auswirkung Die Rolle des Chloridanteils kann in vitro nicht untersucht werden Ursprung des HES - Präparates hat keine relevante Auswirkung Größe des HES - Moleküls hat keine relevante Auswirkung 231 Zusammenhang zwischen Masse und Pathogenität der Fraktionen VII
6 HES mit 200 kda, 70 kda und 130 kda im EZ4U vergleichbar HES der 3. Generation ist seinen Vorgängern in vitro nicht überlegen Der HES - Effekt ist auch über die Inkubation hinaus messbar Der Reduktion der Zellviabilität durch HES steht vermutlich nur eine verzögerte Zytotoxizität gegenüber Einordnung der Ergebnisse dieser Dissertation in den aktuellen Diskurs Osmotische Nephrose geht mit Viabilitätsreduktion und Zellschaden einher Vergleich dieser Ergebnisse mit anderen experimentellen Daten zu HES Vergleich dieser Ergebnisse mit klinischen Studien und Reviews Qualität und Vergleichbarkeit der Studien 245 Große klinische Studien 246 Kleinere klinische Studien 252 Reviews Zusammenfassung: Diskrepanz des theoretischen Modells und der klinischen Studien über HES 259 Die /n-v/'tro-ergebnisse dieser Arbeit und klinische Studien Die Anwendungsbeschränkung für HES-haltige Arzneimittel Vergleich dieser Ergebnisse mit dem klinischen Einsatz in Deutschland 265 Einsatz von HES am Universitätsklinikum Würzburg 265 Einsatz von HES in Deutschland Betrachtung der Ergebnisse der anderen Infusionslösungen 268, Gelatine - Lösungen zeigen in vitro ähnliche Effekte auf proximale Tubulusepithelzellen 268 Volumenwirksamkeit und therapeutische Äquivalenz von Gelatine und HES umstritten 268 Die Nephrotoxizität von Gelatine wird unterschiedlich beurteilt Gelafundin ist in vitro und in vivo noch nierenschädlicher als HES Disussion über Humanalbumin 275 Verbleibende Indikation für Humanalbumin 275 Humanalbumin führt zur erhöhten Aluminiumzufuhr 280 Humanalbumin unterscheidet sich in seiner Auswirkung in vitro von den synthetischen Kolloiden Sterofundin ISO wirkt in vitro weitgehend inert 282 Stellenwert balancierter Kristalloide zur Volumentherapie umstritten. 282 Balancierte Kristalloide in Studien 0,9% NaCI überlegen 284 Sterofundin ISO in vitro und in vivo nahezu inert 287 VIII
7 4.9 Ausblick Die Ergebnisse dieser Arbeit im aktuellen Kontext Offene Fragen Zusammenfassung Ergänzendes Material Ein kurzer Abriss über die Geschichte der Infusionstherapie Ursprünge der Volumentherapie Entwicklung der Kolloide Wie die Nephrotaxizität von HES in den Vordergrund der Diskussion rückte Unerwünschte Arzneimittelwirkungen der Hydraxyethylstärke Zusätzliche Abbildungen Abbildungen zur Studienlage zur Therapie mit Kolloiden, insbesondere zum Einsatz von HES Weltweite Verteilung der einzelnen Infusionslösungen Zusammensetzung der einzelnen Infusionslösungen Andere balancierte Vollelektrolytlösungen 326 Literaturverzeichnis 333 Anhang 384 IX
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