Arabidopsis thaliana

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1 Analysen zur Funktion von PFT1, LAF1 und HY5 in der Lichtsignaltransduktion von Arabidopsis thaliana Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der biologischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau vorgelegt von Eva Zwick Dezember 2012

2 Dekan: Promotionsvorsitzender: Leiter der Arbeit: Referent: Korreferent: Prof. Dr. Ad Aertsen Prof. Dr. Stefan Rotter PD Dr. Thomas Kretsch Prof. Dr. Thomas Laux Prof. Dr. Gerald Radziwill Tag der Verkündigung des Prüfungsergebnisses: 5. März 2013

3 Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Die aus anderen Quellen direkt oder indirekt übernommenen Daten und Konzepte sind unter Angabe der Quelle gekennzeichnet. Insbesondere habe ich hierfür nicht die entgeltliche Hilfe von Vermittlungsbeziehungsweise Beratungsdiensten (Promotionsberater oder anderer Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen. Die Arbeit wurde bisher weder im In- noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt. Eva Zwick

4 Mitveröffentlichter Artikel: Cornelia Klose, Claudia Büche, Aurora Piñas Fernandez, Eberhard Schäfer, Eva Zwick, Thomas Kretsch (2012) The Mediator Complex Subunit PFT1 Interferes with COP1 and HY5 in the Regulation of Arabidopsis Light-signaling. Plant Physiology July 2012.

5 Inhalt Abkürzungen... V 1 Einleitung Die Bedeutung von Licht für Pflanzen Die Phytochrome Die Licht-Signaltransduktion COP HY LAF Weitere Regulatoren der lichtinduzierten Genexpression Der Aufbau eines eukaryotischen Promotors Der Aufbau des Prä-Initiationskomplexes Erkennung einer spezifischen Promotor-Sequenz Cis-regulatorische Elemente von Pflanzen Der Mediator-Komplex PFT eid Die Jasmonat-Signaltransduktion JAZ-Proteine MYC2/JIN Verbindung zwischen Licht- und JA-Signaltransduktion Ziele der Arbeit Material und Methoden Chemikalien und Verbrauchsmaterialien Geräte Lichtquellen Organismen... 22

6 2.5 Pflanzenkultur und Transformation von Pflanzen Anzucht von Sinapis alba zur biolistischen Transformation Biolistische Transformation von Sinapis alba Keimlingen Anzucht von Arabidopsis thaliana Agrobakterium-vermittelte Transformation von Arabidopsis thaliana Genotypisierung von Arabidopsis-Mutanten DNA-Isolierung Genotypisierung Physiologische Experimente Hypokotyllängen- und Wurzellängenmessung von Arabidopsis-Keimlingen Anthocyanextraktion und messung Mikroskopie Mikroskopie von Arabidopsis Keimlingen Mikroskopie von Sinapis Keimlingen Experimente mit Hefe Transformation von Hefezellen Transaktivität und Interaktionstest Herstellung der cdna-library und deren Screen Klonierungen der verwendeten Plasmide Bestimmung der Expression von Markergenen RNA-Isolation und cdna-synthese Real-Time-PCR Bestimmung der Aktivität des HY5-Promotors Chromatin-Immunopräzipitation Ergebnisse Die SALK-Mutante in der VP16-Domäne von PFT Hefe-Library-Screen mit PFT1 und der VP16-Domäne Transgene Linien mit Aminosäureaustauschen in PFT

7 3.3.1 Mikroskopische Analysen der PFT1-Aminosäureaustausch-Linien Hypokotyllängen der PFT1-Aminosäureaustausch-Linien Versuche zur Domänenstruktur von PFT Hypokotyllängen der Pflanzen mit den PFT1-Domänen Glutaminreiche Region von PFT PFT1 und Methyljasmonat Wurzellängen bei verschiedenen Methyljasmonatkonzentrationen Semiquantitative RT-PCR nach Methyljasmonatbehandlung Kinetik der Genexpression nach Lichtbehandlung Screening nach möglichen PFT1-Interaktoren mit Hilfe der Bimolekularen Fluoreszenz-Komplementation (BiFC) Untersuchungen mit G-Box-Binding Faktoren (GBF) Untersuchungen mit transkriptionellen Regulatoren der Anthocyansynthese Untersuchungen zu Wechselwirkungen zwischen LAF1 und PFT Analyse von Interaktionen zwischen PFT1 und verschiedenen Transkriptionsfaktoren mit dem Hefe-zwei-Hybrid-System Yeast-two-Hybrid mit MYC Yeast-two-Hybrid mit LAF Die Doppelmutante eid3 laf Epistasieanalyse der lichtabhängigen Inhibition des Hypokotylwachstums Anthocyanakkumulation im Licht Genexpression nach Hell- und Dunkelrotlichtbehandlung Veränderung der Genexpression nach hellrotem Licht nach 45 min und 4 h HY Veränderung der Genexpression nach hellrotem Licht nach 45 min und 4 h Der Promotor von HY HY5 und LAF Diskussion... 84

8 4.1 Die PFT1-Mutanten Kinetik der lichtregulierten Genexpression von eid3 und pft Transgene Linien mit Aminosäureaustauschen in PFT Untersuchungen zur Funktion der verschiedenen PFT1-Domänen Untersuchungen zur Wechselwirkung von Jasmonat und PFT Der Einfluss von Methyljasmonat auf die Wurzellänge Interaktion mit MYC Expression Methyljasmonat-induzierter Gene Identifizierung neuer Interaktionspartner von PFT Screening nach möglichen PFT1-Interaktoren mit Hilfe der Bimolekularen Fluoreszenz-Komplementation (BiFC) LAF Interaktion von LAF1 und PFT Hypokotyllängenwachstum und Photomorphogenese in der eid3 laf1- Doppelmutante Anthocyanakkumulation in der eid3 laf1-doppelmutante HY Die eid3 hy5 Doppelmutante Analysen zur Regulation des HY5-Promotors Mögliche Funktionsweisen von LAF1 und PFT1 am HY5-Promotor Die Interaktion von LAF1 und HY Zusammenfassung Literaturverzeichnis Anhang

9 Abkürzungen A Adenin/Alanin ABA Abscisinsäure ACGT m Mutation im ACGT-Element ACT ACTIN AD Aktivierungsdomäne von GAL4 AK Antikörper ANNAT2 ANNEXIN 2 APRR5 ARABIDOPSIS PSEUDORESPONSE REGULATOR 5 AS Aminosäure At Arabidopsis thaliana BD Bindedomäne von GAL4 bhlh basic-helix-loop-helix BiFC Bimolekularer Fluoreszenzkomplementation bzip basic Leucin-Zipper C Cytosin CAD9 CINNAMYLALKOHOLDEHYDROGENASE 9 CAPS Cleaved Amplified Polymorphic Sequences CCA1 CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 CCD Charge-coupled Device cd konstante Dunkelheit CFP Cyan Fluorescent Protein ChIP Chromatin Immunopräzipitation CHS CHALCONE SYNTHASE CO CONSTANS COI1 CORONATINE INSENSITIVE 1 Col Columbia COP1 CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC 1 CPRF2 COMMON PLANT REGULATORY FACTOR 2 CRM cis-regulatory modules CRY CRYPTOCHROME C-Terminus carboxyterminal D Aspartat DDB1 DAMAGED DNA-BINDING PROTEIN 1 DET DE-ETIOLATED DR dunkelrotes Licht

10 DREB2A DRE-BINDING PROTEIN 2A E Glutamat EGL3 ENHANCER OF GL3 eid3 empfindlicher im dunkelroten Licht 3 ERF1 ETHYLENE RESPONSE FACTOR 1 FH Formin homologue 1 Domain FHD1 ZINC FINGER HOMEODOMAIN 1 FHY1 ELONGATED HYPOCOTYL 1 FR far-red (dunkelrotes Licht, 715 nm Wellenlänge) FT FLOWERING LOCUS T FUS FUSCA G Guanin GA Gibberellinsäure GBF G-BOX-BINDING FACTOR GCN5 GENERAL CONTROL NON-REPRESSIBLE 5 GTFs generelle Transkriptionsfaktoren HAF2 HISTONE ACETYLTRANSFERASE OF THE TAFII250 FAMILY 2 HALT SD-Medium ohne Histidin/Leucin/Tryptophan/Adenin HD1 HISTONE DEACETYLASE 1 HFR1 LONG HYPOCOTYL IN FAR-RED 1 HIR High Irradiance Response HLT SD-Medium ohne Histidin/Leucin/Tryptophan hmed25 Mediatoruntereinheit 25 des Menschen (human) HR hellrotes Licht (650 nm Wellenlänge) HY5 LONG HYPOCOTYL 5 HYH HY5 HOMOLOG I Isoleucin IP Immuno Präzipitation JA Jasmonat JAR1/FIN219 JASMONATE RESISTANT 1/ FAR-RED INSENSITIVE 219 Jas JA-associated JAZ JASMONATE ZIM-DOMAIN JID JAZ INTERACTING DOMAIN L Leucin LAF1 LONG AFTER FAR-RED 1 Ler Lansberg erecta LFR Low Fluence Response LRU light regulatory units

11 LT SD-Medium ohne Leucin/Tryptophan LUC Luziferase M Methionin MBR MED25 BINDING RING-H2 PROTEIN MED Mediator MeJA Methyljasmonat MRE MYB recognition element MYB MYELOBLASTOSIS Transkriptionsfaktorfamilie in Pflanzen MYB m Mutation im MYB-Element MYC2/JIN1 JASMONATE INSENSITIVE 1 NLS Nuclear Localization Signal N-Terminus Aminoterminus P 35S PAP 35S Promotor des Cauliflower Mosaic Virus PRODUCTION OF ANTHOCYANIN PIGMENT PDF1.2 PLANT DEFENSIN 1.2 Pfr Phytochrom-Konformation mit einem Absorptionsmaximum bei 730 nm PFT1 PHYTOCHROME AND FLOWERING TIME 1 PFT1 eid3 PhyA/B PIC PIF PFT1-Protein mit eid3-mutation Phytochrom A/B Präinitiationskomplex PHYTOCHROME INTERACTING FACTOR PKS1 PHYTOCHROME KINASE SUBSTRATE 1 PKT1 PEROXISOMAL-3-KETO-ACYL-COA THIOLASE 1 P PFT1 Pr Q Qn qrt-pcr R RDR RING RNA Pol II RT-PCR S SCF SD SEM sirna nativer Promotor von PFT1 Phytochrom-Konformation mit einem Absorptionsmaximum bei 660 nm Glutamin glutaminreiche Region/Polyglutamindomäne quantitative Real-Time-PCR rotes Licht (650 nm Wellenlänge) RNA-abhängigen RNA-Polymerase Really Interesting New Gene RNA Polymerase II Real-Time-PCR Serin Skp-Cullin-F-box-Komplex Selective Dropout Standard Error of the Mean (Standardfehler des Mittelwertes) small-interfering RNA

12 SPA SUPPRESSOR OF PHYTOCHROME A SWP STRUWWELPETER T Threonin/Thymin T-DNA Transfer-DNA TE Tris-EDTA TF Transkriptionsfaktor TT8 TRANSPARENT TESTA 8 UTR Untranslatierte Region UV-A/B Ultraviolettes Licht A/B UVR8 UVB-RESISTANCE 8 VLFR Very Low Fluence Response VP16 minimal-vp16 Interaction Domain VSP1 VEGETATIVE STORAGE PROTEIN 1 vwa von Willebrand Faktor Type A Domain W Tryptophan WL weißes Licht Ws Wassilewskija WT Wildtyp Y2H Hefe-zwei-Hybrid YC C-Terminus von YFP YEB Yeast Extract and Beef YFP Yellow Fluorescent Protein YN N-Terminus von YFP YPD Yeast Peptone Dextrose ZAT1 ZINC TRANSPORTER OF ARABIDOPSIS THALIANA 1 ZFHD1 ZINC FINGER HOMEODOMAIN 1 ZIP LEUCINE ZIPPER Δ deletiert

13 Einleitung 1 Einleitung 1.1 Die Bedeutung von Licht für Pflanzen Seit mittlerweile 4,57 Milliarden Jahren scheint unsere Sonne mit einer Leistung von 6, W/m² auf die Erde herab ( 2012). Dank ihr konnte sich auf der Oberfläche der Erde Leben entwickeln. Hierzu gehören neben Tieren, Pilzen und Bakterien auch die Pflanzen. Pflanzen sind die erste Anlaufstelle für das von der Sonne abgestrahlte Licht, da, neben einigen photoautotrophen Algen, nur sie dank der Photosynthese die Sonnenenergie in chemische Energie umwandeln können, die dann in Form von Sacchariden als Nahrungsquelle für alle anderen Lebewesen dient. Pflanzen nutzen das Licht allerdings nicht nur zur Photosynthese, sondern auch als Informationsquelle, um sich optimal an die gegebenen Lichtverhältnisse anzupassen. Die Anpassung beeinflusst alle Stadien der Entwicklung von der Keimung bis hin zur Blütenbildung. Zur Wahrnehmung des Lichts hinsichtlich Qualität, Richtung, Intensität und Dauer haben sich verschiedene Photorezeptoren entwickelt. Blaues Licht und UV-A werden von Cryptochromen und Phototropinen detektiert (Lin et al., 1998, Briggs et al., 2001). Die Phytochrome wirken hauptsächlich als Rezeptoren für hell- und dunkelrotes Licht, können aber auch blaues Licht wahrnehmen (Casal, 2000). UV-B wird über den UVR8-Rezeptor detektiert (Rizzini et al.., 2011). Die Samenkeimung ist bei vielen Pflanzen durch Licht induziert (Hennig et al., 2002). Im Verlauf der Entwicklung in Dunkelheit bilden Keimlinge ein langes Hypokotyl mit apikalem Haken und geschlossenen Kotyledonen aus, was als Skotomorphogenese oder Etiolement bezeichnet wird. Im Licht hingegen wird das Längenwachstum des Hypokotyls stark gehemmt, der Hypokotylhaken öffnet sich und die Kotyledonen werden entfaltet und expandieren. Des Weiteren werden die Chloroplasten differenziert um dem Keimling die Photosynthese zu ermöglichen. Dieser Vorgang wird als Photomorphogenese oder Deetiolierung bezeichnet (Fankhauser und Chory, 1997). Hierbei spielen bei Arabidopsis thaliana die Phytochrome A und B, sowie die Cryptochrome eine dominierende Rolle (Neff et al., 2000). 1

14 Einleitung 1.2 Die Phytochrome Phytochrome kommen in allen höheren Pflanzen vor, wobei in Arabidopsis thaliana fünf Isoformen (Phytochrom A bis E, PhyA bis PhyE) identifiziert wurden (Sharrock und Quail, 1989, Clack et al., 1994). Phytochrome können in zwei verschiedenen Konformationszuständen vorkommen, die durch Absorption von Licht ineinander umgewandelt werden können. Synthetisiert werden sie in der inaktiven Pr-Form (hellrot, red), die ein Absorptionsmaximum bei ca. 665 nm aufweist. Durch Absorption eines Photons wird die Pr-Form der Phytochrome in die aktive Pfr-Form (dunkelrot, far red) konvertiert, die ihr Absorptionsmaximum bei 730 nm hat (Quail et al., 1973). Umgekehrt kann auch die Pfr-Form nach Lichtabsorption wieder in die Pr- Form umgewandelt werden. Da sich die Absorptionsspektren von Pr und Pfr teilweise überlappen, kommt es wellenlängenabhängig zur Einstellung eines Photogleichgewichtes zwischen beiden Konformationszuständen. Die Photorevertierbarkeit der Phytochrome ermöglicht Pflanzen, die spektrale Zusammensetzung ihrer Lichtumgebung zu messen, die hinsichtlich des Anteils von hellrotem Licht zu dunkelrotem Licht (R:FR) variieren kann. So verschiebt sich das Verhältnis in der Dämmerung, im Vegetationsschatten und mit der Jahreszeit (Holmes und Smith, 1975), was Auswirkungen auf die weitere pflanzliche Entwicklung hat. Dadurch wird im Vegetationsschatten die Blütenbildung vorangetrieben und das Streckungswachstum verstärkt, um dem Schatten zu entgehen (shade avoidance response; Franklin, 2008). Basierend auf ihrer Lichtstabiliät und Häufigkeit können Phytochrome in zwei Gruppen eingeteilt werden. Die Phytochrome B bis E zählen zu den Typ II Phytochromen, die allgemein in geringen Mengen vorkommen, im Licht jedoch relativ stabil sind. Im Gegensatz dazu ist PhyA der einzige Vertreter der Typ I Phytochrome in Arabidopsis. Es akkumuliert in großen Mengen in etiolierten Geweben, wird im Licht aber rasch abgebaut (Pratt, 1995). Durch Phytochrome induzierte physiologische Reaktionen können in verschiedene Klassen eingeteilt werden (Mancinelli, 1994). Dabei wird zwischen LFR (Low Fluence Response), VLFR, (Very Low Fluence Response) und HIR (High Irradiance Response) unterschieden. LFRs und VLFRs folgen dem Reziprozitätsgesetz, welches besagt, dass Lichtpulse unterschiedlicher Zeitdauer gleiche Wirkung zeigen, wenn die Menge der eingestrahlten Photonen identisch ist (Mancinelli, 1994). Die LFRs werden durch die lichtstabilen Phytochrome B-E vermittelt. Sie können durch Rotlichtpulse induziert und durch eine nachfolgende Dunkelrotbestrahlung revertiert werden. Die VLFRs werden durch Lichtpulse fast jeder Wellenlänge induziert und 2

15 Einleitung benötigen nur sehr geringe Lichtmengen. Die VLFR wird ausschließlich durch das lichtlabile PhyA vermittelt, welches im Dunkeln in großen Mengen akkumuliert und infolgedessen geringste Lichtmengen wahrnehmen kann (Shinomura et al. 1996). Des Weiteren ist PhyA auch für die Steuerung der Dunkelrot-HIRs verantwortlich. Diese Phytochromreaktionen werden nur durch kontinuierliches, dunkelrotes Licht hoher Intensität ausgelöst. Sie zeigen keine Photoreversibilität und folgen nicht dem Reziprozitätsgesetz (Mancinelli, 1994). Die Stärke der HIR wird durch den Photonenfluss bestimmt (Hennig et al. 2000). Phytochrome beeinflussen vielfältige Prozesse wie Samenkeimung, Photomorphogenese, Gravi- und Phototropismus, Ausbildung der pflanzlichen Gestalt, Schattenmeidung, Steuerung der circadianen Uhr und Photoperiodismus (Whitelam und Devlin, 1997, Franklin et al., 2003). 1.3 Die Licht-Signaltransduktion Es konnten verschiedene, mit Phytochromen interagierende Proteine und Zielgene der Licht- Signaltransduktion identifiziert werden, wobei es viele Hinweise darauf gibt, dass für PhyA und PhyB sowohl gemeinsame als auch getrennte, sehr komplexe Signalwege mit negativ und positiv regulierenden Komponenten bestehen (Quail, 2002). Eine Vielzahl von DNA-bindenden Proteinen, die als positiv oder negativ wirkende Regulatoren der Lichtsignaltransduktion in Arabidopsis fungieren, konnten identifiziert werden (Jiao et al., 2007). So sind PIFs (PHYTOCHROME INTERACTING FACTORs), Mitglieder der bhlh-transkriptionsfaktor- Familie (basic-helix-loop-helix), negative Regulatoren der Lichtantwort und binden an G- Boxen in Promotoren lichtinduzierter Gene (Jiao et al., 2007, Lau und Deng, 2010). Des Weiteren gibt es positiv wirkende Faktoren wie HFR1 (LONG HYPOCOTYL IN FAR-RED 1), HY5 (LONG HYPOCOTYL 5) oder LAF1 (LONG AFTER FAR-RED 1) (Jiao et al., 2007, Lau und Deng, 2010). Abbildung 1-1 zeigt ein vereinfachtes Modell der Lichtsignaltransduktion. 3

16 Einleitung Abbildung 1-1 Modell der Regulation der Lichtantwort. Im Dunkeln wird Phytochrom von PKS1 gehemmt. Transkriptionsfaktoren wie HY5 und LAF1 werden von COP1 zur Degradation markiert, ubiquitiniert und abgebaut, wodurch die Photomorphogenese unterdrückt wird. Nach Eingang eines Lichtsignals wird das Phytochrom A in den Nucleus transportiert und aktiviert hier Transkriptionsfaktoren, die an Promotoren lichtregulierter Gene binden, die als Antwort auf das Licht exprimiert werden. PKS1: PHYTOCHROME KINASE SUBSTRATE 1, PHY; PHYTOCHTOME, COP1: CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC 1, SPA1: SUPPRESSOR OF PHYTOCHROME A, HY5: LONG HYPOCOTYL 5, LAF1: LONG AFTER FAR-RED 1; MYB und ACGT, spezifische Transkriptionsfaktor-Bindesequenzen im Promotor COP1 Der Ubiquitin-vermittelte Proteinabbau spielt eine zentrale Rolle bei der Steuerung der Photomorphogenese. Dieser Signalmechanismus wurde durch die rezessiven, pleiotropen Mutanten der cop/det/fus-gruppe (constitutive photomorphogenic/deetiolated/fusca) entdeckt, die im Dunkeln bereits Merkmale einer Deetiolierung, wie kurze Hypokotyle und geöffnete, expandierte Kotyledonen, aufweisen (Hardtke und Deng, 2000). Die betroffenen Proteine sind am Abbau von Zielproteinen in großen Proteinkomplexen, wie dem COP1-Komplex beteiligt (Saijo et al., 2003). COP1 (CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC 1) ist eine RING-finger Typ E3 Ubiquitin-Ligase und wirkt als genereller Repressor der Photomorphogenese unterhalb verschiedener Photorezeptor-spezifischer Signalwege. COP1 ist für die Regulation des Abbaus der positiv wirkenden Transkriptionsfaktoren HY5, HYH (HY5 HOMOLOG), LAF1 und HFR1 im Proteasom verantwortlich (Osterlund et al., 2000, Holm et al., 2002, Seo et al., 2003, Jang et al., 2005). Die COP1 Wirkung wird lichtabhängig inaktiviert, sodass diese Faktoren im Licht akkumulieren können und die Photomorphogenese durch die Expression lichtspezifischer Gene induziert werden kann (Osterlund und Deng, 1998). SPA-Proteine (SUPPRESSOR OF 4

17 Einleitung PHYTOCHROME A) sind Co-Faktoren von COP1 und spielen somit bei der Proteindegradation eine Rolle (Balcerowicz et al., 2011). Weitere im PhyA-Signalweg bestehende Abbauprozesse wirken z.b. über das mit COP1 interagierende Protein SPA1 (SUPPRESSOR OF PHYA 105) (Höcker et al., 2001). Entsprechend der Wirkung dieses Faktors als negative Signalkomponente im PhyA-Signalweg ist spa1-4-mutante hypersensitiv gegenüber dunkelrotem Licht. SPA1 interagiert mit COP1 über seine Coiled-Coil-Domäne und fördert die Ubiquitylierung von LAF1 (Seo et al., 2003) HY5 Ein zentraler Faktor zur Induktion der Photomorphogenese ist HY5; ein Protein, das zur Familie der bzip (basic leucin-zipper) Transkriptionsfaktoren gehört (Oyama et al., 1997). Die hy5-1- Mutante zeigt Defekte bei der Deetiolierung in verschiedenen Lichtqualtäten, was darauf hindeutet, dass HY5 in den Signalwegen aller Photorezeptoren wirkt (Ulm et al., 2004). Die HY5- Menge wird sowohl auf transkriptioneller (Oyama et al., 1997) als auch auf posttranslationaler Ebene lichtabhängig reguliert. Das Protein wird durch COP1 abgebaut (Osterlund et al., 2000), indem es mit seiner WD40-Interaktionsdomäne mit COP1 interagiert und so dem Proteasom zugeführt wird (Hardtke et al., 2000a). HY5 bindet an sogenannte G-Box Elemente in Promotoren lichtregulierter Gene (Chattopadhyay et al., 1998). Durch eine Kombination von Chromatin-Immunopräzipitation und whole-genome Microarrays konnten in vivo über 3000 Gene als putative HY5-Bindestellen identifiziert werden (Lee et al., 2007). Genontologie-Analysen zeigten, dass insbesondere Transkriptionsfaktoren zu diesen Zielgenen gehören, jedoch auch Gene die in den Signaltransduktionswegen von Auxin, Cytikinin, Ethylen und Jasmonsäure eine Rolle finden. HY5 ist zudem bei der Regulation von Genen beteiligt, die an der Regulation der Zellelongation, Zellteilung und Chloroplastenentwicklung involviert sind (Zhang et al., 2011). Besonders viele frühe lichtregulierte Gene waren in diesen putativen HY5-Zielgenen zu finden. HY5 wirkt als übergeordneter Regulator einer hierarchisch gestalteten Transkriptionsregulationskaskade während der Photomorphogenese und reguliert die PhyA- Signalleitung durch einen negativen feed-back-loop (Li et al., 2010). HY5 bildet mit dem bzip- Faktor GBF1 Heterodimere und bindet an G-Box-Promotoren, um diese zu aktivieren (Singh et al., 2012). Die Interaktion von HY5 mit FHY1 (ELONGATED HYPOCOTYL 1) wurde kürzlich gezeigt; mit Hinweisen auf die Bildung eines großen Multiproteinkomplexes am Promotor von CHS (CHALCONE SYNTHASE) (Chen et al., 2012a). 5

18 Einleitung Auch spielt HY5 eine Rolle im Signalweg von Pflanzenhormonen, da das Protein beispielsweise die Expression negativer Regulatoren des Auxinsignalweges aktiviert (Cluis et al., 2004). HY5 interagiert mit JAR1/FIN219 (JASMONATE RESISTANT 1/ FAR-RED INSENSITIVE 219), das bei der Regulation von JA eine Rolle spielt und die COP1-Level negativ reguliert. Es wurde postuliert, dass die HY5-Stabilität durch JAR1 auch unabhängig von COP1 reguliert werden kann (Wang et al., 2011) LAF1 LAF1 gehört zur R2R3-MYB Familie der Transkriptionsfaktoren und wirkt als positive Signalkomponente spezifisch im PhyA-Signalweg. Die rezessive loss-of-function-mutante laf1 zeigt ausschließlich Defekte in der PhyA-vermittelten Deetiolierung im dunkelroten Licht (Ballesteros et al., 2001), die jedoch nicht so ausgeprägt sind wie in der phya-mutante. Dies deutet auf überlappende Signalwege hin, bei denen einzelne Komponenten die Funktion von LAF1 übernehmen könnten (Ballesteros et al., 2001). Wie HY5 wird auch LAF1 von COP1 abgebaut, indem es an das RING-Motiv von COP1 bindet (Seo et al., 2003). LAF1 besitzt eine NLS und bildet nukleäre Speckles (Ballesteros et al., 2001). Es interagiert mit seiner N-terminalen Region mit HFR1 (Yang et al., 2009, Seo et al., 2003), das auch im PhyA-Signalweg eine Rolle spielt. Beide Proteine steuern jedoch unabhängige Signalwege unterhalb von PhyA (Jang et al., 2007). Die Interaktion der beiden Proteine ermöglicht eine gegenseitige Stabilisierung: durch die Inhibition der Ubiquitinierung durch COP1 werden beide Proteine posttranslational positiv reguliert (Seo et al., 2003). Die Interaktion von LAF1 mit HFR1 findet in der R3-Domäne von LAF1 statt (Yang et al., 2009), die bei anderen MYB-Faktoren für die Interaktion mit bhlh-faktoren notwendig ist (Grotewold et al., 2000). Es wurde gezeigt, dass LAF1 mit PhyA, HFR1 und FHY1/FHL in Abhängigkeit von Dunkelrotlichtflueszenzen Multiproteinkomplexe bildet (Yang et al., 2009). Wie bereits erwähnt stimuliert SPA1 die Ubiquitinierung von LAF1 durch COP1 (Seo et al., 2003) Weitere Regulatoren der lichtinduzierten Genexpression Weitere Co-Regulatoren der Transkription, die übergeordnete Rollen bei der Kontrolle der lichtabhängigen Genexpression spielen, sind DELLA-Proteine. Diese sind Repressoren Gibberellinsäure-induzierter Signalwege in Arabidopsis (Fleet und Sun, 2005) spielen jedoch auch 6

19 Einleitung bei der Transkription lichtregulierter Gene eine Rolle, da sie die Transkriptionsfaktoren PIF3 und PIF4 binden und so deren Bindung an Promotorelemente verhindern, wodurch z.b. das Elongationswachstum von Keimlingen gehemmt wird (de Lucas et al., 2008). DELLA- Repressoren werden in Gegenwart von Gibberellinsäure (GA) proteosomal abgebaut (Itoh et al., 2003). Licht reduziert die GA-Menge und fördert so die die Akkumulation der DELLA-Proteine (Achard et al., 2007). Diese Mechanismen ermöglichen eine Integration der Licht- und Hormon- Signalwege bei der Steuerung der Keimlingsentwicklung. Chromatin-Modifikationen spielen ebenfalls eine Rolle bei der lichtregulierten Genexpression. Mutationen in den Histon-Acetyltransferasen HAF2 (HISTONE ACETYLTRANSFERASE OF THE TAFII250 FAMILY 2) und GCN5 (GENERAL CONTROL NON-REPRESSIBLE 5) führen zur Unterdrückung der Photomorphogenese in verschiedenen Lichtbedingungen (Bertrand et al., 2005, Benhamed et al., 2006). Im Gegensatz dazu verursacht eine Mutation der Histon-Deacetylase HD1 (HISTONE DEACETYLASE 1) einen hypersensitiven Keimlingsphänotyp (Benhamed et al., 2006). Die kontrollierte Acetylierung spezifischer Lysinreste der Histone H3 und H4 in den Promotorregionen lichtregulierter Gene spielt demnach eine wichtige Rolle bei der Genexpression während der Photomorphogenese. DET1 (DE-ETIOLATED 1) bildet gemeinsam mit DDB1 (DAMAGED DNA-BINDING PROTEIN 1) und COP10 einen Multiproteinkomplex (CDD), der ebenfalls mit Chromatinmodifikationen in Verbindung gebracht wird (Yanagawa et al., 2004). Der CDD Komplex bindet vermutlich spezifisch an modifizierte Histone (Benvenuto et al., 2002). Die Interaktion zwischen DET1 und Chromatin wird dabei durch Promotorelemente oder Transkriptionsfaktoren wie HY5 oder CCA1 (CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1) vermittelt (Maxwell et al., 2003). 1.4 Der Aufbau eines eukaryotischen Promotors Eine RNA-Polymerase interagiert mit einer Anzahl von generellen Transkriptionsfaktoren (GTF), die die Polymerase an einen Promotor führen und diesen zur Transkription öffnen. In Eukaryoten sind die TF-Interaktionen am Promotor sehr komplex, wobei der Transkriptionsapparat aus mehreren Duzend Polypeptiden besteht, der eine Gesamtmasse von einigen Millionen Dalton hat. 7

20 Einleitung Ein eukaryotischer Promotor (Abbildung 1-2) besitzt mehrere cis-regulatorische Elemente (CRM, cis-regulatory modules), z.b. TATA-Box, G-Box oder MYB-Bindesequenzen, die aus Bindestellen für Aktivatoren und Repressoren der Transkription bestehen. CRMs können sowohl mehrere Tausend Basenpaare upstream als auch downstream des Startcodons liegen. Meistens wird als Promotor nur der direkt um den Start liegende Bereich von jeweils ca. 50 bp bezeichnet, der für eine Transkription in vitro ausreicht und dann auch als Core-Promotor bezeichnet wird (Courey, 2008). Abbildung 1-2 Schema von Transkriptionsfaktoren am Promotor. In grau ist die DNA dargestellt, die cisregulatorische Elemente mit den Beispielen MRE, G-Box und ACGT enthält an die in grün dargestellter spezifische Transkriptionsfaktoren wie MYBs, GBFs und bzips zum Teil in Form von Dimeren binden. An den core-promotor mit allgemeinen Promotorsequenzen wie der TATA-Box binden die in blau dargestellten generellen Transktiptionsfaktoren, die mit der RNA Polymerase II (gelb) den PIC bilden. Der Mediator-Komplex (lila) besteht aus drei Teilen, dem Tail, Middle und Head und stellt eine Verbindung der spezifischen Transkriptionsfaktoren mit der basalen Transkriptionsmaschienrie inkl. der RNA Pol II her. MYBs: MYB-Transkriptionsfaktoren; MRE: MYB regulatorisches Element; GBFs: G-Box-Binde-Faktoren; bzips: basic Leucin-Zipper; TF: Transkriptionsfaktor; RNA Pol II: RNA Polymerase II; ATG: Startcodon Der Aufbau des Prä-Initiationskomplexes Für die Promotor-spezifische Initiation der RNA-Polymerase II existieren sechs verschiedene generelle TF (TFIIA-H), die wiederum durch ihre Untereinheiten den Promotor und weitere Komponenten erkennen und binden und so den Präinitiationskomplex (PIC, pre-initiation complex) bilden und stabilisieren. So bindet TFIID durch seine Untereinheit TBP (TATAbinding Protein) an die TATA-Box (falls vorhanden) und TFIIB, der die RNA-Pol II bindet und die Auswahl des Transkriptionsstartes vermittelt. TFIIE bindet unbeachtet der DNA-Sequenz an 8

21 Einleitung den Promotor und zieht TFIIH heran. TFIIH hat die Funktion einer Helikase, welche essentiell für die Öffnung der DNA und der Bildung der Transkriptionsblase ist. Der Aufbau des PIC beginnt mit der Erkennung des Promotors durch TFIID, der TFIIB heranzieht. TFIIB wiederum rekrutiert TFIIF, das bereits mit der RNA-Pol II verbunden ist. Zuletzt binden TFIIE und H. Der Mediator-Komplex bindet dann die RNA-Pol II (siehe Abschnitt 1.5). Diese Assemblierung des PIC kann auch durch bereits gebundene spezifische Transkriptionsaktivatoren vermittelt werden (Courey, 2008) Erkennung einer spezifischen Promotor-Sequenz Transkriptionsaktivatoren und auch Repressoren können sequenzspezifisch an DNA binden. Hierzu muss die Sequenz erkannt werden, was eine spezifische Interaktion des Proteins und der Basenpaare voraussetzt, die meistens über Wasserstoff-Brücken vonstatten geht. Hierzu gibt es in Eukaryoten viele verschiedene Proteinfamilien von DNA-binde-Motiven, von denen hier nur auf zwei eingegangen wird. Eine α-helix knüpft stets in der großen Furche des DNA-Stranges an. Ein Protein mit einem basic Helix-Turn-Helix-Motiv (bhlh) kann spezifische Sequenzen erkennen und binden. Hierbei liegt eine positiv geladene, basische α-helix in der großen Furche des DNA-Strangs und bildet dort über die Seitenketten ihrer Aminosäuren mit einzelnen Basen in der DNA Wasserstoff-Brücken. Oft bedarf es einer Dimerisierung von zwei bhlh-proteinen, was die Möglichkeit zur spezifischen Bindung erhöht. Hierfür sind zwei α-helices eines Proteins durch einen Loop miteinander verbunden, sodass insgesamt vier Helices für eine Dimerisierung zur Verfügung stehen. Auch Proteine mit einer basic Leucin-Zipper-Domäne (bzip) binden mit ihren α-helices an den DNA-Strang. Eine bzip-domäne bindet mit ihrer α-helix von ca. 40 AS am N-Terminus mit vorwiegend positiv geladenen Seitenketten (basisch) an die DNA. Der C- Terminus (Leucin-Zipper) bildet eine Kontaktstelle für eine Proteindimerisierung durch vorwiegend hydrophobe Seitenketten an einer Seite der Helix. (Courey, 2008) Cis-regulatorische Elemente von Pflanzen Ein seit vielen Jahren bekanntes cis-regulatorisches Element in pflanzlichen Promotoren ist die G-Box (Menkens et al., 1995). Die G-Box ist ein Hexamer bestehend aus der Sequenz CACGTG. bzip-proteine, zu denen auch die GBFs gehören, interagieren speziell mit G-Boxen in licht- 9

22 Einleitung regulierten Promotoren, jedoch kommen G-Boxen auch in Promotoren von hormon-regulierten Genen vor (ABA, Ethylen, JA). G-Boxen sind von spezifischen DNA-Sequenzen umgeben, die wichtig für die korrekte Antwort auf das eingehende Signal sind, wobei diese spezifische Sequenz wiederum andere, spezielle Transkriptionsfaktoren bindet, die ihrerseits auch mit den GBFs interagieren. Hartmann et al. (2005) identifizierten licht-regulatorische Einheiten (LRU, light regulatory units) in Promotoren von Pflanzen. Die LRU von CHS besteht aus einem ACGT-Element und besitzt auch eine MYB-Erkennungssequenz (MRE, MYB recognition element), die beide nötig und hinreichend für die Promotoraktivität sind und als cis-regulatorische Elemente speziell für die Lichtantwort angesehen werden. bzip-faktoren (u.a. GBFs) binden an ACGT-Elemente (Weisshaar et al., 1991) und MYB-Faktoren erkennen MREs durch ihre MYB-Repeats (z.b. R2R3) in ihrer DNA-Bindedomäne (Hartmann et al., 2005). Jedes Element für sich ermöglicht zwar eine Lichtantwort in diesem Falle die Produktion von Flavonoiden aber nur in Kombination kann diese vollständig ausgeführt werden. Williams et al. (1992) zeigten, dass die flankierende Sequenz eines ACGT-Motivs die spezifische Bindung von bzips beeinflusst. Möglicherweise ist auch der Abstand von cis-regulatorischen Elementen relevant für ihre Funktion (Hartmann et al., 2005). In Zea mays wurden weitere cis-elemente gefunden, die ebenfalls für ihre Coaktivierung durch spezifische MYB- und bhlh-faktoren wichtig sind (Bodeau und Walbot, 1996). Hartmann et al. (2005) postulierten, dass verschiedene Zweige der Flavonoid-Biosynthese durch mehrere unterschiedlich kontrollierte MYB-Faktoren reguliert werden. Hierbei werden eventuell Interaktionen der MYB-Faktoren mit anderen Transkriptionsfaktoren unterschiedlich kombiniert. Die Gruppe stellte die Hypothese auf, dass zumindest im Falle der Flavonoid-Biosynthese, bzips vorwiegend in Abhängigkeit eines Stimulus die Genexpression steuern und bhlhs die speziellen Gene eher abhängig vom Zelltyp regulieren. Mitglieder beider Transkriptionsfaktor-Familien können mit MYB-Faktoren interagieren und so spezifische Kombinationen für eine Aktivierung der Genexpression bilden. 1.5 Der Mediator-Komplex Transkriptionsfaktoren können zwar sequenzspezifisch DNA binden, sind allein jedoch nicht in der Lage, regulatorische Signale auf die basale Transkriptionsmaschinerie zu übertragen. Sie sind dafür auf Cofaktoren angewiesen, welche die Aktivierung oder Reprimierung der Transkription vermitteln. Hierbei kommt dem Mediator-Komplex eine wichtige Rolle zu (Abbildung 1-2). Er ist 10

23 Einleitung ein großer Multiprotein-Komplex, der in allen eukaryotischen Organismen, von der Hefe bis zum Menschen, konserviert ist (Malik und Roeder, 2000). Der Mediator-Komplex gehört zu den wichtigsten Cofaktoren für die Transkription. Er besteht aus drei Hauptdomänen, dem head, middle und tail mit einer zusätzlichen, nicht festen Kinasedomäne (Dotson et al., 2000) und bildet die Brücke zwischen sequenzspezifischen Transkriptionsfaktoren und der basalen Transkriptionsmaschinerie, insbesondere der RNA-Polymerase II (Kim et al., 1994). Er interagiert sowohl mit genspezifischen Aktivatoren und Repressoren der Transkription, als auch mit einigen generellen Transkriptionsfaktoren am Corepromotor, die den Präinitiationskomplex der Transkription bilden (Courey, 2008). Zu den wichtigsten Funktionen des Mediators zählt die Rekrutierung und Stabilisierung der RNA-Polymerase II an Promotorelementen (Blazek et al., 2005). Der Mediator-Komplex ist dabei nicht nur für die aktivierte sondern auch für die basale Transkription essentiell (Kim et al., 1994, Mittler et al., 2001). Auch könnte er bei der Regulation von Transposons und somit beim Gene Silencing (Kim et al., 2011), bei der Stabilisierung der DNA- (Kobbe et al., 2008) und Chromatinstruktur (Kagey et al., 2010) beteiligt sein. Diese Befunde lassen vermuten, dass spezifische Untereinheiten des Mediator-Komplexes auch an der Steuerung komplexer physiologischer Prozesse in Arabidopsis beteiligt sind. Auch in Arabidopsis thaliana konnte die Existenz eines Mediator-Komplexes biochemisch nachgewiesen werden (Bäckstrom et al., 2007). Dabei wurden die Arabidopsis Proteine STRUWWELPETER (SWP) und PHYTOCHROME AND FLOWERING TIME 1 (PFT1) als Mediator-Untereinheiten MED14 und MED25 identifiziert. SWP übt eine wichtige Funktion bei der Kontrolle der Zellproliferation, Zellanzahl und der Entwicklung des Sprossmeristems aus (Autran et al., 2002). Die Funktionen von PFT1 werden im nächsten Abschnitt näher beschrieben PFT1 PFT1 (PHYTOCHROME AND FLOWERING TIME 1) ist ein kernlokalisiertes, 836 Aminosäuren langes Protein und besitzt mehrere Domänen: Am N-Terminus befindet sich eine von Willebrand Faktor Typ A Domäne (vwa) (Cerdan und Chory, 2003). Diese sind an verschiedenen zellulären Prozessen beteiligt und vermitteln Protein-Protein-Interaktionen (Hinshelwood und Perkins, 2000). Danach folgt eine Formin homologe 1 Domäne (FH). 11

24 Einleitung Formine sind an Aktin-abhängigen Prozessen, z.b. der Cytokinese beteiligt (Frazier und Field, 1997). Am C-terminalen Ende ist eine glutaminreiche Region (Qn) zu finden, die einigen Transkriptionsaktivatoren ähnelt (Escher et al., 2000) und als Co-Aktivator bei der Transkription wirken könnte. Die eid3-mutation, ein Aminosäureaustausch an AS 650 (Threonin) zu Methionin (Klose, 2011, Abschnitt 1.4.2), befindet sich in der minimal-vp16 Interaction Domain (VP16), die dem humanen Med25 ähnelt. hmed25 interagiert mit dem Transkriptionsaktivator VP16 (Mittler et al., 2003). Die VP16-Domäne ist innerhalb verschiedener Pflanzenfamilien hoch konserviert (Bäckstrom et al., 2007), was durch die Komplementation des Phänotyps der pft1- Mutante in Arabidopsis thaliana mit MED25 aus Weizen gezeigt werden konnte (Kidd et al., 2009). PFT1 wurde als Komponente des PhyB-Signalweges beschrieben, die an der Steuerung des Blühzeitpunktes beteiligt ist, indem es antagonistisch zu PhyA und PhyB wirkt (Cerdan und Chory, 2003) und somit die Blütenbildung vorantreibt. Pflanzen sind in der Lage, die Tageslänge zu messen. Der Photoperiodismus ist vor allem für die Regulation der Blühinduktion bedeutsam. Arabidopsis thaliana ist eine fakultative Langtagpflanze und blüht daher bei langen Tagen früher als bei kurzen Tagen (Karlsson et al., 1993). CO (CONSTANS) und FT (FLOWERING LOCUS T) sind zentrale Signalkomponenten der photoperiodischen Blühinduktion (Putterill et al., 1995, Kardailsky et al., 1999). Die Expression von CO wird circadian reguliert, sodass hohe Transkriptmengen nur in Langtagen am Ende der Lichtphase auftreten (Suárez-López et al., 2001). Unter diesen Bedingungen induziert CO die Expression von FT, welches wiederum gemeinsam mit anderen Faktoren die Expression von Blütenmeristem-Identitätsgenen aktiviert und damit die Blütenbildung auslöst (Yanovsky und Kay, 2002, Wigge et al., 2005). Um seine Wirkung zu entfalten, muss CO jedoch durch Lichtsignale posttranslational stabilisiert werden, da es im Dunkeln rasch abgebaut wird. Dabei wirken die Photorezeptoren PhyA und CRY2 (CRYPTOCHROME 2) stabilisierend auf CO, während PhyB einen CO-Abbau bewirkt (Valverde et al., 2004). FT und CO sind Hauptziele downstream von PFT1. Zudem kann PFT1 FT unabhängig von CO aktivieren (Iñigo et al., 2012a). Außerdem hat PFT1 auch eine wichtige Funktion in der Jasmonatabhängigen Pathogenabwehr mit einer in pft1-mutanten erhöhten Empfindlichkeit gegenüber nekrotischen Pilzen in den Blättern und einer erhöhten Resistenz gegenüber Pilzen, die die Wurzel angreifen. Hierbei ergaben sich reduzierte Transkriptmengen Jasmonat-induzierter Gene der Pathogenabwehr (Kidd et al., 2009). PFT1 ist an der Regulation der Pflanzenorgangröße beteiligt, indem es die Zellexpansion und -proliferation begrenzt (Xu und Li, 2011). Kürzlich wurden zwei Interaktionspartner (ZFHD1 (ZINC FINGER HOMEODOMAIN 1) und DREB2A (DRE-BINDING PROTEIN 2A)) von PFT1 identifiziert, die an der Regulation bei 12

25 Einleitung Salz- und Trockenstress, also abiotischer Faktoren beteiligt sind. Hierbei zeigte sich die pft1- Mutante toleranter gegenüber Trockenheit (Elfving et al., 2011), was mit der positiven Rolle von PFT1 im JA-Weg erklärt werden kann; denn dieser wirkt antagonistisch zum ABA-Signalweg, der bei der Trockenstressantwort eine Rolle spielt (Anderson et al., 2004). Des Weiteren wurden zwei Proteine, MBR1 (MED25 BINDING RING-H2 PROTEIN 1) und MBR2 (MED25 BINDING RING-H2 PROTEIN 2) identifiziert, die mit PFT1 interagieren und die Blütenbildung vorantreiben, was sowohl abhängig als auch unabhängig von PFT1 geschieht (Iñigo et al., 2012). Die Arbeitsgruppe zeigte außerdem, dass PFT1 über das Proteasom abgebaut wird und dies mit seiner Rolle in der Expression von FT zusammenhängt. Die beiden oben genannten Proteine führen PFT1 zur Degradation über ihre typische E3-ubiquitin-Ligase-Aktivität (Iñigo et al., 2012b) eid3 Die Untersuchung von Photomorphogenesemutanten in Arabidopsis thaliana ermöglicht Abbildung 1-3 eid3-phänotyp im Vergleich zum Wildtyp im dunkelroten Licht. Die die Gewinnung neuer Erkenntnisse über die Keimlinge wurden für vier Tage unter schwachem dunkelroten Phytochromsignaltransduktion. Wie oben Licht aufgezogen. Der Wildtyp Ler hat ein langes Hypokotyl erwähnt, existiert eine dominante, natürliche und geöffnete Kotyledonen. Die eid3-mutante zeigt ein stark Mutante mit einer extrem erhöhten verkürztes Hypokotyl mit vermehrtem Anthocyangehalt. Lichtempfindlichkeit (empfindlicher im dunkelroten Verändert nach Klose et al., Licht 3), die von unserer Arbeitsgruppe (Klose et al., 2012) beschrieben wurde (Abbildung 1-3). Sie wurde bei einem Screening nach hypersensitiven Mutanten im PhyA-Signalweg isoliert. Das eid-screeningprogramm beinhaltet drei bis vier Tage Bestrahlung von Keimlingen mit einem Wechsel von jeweils 20 min hell- und dunkelrotem Licht (Büche et al., 2000). Die eid3-mutante enthält eine Missensemutation in der VP16-Domäne von PFT1, die eine sehr geringe Konservierung zum humanen MED25 aufweist, aber innerhalb der Pflanzen hochkonserviert ist. Für diese Domäne in PFT1 wurde daher eine Interaktion mit pflanzenspezifischen Transkriptionsfaktoren vermutet (Bäckstrom et al., 2007). Hierbei ist das Threonin an Aminosäure 650 durch ein Methionin ausgetauscht. Die Mutante ist hypersensitiv im dunkelroten Licht, d.h. ein Keimling dieses Genotyps bildet ein sehr kurzes Hypokotyl schon bei geringeren Photonenflüssen aus und tritt so früher in die Photomorphogenese ein als ein Wildtypkeimling. 13

26 Einleitung Die Mutation ist dominant und ein Gain-of-Function Allel von PFT1, sodass das mutierte Protein einen konstitutiv aktiven Transkriptionsregulator darstellt und daher auch im Dunkeln eine leichte konstitutive Photomorphogenese zeigt. In Genexpressionsstudien wurde eine konstitutive Expression lichtregulierter Gene im Dunkeln festgestellt. Zu den im Vergleich zum Wildtyp, stärker exprimierten Genen in eid3 gehören Proteine der Chloroplasten-Entwicklung und Enzyme der Flavonoid-Biosynthese, die mit der Photomorphogenese eines Keimlings in Zusammenhang stehen. Bei den Genen, die eine verminderte Expression in eid3 haben, handelt es sich um Faktoren der Transkriptionsregulation, Signaltransduktion, Zellteilung und Mobilisierung von Nährstoffspeichern. Letztere werden beim Übergang von der Skoto- zur Photomorphogenese wahrscheinlich unterdrückt, um den Keimling vom heterotrophen zum photoautotrophen Organismus zu transformieren. Epistasieanalysen mit verschiedenen DNA-bindenden Proteinen (z.b. HY5, Abschnitt 1.3.2), die positiv in der Lichtsignaltransduktion wirken, zeigten, dass diese notwendig für die Ausbildung des hypersensitiven Phänotyps der eid3-mutante sind. Der epistatische Effekt der hy5-1-mutante auf die eid3-mutation zeigt, dass PFT1 bzw. PFT1 eid3 ein positiver Regulator der HY5-Expression ist. Die im Vergleich zum Wildtyp abweichend regulierten Gene in eid3 decken sich z.t. mit Zielgenen des Transkriptionsfaktors HY5 (Abschnitt 1.3.2). PFT1 eid3 wirkt als positiv wirkender Faktor down-stream von PhyB und PhyA in der Lichtsignaltransduktion und reguliert die VLFR und die HIR im dunkelroten Licht. Auch downstream von Blaulichtrezeptoren hat PFT1 eine Funktion. Die eid3-mutante zeigt Veränderungen in der Blühinduktion, die auch von PhyA abhängen. So blühen eid3-pflanzen sowohl unter Kurztag- als auch Langtagbedingungen früher als der Wildtyp, indem die Expression von FT erhöht wird (Klose et al., 2012). 1.6 Die Jasmonat-Signaltransduktion Jasmonat (JA) reguliert die Abwehr von Pflanzen gegen Pathogene, Herbivoren und Verletzungen, sowie verschiedene entwicklungsspezifische Prozesse (Wasternack, 2007). Hierbei stellen JAZ-Proteine (JASMONATE ZIM-DOMAIN) Transkriptionsrepressoren dar. Die beiden Signalkomponenten COI1 (CORONATINE INSENSITIVE 1) und MYC2/JIN1 (JASMONATE INSENSITIVE 1) sind an der Regulation dieser Faktoren beteiligt (Kazan und 14

27 Einleitung Manners, 2011), bzw. besteht zwischen MYC2 und JAZ ein negativer feed-back-loop (Turner, 2007). COI1 ist Teil einer E3-Ubiquitinligase (SCF COI1 ), die JAZ-Proteine zum proteolytischen Abbau markiert (Devoto et al., 2002) JAZ-Proteine In Arabidopsis gibt es 12 JAZ-Proteine, die Homo- und Heterodimere bilden können (Chini et al., 2007). Die JAZ-Proteine beinhalten in ihrer C-terminalen Region eine Jas-Domäne (JAassociated), die notwendig und hinreichend für die Interaktion mit COI1 ist (Katsir et al., 2008). Diese Domäne bildet eine zweiteilige Struktur: ein Loop, der als Tasche für das JA-Ile dient, bindet JA-Ile und COI1 und eine α-helix, die das COI1 bindet und so notwendig für die Funktion als Corezeptor ist (Pauwels und Goossens, 2011). Einige JAZ-Proteine interagieren über ihre Jas-Domäne mit R2R3-MYB-Proteinen, wie z.b. PAP1 (PRODUCTION OF ANTHOCYANIN PIGMENT 1), das bei der Anthocyanbiosynthese eine Rolle spielt (Qi et al., 2011) oder MYB21 und MYB24, welche bei Reifung der Stamina eine regulatorische Rolle einnehmen (Pauwels und Goossens, 2011). MYB21/24 interagieren mit den JAZ-Proteinen über ihre R2R3-Domäne (Song et al., 2011). Durch die oben genannten DELLA-Proteine können die Signalwege von JA und GA untereinander koordiniert werden (Pauwels und Goossens, 2011): DELLA-Proteine konkurrieren mit MYC2 um eine Interaktion mit JAZ. Bei Behandlung mit GA wird die Menge an DELLA- Proteinen herabgesetzt und die Bindung von MYC2 an Promotoren mit G-Boxen sinkt. Ohne GA binden die DELLA-Proteine JAZ, und MYC2 kann JA-regulierte Gene aktivieren. Die vielfältigen Interaktionen von JAZ mit anderen Proteinen können die Erklärung für die Existenz von sehr großen JAZ-haltigen Komplexen von mehr als einem MDa Molekulargewicht sein (Geerinck et al., 2010). JAZ-Proteine sind also als Repressoren an verschiedenen Signalwegen beteiligt und besitzen unterschiedliche Mechanismen für die Repression von Transkripstionsfaktoren (Pauwels und Goossens, 2011). 15

28 Einleitung MYC2/JIN1 MYC2 ist ein bhlh-transkriptionsfaktor, der diverse JA-abhängige Gene sowohl positiv als auch negativ reguliert (Dombrecht et al., 2007) und mit seiner bhlh-domäne an G-Boxen von Promotoren bindet. Eine positiv regulatorische Funktion von MYC2 ist die JA-abhängige Inhibition des Hauptwurzelwachstums und der Anthocyanbiosynthese (Pauwels und Goossens, 2011). Bei der Resistenz gegenüber nekrotischen Pilzen nimmt MYC2 die Funktion eines negativen Regulators ein. MYC2 kann mit seinem C-Terminus mit anderen bhlh-proteinen wie EGL3 (ENHANCER OF GL3) Hetero- aber auch Homodimere bilden (Pauwels und Goossens, 2011). Im N-Terminus von MYC2 befindet sich eine konservierte Domäne, die für die Interaktion mit JAZ-Proteinen notwendig ist (JID: JAZ INTERACTING DOMAIN) (Fernández-Calvo et al., 2011). JID-Domänen wurden auch in anderen bhlh-proteinen wie TT8 gefunden, die auch mit JAZ-Proteinen interagieren und so mit diesen zusammenwirken, jedoch ist hierbei die JID-Domäne für die Interaktion nicht notwendig (Pauwels und Goossens, 2011). Die Induktion der Anthocyanbiosynthese durch JA benötigt COI1 und die bhlh-proteine TT8 und MYC2 (Pauwels und Goossens, 2011). Sobald die JA-Konzentration gering ist, interagieren JAZ-Proteine mit MYC2 und stoppen so dessen Expression und Aktivität als Transkriptionsinitiator. Wenn die JA-Konzentration durch Stress in der Pflanze erhöht ist, initiiert das bioaktive Derivat JA-Isoleucin die Degradation der JAZ-Proteine und gibt MYC2 als aktivierenden Transkriptionsfaktor der Pathogenabwehr frei (Kazan und Manners, 2011). Abbildung 1-2 zeigt ein Modell des Jasmonat-Signalweges. 16

29 Einleitung Abbildung 1-2 Modell der Regulation der JA-Antwort. JA hemmt JAZ-Proteine, die negative Regulatoren der JA-Antwort sind. COI1 markiert diese JAZ-Proteine zur Degradation. Der Transkriptionsfaktor MYC2 wird so freigegeben, um an Promotoren von JA-induzierten Genen zu binden, die als Antwort auf eine erhöhte JA- Konzentration exprimiert werden. JA: Jasmonat, COI1: CORONATINE INSENSITIVE 1, JAZ: JASMONATE ZIM-DOMAIN, VSP2: VEGETATIVE STORAGE PROTEIN Verbindung zwischen Licht- und JA-Signaltransduktion MYC2 scheint ein Protein zu sein, das beide Signalwege nach Lichtgabe und nach Freisetzung von JA reguliert. Myc2-Mutanten sind sensitiv gegenüber dunkelrotem Licht (Robson et al., 2010) und lichtinduzierte Gene werden durch dunkelrotes und blaues Licht vermehrt exprimiert (Yadav et al., 2005). Yadav et al. (2005) zeigten außerdem eine Inhibition des Hypokotylwachstums von myc2-mutanten im blauen Licht, was darauf hindeutet, dass MYC2 ein negativer Regulator in der Photomorphogenese nach blauem Licht ist. MYC2 bindet als Transkriptionsfaktor an die G-Box im Promotor von SPA1 (Gangappa et al., 2010), dem Suppressor von PhyA (Höcker et al., 1998, 2001). MYC2 und SPA1 wirken im Dunkeln redundant und im Licht synergetisch, um die Photomorphogenese zu unterdrücken (Gangappa et al., 2010). PhyA-Mutanten sind weniger sensitiv gegenüber MeJA (Robson et al., 2010), was auf eine reziproke Interaktion zwischen den Signalketten von JA und dunkelrotem Licht hindeutet. Hierbei ist die JA-Biosynthese und JA-Signaltransduktion bei der Regulation der Pflanzenentwicklung im dunkelroten Licht beteiligt. PhyA ist wiederum für die korrekte Expression JA-induzierter Gene notwendig (Kazan und Manners, 2011). Kazan und Manners 17

30 Einleitung (2011) postulierten, dass dunkelrotes Licht verschiedene Zweige des JA-Signalwegs unterschiedlich reguliert: Pflanzen, die mit dunkelrotem Licht behandelt werden, exprimieren nach MeJA-Behandlung mehr MYC2 und VSP1 (VEGETATIVE STORAGE PROTEIN 1), während ERF1 (ETHYLENE RESPONSE FACTOR 1) und PDF1.2 (PLANT DEFENSIN 1.2) weniger stark exprimiert werden. Auch HY5 spielt eine Rolle im JA-Signalweg (Lau und Deng, 2010), indem es an den Promotor eines Gens bindet, das bei der JA-Biosynthese mitwirkt und so die JA-Produktion reguliert (Kazan und Manners, 2011). 18

31 Einleitung 1.7 Ziele der Arbeit In dieser Arbeit sollten Interaktionspartner von PFT1 identifiziert werden, um dessen Funktion im Netzwerk der Proteine in der Lichtsignaltransduktion weiter zu untersuchen. Hierzu sollten mittels Bimolekularer Fluoreszenzkomplementation (BiFC) und Yeast-two-Hybrid verschiedene im Lichtsignalweg involvierte Proteine auf deren potenzielle Interaktion mit PFT1 und dem mutierten Protein PFT1 eid3 getestet werden. Die missense-mutante von PFT1 eid3 sollte mittels quantitativer Real-Time-PCR auf ihre spezifischen Expressionsmuster lichtregulierter Gene näher charakterisiert werden. Des Weiteren sollten PFT1-Konstrukte mit eigens eingebrachten Punktmutationen einzelne Aminosäuren identifizieren, die für die Proteinfunktion wichtig sein könnten. Die Funktion von PFT1 sollte auch in der Hormonsignaltransduktion von Jasmonat mittels physiologischen und semiquantitativen RT-PCRs näher untersucht werden. HY5 und LAF1 sind bereits bekannte, gut charakterisierte Transkriptionsfaktoren aus der Lichtsignaltransduktion. Nach Identifikation von LAF1 als Interaktionspartner von PFT1 lag ein Fokus dieser Arbeit auf der Doppelmutante eid3 laf1, die neu hergestellt wurde und die neben qrt-pcr auch auf physiologischer Ebene im Hinblick auf die frühe Keimlingsentwicklung und Anthocyan-Akkumulation im hell- und dunkelroten Licht untersucht werden sollte. Ein zweiter Hauptpunkt stellte HY5 dar, dessen Doppelmutante mit eid3 bereits teilweise beschrieben war. Auch hier sollten Genexpressionsanalysen durchgeführt werden. Zudem sollte nach einer möglichen Korrelation des Promotors von HY5 mit der eid3-mutation gesucht werden. 19

32 Material und Methoden 2 Material und Methoden 2.1 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien Produkt Ammoniumpersulfat (APS) Ampicillin sodium Bacto-Agar Bacto-Peptone Bacto-Tryptone Bacto-Yeast Extract Complete Supplement Mixture (CSM)-Pulver Dimethylsulfoxid (DMSO) Ethidiumbromid Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Filterpapiere zur Aussaat (MN 615, d=80 mm) Gentamycinsulphat Glaskügelchen (#A556.1) Goldpartikel (60 mg) Kanamycinesulphatmonohydrat MS-Medium Natrium Dodecylsulfat (SDS) Polyethylensorbitanmomolaurat (Tween20) Rifampicin Tetramethylethylendiamin (TEMED) Triton-X-100 β-mercaptoethanol Bezugsquelle Roth, Karlsruhe Duchefa Biochemie B.V., Harleem, Netherlands Becton, Dickinson and Company, Frankreich Becton, Dickinson and Company, Frankreich Becton, Dickinson and Company, Frankreich Becton, Dickinson and Company, Frankreich MP Biomedicals, USA Roth, Karlsruhe Roth, Karlsruhe Roth, Karlsruhe Macherey-Nagel Duchefa Biochemie B.V., Harleem, Netherlands Roth, Karlsruhe Sigma, Deisenhofen Duchefa Biochemie B.V., Harleem, Netherlands Duchefa Biochemie B.V., Harleem, Netherlands Roth, Karlsruhe Roth, Karlsruhe Duchefa Biochemie B.V., Harleem, Netherlands Sigma, Deisenhofen Roth, Karlsruhe Roth, Karlsruhe 2.2 Geräte 7300 Real-Time-PCR System (Applied Biosystems, USA) Anzuchtschrank MLR-351 (SANYO) Bakterienanzucht, Certomat BS-T (B.Braun, Biotech International) Blottinganlage, Trans-Blot -SD Semi-Dry Transfer Cell (BioRad, Hercules USA) Gelkammer, für Agarosegele (peqlab) Hefeanzucht, Certomat H und Certomat R (B.Braun, Biotech International) Mikroskop, Axioskop II mit angeschlossenem Axiocam Kamera System (Zeiss, Oberkochen) Partikelgun-Anlage PDS-1000/He (Biorad, Hercules USA) 20

33 Material und Methoden PCR-Cycler Labcycler Basic (SensoQuest) Quecksilberdampf-Kurzbogenlampe, HBO 100 W (Osram, Berlin) Silamat S5, (Ivoclar Vivaden) Spectrometer, NanoDrop ND-1000, PEQLAB Biotechnologie GmbH UV-Licht-Quelle, Transilluminator (Ultra-violet Products. Inc) Zentrifuge, Sorvall RC5C Plus (Thermo Scientific) Zentrifugen 5415R oder 5430 (Eppendorf) 2.3 Lichtquellen Sicherheitsgrünlicht: (nach Schäfer 1977) LED-Lampen: Green Kingbright, L-53SG (Reichelt Elektronik, Sande) Emissionsmaximum: 565 nm (Halbwertsbreite 30 nm) Standard-Hellrotfeld: Leuchtstoffröhren TL 40 W/15 (Philips, Hamburg), gefiltert durch Plexiglas 501/3 (Röhm und Haas, Darmstadt) Emissionsmaximum: 656 nm (Halbwertsbreite 24 nm) Photonenfluss: 22 μmol/(s*m 2 ) Raumtemperatur: 22 C Standard-Dunkelrotfeld: Leuchtstoffröhren Osram (Berlin) Linestra 120 W/235 V in Kombination mit Wärmeabsorptionsglas KG 3/2 (Schott, Mainz), sowie Plexigläser 501/3 und PG 627/3 (Röhm und Haas, Darmstadt) Emmissionsmaximum: 730 nm (Halbwertsbreite 128 nm) Photonenfluss: 20 μmol/(s*m 2 ) Raumtemperatur: 22 C 21

34 Material und Methoden Prado-Bestrahlungsanlage Leitz Prado 500 W (Leitz, Wetzlar) kombiniert mit Xenophot Longlife Birnen (Osram, Berlin) Filter: KG65 (Schott, Mainz) Interferenzfilter: DAL715 Raumtemperatur: 22 C Sanyo Versatile Environmental Test Chamber, Modell MLR h Nacht - 12 h Tag, Temperatur 22 C 2.4 Organismen Bakterienstämme: E.coli K12; TOP10 (Klonierungen) Argrobacterium tumefaciens Hefestämme: Pflanzen: pj694-a und α (Yeast-Two-Hybrid), Y187 (cdna-library) Sinapis alba Arabidopsis thaliana: Genotyp/Linie Hintergrund Bemerkung Referenz/Vektor Landsberg erecta Ler Wildtyp Columbia Col Wildtyp eid3 Ler Aminosäureaustausch T650A pft1-3 Col T-DNA-Insertion GenBank SALK_ pft1-2 Col T-DNA-Insertion GenBank SALK_ Kidd et al., 2009 laf1 Ler Ds-Insetion Ballesteros M.L., et.al. (2001) eid3 laf 1 Ler Kreuzung hy5-1 Ler Substitution (CAA) zu Stopcodon (TAA) Oyama T, et.al. (1997) eid3 hy5-1 Ler Kreuzung Klose, 2011 hy5-1 laf1 Ler Kreuzung P HY5 full-length HY5-Promotor , Fusion Nagy F., persönliche Ws mit LUC Übergabe P HY5 Δ HY5-Promotor , Fusion Nagy F., persönliche Ws mit LUC Übergabe 22

35 Material und Methoden Genotyp/Linie P HY5 ACGT m1 P HY5 ACGT m2 P HY5 MYB m Hintergrund Ws Ws Ws Bemerkung eid3 P HY5 full-length Ler/Ws Kreuzung eid3 P HY5 Δ Ler/Ws Kreuzung eid3 P HY5 ACGT m1 Ler/Ws Kreuzung eid3 P HY5 ACGT m2 Ler/Ws Kreuzung eid3 P HY5 MYB m Ler/Ws Kreuzung P PFT1 -PFT1 T650T -YFP pft1-2 Wildtyp T650T P PFT1 -PFT1 T650M -YFP pft1-2 HY5-Promotor Mutation bp in , Fusion mit LUC HY5-Promotor Mutation bp in , Fusion mit LUC HY5-Promotor Mutation bp in , Fusion mit LUC Amisosäureaustausch T650M = eid3 Referenz/Vektor Nagy F., persönliche Übergabe Nagy F., persönliche Übergabe Nagy F., persönliche Übergabe pb7ywg ΔP 35S, Klose, 2011 pb7ywg ΔP 35S, Klose, 2011 P PFT1 -PFT1 T650A -YFP pft1-2 Aminosäureaustausch T650A pb7ywg ΔP 35S P PFT1 -PFT1 L653Q -YFP pft1-2 Aminosäureaustausch L653Q pb7ywg ΔP 35S P PFT1 -PFT1 S656A -YFP pft1-2 Aminosäureaustausch S656A pb7ywg ΔP 35S P 35S -vwa-yfp Col vwa-domäne von PFT1 (cdna) pb7ywg P 35S -FH-YFP Col FH-Domäne von PFT1 (cdna) pb7ywg P 35S -VP16-YFP Col VP16-Domäne von PFT1 (cdna) pb7ywg 2.5 Pflanzenkultur und Transformation von Pflanzen Anzucht von Sinapis alba zur biolistischen Transformation Für die transiente Transformation von Senfkeimlingen wurden Sinapis alba-samen in Gerdadosen auf viermal gefalteter, befeuchteter Küchenrolle aufgezogen Biolistische Transformation von Sinapis alba Keimlingen Zur Vorbereitung wurden 60 mg Goldpartikel mit 1 μm Durchmesser (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) in 1 ml 100 %igem Ethanol für 10 min gewaschen, anschließend abzentrifugiert und das Gold in 1 ml 50 %igem Glycerin (steril) resuspendiert. 25 μl der Goldsuspension wurden mit den zu transferierenden Plasmiden (jeweils sechs μg Plasmid-DNA) für drei Minuten durch Vortexen gemischt. Danach wurde 25 μl 2,5 M CaCl 2 und 10 μl 0,1 M Spermidin zugefügt. Die DNA wurde durch Zugabe von 1 ml 100 %igem Ethanol gefällt. Zum Waschen wurden die Goldpartikel in 1 ml 70 %igem Ethanol resuspendiert. Die beladenen Goldpartikel wurden dann 23

36 Material und Methoden in 50 μl 100 %igem Ethanol aufgenommen. Nach jedem Schritt wurde die Probe 3 min lang geschüttelt und danach zwei Minuten bei 12ooo rpm abzentrifugiert. Bis zur Verwendung wurde die Probe bei -20 C gelagert. 10 μl der vorbereiteten Goldpartikel-Suspension wurde noch einmal durch fünf Minuten Vortexen gemischt und dann auf einer Trägerfolie (Macrocarrier, BioRad, Hercules, USA) aufgetragen und erst nach dem Verdampfen des Ethanols weiter verwendet. Für die biolistische Transformation kam die Particle Gun PDS-1000/He (BioRad, Hercules USA) zum Einsatz. Mit DNA beladene Goldpartikel werden durch Hochdruck beschleunigt und durchschlagen somit die Zellwand der Pflanze. Der angewandte Druck wird hierbei durch Folien definierter Reißfestigkeit festgelegt (Rupture Disc, BioRad, Hercules, USA). Verwendung fanden Rupture Discs der Stärke 1100 psi für die biolistische Transformation von Senf-Keimlingen. Zum Beschießen der Proben wurden die auf Objektträger geklebten Keimlinge zwei Stufen unterhalb der Goldpartikel in die Particle Gun eingelegt. Nach dem Beschuss wurden die Senf- Keimlinge über Nacht senkrecht in Objektglas-Halterungen gelagert, wobei die Wurzeln weiterhin mit Wasser versorgt waren Anzucht von Arabidopsis thaliana Anzucht auf Papier Für physiologische Experimente mit Keimlingen wurden Arabidopsis thaliana-samen in Plastikpetrischalen auf vier Lagen Filterpapier, die mit 4,5 ml ddh 2 O befeuchtet worden waren, ausgesät. Danach wurden die Petrischalen zur Stratifikation in lichtundurchlässigen Kisten für zwei bis drei Tage bei 4 C inkubiert. Die Keiminduktion erfolgte durch zweistündige Bestrahlung im Hellrotfeld. Anschließend wurden die Samen dem jeweiligen Experiment entsprechend für vier Tage bestrahlt, bzw. in der lichtundurchlässigen Kiste bei 20 C aufbewahrt. Zur Erstellung von Photonenflusskurven wurden die Petrischalen gestapelt und mit einer schwarzen Manschette zur Reduzierung von Streulicht versehen. 24

37 Material und Methoden Anzucht auf MS-Agar Zur Sterilisation von Saatgut wurden die Samen zunächst mit ddh 2 O gewaschen. Nach kurzem Abzentrifugieren wurde der Überstand entfernt und die Samen mit 30 %iger Domestoslösung zwei Minuten lang invertiert. Danach wurden die Samen dreimal mit sterilem ddh 2 O gewaschen, in 0,1 %iger Agarose aufgenommen und einzeln mittels einer 10 µl Pipette auf 0,5 x MS-Agar ausgesät. Die Platten wurden wie oben stratifiziert und dann in Sanyoschränke (12 h Tag, 12 h Nacht) gestellt. Für die Wurzellängenmessung wurden quadratische Platten mit 1 % Agar senkrecht aufgestellt. Für die Extraktion von RNA aus etiolierten Keimlingen wurden Arabidopsis thaliana-samen in Plastikpetrischalen mit 0,5x MS-Agar auf einer zusätzlichen Lage Filterpapier, die mit 1 ml ddh 2 O befeuchtet worden war, ausgesät und wie oben beschrieben in Dunkelheit aufgezogen. Zur Behandlung mit Methyljasmonat wurde ein kleines Stück Filterpapier mit 10 µl 1 M MeJA- Lösung getränkt und in die Petrischale gelegt. 0,5 x MS-Agar: 2,45 g/l M&S (Duchefa) ph 5,7 mit KOH 0,8 % Phytagel Anzucht auf Erde Zur Einzelpflanzenaufzucht und Produktion größerer Samenmengen wurden Pflanzen mit Hilfe des ARA-Systems auf Erde angezogen. Die Trays mit Pflanzkörbchen oder großen Pflanztöpfen wurden nach der Aussaat in einen Autoklaviersack verpackt und zur Stratifikation für zwei bis drei Tage bei 4 C inkubiert. Anschließend wurde die Aussaat in eine Phytokammer verbracht. Nach 5-7 Tagen wurde der Autoklaviersack entfernt. Nach zwei Wochen wurden überschüssige Pflanzen aus den Aussaatkörbchen entfernt bzw. pickiert. Nach einsetzender Blüte wurden die Pflanzen zum Schutz vor Kreuzungen mit Aracon-Ständern und Araconfolien versehen. Nach vollständigem Abtrocknen der Pflanzen wurden die Samen geerntet. 25

38 Material und Methoden Agrobakterium-vermittelte Transformation von Arabidopsis thaliana Zur Transformation von A. thaliana-pflanzen durch A. tumefaciens wurde die Infiltrationsmethode (Floral dip) verwendet (Clough und Bent, 1998). Hierbei werden die oberirdischen Teile von ca. sechs Wochen alten Pflanzen in eine Agrobacterium-Suspension eingetaucht. Die Pflanzen wurden einen Tag vor der Transformation gut gewässert. Unmittelbar vor der Transformation wurden bereits geöffnete Blüten und vorhandene Schoten entfernt. Die Herstellung der Agrobacterium-Suspension erfolgte in zwei Schritten: Es wurde eine Agrobacterium-Vorkultur in 4 ml YEB-Medium (mit 50 mg/l Gentamycin und 100 mg/l Rifampicin) angesetzt, die über Nacht bei 28 C unter Schütteln (180 Upm) gewachsen war. Von dieser Vorkultur wurde 1 ml abgenommen und in 400 ml YEB-Medium (mit 50 mg/l Gentamycin und 100 mg/l Rifampicin) gegeben. Diese Übernachtkultur wuchs bei 28 C unter Schütteln (180 Upm). Am nächsten Tag wurden die Zellen 10 min bei 5000 g abzentrifugiert und in 800 ml Infiltrationsmedium resuspendiert. Die oberirdischen Teile der Pflanzen wurden unter Rühren für zehn Sekunden in die Bakteriensuspension getaucht. Die Pflanzen wurden über Nacht liegend und abgedeckt aufbewahrt. Am nächsten Tag wurden sie wieder aufgestellt und bis zur Samenreife wachsen gelassen. YEB-Medium: Infiltrationsmedium: 0,5 % Rinder-Extrakt 0,05 % Saccharose 0,1 % Hefe-Extrakt 0,0005 % Silwet L77 0,5 % Pepton 0,5 % Saccharose 0,049 % MgSO Basta-Selektion transformierter Arabidopsis thaliana-samen Größere Mengen transformierten Saatguts wurden zur Selektion der Basta-resistenten transformierten Pflanzen in großen Trays auf Erde ausgesät. Die vierblättrigen Pflänzchen wurden zweimal im Abstand von etwa fünf Tagen mit einer verdünnten Lösung des Herbizids Basta besprüht (375 μl Basta in 500 ml Wasser). Die Basta-resistenten Pflänzchen wurden einzeln in Töpfchen überführt und weiter kultiviert. 26

39 Material und Methoden 2.6 Genotypisierung von Arabidopsis-Mutanten DNA-Isolierung Zur Genotypisierung von durch Kreuzung hergestellten Doppelmutanten, bzw. neuen T-DNA- Insertionslinien wurde genomische DNA isoliert. Dafür wurde Blattmaterial (2-4 kleine Blätter) in einem Eppendorfgefäß mit einem Kunststoff- Pistill vor und nach Zugabe von 500 μl DNA-Extraktionspuffer zermörsert und gemischt. Danach erfolgte eine Zentrifugation (5 Minuten, Upm). 350 μl des Überstandes wurden in ein neues Eppendorfgefäß überführt, in dem 350 μl Isopropanol vorgelegt waren. Durch Invertieren wurden beide Flüssigkeiten gemischt. Nach 2 min Inkubation bei Raumtemperatur wurde wiederum zentrifugiert (10 Minuten, Upm). Der Überstand wurde danach verworfen, das DNA-Pellet ca. 15 Minuten getrocknet und mit 300 μl TE-Puffer bei 37 C 15 Minuten unter Schütteln gelöst. Für eine PCR wurden 2 μl dieser Lösung eingesetzt. DNA-Extraktionspuffer: 2,42 % Tris-HCl ph 9,0 mit HCl 1,7 % LiCl 0,93 % EDTA 1 % SDS Genotypisierung PCR-Reaktion: 2 μl genomische DNA 1 x PCR Puffer (Genaxxon) 200 pmol dntps (Genaxxon) 10 pmol forward-primer 10 pmol reverse-primer 1,5 U Taq-Polymerase (Genaxxon) 27

40 Material und Methoden PCR-Programm nach Anleitung des Polymeraseherstellers (Geneaxxon, Deutschland: Standard DNA amplification assay, Version: ). Ggf. Restriktionsverdau (dcaps-marker): 20 μl PCR-Produkt 1x Puffer (NEB) 5000 U Restriktionsenzym (NEB) 1 h, 37 C. Die verwendeten Primer und Enzyme befinden sich im Anhang. 2.7 Physiologische Experimente Hypokotyllängen- und Wurzellängenmessung von Arabidopsis-Keimlingen Keimlinge, deren Hypokotyllängen gemessen werden sollten, wurden reihenweise auf mit schwarzen Streifen bedrucktem Papier auf Klebefilm fixiert und eingescannt. Zur Messung der Wurzellänge wurden die MS-Agarplatten an den gegebenen Zeitpunkten eingescannt. Die Pflanzenteile wurden digital mit dem Computerprogramm ImageJ bestimmt. Jeder Versuchsansatz wurde mindestens zweimal unabhängig voneinander durchgeführt. Je Versuchsansatz und Linie wurden 15 bis 20 Keimlinge gemessen. Aus den Messergebnissen wurden die Mittelwerte und Standardfehler des Mittelwertes (SEM) errechnet Anthocyanextraktion und messung Die auf Papier angezogenen Keimlinge wurden geerntet und ihre Masse bestimmt. Danach wurden diese in Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt, in die zuvor 750 µl Extraktionspuffer vorgelegt worden war. Die Keimlinge wurden im Wasserbad bei 100 C für 1 min gekocht, auf Eis gestellt und unter kontinuierlichem Schütteln bei 4 C über Nacht inkubiert. Danach wurden die Eppis in der gekühlten Zentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit 10 min zentrifugiert. Die Absorbanz des Überstandes wurde sowohl bei 535 nm als auch bei 650 nm am Photometer 28

41 Material und Methoden Ultrospec 3000 (Pharmacia Biotech) gemessen. Zur Berechnung des Anthocyangehaltes wurde folgende Formel verwendet: Anthocyangehalt = A 535 2,2*A 650 (Schmidt und Mohr, 1981). Anthocyan-Extraktionspuffer: 18% 1-Propanol 1% HCl 2.8 Mikroskopie Mikroskopische Untersuchungen wurden am AxioskopII (Zeiss, Oberkochen) vorgenommen. Als Strahlenquelle diente eine Quecksilberdampf-Kurzbogenlampe, HBO 100 W (Osram, Berlin). Zur Analyse der intrazellulären Lokalisation der YFP-Derivate wurden verschiedene Filtersätze (AHF Analysetechnik, Tübingen) verwendet: Filtersatz Excitation Farbteiler Emission Verwendung CFP D 436/ DCLP D 480/40 CFP YFP HQ 500/20 Q 515/LP HQ 636/30 YFP Mikroskopie von Arabidopsis Keimlingen Für Einzelanalysen wurden Arabidopsis-Keimlinge in einen Tropfen Wasser auf ein Objektglas gelegt und mit einem Deckglas bedeckt. Für die Mikroskopie wurde ein Öl-Objektiv (Plan- APOCHROMAT, 63x, Zeiss) verwendet Mikroskopie von Sinapis Keimlingen Die auf Objektgläsern fixierten Senfkeimlinge wurden auf die Breite des Objektglases zugeschnitten. Hierzu wurden über das Objektglas hinausragende Kotyledonen und Wurzeln mit dem Skalpell entfernt. Zur Analyse wurden die Keimlinge in einer Plexiglas- Wanne unter Wasser mit einem Keramik-Objektiv (40x) untersucht. 29

42 Material und Methoden 2.9 Experimente mit Hefe Die Versuche wurden nach folgenden Veröffentlichungen durchgeführt: Bartel, 1993, Fritz und Green (1992). Alle Lösungen, die beim Arbeiten mit Hefezellen verwendet wurden, wurden vorher autoklaviert Transformation von Hefezellen Zwei mal 5 ml YPD-Medium (ggf. selektiv) wurden mit einer Hefekolonie angeimpft und bei 30 C und 180 rpm über Nacht geschüttelt. Zwei mal 4 ml Übernachtkulturen wurden in 100 ml YPD für weitere 2-4 h bei 30 C und 180 rpm wachsen gelassen. 40 ml der Kultur wurden in ein steriles Falkon überführt und 5 min bei 2000 rpm abzentrifugiert. Das überstehende Medium wurde abgegossen und das Pellet in 20 ml sterilem ddh 2 O vorsichtig resuspendiert und wieder wie oben abzentrifugiert. Nach Entfernen des Überstandes wurde das Pellet in 20 ml TE/LiAc aufgenommen, zentrifugiert und der Überstand entfernt. Nun wurden die Zellen in 400 µl TE/LiAc aufgenommen und 50 µl der Zellsupension zur Transformation verwendet. Der A-Stamm wurde immer mit dem Aktivierungsdomänenvektor und der α-stamm mit dem Bindedomänenvektor transformiert. In einem 2 ml Eppendorfgefäß wurden 0,5 2 µg Plasmid und 5 µl Salmon-Sperm-Carrier-DNA (in TE) mit den Hefezellen gut gemischt und mit 250 µl PEG-Lsg versetzt. 30 min wurde bei 30 C und gelegentlichem Invertieren inkubiert. Nach Zugabe von 15 µl DMSO erfolgte der Hitzeschock für 15 min bei 42 C im Wasserbad. Nach vorsichtigem Abzentrifugieren für sec bei maximal 1000 rpm und Abziehen des Überstandes wurde das Pellet in 200 µl 0,9 %iger NaCl-Lösung resuspendiert und auf die jeweilige SD-Platte ausplattiert. Diese wurden dann bei 30 C 2-4 d inkubiert. YPD-Medium TE/LiAc PEG-Lösung 2 % Pepton 0,1 M Liciumacetat 50 % PEG % Hefeextrakt ph 7,5 mit Essigsäure in TE/LiAc 2 % Glucose 12 mm Tris-HCl 1 mm EDTA 30

43 Material und Methoden Transaktivität und Interaktionstest Transformierte Hefezellen wurden zum Test auf Transaktivität des betreffenden Proteins auf die SD-Platte gebracht, die zur Interaktionsselektion vorgesehen war. Wenn keine Kolonien sichtbar wurden, so war das Protein nicht transaktivierend. Zum Interaktionstest (Mating) wurde je eine Kolonie des A- und des α-stammes in 50 µl YPD und 150 µl ddh 2 O in einem 2 ml Eppendorfgefäß gemischt und über Nacht bei 30 C inkubiert. Am nächsten Tag wurden Tropfen à 10 µl auf Selektionsmedium gebracht und 2 Tage bei 30 C wachsen gelassen. SD-Medium 0,67 % Yeast-Nitrogenase Base (BD Difco, USA) x % CSM-Pulver (Menge nach Packunsangabe; MPbio, USA) ph 5,8 mit KOH 2% Glucose 2 % Agar 3 mm 3-Aminotriazol Herstellung der cdna-library und deren Screen Zur Herstellung der cdna-library wurden vier Tage alte Wildtypkeimlinge (Col) zum einen im Dunkeln belassen und zum anderen in dunkelrotes Licht gestellt und jeweils nach einer und sechs Stunden geerntet. Die RNA-Isolation wurde wie in Abschnitt beschrieben durchgeführt und die gesamte RNA vereinigt, danach wurde das Make your own Mate & Plate TM Library System von Clontech (USA) benutzt und nach Anleitung des Herstellers durchgeführt (Manual 19. November 2008). Der Screen einer Library wurde nach Anleitung von Clontech (USA) Yeastmaker TM Transformation System 2 durchgeführt (Manual 21. November 2008). Yeast 2.10 Klonierungen der verwendeten Plasmide Für die PCRs der Klonierungen wurde die Phusion TM High-Fidelity DNA Polymerase von Finnzymes (Finnland, Manual Version 1.5, Juni 2007) verwendet. Zunächst wurden die zu 31

44 Material und Methoden klonierenden Gene/DNA-Sequenzen per pentr D-TOPO Directional Cloning Kit (Invitrogen, USA, Manual Version G 6. April 2006) in den Entryvektor gebracht und danach per Gateway recombination cloning (Invitrogen, USA, Manual Version 2004, Seite 3 auf in den Expressionsvektor überführt. Die Punktmutationen zum Aminosäureaustausch im PFT1-Protein wurden durch zielgerichtete Mutagenese des P PFT1 -PFT1 T650M -YFP-Plasmides mit spezifischen Primern und anschließendem DpnI-Verdau eingeführt. Die verwendeten Plasmide und Primer sind im Anhang angegeben. Nach Transformation in chemokompetente E.coli-Zellen und Isolierung von Plasmid-DNA per GeneJet TM Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Manual auf Seite 4) wurden die Klone sequenziert (GATC-biotech, Deutschland) und durch Alignment ( auf ihre Richtigkeit überprüft. Zur biolistischen Transformation wurden Maxipräps (Jetstar 2.0 Plasmid Maxi Prep Kit, Genomed, Deutschland, Manual März 2003) aus 100 ml Bakterienkultur gewonnen Bestimmung der Expression von Markergenen RNA-Isolation und cdna-synthese Nach Anzucht wie in Abschnitt beschrieben wurden die Keimlinge zur Dunkelkontrolle im Dunkeln gelassen, bzw. 5 min mit hellrotem Licht behandelt und nach 45 min und 4 h nach Inkubation im Dunkeln mit einem Skalpell im Sicherheitsgrünlicht geerntet und in einem mit 6-9 Glaskügelchen bestückten Reaktionsgefäß in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Danach wurden die Proben mit dem Silamat S5 (ivoklar vivadent) 7 sec gemörsert und die RNA mittels RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, Deutschland, Manual: RNeasy Mini Handbook, September 2010) isoliert, wobei der optionale DNase-Verdau (RNase-Free DNase Set, QIAGEN, Deutschland) durchgeführt wurde. Die RNA-Konzentration und Reinheit wurde am NanoDrop-1000 Spectrophtometer (peqlab) gemessen und 1-2 µg zur Herstellung von cdna 32

45 Material und Methoden mittels Superscript III Reverse Transkriptase (Invitrogen, USA, Manual: 7. Dezember 2004) nach Angaben des Herstellers verwendet Real-Time-PCR Die anschließende quantitative PCR wurde mit einem ABI 7300 Real Time PCR-System (Applied Biosystems, USA) durchgeführt. Zur Detektion der Real Time-PCR Produkte wurde eine TaqMan-Sonde verwendet. Die Sequenzen für Primerpaare und Sonden wurden mit Primer Express Version 3.0 (Applied Biosystems, USA) erstellt (siehe Primer-Tabelle im Anhang). Die Real Time-PCRs wurden als Tripletts in einem Gesamtvolumen von 25μl durchgeführt: 1x ABsolute QPCR ROX Mix (ABgene) 920 pmol forward Primer 920 pmol reverse Primer 200 pmol TaqMan-Sonde (Markergen FAM-markiert, Actin JOE-markiert) 50 ng cdna (entspricht 50 ng RNA). Das Real Time-PCR Rrogramm begann mit einer 15-minütigen Phase bei 95 C zur Aktivierung der Taq-Polymerase, gefolgt von 45 Zyklen bestehend aus je 15 sec bei 95 C und 1 min bei 60 C. Die Rohdaten wurden mit der 7300 System SDS-Software (Version ) analysiert und die CT Werte und Transkriptmengen der Gene bestimmt. Die Expression eines Markergens wurde auf die Expression des Referenzgens normalisiert. Als Referenzgen wurde ACTIN 2 verwendet. Mithilfe einer cdna Verdünnungsreihe wurde für jedes Primerpaar eine Standardkurve für die Effizienz der cdna-amplifikation erstellt und damit die normalisierten Expressionswerte korrigiert. 33

46 Material und Methoden 2.12 Bestimmung der Aktivität des HY5-Promotors Die verschiedenen Doppelmutanten eid3 P HY5 -LUC wurden wie oben beschrieben auf Papier (mit 4,5 ml 1 % Saccharoselösung) ausgesät und nach 4 Tagen neben der Dunkelkontrolle verschiedenen Lichtbehandlungen unterzogen. Danach wurden die Keimlinge mit 2,5 mm Luciferinlösung besprüht und unter die CCD-Kamera (Fusion Vilber Lourmat, Deutschland) gestellt Chromatin-Immunopräzipitation Die Chromatin-Immunopräzipitation wurde nach dem Protokoll von Werner Aufsatz (GMI, Wien) mit 2 Wochen alten Keimlingen durchgeführt ( Die Samen der beiden YFP-Linien P PFT1 -PFT1 T650T -YFP und P PFT1 -PFT1 T650M -YFP im pft1-2- Hintergrund wurden auf Miracloth auf Erde ausgesät, für 2 Tage stratifiziert und in einer 12:12- Tag:Nacht Kammer bei 20 C aufgezogen. Nach 2 Wochen wurden Pflanzen für je eine Dunkelkontrolle und je eine Probe nach einem 5 min Hellrotpuls und 15 min in Dunkelheit geerntet, sofort gecrosslinkt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur weiteren Verwendung bei -80 C gelagert. Die Chromatinproben wurden sechsmal für 20 sec mit dem Ultraschallstab Sonopuls GM 70 sonicator (Bandelin, Berlin) bei 30% duty cycle und 45% sonication power behandelt. Es wurde Protein G Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare, Uppsala, Schweden) mit gescherter Salmonsperm DNA vorabsorbiert und das Chromatin mit anti-gfp-antikörpern (Daniel Kirchenbauer, persönliche Übergabe) immunoprezipitiert. Die DNA wurde zweimal mit Phenol versetzt, geschüttelt und abzetrifugiert. Jeweils der Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Danach wurden die Proben zweimal mit Chloroform gemischt, abzenxtrifugiert und der Überstand mit 20 µl 5 M NaCl und 550 µl Ethanol abs. gemischt, bei 4 C 15 min zentrifugiert, mit 70 % Ethanol gewaschen und in der Speedvac (Vakuum concentrator, Bachofer) getrocknet. Die DNA wurde dann über Nacht in 50 µl ddh 2 0 bei 4 C gelöst. 34

47 Material und Methoden Als Kontrolle zur erfolgreichen ChIP wurde eine Inputprobe vor der IP und je eine mit und ohne Anti-GFP behandelte Probe nach der IP entnommen, denaturiert und ein Western Blot mit dem Anti-GFP-Antikörper durchgeführt. Eine quantitative Real-Time PCR wurde mit dem ABsolute SYBR Green Rox Mix Kit (Thermo Scientific) nach Angaben des Herstellers und dem 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) durchgeführt. Die Daten wurden nach mit der Methode Prozent des Inputs (%IP) analysiert (Haring et al. 2007). 35

48 Ergebnisse 3 Ergebnisse 3.1 Die SALK-Mutante in der VP16-Domäne von PFT Die für die bisherigen Versuche (Klose, 2011) verwendete Linie SALK_ (pft1-2) besitzt die T-DNA-Insertion im fünften Exon des PFT1-Gens (Abbildung 3-1); (Kidd et al. 2009). Abbildung 3-1 Schema des PFT1 Gens. Die hellblauen Abschnitte stellen die UTRs dar, die dunkelblauen die Exons, die Linien die Introns. Die beiden T-DNA-Insertionen der SALK-Linien sind mit einem Dreieck gekennzeichnet, die eid3-mutation mit einem Stern. Da sich diese Mutante im dunkelroten Licht verhält wie der Wildtyp (Klose, 2011) wurde eine weitere Linie SALK_ erworben, die die Insertion in der Nähe der eid3-mutation (bp ) im 14. Exon zwischen den Basenpaaren 4630 und 4631 trägt: (pft1-3). Bei einer Aussaat von 1000 Samen auf MS-Agar-Platten keimten 272 wesentlich später als der Wildtyp. Die entsprechenden Keimlinge entwickelten nur zwei leicht grüne Keimblätter, die dann verblassten und abstarben (Abbildung 3-2). Diese 3:1 Verteilung passt zu der Annahme, dass es sich bei den absterbenden Keimlingen um homozygote T-DNA-Linien mit der Insertion im PFT1-Gen handelt (Χ 2 -Test; p = 0,05). Die PCR-Analyse mit dem Left-Border-Primer und den genspezifischen Primern mit den überlebenden Pflanzen ergab nur heterozygote oder Wildtyp- Pflanzen. Aus den absterbenden Pflänzchen konnte keine DNA extrahiert werden. Die T-DNA- Insertion im 14. Exon blockiert die weitere Entwicklung der Pflanzen über das Keimlingsstadium hinaus. Abbildung 3-2 Keimung und Entwicklung der pft1-3 T-DNA- Insertionslinie. Die Bilder zeigen je eine Wildtyp- (Col) und eine homozygote pft1-3-pflanze zu vier verschiedenen Zeitpunkten nach der Aussaat auf MS-Agar. Nach 46 Tagen blühten die Col-Pflanzen und konnten nicht mehr in der Petrischale gehalten werden. Balken = 3 mm. 36

49 Ergebnisse 3.2 Hefe-Library-Screen mit PFT1 und der VP16-Domäne Es sollten neue Interaktionspartner von PFT1 gefunden werden. Hierfür wurde die Methode aufgegriffen, eine cdna-bank (Library) aller exprimierten Gene aus speziell behandelten Pflanzen herzustellen. Hierfür werden Pflanzen bestimmten Behandlungen z.b. Licht oder Pflanzenhormonen unterzogen, deren mrna isoliert und in cdna umgeschrieben. Diese wird dann als Fusion mit der Aktivierungsdomäne des Hefe-Reportergens GAL4 in Hefezellen eingebracht, die das codierte Gen exprimieren. Die so entstandene Library wird dann mit dem zu testenden Gen (in Fusion mit der Bindedomäne) transformiert und auf Selektionsmedium gebracht. Die wachsenden Kolonien sollten demnach potenzielle Interaktionspartner enthalten, die per DNA-Isolation und Sequenzierung näher identifiziert werden können Da die von Willebrand-Domäne von PFT1 transaktivierend ist (Klose et al., 2012), wurde für die Yeast-two-Hybrid-Experimente ein Konstrukt mit Deletion dieser Domäne (PFT1ΔvWA) verwendet. Es wurden zwei verschiedene Libraries gescreent: eine enthielt die cdna-bank aus mit dunkelrotem Licht (diese Arbeit) und die andere eine cdna-bank aus mit ABA (Michael Ignatz) behandelten Keimlingen. Der Screen erfolgte mit PFT1ΔvWA oder der VP16-Domäne von PFT1. Es konnten Interaktionen mit den Proteinen AtFDH1, AtANNAT2 und AtCAD9 detektiert werden. AtANNAT2 gehört zur Familie der Annexine, die in Tieren gut untersucht sind. Sie binden Calcium-Ionen und sind im Cytoplasma lokalisiert. Sobald die Konzentration des cytosolischen Ca 2+ steigt, relokalisieren sie in der Plasmamembran. Annexine sind wahrscheinlich über den Gogli-Apparat an der Polysaccharidsekretion beteiligt (Lee et al., 2004). AtCAD9 (CINNAMYLALKOHOLDEHYDROGENASE 9) hat ein hochkonserviertes katalytisches Zn1-Zentrum, eine Zinkbindestelle, ein Zn2-Strukturmotiv und ein NADPH- Bindedomänemotiv. Es ist involviert in Ligninbildung und ablagerung (Kim et al., 2004). AtFDH1 ist eine NAD-abhängige Formatdehydrogenase, im Kohlenstoffmetabolismus involviert und in den Mitochondrien lokalisiert (Oliver, 1981). FDH1 interagiert mit ZAT7 (Ciftci-Yilmaz et al., 2007), einem Zink-Finger-Protein, das an der Transkription beteiligt ist (Meissner und Michael, 1997). Da diese Arbeit auf transkriptionelle Regulation fokussiert war und die identifizierten Proteine cytosolisch lokalisiert oder an der Biosynthese beteiligt sind, wurden die potenziellen Interaktionspartner nicht weiter verfolgt. Außerdem ergaben sich bei den Screens zwar gute Matingeffizienzen, jedoch unverhältnismäßig viele Kolonien, was auf unspezifische Interaktionen 37

50 Ergebnisse hindeutet. Wie in Abschnitt 3.9 zu sehen, zeigte sich, dass die VP16-Domäne von PFT1 auch separat transaktivierend wirkt. 3.3 Transgene Linien mit Aminosäureaustauschen in PFT1 In der konservierten VP16-Domäne des PFT1 befindet sich ein hochkonservierter Bereich mit möglichen Phosphorylierungsstellen, die evtl. zur Regulation des Proteins über Phosphorylierungen dienen könnten. Hierzu wurden verschiedene Aminosäuren an den Positionen 650, 653 und 656 per Punktmutation ausgetauscht. Der AS-Austausch wurde innerhalb des vollständigen genomischen Konstrukts mit dem Promotor und der Exon-Intron- Struktur vorgenommen und in die pft1-2 Mutante (Ökotyp Col) stabil transformiert. Diese Strategie wurde gewählt, um eine Interferenz mit dem endogenen PFT1 im Wildtyp zu verhindern. Außerdem kam es bei Überexpression des PFT1 durch einen 35S-Promotor zu Problemen hinsichtlich Aggregatbildung im Cytosol und segregierender Phänotypen der transgenen Linien (Klose, 2011). Das Threonin (AS 650) wurde wie bei der eid3-mutation durch ein Methionin (T650M) (Klose, 2011) und zusätzlich durch ein Alanin (T650A) ersetzt. Hierbei wird die OH-Gruppe, die für eine Phosphorylierung zur Verfügung stünde, entfernt. Das nicht geladene Leucin (653) wurde durch das zwitterionische Glutamin (L653Q) ersetzt. Serin besitzt eine OH-Gruppe im Aminosäurerest, die durch den Austausch mit Alanin (S656A) entfernt wurde. In Abbildung 3-3 ist das YFP- Konstrukt mit einem Auszug der entsprechenden AS-Sequenz dargestellt. Die mutierten Aminosäuren sind rot und unterstrichen hervorgehoben. Abbildung 3-3 YFP-Konstrukt. Die mutierte Aminosäuresequenz der VP16-Domäne ist im Einbuchstabencode dargestellt. Die mutierten Aminosäuren Threonin, Leucin und Serin an den Positionen 650, 653 und 656 sind rot und unterstrichen hervorgehoben. P PFT1 : nativer PFT1-Promotor, vwa: von Willebrand Faktor-Type A, FH: Forminhomologe, VP16: minimal VP16 interaction-domain, Qn: glutaminreiche Region, YFP: Yellow fluorescent Protein. 38

51 Ergebnisse Die verschiedenen Linien wurden mittels Basta-Resistenz, die im Konstrukt vorhanden war, nach homozygoten Pflanzen selektioniert und deren Samen zur Durchführung weiterer Versuche verwendet Mikroskopische Analysen der PFT1-Aminosäureaustausch-Linien P PFT1 -PFT1 eid3 -YFP ist in transgenen Arabidopsis-Linien der pft1-2-mutante nach dem eid-screeningprogramm (Büche et al., 2000) im Kern lokalisiert (Klose, 2011). Hierbei gab es jedoch keine Vergleichslinien mit dem wildtypischen Protein. Um nun den Unterschied zum Wildtypprotein und den Linien mit den ausgetauschten Aminosäuren T650A, S656A und L653Q zu untersuchen, wurden epifluoreszenzmikroskopische Analysen unter verschiedenen Lichtbedingungen durchgeführt. Abbildung 3-4 zeigt die Bilder der beiden Linien mit PFT1-YFP und PFT1 eid3 -YFP im Dauerdunkel, nach 2 min Weißlicht und einem 2 min Weißlichtpuls und 10 min Dunkelinkubation. In allen Fällen ist das YFP- Signal im Kern lokalisiert. Nach Lichtbehandlung bilden sich körnige Strukturen. Es ist zu sehen, dass sich das wildtypische und das Protein mit der eid3- Mutation nicht unterscheiden. Auch die Linien T650A, S656A und L653Q zeigten keinen Unterschied zu den Ergebnissen mit PFT1 und PFT1 eid3 (nicht gezeigt). Abbildung 3-4 Fluoreszenzmikroskopische Lokalisation von PFT1-YFP und PFT1 eid3 -YFP unter der Kontrolle des nativen Promotors. Die Bilder zeigen die Lokalisation von PFT1-YFP- und PFT1 eid3 -YFP-Fusionsproteinen in Kernen transgener Arabidopsis-Linien. Die Keimlinge wurden für 4 Tage im Dunkeln aufgezogen, für 2 min mit dem Weißlicht des Mikroskops bzw. 2 min mit WL und 10 min in Dunkelheit unter dem Mikroskop betrachtet. Es ist jeweils das Bild im YFP-Filter- Set und ein zugehöriges Durchlicht-Bild gezeigt. Balken = 10 µm. 39

52 Ergebnisse Hypokotyllängen der PFT1-Aminosäureaustausch-Linien Da die eid3-mutante hypersensitiv auf dunkelrotes Licht reagiert (Klose et al., 2012), wurde sie mit den YFP-Linien im Hinblick auf die Entwicklung der Hypokotyllängen von Arabidopsis- Keimlingen im hellroten und dunkelroten Licht unter verschiedenen Photonenflüssen untersucht (Abbildung 3-5). Als Wildtypkontrolle diente zum einen Ler, da die Mutante eid3 im Ler- Hintergrund vorlag und zum anderen Col als Kontrolle für pft1-2, welche als Hintergrund für die YFP-Linien diente. Des Weiteren wurden die YFP-Linien mit der PFT1 eid3 -Mutation (T650M) und dem Wildtyp-PFT1 (T650T) als Kontrolle für die neu hergestellten Linien T650A, L653Q und S656A herangezogen. Abbildung 3-5 Photonenflusseffektkurven der Aminosäureaustausch- YFP Linien im dunkel- (715 nm) und hellroten (650 nm) Licht. A zeigt das Diagramm des Versuches im dunkelroten Licht, B das im hellroten Licht bei verschiedenen Photonenflüssen. Nach der Keiminduktion wurden die Arabidopsis Pflanzen 4 Tage bestrahlt und dann die Hypokotyle gemessen. Die Kurven zeigen die relativ zum Dunkeln gesetzten Werte. Es sind die Wildtypen (Col und Ler), die eid3-mutante, die T- DNA-Linie pft1-2 und die in den pft1-2-hintergrund stabil transformierten YFP-Linien mit den Aminosäureaustauschen (genomische DNA-Sequenz) unter dem endogenen PFT1- Promotor gezeigt. T650T stellt die transgene YFP-Linie mit dem Wildtyp-Protein und T650M die mit der PFT1 eid3 - Mutation dar. Die Kurven zeigen die gemittelten Ergebnisse dreier unabhängiger Replika mit jeweils ca. 20 Keimlingen. Fehlerbalken = SEM. 40

53 Ergebnisse Bei dem Versuch im dunkelroten Licht (715 nm) sieht man, dass die relativ zum Dunkeln gesetzten Werte (A) der eid3-mutante einem hypersensitiven Kurvenverlauf entsprechen, sodass diese Mutante auch auf geringe Photonenflüsse ein kurzes Hypokotyl ausbildet. Die Wildtypen Col und Ler zeigen die typische sigmoid verlaufende Kurve mit einer Verkürzung des Hypokotyls bei höheren Photonenflüssen. Vergleicht man pft1-2 mit Col fällt eine Hyposensitivität auf (Klose et al., 2012). Die transgene Linie mit dem Wildtypprotein (P PFT1 -PFT1 T650T -YFP in pft1) komplementiert die Hyposensitivität von pft1-2. Die von Cornelia Klose 2011 hergestellte transgene Linie mit dem YFP-Konstrukt das die eid3-mutation (P PFT1 -PFT1 T650M -YFP in pft1) enthält, reagiert hypersensitiv, d.h. der eid3-phänotyp wird durch das eingebrachte Protein PFT1 eid3 hergestellt. Die transgenen Linien T650A und L653Q ergeben die gleichen Kurvenverläufe wie die Linie mit dem Wildtypprotein bzw. Col, d.h. sie sind weder hyper- noch hyposensitiv. Die Mutation S656A stört die Funktion von PFT1 dahingehend, dass diese transgene Linie einen ähnlichen Kurvenverlauf zeigt wie pft1-2, das durch die T-DNA-Insertion kein funktionelles PFT1 hat. Auch die Ergebnisse im hellroten Licht (650 nm, B) zeigen die Hypersensitivität der eid3-mutante und der transgenen PFT1 T650M -YFP Linie im Vergleich zu den beiden Wildtypen Col und Ler, sowie der transgenen Linie PFT1 T650T. Klose zeigte (2011), dass die T-DNA-Linie im hellroten Licht ein hypersensitives Hypokotylwachstum hat, was sich durch das eingebrachte wildtypische PFT1 T650T komplementieren lässt, und diese Kurve dem Verlauf des Wildtyps (Col) entspricht. Die beiden Linien T650A und S656A haben einen ähnlichen Kurvenverlauf wie pft1-2 und sind somit nicht in der Lage deren hypersensitiven Phänotyp zu komplementieren. Bei L653Q fällt im Diagramm auf, dass die Kurve einen hyposensitiven Verlauf oberhalb aller anderen Linien nimmt und somit die Funktion des wildtypischen PFT1 zu blockieren scheint. 41

54 Ergebnisse 3.4 Versuche zur Domänenstruktur von PFT1 Es sollte untersucht werden, ob die dominant negativen Effekte, die die Überexpressions-Linie von PFT1 und PFT1 eid3 bei Überexpression mit dem 35S-Promotor in Col hervorruft (Klose, 2011), auch durch Kompetitionseffekte einzelner Domänen von PFT1 mit Interaktoren hervorgerufen werden kann. Hierzu wurde die cdna verschiedener Domänen von PFT1 (Schema siehe Abbildung 3-6) - exprimiert durch einen 35S-Promotor - mit YFP fusioniert und via Agrobakterien in die Col-Pflanzen gebracht. Es wurden die Domänen von Willebrand Faktor- Type A (vwa), Forminhomologe1-Domäne (FH) und VP16-ähnliche Interaktions-Domäne gewählt. Abbildung 3-6 Schematischer Überblick der Domänenstruktur von PFT1. Von Willebrandfaktor-Typ A- Domäne, vwa; Forminhomologe 1-Domäne, FH; VP16-ähnliche Interaktionsdomäne, VP16; Glutamin-reiche Region, Qn; Per Stern ist die eid3-mutation an AS 650 (Threonin) indiziert. Die verschiedenen Linien wurden mittels Basta-Resistenz, die im Konstrukt vorhanden war, nach homozygoten Pflanzen selektioniert und deren Samen zur Durchführung weiterer Versuche verwendet. Zur Kontrolle der Proteinmenge wurde das im Mikroskop sichtbare YFP-Signal herangezogen. Die Linien zeigten gleichmäßig starke YFP-Intensitäten Hypokotyllängen der Pflanzen mit den PFT1-Domänen Die Linien, welche die einzelnen Domänen von PFT1 im Col-Hintergrund enthalten (Abbildung 3-7), zeigen keinen signifikanten Unterschied zum Wildtyp Col: weder im hell- noch dunkelroten Licht, d.h. es ergibt sich kein dominant negativer Effekt der sich bei Klose (2011) mit dem fulllength-protein zeigte. Die Linien wurden auch unter dem Epifluorenszenzmikroskop untersucht. Alle Domänen waren im Kern lokalisiert, zeigten aber keine granulären Strukturen (Daten nicht gezeigt). 42

55 Ergebnisse Abbildung 3-7 Photonenflusseffektkurven der transgenen Linien mit überexprimierten PFT1- Domänen im dunkel- (715 nm) und hellroten (650 nm) Licht. A zeigt das Diagramm des Versuches im dunkelroten Licht, B das im hellroten Licht bei verschiedenen Photonenflüssen. Nach der Keiminduktion wurden die Arabidopsis- Pflanzen für 4 Tage bestrahlt und dann die Hypokotyle gemessen. Die Kurven zeigen die relativ zum Dunkeln gesetzten Werte. Es sind die Wildtypen Ler und Col, die eid3-mutante und die in den Col-Hintergrund stabil transformierten YFP-Linien der Domänen von Willebrand- Faktor Type A (vwa), Forminhomologe (FH) und VP16 unter dem 35S-Promotor gezeigt. Die Kurven zeigen die gemittelten Ergebnisse dreier unabhängiger Replika mit jeweils ca. 20 Keimlingen. Fehlerbalken = SEM. 3.5 Glutaminreiche Region von PFT1 Am C-terminalen Ende von PFT1 befindet sich eine Region, die viele Glutaminreste enthält. Glutaminreiche Abschnitte in Proteinen fungieren als Aktivatoren für die Transkription (Courey und Tjian, 1988) und tendieren zur Aggregatbildung in vivo und vitro (Scherzinger et al., 1997). Es sollte getestet werden, ob die Verdopplung der glutaminreichen Region auch in Pflanzen einen Einfluss auf die Verteilung des Proteins im Zellkern hat. Cornelia Klose zeigte 2011 in biolistisch transformierten Senfkeimlingen, dass PFT1-YFP und PFT1 eid3 -YFP vorwiegend im Zellkern lokalisiert sind. Bestrahlung mit hell- oder dunkelrotem Licht erbrachte keine Unterschiede. Es wurde ein YFP-Konstrukt unter dem nativen Promotor von PFT1 (genomische DNA) mit verdoppelter glutaminreicher Region (Aminosäuren ; 2Qn) biolistisch in Senf gebracht. 43

56 Ergebnisse Abbildung 3-8 zeigt das YFP-Konstrukt im Dunkeln und nach Hell- bzw. Dunkelrotbehandlung. In allen Fällen ist das Signal gleichmäßig im Zellkern vorhanden und bildet keine Aggregate. Das Signal erscheint nach der Behandlung der Probe mit dunkelrotem Licht stärker, allerdings ist der Zellkern hier von der Seite aufgenommen. Zur Kontrolle einer erfolgreichen Transformation und zum Nachweis des Zellkerns wurde ein CFP-Konstrukt mit dem kernlokalisierten Protein CPRF2 verwendet. Abbildung 3-8 Epifluorenszenz-Bilder der Lokalisation von P PFT1 :PFT1 2Qn-YFP in Senf. 4 Tage alte etiolierte Senfkeimlinge wurden biolistisch mit einer CFP- Positivkontrolle und dem YFP-Konstrukt transformiert, im Dunkeln belassen und am nächsten Tag nach der entsprechenden Lichtbehandlung mikroskopiert. Die Bilder A-A zeigen eine transformierte Zelle nach Inkubation im Dunkeln (cd). B-B eine Zelle nach 2 min Hellrotbehandlung (HR) und nachfolgender Inkubation im Dunkeln für 40 min. Eine Zelle nach 5 min Behandlung mit dunkelrotem Licht und folgender Inkubation im Dunkeln für 40 min ist in C-C zu sehen. A, B, C zeigen die Zelle im YFP- Filter-Set, A, B, C im CFP-Filter-Set und A, B, C das Durchlicht - Bild. Balken = 10 µm. 44

57 Ergebnisse 3.6 PFT1 und Methyljasmonat Publizierte Daten zeigen, dass PFT1 in Arabidopsis eine Rolle bei der Pathogenabwehr und im Signaltransduktionsweg von Jasmonat spielt (Kidd et al., 2009). Um den Effekt von eid3 auf Methyljasmonat (MeJA) zu untersuchen, wurden Wildtyppflanzen, pft1-2 und eid3 verschiedenen Konzentrationen von Methyljasmonat ausgesetzt, um verschiedene physiologische Parameter zu messen Wurzellängen bei verschiedenen Methyljasmonatkonzentrationen Die Länge der Wurzeln von Arabidopsis-Keimlingen ist ein physiologischer Test zur Bestimmung der Reaktion auf JA. Die Hauptwurzellängen der aufrecht auf mit verschiedenen Methyljasmonat-Konzentrationen versetzten MS-Agar gewachsenen Pflanzen wurden nach 7 und 14 Tagen gemessen. Abbildung 3-9 zeigt die absoluten und relativen Wurzellängen der drei Genotypen. Die Wurzeln der eid3-linie sind, wie man in Abbildung 3-9 B sehen kann, insgesamt kürzer als die des Wildtyps und der T-DNA-Linie pft1-2. Daher sind die Werte von PFT1 eid3 bei den absoluten Längen geringer als die der beiden anderen Genotypen. Nach Beziehung der Wurzellängen auf die Kontrolle ohne Methyljasmonatbehandlung könnte man bei pft1-2 und eid3 eine leichte Hypersensitivität gegenüber dem Phytohormon vermuten (Abbildung 3-9 A). Im Rahmen der Standardabweichung lassen sich jedoch keine Unterschiede mehr feststellen. 45

58 Ergebnisse Abbildung 3-9 Wurzellängen von Arabidopsis-Keimlingen nach 7 und 14 Tagen unter Methyljasmonatbehandlung. Samen wurden oberflächensterilisiert, auf senkrechten MS-Agar-Platten mit entsprechender MeJA-Konzentration aufgesät, stratifiziert und im Lichtschrank aufgezogen. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde die Hauptwurzel vermessen. Die Diagramme A und B zeigen die Wurzellängen nach 7 Tagen Wachstum mit verschiedenen MeJA-Konzentrationen, C und D die nach 14 Tagen. A und C zeigen die Kurven relativ zu unbehandelten Keimlingen und B und D die absoluten Längen der Hauptwurzeln. Es sind der Wildtyp (Col), die pft1-2-t-dna-linie und eid3 gezeigt. Die Kurven zeigen die gemittelten Ergebnisse zweier unabhängiger Replika mit jeweils ca. 20 Keimlingen. Balken = SEM Semiquantitative RT-PCR nach Methyljasmonatbehandlung Um zu testen, ob PFT1 eid3 im Hinblick auf die Expression vom Jasmonat-induzierten Genen anders reagiert als der Wildtyp, wurde eine semiquantitative PCR mit dem Jasmonat-Markergen VSP1 (Jung et al., 2007) durchgeführt. Hierbei wurde auch die Doppelmutante von eid3 hy5 getestet. Es wurden Proben von vier Tage alten etiolierten Keimlingen ohne und nach sechsstündiger Behandlung mit Methyljasmonat geerntet und deren RNA isoliert. Nach Synthese der cdna wurden PCRs mit ACTIN1-Primern als interner Standard und VSP1-spezifischen Primern durchgeführt. Abbildung 3-10 zeigt zum einen die ACTIN1-Banden und zum anderen die von VSP1 in den verschiedenen Genotypen mit und ohne Behandlung. Wie im Wildtyp zu 46

59 Ergebnisse sehen, ist das Gen auch ohne Hormonbehandlung exprimiert, wird aber durch MeJA deutlich induziert. Die hy5-mutante zeigt eine stärkere Induktion von VSP1 im Vergleich zum Wildtyp. Die eid3-mutante zeigt eine leicht geringere Expression. Die verstärkte Expression von Methyljamonat-induzierten Genen in hy5 wurde mittlerweile von Prasad et al. (2012) ebenfalls gezeigt. Die eid3 hy5-doppelmutante zeigt die gleiche Ausprägung der Expression wie hy5. Abbildung 3-10 Semi-quantitative PCR des Jasmonatmarkergens VSP1. 4 Tage alte etiolierte Arabidopsis-Keimlinge wurden mit MeJA, das auf ein Stück Filterpapier aufgetropft und zu den Keimlingen in die Petrischale gefügt wurde, behandelt (+). Zur Negativkontrolle wurde auch RNA aus unbehandelten Keimlingen extrahiert, cdna hergestellt und eine PCR mit genspezifischen Primern durchgeführt. Die obere Bildhälfte zeigt die Produkte der ACTIN1-PCR, die als Standard dient. Das ACTIN1 ist in allen Proben gleich exprimiert. In der unteren Hälfte ist die PCR des Markergens VSP1 gezeigt. Es wurden Proben des Wildtyps (Ler), der eid3, hy5 und der eid3 hy5-doppelmutante ohne (-) und nach 6-stündiger (+) Behandlung mit Methyljasmonat getestet. 47

60 Ergebnisse 3.7 Kinetik der Genexpression nach Lichtbehandlung Zum Vergleich der natürlichen eid3-mutante und der T-DNA-Linie pft1-2 im Hinblick auf etwaige Unterschiede in der Genexpression wurden quantitative Real-Time-PCRs (qrt-pcr) lichtinduzierter Markergene durchgeführt. Dabei sollten vor allem die Änderungen im kinetischen Verlauf der frühen Genexpression untersucht werden. Hierzu wurden die Markergene HY5 (ELONGATED HYPOCOTYL 5), APRR5 (ARABIDOPSIS PSEUDORESPONSE REGULATOR 5) und PKS1 (PHYTOCHROME KINASE SUBSTRATE 1) als Vertreter der früh induzierten Gene gewählt (Peschke und Kretsch, 2011). Zudem wurde PKT1 (PEROXISOMAL-3-KETO-ACYL-COA THIOLASE 1) als Marker für die HIR (Peschke und Kretsch, 2011) untersucht. Die etiolierten Keimlinge wurden einem 2-minütigen Hellrotpuls ausgesetzt und nach 15, 20 und 30 Minuten erneuter Dunkelheit geerntet. Als Dunkelkontrolle wurde eine Probe ohne Lichtbehandlung eingesetzt, bei der die betreffenden Gene weniger exprimiert sein sollten. Da eid3 im Ler- und pft1-2 im Col-Hintergrund vorliegen, wurden beide Ökotypen als Wildtypkontrollen hinzugezogen. Abbildung 3-11 zeigt die Markergen-Kurven der Genotypen im zeitlichen Verlauf nach dem HR-Puls. Die Werte der Gene wurden relativ zum internen Standard ACTIN1 (ACT) gesetzt. Im Falle von HY5 ist das Gen bereits nach 15 min hochreguliert und die Level bleiben im weiteren Verlauf der Kurve mehr oder weniger gleich, bzw. steigen leicht an (Abbildung 3-11). Die eid3-mutante akkumuliert dabei wesentlich mehr Transkript als die anderen Genotypen. Daher ist die Reaktion von eid3 hypersensitiv. Die beiden Wildtypen unterscheiden sich nach 15 und 20 min um das Doppelte: Ler besitzt doppelt so viel Transkript wie Col. Beide Wildtypen erreichen nach 30 min dasselbe Niveau. Die HY5-Transkriptlevel der T-DNA-Linie bleiben fast konstant auf ihrem Anfangswert der Dunkelkontrolle. Pft1-2 ist im Vergleich zu Col hyposensitiv und ist mit dieser Reaktion eine knock-out oder knock-down Mutante. Die Kurvenverläufe von PKS1 (Abbildung 3-11) ähneln denen von HY5. Bereits nach 15 und 20 min nach dem Lichtpuls erreicht eid3 ca. doppelt so hohe Transkriptlevel wie die anderen Genotypen. Bei den Wildtypen und eid3 kommt es zu einem weiteren Anstieg der Transkriptmenge nach 30 min, wobei Ler und Col denselben Wert wie eid3 erreichen. In pft1-2 ist keine Lichtreaktion zu erkennen. APRR5 zeigt in den beiden Wildtypkontrollen einen starken Expressionsanstieg nach 15 min, der nach weiteren 5 min in Dunkelheit wieder fast auf den Ausgangswert im Dunkeln zurückfällt (Abbildung 3-11). Nach 30 min ist mehr APRR5-Transkript vorhanden als in den Dunkelproben. 48

61 Ergebnisse Die beiden Wildtypen unterscheiden sich wieder dahingehend, dass Ler höhere Level an mrna enthält als Col. Interessanterweise verlaufen die Kurven der beiden Mutanten eid3 und pft1-2 gleich; mit Werten weit unterhalb der WT-Kurven. Die Transkriptmenge fällt nach dem leichten Anstieg nach 15 min wieder auf das Anfangsniveau herab, d.h. beide haben eine negative Wirkung auf die Genexpression. Im Falle von PKT1 ist in Col, Ler und pft1-2 zu den frühen Zeitpunkten keine Lichtregulation erkennbar. Die Mutante eid3 zeigt im Dunkeln erhöhte Transkriptmengen die nach dem Lichtpuls abfallen. Nach 15 min besitzt eid3 viermal höhere Werte als die Wildtypen und pft1-2. Nach 20 min fallen die Werte von eid3 auf das Niveau der Wildtypkontrollen ab. Die relative Expression des Gens im Vergleich zu ACTIN1 liegt allerdings nur bei maximal 0,4. PKT1 ist ein Markergen für die HIR und benötigt eine mehrstündige Lichtgabe zum Start seiner Expression. Abbildung 3-11 Transkriptakkumulation unterschiedlicher Lichtmarkergene nach HR-Pulsbehandlung. Samen von Col, Ler, eid3 und pft1-2 wurden oberflächensterilisiert, auf MS-Agar und einer Lage Filterpapier ausgesät, stratifiziert und die Keimung durch Licht induziert. Die Keimlinge wurden für 4 Tage im Dunkeln aufgezogen, dem 2 min HR-Puls ausgesetzt und an verschiedenen Zeitpunkten geerntet. Die Transkriptmenge wurde über qrt-pcr bestimmt. ACTIN1 (ACT) diente als konstitutiver Marker und Standard zur Berechnung der relativen Transkriptmengen. Die Diagramme zeigen die Expression der Markergene HY5 (ENLONGATED HYPOCOTYL 5), APRR5 (ARABIDOPSIS PSEUDORESPONSE REGULATOR 5), PKS1 (PHYTOCHROME SUBSTRATE 1) und PKT1 (PEROXISOMAL-3-KETO-ACYL-COA THIOLASE 1). Es sind die Werte für Proben ohne Lichtbehandlung (cd) und eine Kinetik nach einem 2 min HR-Puls und Inkubation im Dunkeln von 15, 20 und 30 min gezeigt. Die Kurven zeigen die gemittelten Ergebnisse dreier unabhängiger biologischer Replika. Balken = SEM. 49

62 Ergebnisse 3.8 Screening nach möglichen PFT1-Interaktoren mit Hilfe der Bimolekularen Fluoreszenz-Komplementation (BiFC) Um mögliche Interaktionspartner von PFT1 zu identifizieren, wurden BiFC-Experimente durchgeführt. Für die Bimolekulare Fluoreszenz-Komplementation wird je eine Hälfte des YFP (C- und N-Terminus: YC und YN) mit je einem zu testenden Protein fusioniert. Die beiden YFP-Hälften sind für sich nicht funktionsfähig und können nicht fluoreszieren. Bei einer Interaktion der beiden Proteine wird allerdings die Funktion des YFPs wiederhergestellt, was sich, nach Anregung mit einer bestimmten Wellenlänge, in einem Fluoreszenzsignal äußert. Da es sich bei den getesteten Proteinen um Transkriptionsfaktoren handelt, die bei Yeast-two-Hybrid- Experimenten transaktivierend wirken könnten und so für diese Methode nicht geeignet sein können, wurde die BiFC angewandt. Zudem finden alle Reaktionen im transient biolistisch transformierten Senf, einer nahe verwandten Pflanze von Arabidopsis, in planta statt. Als Positivkontrolle zum Nachweis einer erfolgreichen biolistischen Transformation wurde ein CFP- Konstrukt mit dem im Kern lokalisierten Protein CPRF2 hinzugezogen, sodass ein Fluoreszenzsignal im Zellkern im CFP-Filter-Set zu sehen ist. Es wurden Klone verwendet, die Transkriptionsfaktoren exprimierten, von denen bekannt war, dass sie eine Rolle in der Lichtsignaltransduktion spielen. Die zu testenden Proteine wurden mit der N-terminalen Hälfte von YFP (YC) fusioniert. Die C-terminale Hälfte (YC) wurde an PFT1 bzw. PFT1 eid3 gefügt. Die Konstrukte wurden mittels biolistischer Transformation zusammen mit der CPRF2-CFP- Kontrolle in vier Tage alte etiolierte Senfkeimlinge eingebracht. Die Keimlinge wurden über Nacht im Dunkeln gelagert und am nächsten Tag, zum einen nach einem zwei-minütigen Hellrotpuls mit folgenden 40 min Dunkelheit und zum anderen nach einem fünf-minütigen Dunkelrotpuls und 40 min Dunkelheit, unter dem Mikroskop betrachtet. Zusätzlich wurde eine Dunkelkontrolle ohne Lichtbehandlung untersucht Untersuchungen mit G-Box-Binding Faktoren (GBF) GBFs (G-BOX-BINDING FACTORS) sind kernlokalisierte (Terzaghi et al., 1997) bzip- Proteine, die an G-Boxen, u.a. in Promotoren von lichtregulierten Genen, binden (Schindler et al., 1992). GBF bilden eine kleine Subfamilie von bzip-transkriptionsfaktoren bestehend aus GBF1, GBF2, GBF3, ZIP68, sowie ZIP16. Daten deuten an, dass GBF1 und 2 an der Regulation der Photomorphogenese in blauem Licht beteiligt sind (Mallappa et al., 2006, Terzaghi 50

63 Ergebnisse et al., 1997). Es wurden GBF 1, 2, 3 und ZIP68 zusammen mit PFT1 und PFT1 eid3 in Senf transformiert (Abbildungen 3-12 bis 3-15). Der Versuch mit dem Protein GBF1 (Abbildung 3-12) ergab keinerlei YFP-Signale: weder mit PFT1 noch mit PFT1 eid3. Auch Lichtpulse in Form von hell- und dunkelrotem Licht hatten keine Auswirkung auf die beiden Proteine. GBF1 dient als Negativkontrolle zum Nachweis der Spezifität einer Protein-Protein-Interaktion. Abbildung 3-12 BiFC von PFT (eid3) und GBF1 im Dunkeln und nach einem HR- bzw. DR-Puls. 4 Tage alte etiolierte Senfkeimlinge wurden biolostisch mit der CFP-Positivkontrolle und den beiden zu testenden YC/YNfusionierten Proteinen transformiert und am nächsten Tag nach entsprechender Lichtbehandlung mikroskopiert. Es werden je ein repräsentativer Zellkern im YFP-Filter-Set (A-C), im CFP-Filter-Set (A -C ) und das jeweilige Durchlichtbild (A -C ) gezeigt. Balken = 10 µm. 51

64 Ergebnisse Abbildung 3-13 BiFC von PFT (eid3) und GBF2 im Dunkeln und nach einem HR- bzw. DR-Puls. 4 Tage alte etiolierte Senfkeimlinge wurden biolostisch mit der CFP-Positivkontrolle und den beiden zu testenden YC/YNfusionierten Proteinen transformiert und am nächsten Tag nach entsprechender Lichtbehandlung mikroskopiert. Es werden je ein repräsentativer Zellkern im YFP-Filter-Set (A-C), im CFP-Filter-Set (A -C ) und das jeweilige Durchlichtbild (A -C ) gezeigt. Balken = 10 µm. GBF2 zeigte schwache YFP-Signale mit dem Wildtypprotein in Dunkelheit. Nach den Hell- und Dunkelrotlichtbehandlungen erschienen deutlich stärkere Fluoreszenzsignale im Zellkern. Das mutierte PFT1 eid3 hatte im Dunkeln und nach hellrotem Licht keine deutlichen BiFC-Signale aufzuweisen. Nur nach einer Dunkelrotlichtbehandlung konnte ein Fluoreszenz-Signal beobachtet werden (Abbildung 3-13). 52

65 Ergebnisse GBF3 ergab mit den beiden Proteinen PFT1 und PFT1 eid3 keine BiFC-Signale im Dunkeln. Nur nach einer Behandlung mit hell- oder dunkelrotem Licht waren YFP-Signale zu erkennen. Dies gilt für den Versuch von GBF3 mit dem Wildtypprotein und auch mit der mutierten Version PFT1 eid3 (Abbildung 3-14). Abbildung 3-14 BiFC von PFT (eid3) und GBF3 im Dunkeln und nach einem HR- bzw. DR-Puls. 4 Tage alte etiolierte Senfkeimlinge wurden biolostisch mit der CFP-Positivkontrolle und den beiden zu testenden YC/YNfusionierten Proteinen transformiert und am nächsten Tag nach entsprechender Lichtbehandlung mikroskopiert. Es werden je ein repräsentativer Zellkern im YFP-Filter-Set (A-C), im CFP-Filter-Set (A -C ) und das jeweilige Durchlichtbild (A -C ) gezeigt. Balken = 10 µm. Abbildung 3-15 zeigt die Fluoreszenzbilder des Interaktionstests mit ZIP68. ZIP68 ist auch ein Mitglied der GBF-Proteinfamilie und an der Transkriptionsregulation im Licht beteiligt (Shen et al., 2008). Im Falle des Wildtypproteins PFT1 in Kombination mit ZIP68 waren konstitutiv YFP- Signale zu sehen, d.h. im Dunkeln und auch nach den verschiedenen Lichtbehandlungen waren die Signale im Kern zu beobachten und es traten keine Veränderungen auf. Dasselbe gilt für PFT1 eid3. 53

66 Ergebnisse Abbildung 3-15 BiFC von PFT (eid3) und ZIP68 im Dunkeln und nach einem HR- bzw. DR-Puls. 4 Tage alte etiolierte Senfkeimlinge wurden biolostisch mit der CFP-Positivkontrolle und den beiden zu testenden YC/YNfusionierten Proteinen transformiert und am nächsten Tag nach entsprechender Lichtbehandlung mikroskopiert. Es werden je ein repräsentativer Zellkern im YFP-Filter-Set (A-C), im CFP-Filter-Set (A -C ) und das jeweilige Durchlichtbild (A -C ) gezeigt. Balken = 10 µm Untersuchungen mit transkriptionellen Regulatoren der Anthocyansynthese Die MYB-Faktoren PAP (PRODUCTION OF ANTHOCYANIN PIGMENT) MYB-Faktoren sind an der Regulation vieler Prozesse in der Zelle, z.b. der Kontrolle der Zellteilung und differenzierung, beteiligt. Sie besitzen eine MYB-DNA-Bindedomäne, die sich aus bis zu drei Repeats (R1, R2 und R3) zusammensetzt. Diese Repeats bilden eine Helix-Turn- Helix-Struktur (Ogata et al., 1992). MYB-Proteine werden durch die Anzahl der vorhandenen Repeats eingeteilt: Faktoren mit zwei Repeats werden mit R2R3 bezeichnet (Jin und Martin, 1999). PAP (PRODUCTION OF ANTHOCYANIN PIGMENT) gehören zur Gruppe der R2R3-MYB-Transkriptionsfaktoren. Sie gehören der Subgruppe sechs der pflanzlichen R2R3- MYB-Transkripstionsfaktoren an (Stracke et al., 2001), welche die Anthocyansynthese in Arabidopsis thaliana reguliert: PAP1 (MYB75) und PAP2 (MYB90) (Borevitz et al., 2000) bzw. PAP3 (MYB113) und PAP4 (MYB114) (Gonzalez et al., 2008). PAP3 zeigte in der BiFC-Analyse mit PFT1 ein YFP-Signal im Kern mit und ohne Lichtpulsbehandlung (Abbildung 3-16). Dagegen ergab PFT1 eid3 mit PAP3 nur nach einem Hellrotlichtpuls ein schwaches und nach 54

67 Ergebnisse einem Dunkelrotlichtpuls ein deutliches BiFC-Signal (Abbildung 3-16). Die Untersuchungen mit PAP1, 2 und 4 ergaben keinen Hinweis für Interaktionen (Daten nicht gezeigt). Abbildung 3-16 BiFC von PFT (eid3) und PAP3 im Dunkeln und nach einem HR- bzw. DR-Puls. 4 Tage alte etiolierte Senfkeimlinge wurden biolostisch mit der CFP-Positivkontrolle und den beiden zu testenden YC/YNfusionierten Proteinen transformiert und am nächsten Tag nach entsprechender Lichtbehandlung mikroskopiert. Es werden je ein repräsentativer Zellkern im YFP-Filter-Set (A-C), im CFP-Filter-Set (A -C ) und das jeweilige Durchlichtbild (A -C ) gezeigt. Balken = 10 µm Das bhlh-protein TT8 ( TRANSPARENT TESTA 8) TT8 (TRANSPARENT TESTA 8) ist ein bhlh-protein, das eine große Rolle im Netzwerk der Regulation der Flavonoid-Biosynthese spielt (Nesi et al., 2000) und mit den PAPs interagiert (Zimmermann et al., 2004). Die Abbildung 3-17 zeigt die BiFC-Analyse der Interaktionstests von PFT1 und PFT1 eid3 mit TT8. Die Kotransformation von PFT1 mit TT8 ergab YFP-Signale im Zellkern sowohl im Dunkeln als auch nach Hell- und Dunkelrotlichtpulsen. Dahingegen konnte beim Test mit PFT1 eid3 im Dunkeln kein BiFC-Signal festgestellt werden. Signale traten erst nach Behandlung der Proben mit Pulsen von hell- und dunkelrotem Licht auf. 55

68 Ergebnisse Abbildung 3-17 BiFC von PFT (eid3) und TT8 im Dunkeln und nach einem HR- bzw. DR-Puls. 4 Tage alte etiolierte Senfkeimlinge wurden biolostisch mit der CFP-Positivkontrolle und den beiden zu testenden YC/YNfusionierten Proteinen transformiert und am nächsten Tag nach entsprechender Lichtbehandlung mikroskopiert. Es werden je ein repräsentativer Zellkern im YFP-Filter-Set (A-C), im CFP-Filter-Set (A -C ) und das jeweilige Durchlichtbild (A -C ) gezeigt. Balken = 10 µm. 56

69 Ergebnisse Untersuchungen zu Wechselwirkungen zwischen LAF1 und PFT1 LAF1 (LONG AFTER FAR-RED 1) ist ein kernlokalisiertes Protein der R2R3-MYB Proteinfamilie, das als positive Signalkomponente im PhyA-Weg wirkt (Ballesteros et al., 2001). Arabidopsis-Knock-out-Mutanten haben einen hyposensitiven Phänotyp in der Keimlingsentwicklung im dunkelroten Licht, d.h. die Mutation bewirkt den gegenteiligen Effekt wie die eid3-mutation. Daher war es interessant zu untersuchen, ob die beiden Proteine LAF1 und PFT1 wechselwirken. Abbildung 3-18 zeigt Senfkeimlinge mit einem LAF1-YFP-Konstrukt nach unterschiedlichen Lichtbehandlungen. Die YFP-Signale waren bei allen gewählten Bedingungen deutlich im Kern zu sehen. Abbildung 3-18 Lokalisation von LAF1-YFP in Senfkeimlingen im Dunkeln und nach einem HRbzw. DR-Puls. 4 Tage alte etiolierte Senfkeimlinge wurden biolostisch mit der CFP-Positivkontrolle und dem mit YFP fusionierten LAF1 transformiert und am nächsten Tag nach entsprechender Lichtbehandlung mikroskopiert. Es ist je ein repräsentativer Zellkern im YFP-Filter-Set (A-C), im CFP-Filter-Set (A -C ) und das Durchlichtbild (A -C ) gezeigt. Balken = 10 µm. Es zeigte sich, dass LAF1 mit PFT1 in den BiFC-Interaktionsanalysen deutliche kernlokalisierte Signale im Dunkeln und nach Hellrotlichtbehandlung ergeben. Nach dem Dunkelrotlichtpuls erschien nur ein schwaches YFP-Signal, was darauf hindeutet, dass die Menge an interagierenden Proteinen durch den DR-Puls reduziert wird. Im Test von LAF1 mit PFT1 eid3 zeigten sich im Dunkeln und nach Hellrotbestrahlung deutliche Signale, während nach dem Dunkelrotlichtpuls keine Fluoreszenz auszumachen war (Abbildung 3-19). Mit PFT1 eid3 scheint somit der Effekt der Reduktion der BiFC-Signale nach dem DR-Puls verstärkt zu werden. 57

70 Ergebnisse Abbildung 3-19 BiFC von PFT (eid3) und LAF1 im Dunkeln und nach einem HR- bzw. DR-Puls. 4 Tage alte etiolierte Senfkeimlinge wurden biolostisch mit der CFP-Positivkontrolle und den beiden zu testenden YC/YNfusionierten Proteinen transformiert und am nächsten Tag nach entsprechender Lichtbehandlung mikroskopiert. Es werden je ein repräsentativer Zellkern im YFP-Filter-Set (A-C), im CFP-Filter-Set (A -C ) und das jeweilige Durchlichtbild (A -C ) gezeigt. Balken = 10 µm. 58

71 Ergebnisse 3.9 Analyse von Interaktionen zwischen PFT1 und verschiedenen Transkriptionsfaktoren mit dem Hefe-zwei-Hybrid-System Das Hefe-zwei-Hybrid-System (Y2H) ist neben der BiFC eine weitere Methode zur Analyse von Protein-Protein-Interaktionen. Hier wurde das GAL4-System benutzt: hierbei wird ein Protein mit der Aktivierungsdomäne (AD) von GAL4 fusioniert und ein potenzieller Interaktionspartner mit dessen Bindedomäne (BD). Die beiden Konstrukte werden in haploide Hefezellen transformiert und über ein Mating zusammengebracht, sodass die resultierenden Zellen diploid sind. Danach werden sie auf Selektionsmedium ausgestrichen. Bei einer Interaktion wird das Reportergen exprimiert, was das Wachstum der Zellen auf Selektionsmedium (HLT bzw. HALT) möglichen sollte. Die von Willebrand-Domäne des PFT1 wirkt im Y2H-System transaktivierend (Klose, 2011), d.h. das Protein selbst übernimmt die Rolle der Aktivierungsdomäne von GAL4, sodass keine Interaktion nötig ist, um das Reportergen zu exprimieren. Daher wurden für die Interaktionstests in Hefe nur Konstrukte mit deletierter von Willebrand-Domäne benutzt (PFT1ΔvWA, PFT1 eid3 ΔvWA). Der leere AD-Vektor mit dem Konstrukt BD-VP16 führte in den Hefezellen zu Wachstum auf allen Selektionsmedien, da VP16 aktivierend auf die Expression des Reportergens wirkt. Das Konstrukt von VP16 eid3, fusioniert mit der Bindedomäne, zeigte ohne Interaktionspartner kein Kolonienwachstum auf HLT oder HALT. Diese Ergebnisse zeigen, dass die VP16-Domäne alleine ebenfalls transaktivierend wirkt, nicht jedoch VP16 bei vorliegender eid3-mutation (Abbildung 3-20). Abbildung 3-20 Transaktivität der VP16- Domäne von PFT1. Das Bild zeigt das Hefewachstum nach 4 Tagen auf Kontrollmedium, schwach selektivem HLT-Medium und stark selektivem HALT-Medium. Die cdna der VP16- Domäne und der VP16-Domäne mit eid3-mutation wurden mit der BD von GAL4 fusioniert. Der leere AD-Vektor diente als Kontrolle. Nach Transformation und Mating der haploiden Hefestämme wurden diese auf Selektionsmedium übertragen. LT, Medium ohne Leu Trp; HLT, Medium ohne Leu Trp His; HALT, Medium ohne Leu Trp His Adenosin. 59

72 Ergebnisse Nachdem LAF1 als Interaktionspartner im Split-YFP identifiziert wurde (siehe 3.8.3), sollte diese Interaktion noch einmal im Yeast-two-Hybrid-System validiert werden. Zudem wurde die Interaktion mit MYC2 getestet Yeast-two-Hybrid mit MYC2 MYC2 (JIN1) ist ein bhlh-transkriptionsfaktor, der downstream des Signalweges von blauem Licht liegt (Yadav et al., 2005). Das Protein spielt außerdem eine Rolle in der Jasmonatsignalkette (Dombrecht et al., 2007), weswegen nach den Versuchen mit MeJA auch ein Interaktionstest mit einem in diesem Weg involvierten Protein durchgeführt wurde. Nach dem Mating der haploiden Hefezellen, die MYC2 (AD) bzw. PFT1ΔvWA/ PFT1 eid3 ΔvWA (BD) enthielten, konnte Kolonienwachstum auf Selektionsmedium (HLT) beobachtet werden. Auf dem hochselektiven HALT-Medium wuchsen hingegen nur Hefen mit MYC2 und PFT1 eid3 ΔvWA. Die Matings von MYC2 mit der VP16- bzw. der mutierten VP16 eid3 -Domäne ergaben Kolonienwachstum auf allen Selektionsmedien. Das Wachstum mit dem VP16-Wildtyp- Konstrukt ist auf die Transaktivität von VP16 (s.o.) zurückzuführen. Das Wachstum des Matings von MYC2 mit VP16 eid3 deutet an, dass die Mutation die Interaktion verstärkt. Die Kontrolle wuchs nur auf LT (Abbildung 3-21). Abbildung 3-21 Y2H-Analysen der Interaktion von MYC2 mit PFT1 und PFT1 eid3. Das Bild zeigt das Hefewachstum nach 4 Tagen auf Kontrollmedium, schwach selektivem HLT- Medium und stark selektivem HALT-Medium. Die cdna von MYC2 wurde mit der AD von GAL4 fusioniert, die cdnas von PFT1 ΔvWA, PFT1eid3ΔvWA, der VP16-Domäne und der VP16eid3-Domäne von PFT1 wurden mit der BD von GAL4 fusioniert. Der leere BD-Vektor diente als Kontrolle. Nach Transformation und Mating der haploiden Hefestämme wurden diese auf Selektionsmedium übertragen. LT, Medium ohne Leu Trp; HLT, Medium ohne Leu Trp His; HALT, Medium ohne Leu Trp His Adenosin. 60

73 Ergebnisse Yeast-two-Hybrid mit LAF Eigenschaften von LAF1 im Yeast-two-Hybrid Bevor ein Y2H-Test mit LAF1 und PFT1 vorgenommen werden konnte, musste zunächst überprüft werden, ob LAF1 transaktivierend wirkt. Hierzu wurde die cdna von LAF1 mit der Bindedomäne von GAL4 fusioniert und mit dem leeren Aktivierungsdomänenvektor in Hefezellen eingebracht. Die Hefezellen mit LAF1 wuchsen zusammen mit dem leeren AD- Vektor auch auf Selektionsmedium (HLT und hochselektives HALT) (Abbildung 3-22 oben). Da dies ein Hinweis auf die Transaktivität von LAF1 ist, wurden zwei Konstrukte hergestellt, die jeweils eine Hälfte von LAF1 enthielten: es wurde zum einen der C-Terminus (LAF1 ΔN) und zum anderen der N-Terminus (LAF1 ΔC) mit der BD fusioniert. Hierbei zeigte sich, dass die C- terminale Hälfte des Proteins auch Wachstum auf Selektionsmedium zulässt und somit transaktivierend wirkt. Die N-terminale Hälfte von LAF1 im BD-Vektor mit der AD-Kontrolle ergab nur auf LT-Medium Kolonien, was zeigt, dass der N-Terminus nicht transaktiv wirkt. Die folgenden Yeast-two-Hybrid-Analysen wurden daher nur mit dem N-Terminus durchgeführt (LAF1 ΔC). Abbildung 3-22 Transaktivität von LAF1. Das Bild zeigt das Hefewachstum nach 4 Tagen auf Kontrollmedium, schwach selektivem HLT- Medium und stark selektivem HALT-Medium. Die cdna von LAF1 und den beiden Deletionskonstrukten LAF1 ΔC und LAF1 ΔN wurden mit der BD von GAL4 fusioniert. Der leere AD-Vektor diente als Kontrolle. Nach Transformation und Mating der haploiden Hefestämme wurden diese auf Selektionsmedium übertragen. LT, Medium ohne Leu Trp; HLT, Medium ohne Leu Trp His; HALT, Medium ohne Leu Trp His Adenosin. 61

74 Ergebnisse Interaktion von PFT1 mit LAF1 Um die Interaktion von PFT1 mit LAF1, die im BiFC gezeigt wurde zu verifizieren, wurden Y2H-Tests durchgeführt. Hierzu wurden aufgrund der Transaktivität des C- Terminus von LAF1 nur Konstrukte mit dem N-Terminus verwendet (LAF1 ΔC). Des Weiteren fanden PFT1 bzw. PFT1 eid3 -Konstrukte ohne die transaktivierende von Willebrand-Domäne Verwendung (PFT1 ΔvWA, PFT1 eid3 ΔvWA). Es wurde zunächst LAF1 ΔC, fusioniert mit der Aktivierungsdomäne, und PFT1 (eid3), fusioniert mit der Bindedomäne von GAL4, getestet. Es zeigte sich Zellwachstum auf dem HLT-Selektionsmedium, nicht jedoch auf HALT (Abbildung 3-23). Abbildung 3-23 Y2H-Analysen der Interaktion von LAF1 ΔC mit PFT1 und PFT1 eid3. Das Bild zeigt das Hefewachstum nach 4 Tagen auf Kontrollmedium, schwach selektivem HLT-Medium und stark selektivem HALT-Medium. Die cdna von LAF1 ΔC wurde mit der Aktivierungsdomäne von GAL4 fusioniert, die cdnas von PFT1 ΔvWA, PFT1 eid3 ΔvWA wurden mit der Bindedomäne von GAL4 fusioniert. Der leere BD-Vektor diente als Kontrolle. Nach Transformation und Mating der haploiden Hefestämme wurden diese auf Selektionsmedium übertragen. LT, Medium ohne Leu Trp; HLT, Medium ohne Leu Trp His; HALT, Medium ohne Leu Trp His Adenosin. In Kontrollexperimenten wurde LAF1 ΔC mit der Bindedomäne von GAL4 fusioniert und umgekehrt PFT1 ΔvWA und PFT1 eid3 ΔvWA mit der Aktivierungsdomäne. Zusätzlich wurde die isolierte PFT1-Domäne VP16 ohne (VP16) und mit eid3-mutation (VP16 eid3 ) in die Analyse mit einbezogen. Es zeigte sich, dass die Hefezellen mit den beiden Konstrukten von PFT1/PFT1 eid3 ΔvWA mit LAF1 ΔC auf HLT-Medium wuchsen. Ein Unterschied ergab sich auf dem hochselektiven HALT-Medium, auf dem nur die Zellen mit dem PFT1-Protein inkl. eid3- Mutation Wachstum zeigten. Die VP16-Domäne alleine mit LAF1 ΔC wuchs nicht auf den Selektionsmedien, was darauf hindeutet, dass die beiden Proteinabschnitte nicht miteinander interagieren. Dies gilt auch für die mutierte Version VP16 eid3. Auch wurde ein Y2H-Experiment von LAF1 ΔC mit der FH-Domäne von PFT1 durchgeführt, was nicht zu Wachstum auf selektiven Platten führte (Daten nicht gezeigt). 62

75 Ergebnisse Abbildung 3-24 Y2H-Analysen der Interaktion von LAF1 ΔC mit PFT1, PFT1 eid3, VP16 und VP16 eid3. Das Bild zeigt das Hefewachstum nach 4 Tagen auf Kontrollmedium, schwach selektivem HLT-Medium und stark selektivem HALT- Medium. Die cdna von LAF1 ΔC wurde mit der Bindedomäne von GAL4 fusioniert, die cdnas von PFT1 ΔvWA, PFT1 eid3 ΔvWA, VP16 und VP16 eid3 wurden mit der Aktivierungsdomäne von GAL4 fusioniert. Der leere AD-Vektor diente als Kontrolle. Nach Transformation und Mating der haploiden Hefestämme wurden diese auf Selektionsmedium übertragen. LT, Medium ohne Leu Trp; HLT, Medium ohne Leu Trp His; HALT, Medium ohne Leu Trp His Adenosin. 63

76 Ergebnisse 3.10 Die Doppelmutante eid3 laf1 Um die Wechselwirkung von LAF1 und PFT1 eid3 auf genetischem Niveau weiter zu untersuchen, wurden Doppelmutanten von eid3 und laf1 hergestellt. Hierzu wurden homozygote eid3- und laf1-knock-out-mutanten (Ds-Insertion) gekreuzt und die F3-Generation mit Hilfe von PCR- Markern nach homozygoten Doppelmutanten durchsucht. Mit den Samen der homozygoten Linie wurden weitere Experimente unternommen. Eid3 zeigt im dunkelroten Licht einen hypersensitiven Phänotyp (Klose, 2011), wohingegen die Ds-Insertionslinie laf1 hyposensitiv reagiert (Ballesteros et al., 2001). Dies ist eine optimale Vorraussetzung für Epistasieanalysen Epistasieanalyse der lichtabhängigen Inhibition des Hypokotylwachstums Die Diagramme in Abbildung 3-25 zeigen die Reaktionen der vier Tage alten Keimlinge der Doppelmutante, der beiden Einzelmutanten und des Wildtyps (Ler) unter verschiedenen Photonenflüssen dunkel- und hellroten Lichts. Im dunkelroten Licht (DR) zeigt der Wildtyp die typische sigmoid verlaufende Kurve. Die eid3 Mutante reagiert hypersensitiv, während laf1 einen hyposensitiven Phänotyp zeigt. Die Keimlinge der Doppelmutante zeigen den gleichen Phänotyp wie eid3, sodass eid3 in Bezug auf die lichtabhängige Inhibition des Hypokotylwachstums epistatisch zu laf1 ist. Im hellroten Licht (HR) wird im Wildtyp mit steigendem Photonenfluss das Hypokotyl kürzer (Abbildung 3-25). Genauso in der laf1-mutante. Ein leicht hyposensitiver Phänotyp zeigt sich dabei nur im HR bei niedrigen Photonenflüssen. Eid3 besitzt auch im HR eine Hypersensitivität, die sich in der Doppelmutante genauso ausbildet. Somit erscheint auch in dieser Lichtqualität die eid3-mutation epistatisch gegenüber laf1 zu sein. 64

77 Ergebnisse Abbildung 3-25 Photonenflusseffektkurven der Doppelmutante eid3 laf1. A zeigt das Diagramm des Versuches im dunkelroten Licht, B das im hellroten Licht bei verschiedenen Photonenflüssen. Nach der Keiminduktion wurden die Arabidopsis-Pflanzen 4 Tage lang bestrahlt und dann die Hypokotyle gemessen. Die Kurven zeigen die relativ zum Dunkeln gesetzten Werte. Es sind der Wildtyp Ler, die eid3- Mutante, die laf1-mutante und die Doppelmutante gezeigt. Die Kurven zeigen die gemittelten Ergebnisse dreier unabhängiger Replika mit jeweils ca. 20 Keimlingen. Fehlerbalken = SEM Anthocyanakkumulation im Licht Die Bildung von Anthocyan nach Bestrahlung mit dunkelrotem Licht ist eine typische HIR, die durch PhyA gesteuert wird (Whitelam und Devlin, 1997). Da eid3 mehr Anthocyan akkumuliert als Ler (Klose, 2011), wurde dessen Gehalt auch in der eid3 laf1-doppelmutante bei verschiedenen Photonenflüssen analysiert. Abbildung 3-26 zeigt den Anthocyangehalt des Wildtyps, sowie der eid3-, laf1- und eid3 laf1- Mutanten nach vier Tagen Bestrahlung mit dunkelrotem und hellrotem Licht. Mit steigendem Photonenfluss im dunkelroten Licht (A) steigt bei allen vier Genotypen der Anthocyangehalt der Keimlinge an. In den laf1 Keimlingen ist der Anstieg - im Vergleich zu den Wildtyp-Keimlingen - geringer. Bei einem Photonenfluss von 4,3 µmol/m^2*sec enthalten diese Keimlinge auch nur etwa halb so viel Anthocyan wie die Wildtyp-Keimlinge. Die eid3 Mutante zeigt hingegen gegenüber dem Wildtyp den bereits bekannten stärkeren Anstieg des Anthocyangehaltes bei 65

78 Ergebnisse Erhöhung des Photonenflusses im Vergleich zur Wildtyp-Kontrolle. Bei einem Photonenfluss von 4,3 µmol/m^2*sec ist der Anthocyangehalt verglichen mit dem Wildtyp mehr als dreimal so hoch. Erstaunlicherweise findet sich bei der eid3 laf1-mutante ein noch stärkerer Anstieg des Anthocyangehaltes als bei eid3. Beim maximalen Photonenfluss ist etwa viermal mehr Anthocyan enthalten als im Wildtyp. Wie bei eid3 setzt die Anthocyanbildung auch in eid3 laf1 Keimlingen schon bei niedrigeren Photonenflüssen ein. Im Diagramm B von Abbildung 3-26 sieht man die Photonenflusseffektkurven der vier Genotypen nach 4 Tagen im hellroten Licht. Auch hier steigt der Anthocyangehalt mit steigendem Photonenfluss an, allerdings führt die Behandlung mit hellrotem Licht zu einer deutlich geringeren Anthocyan-Akkumulation verglichen mit der Dunkelrot-Behandlung. Auch hier wird in den laf1-keimlingen weniger Anthocyan akkumuliert als im Wildtyp. Ähnlich wie nach der Dunkelrot-Bestrahlung enthalten die eid3-keimlinge deutlich mehr Anthocyan als die Wildtyp-Keimlinge. Der Anthocyangehalt von eid3 laf1 ist bei niedrigen Photonenflüssen im hellund dunkelroten Licht ähnlich, steigt aber bei höheren an, bleibt im hellroten Licht jedoch unter der von eid3. Sowohl nach kontinuierlicher Dunkelrot- als auch nach Hellrotbehandlung wird in eid3 laf1 Keimlingen deutlich mehr Anthocyan akkumuliert als in Wildtypkeimlingen und bei 715 nm sogar mehr als in eid3-keimlingen. 66

79 Ergebnisse Abbildung 3-26 Akkumulation von Anthocyan in der eid3 laf1 Doppelmutante. Die Abbildung zeigt den Anthocyangehalt im dunkelroten Licht (A) und den im hellroten Licht (B) bei verschiedenen Photonenflüssen. Nach der Keiminduktion wurden die Arabidopsis- Pflanzen 4 Tage im kontinuierlichen Licht mit verschiedenen Photonenflüssen aufgezogen und dann das Anthocyan extrahiert. Es sind der Wildtyp Ler, die eid3-mutante, die laf1-mutante und die eid3 laf1- Doppelmutante gezeigt. Die Kurven entsprechen den gemittelten Ergebnissen dreier unabhängiger biologischer Replika mit jeweils ca. 20 Keimlingen. Fehlerbalken = SEM Genexpression nach Hell- und Dunkelrotlichtbehandlung PFT1 und LAF1 sind Transkriptionsfaktoren, die in der Lichtsignaltransduktion eine Rolle spielen. Daher sollte deren Einfluss auf die Expression lichtregulierter Gene über die Messung der Transkript-Akkumulation in den Einzel- und Doppelmutanten bestimmt werden. Hierbei wurde zum einen ein saturierender Rotlichtpuls zur Induktion der LFR (Low Fluence Response) und zum anderen ein Dunkelrotlichtpuls zur Induktion der VLFR (Very Low Fluence Response) eingesetzt. Die Quantifizierung der Transkript-Akkumulation lichtregulierter Markergene erfolgte mittels qrt-pcr. APRR5 (ARABIDOPSIS PSEUDORESPONSE REGULATOR 5), HY5 (ELONGATED HYPOCOTYL 5) und PKS1 (PHYTOCHROME KINASE SUBSTRATE 1) vertreten die früh induzierten Gene, die 45 min nach einem Lichtpuls die höchste Expression zeigen. Abbildung 3-27 zeigt die Balkendiagramme der qrt-pcr für die vier genannten Gene. CHS (CHALCONE SYNTHASE) ist ein Marker für spät exprimierte Gene (Abbildung 3-28), das nach 4-6 h seine maximale Transkript-Akkumulation aufweist (Peschke und Kretsch, 2011). SPA1 (SUPPRESSOR OF PHYA-105 1) ist ein Gen, das u.a. im PhyA-Signalweg (Höcker et al., 67

80 Ergebnisse 1998) und somit auch an der Regulation der Lichtreaktion auf dunkelrotes Licht beteiligt ist. ACTIN1 wird konstitutiv exprimiert und wurde als Referenzgen eingesetzt, auf welches die relativen Transkriptlevel der Markergene bezogen wurden. Zur Gewinnung der Pflanzenproben wurden 4 Tage alte etiolierte Keimlinge den oben genannten beiden verschiedenen Lichtbehandlungen ausgesetzt. Die Ernte erfolgte nach einer weiteren Inkubation im Dunkeln für 45 min nach dem Lichtpuls. Zur Kontrolle dienten Proben ohne Lichtbehandlungen (cd). Des Weiteren wurde der Wildtyp (Ler) als Referenz für die Mutanten eingesetzt. Als Kontrollen gegenüber der Doppelmutante eid3 laf1 dienten die Einzelmutanten eid3 und laf1. Die phya-201 Kontrolle sollte Aufschluss über den Einfluss des entsprechenden Rezeptors auf die jeweilige Lichtreaktion geben. Abbildung 3-27 zeigt die Ergebnisse der früh induzierten Markergene. Im Wildtyp sind die Gene APRR5, HY5 und PKS1 (A, B, C) ohne Lichtbehandlung kaum exprimiert, während SPA1(D) in Dunkelheit bereits erhöhte Transkriptlevel aufweist. Die Gabe eines Hellrotlichtpulses führt zu einer im Vergleich zum Wildtyp verstärkten Transkript-Akkumulation bei allen vier Genen. APRR5, HY5 und PKS1 zeigen in eid3 bereits im Dunkeln erhöhte Transkriptlevel, wohingegen die relative Transkriptmenge von SPA1 unter der des Wildtyps liegt. Nach Hellrotbehandlung steigt die relative mrna-menge aller vier Gene in eid3 an und erreicht höhere Werte als beim Wildtyp. Die Ausnahme bildet hier PKS1 bei dem eid3 einen ähnlichen Wert wie Ler erreicht. Die Mutante laf1 zeigt bereits im Dunkeln geringere relative Transkriptmengen der früh induzierten Markergene im Vergleich zum Wildtyp. In dieser Mutante steigen die Transkiptlevel aller Gene (A-D) nach dem HR-Puls an, jedoch bleiben sie weit unter der des Wildtyps und der eid3-mutante. Die Doppelmutante eid3 laf1 akkumuliert im Dunkeln im Falle von APRR5 mehr Transkript als der Wildtyp und eid3. Wie in Abbildung 3-27 (B und D) zu sehen, gilt dies nicht für HY5 und SPA1, bei denen die relativen Transkriptmengen unter denen des Wildtyps und eid3 liegen. Die Transkriptlevel von PKS1 entsprechen denen von eid3 und sind somit höher als die des Wildtyps. Jedoch kann man die Werte in konstanter Dunkelheit als mehr oder weniger gleich unter den verschiedenen Genotypen ansehen. Im Vergleich zu laf1 akkumuliert die Doppelmutante mehr Transkript aller getesteten Gene. Nach dem HR-Puls steigen die relativen Transkriptmengen im Vergleich zum Wildtyp stark an: APRR5, HY5 und PKS1 werden in der Doppelmutante sogar stärker exprimiert als in eid3 (Abbildung 3-27 A-C). Nur das Gen SPA1 wird nach dem HR-Puls ähnlich stark exprimiert wie der Wildtyp und bleibt so unter dem Wert von eid3. 68

81 Ergebnisse Nach Bestrahlung mit dunkelrotem Licht akkumulieren APRR5, HY5 und PKS1 im Wildtyp mehr Transkript als SPA1 (Abbildung 3-27 A-C). Die Transkriptmenge von SPA1 bleibt jedoch auf dem gleichen Niveau wie in der Probe ohne Lichtbehandlung (D). Die eid3-mutante akkumuliert nach dem Dunkelrotlichtpuls mehr Transkript der getesteten Gene als der Wildtyp. Im Vergleich zu den Proben des HR-Pulses kommt es in eid3 nach dem DR-Puls zu höheren Transkript-Leveln von PKS1 und SPA1 (Abbildung 3-27 C und D). Alle Gene akkumulieren in laf1 nach der DR-Behandlung im Vergleich zur Dunkelkontrolle mehr mrna, jedoch weit weniger als in eid3. HY5 und SPA1 erreichen in laf1 das selbe Transkriptlevel wie im Wildtyp, während APRR5 und PKS1 deutlich weniger erreichen. Die Doppelmutante eid3 laf1 akkumuliert nach dem DR-Puls mehr Transkript der Gene HY5, PKS1 und SPA1 (Abbildung 3-27 B-D) als der Wildtyp. Die Gene PKS1 und SPA1 erreichen das gleiche Expressionsniveau in der Doppelmutante wie in eid3. Die Transkripte von HY5 akkumulieren dagegen wesentlich stärker. Nur APRR5 (Abbildung 3-17 A) wird in der Doppelmutante zwar induziert, jedoch in wesentlich schwächerem Maße als im Wildtyp und in eid3. Abbildung 3-27 Transkript-Akumulation unterschiedlicher Lichtmarkergene nach HR- und DR- Pulsbehandlung. Samen von Ler, eid3, laf1 und eid3 laf1 wurden oberflächensterilisiert, auf MS-Agar und einer Lage Filterpapier ausgesät, stratifiziert und die Keimung durch Licht induziert. Die Keimlinge wurden für 4 Tage im Dunkeln aufgezogen, einem HR-Puls (2 min) oder DR-Puls (5 min) ausgesetzt und nach weiteren 45 min im Dunkeln geerntet. Als Referenz diente eine Probe ohne Lichtbehandlung (cd). Die Transkriptmenge wurde über qrt-pcr bestimmt. ACTIN1 (ACT) diente als konstitutiver Marker und Standard zur Berechnung der relativen Transkriptmengen. Die Diagramme zeigen die Expression der Markergene APRR5 (ARABIDOPSIS PSEUDORESPONSE REGULATOR 5), A; HY5 (ENLONGATED HYPOCOTYL 5), B; PKS1 (PHYTOCHROME SUBSTRATE 1), C und SPA1 (SUPPRESSOR OF PHYA-105 1), D. Es sind die Werte für Proben ohne Lichtbehandlung (cd), nach Hellrot- (HR-Puls) und Dunkelrotlichtbehandlung (DR-Puls) gezeigt. Die Kurven zeigen die gemittelten Ergebnisse dreier unabhängiger biologischer Replika. Balken = SEM. 69

82 Ergebnisse Abbildung 3-28 zeigt die Balkendiagramme des spät induzieren Gens CHS. Im Wildtyp ist CHS ohne Lichtbehandlung kaum exprimiert. Nach Gabe eines HR-Pulses wird es kaum induziert. Die Einzelmutante eid3 akkumuliert im Dunkeln mehr Transkript als der Wildtyp. Nach Hellrotpulsbehandlung steigt die Transkript-Akkumulation von CHS deutlich an. Die Expressionslevel bleiben in eid3 immer über denen des Wildtyps. In laf1 zeigt CHS dasselbe Expressionsmuster und -niveau wie der Wildtyp mit deutlicher Induktion der Expression nach Gabe eines HR-Pulses. Die Doppelmutante besitzt im Dunkeln erhöhte relative Transkriptmengen von CHS im Vergleich zu Ler, jedoch weniger als eid3. Nach dem HR-Puls steigt das Expressionslevel von CHS nicht an und erreicht so den gleichen Wert wie im Wildtyp. Nach dem DR-Puls steigt die relative Transkriptmenge von CHS (Abbildung 3-28) im Wildtyp leicht an und erreicht denselben Wert wie nach dem HR-Puls. Die eid3-mutante zeigt nach DR dasselbe Muster wie nach HR: die Expression von CHS wird induziert und übertrifft die Werte des Wildtyps. Das spät induzierte Gen wird in laf1 durch den DR-Puls vermehrt exprimiert, wobei von CHS mehr Transkript akkumuliert wird als dies im Wildtyp der Fall ist, jedoch weniger als in eid3. In der Doppelmutante eid3 laf1 steigt nach dem dunkelroten Lichtpuls die relative Transkriptmenge von CHS stärker an als in der eid3-einzelmutante (Abbildung 3-28). Die beiden Mutationen scheinen auch hier auf CHS eine stärkeren Einfluss zu haben als die eid3- Mutation. Abbildung 3-28 Transkript-Akumulation des Lichtmarkergens CHS nach HR- und DR-Pulsbehandlung. Samen von Ler, eid3, laf1, und eid3 laf1 wurden oberflächensterilisiert, auf MS-Agar und einer Lage Filterpapier ausgesät, stratifiziert und die Keimung durch Licht induziert. Die Keimlinge wurden für 4 Tage im Dunkeln aufgezogen, einem HR-Puls (2 min) oder DR-Puls (5 min) ausgesetzt und nach weiteren 45 min im Dunkeln geerntet. Als Referenz diente eine Probe ohne Lichtbehandlung (cd). Die Transkriptmenge wurde über qrt-pcr bestimmt. ACTIN1 (ACT) diente als konstitutiver Marker und Standard zur Berechnung der relativen Transkriptmengen. Das Diagramm zeigt die Expression des Markergens CHS (CHALCONE SYNTHASE). Es sind die Werte für Proben ohne Lichtbehandlung (cd), nach Hellrot- (HR-Puls) und Dunkelrotlichtbehandlung (DR- Puls) gezeigt. Die Kurven zeigen die gemittelten Ergebnisse dreier unabhängiger biologischer Replika. Balken = SEM. 70

83 Ergebnisse Veränderung der Genexpression nach hellrotem Licht nach 45 min und 4 h Neben der Pulsbehandlung der eid3 laf1 Doppelmutante im HR und DR nach 45 min (Abschnitt ) wurden auch qrt-pcrs durchgeführt, die die Markergenexpression auch nach 4 Stunden zeigen sollten (Abbildung 3-29). Hierzu wurden wiederum 4 Tage alte etiolierte Keimlinge des Wildtyps, der beiden Einzelmutanten eid3 und laf1 und der Doppelmutante eid3 laf1 mit einem zweiminütigen HR-Puls behandelt. Nach 45 min und 4 h Inkubation im Dunkeln wurden die Proben geerntet und qrt-pcrs mit den beiden frühen Markergenen HY5 und PKS1 bzw. dem späten Gen CHS durchgeführt. Als Kontrolle wurden wieder Proben genommen, die keinem Lichtpuls ausgesetzt waren (cd). Die Werte stellen die relative Expression zu ACTIN1 dar. Abbildung 3-29 Transkript-Akumulation unterschiedlicher Lichtmarkergene nach zwei Zeitpunkten nach HR-Pulsbehandlung. Samen von Ler, eid3, laf1 und eid3 laf1 wurden oberflächensterilisiert, auf MS-Agar und einer Lage Filterpapier ausgesät, stratifiziert und die Keimung durch Licht induziert. Die Keimlinge wurden für 4 Tage im Dunkeln aufgezogen, einem HR-Puls (2 min) ausgesetzt und nach weiteren 45 min bzw. 4 h im Dunkeln geerntet. Als Referenz diente eine Probe ohne Lichtbehandlung (cd). Die Transkriptmenge wurde über qrt-pcr bestimmt. ACTIN1 (ACT) diente als konstitutiver Marker und Standard zur Berechnung der relativen Transkriptmengen. Die Diagramme zeigen die Expression der Markergene HY5 (ENLONGATED HYPOCOTYL 5), A; PKS1 (PHYTOCHROME SUBSTRATE 1), B und CHS (CHALCONE SYNTHASE), C. Die Balken zeigen die gemittelten Ergebnisse dreier unabhängiger biologischer Replika. Balken = SEM. 71

84 Ergebnisse Ohne Lichtbehandlung sind alle Gene im Wildtyp kaum exprimiert, was sich 45 min nach Gabe des Hellrotlichtpulses dahingehend ändert, dass die Expression ansteigt. Die beiden früh induzierten Gene HY5 und PKS1 (Abbildung 3-29 A und B) zeigen nach 45 min ihre höchsten relativen Transkriptmengen, die nach 4 h wieder abfallen. Im Falle von HY5 sogar auf das Niveau im Dunkeln. Das spät induzierte Gen CHS erreicht sein Maximum erst nach 4 h. Die Gene sind in der eid3-mutante auch im Dunkeln stärker exprimiert als im Wildtyp. Nach dem HR-Puls wird die Expression der Gene induziert und die relativen Transkriptmengen von HY5 und CHS übersteigen die des Wildtyps sehr deutlich (Abbildung 3-29 A und C). Das Niveau von PKS1 erreicht denselben Wert wie das im Wildtyp (Abbildung 3-29 B). Die laf1-mutante verhält sich im Dunkeln wie der Wildtyp, mit sehr geringen Mengen an relativem Transkript aller drei Gene. Auch das Muster der Expression zu den beiden Zeitpunkten entspricht dem Wildtyp: die beiden früh induzierten Gene HY5 und PKS1 (Abbildung 3-29 A und B) erreichen nach 45 min ihre maximalen Werte, die jedoch unter denen des Wildtyps liegen. Die CHS-Transkriptlevel in laf1 erreichen nach 4 h ihren höchsten Wert. Die Level haben nach beiden Zeitpunkten ähnliche Werte wie der Wildtyp (Abbildung 3-29 C). Die eid3 laf1-doppelmutante zeigt sehr heterogene Expressionsmuster. Auffällig ist die Induktion von HY5, das erst nach 4 h seine maximale relative Transkriptmenge erreicht, obwohl es vorwiegend ein früh induziertes Gen ist. Im Vergleich zu eid3 und dem Wildtyp hat HY5 in eid3 laf1 im Dunkeln reduzierte Transkriptlevel (Abbildung 3-29 A). Nach 45 min steigt die relative Transkriptmenge zwar an, bleibt jedoch weit unter den Werten der anderen drei Genotypen, was den Ergebnissen in Abbildung 3-27 widerspricht. Hier könnten bei diesem Experiment Fehler in der Behandlung des Genotyps aufgetreten sein. Nach 4 h erreicht HY5 in der Doppelmutante ein weit höheres Niveau als in eid3. Dieses Niveau gleicht dem in eid3 nach 45 min. Das Expressionsmuster von PKS1 in der Doppelmutante (Abbildung 3-29 B) entspricht dem des Wildtyps mit der maximalen Transkript-Akkumulation 45 min nach dem HR-Puls, wobei die relativen Mengen im Dunkeln und nach 4 h denen in der eid3-mutante gleichen. Die Expressionsmuster von CHS (Abbildung 3-29 C) ähneln denen von HY5. In der Doppelmutante eid3 laf1 entsprechen die relativen Transkriptmengen nach 45 min denen im Dunkeln. Im Dunkeln akkumuliert die Doppelmutante Transkript, was im Wildtyp nicht der Fall ist. Nach 4 h erreicht die Doppelmutante das höchste Expressionsniveau mit einem höheren Wert als in der eid3-mutante. 72

85 Ergebnisse 3.11 HY5 HY5 ist einer der zentralen Transkriptionsfaktoren der Lichtregulation in Arabidopsis thaliana Oyama et al., 1997). Auf physiologischer Ebene in Bezug auf die Hypokotyllänge bei der Keimlingsentwicklung ist hy5 nahezu insensitiv im dunkelroten Licht. Das Gleiche gilt für Keimlinge der eid3 hy5 Doppelmutante, welche ähnlich dunkelrotunempfindlich sind wie hy5 (Klose et al., 2012). Die hy5 Mutation konnte den hypersensitiven eid3-phänotyp unterdrücken, d.h. sie war vollständig epistatisch über eid3. Die Wirkung von PFT1 im Licht ist somit abhängig von HY5. Wie Abbildung zeigt, ist HY5 in der eid3-mutante bereits im Dunkeln exprimiert, was ein Grund für die Hypersensitivität von eid3 sein könnte. Um die Untersuchungen von C. Klose fortzuführen, testete ich in der Doppelmutante die Expression von lichtregulierten Markergenen (Abschnitt ) und untersuchte den Promotor von HY5 im Hinblick auf mögliche Interaktion mit PFT1 (Abschnitt ) Veränderung der Genexpression nach hellrotem Licht nach 45 min und 4 h Die Expression der lichtregulierten Gene PHYA, APRR5, PKS1 und CHS wurde mittels qrt- PCR analysiert. Die Experimente wurden wiederum mit 4 Tage alten, etiolierten Keimlingen, gleich den Experimenten mit eid3 laf1 durchgeführt. Abbildung 3-30 zeigt die Expression der relativ zu ACTIN1 gesetzten Markergene im cd (ohne HR-Puls), sowie 45 min und 4 h nach einem 2-minütigen HR-Puls. Die mrna-pegel der beiden frühen Markergene APRR5 und PKS1 sind im Dunkeln in eid3 im Vergleich zum Wildtyp und der Doppelmutante leicht und in hy5 stark reduziert. Die hy5- Einzelmutante zeigt eine wesentlich schwächere Expression nach 45 min als der Wildtyp und eid3. Im Dunkeln und nach 4 h liegen die Werte nahe der Nachweisgrenze. Die Doppelmutante eid3 hy5 zeigt vergleichbare Transkriptlevel wie eid3, sodass das Fehlen von HY5 nicht epistatisch wirkt. APRR5 und PKS1 zeigen in allen Linien deutlich erhöhte Transkriptlevel nach der Lichtbehandlung nach 45 min, die dann nach 4 h wieder stark reduziert sind. APRR5 (Abbildung 3-30 A) zeigt in diesem Experiment in Ler die höchste Transkript-Akkumulation. 73

86 Ergebnisse Abbildung 3-30 Transkript-Akumulation unterschiedlicher Lichtmarkergene zu zwei Zeitpunkten nach HR-Pulsbehandlung. Samen von Ler, eid3, hy5 und eid3 hy5 wurden oberflächensterilisiert, auf MS-Agar und einer Lage Filterpapier ausgesät, stratifiziert und die Keimung durch Licht induziert. Die Keimlinge wurden für 4 Tage im Dunkeln aufgezogen, einem HR-Puls (2 min) ausgesetzt und nach weiteren 45 min bzw. 4 h im Dunkeln geerntet. Als Referenz diente eine Probe ohne Lichtbehandlung (cd). Die Transkriptmenge wurde über qrt-pcr bestimmt. ACTIN1 (ACT) diente als konstitutiver Marker und Standard zur Berechnung der relativen Transkriptmengen. Die Diagramme zeigen die Expression der Markergene APRR5 (ARABIDOPSIS PSEUDORESPONSE REGULATOR 5), A; PKS1 (PHYTOCHROME SUBSTRATE 1), B; CHS (CHALCONE SYNTHASE), C und PHYA (PHYTOCHROME A), D; Die Kurven zeigen die gemittelten Ergebnisse dreier unabhängiger biologischer Replika. Balken = SEM. Das Gen PKS1 (Abbildung 3-30 B) wird nach Lichtbehandlung im Wildtyp induziert und erreicht nach 45 min seinen maximalen Transkriptlevel. Nach 4 h sinkt dieser wieder ab. Die eid3- Mutante reagiert, wie schon gezeigt, hypersensitiv. Sie akkumuliert bereits im Dunkeln Transkriptmengen, welche nach dem HR-Puls deutlich über die des Wildtyps ansteigen und nach 4 h auf einen dem Wildtyp ähnlichen Wert absinken. Die hy5-mutante besitzt PKS1- Transkriptlevel, die nahe an der Nachweisgrenze liegen, d.h. die Expression dieses Gens hängt strikt von HY5 ab. In der Doppelmutante eid3 hy5 ist die relative Transkriptmenge im Dunkeln ähnlich der von eid3. Sie steigt nach Gabe des Lichtpulses zwar an, erreicht aber nicht das Niveau von Ler und ist wesentlich geringer als in eid3. Die hy5-mutation ist somit partiell epistatisch über eid3. Die relativen Transkriptmengen des spät induzierten Gens CHS (Abbildung 3-30 C) steigen nach 45 min im Wildtyp leicht an und sind 4 h nach dem HR-Puls gegenüber der Dunkelkontrolle 2- bis 3-fach erhöht. Im Dunkeln wird das CHS-Gen in der eid3-mutante extrem stark exprimiert. 74

87 Ergebnisse Die relativen Transkriptmengen erhöhen sich innerhalb von 45 min nach dem Lichtpuls noch und fallen nach 4 h unter das Niveau im Dunkeln ab. Die Transkriptlevel sind in hy5 im Dunkeln ähnlich dem Wildtyp und bleiben im Verlaufe der Zeit gleich niedrig, wie der Wildtyp. Die Ergebnisse der Doppelmutante zeigen, dass hy5 strikt epistatisch wirkt und das Fehlen von HY5 einen starken Effekt auf die Expression dieses späten Gens hat. Der Wildtyp hat im Dunkeln ein geringes Expressionsniveau von PHYA (Abbildung 3-30 D), das nach Lichtbehandlung ansteigt und nach 45 min sein Maximum erreicht, da es nach 4 h wieder auf den Dunkelwert absinkt. Im krassen Gegensatz zum Wildtyp besitzt eid3 sehr erhöhte relative Transkriptmengen im Dunkeln, die nach Lichtgabe sinken, jedoch auch nach 4 h nicht das Wildtyp-Niveau erreichen. PHYA bleibt in hy5 innerhalb von 45 min nach dem HR-Puls relativ konstant und steigt nach 4 h leicht an. Die Mutation wirkt wieder epistatisch zu eid3, da die Doppelmutante eid3 hy5 im Dunkeln und nach 45 min die gleichen Expressionslevel hat wie hy5 und nach 4 h dem Wildtyp gleicht und so unter dem Level von hy5 bleibt Der Promotor von HY5 Es ist bekannt, dass HY5 ein zentraler Effektor der Lichtregulation ist (Oyama et al., 1997). Beispielsweise bindet UVR8 - ein UV-Licht-spezifisches Protein - an den Promotor von HY5 und reguliert so dessen Expression als Antwort auf UV-Strahlung (Brown et al., 2005). Die Expression von HY5 wird außerdem durch hell- und dunkelrotes Licht aktiviert (Abschnitt , Klose et al., 2012). In eid3 war die HY5 Genexpression im Vergleich zum Wildtyp erhöht, sodass eine direkte oder indirekte Interaktion von PFT1 mit dem Promotor bestehen könnte. Hierzu wurden verschiedene Experimente durchgeführt, die den Einfluss von PFT1 bzw. PFT1 eid3 auf den HY5-Promotor näher beleuchten sollten HY5-Promotorlinien und eid3 Um den Effekt von PFT1 eid3 als transkriptioneller Regulator weiter zu untersuchen, wurden fünf verschiedene HY5-Promotor-Linien (Abbildung 3-31) mit eid3 gekreuzt. Das Enzym Luziferase wird in diesen Linien vom HY5-Promotor reguliert. Die homozygoten Linien wurden mittels 75

88 Ergebnisse dcaps-markern auf die eid3-mutation hin selektioniert. Die transgene Linie full-length beinhaltete den gesamten P HY5 von Basenpaar -565 bis +192 und Δ einen verkürzten Teil von bp -157 bis +192 (Abbildung 3-31, A). Drei weitere Linien mit Mutationen in bestimmten Teilbereichen des Promotors standen im Kontext des gesamten Promotors (-565 bis +192) zur Verfügung: ACGT m1 hat Basenpaaraustausche an Position -87 bis -81, ACGT m2 Mutationen im den bp -94 bis -88. Die beiden Sequenzen überspannen ein ACGT-Element. Diese Elemente gelten als Bindestellen für bzip-transkriptionsfaktoren (Jakoby et al., 2002) und sind je nach flankierenden Sequenzen auch Teil einer G-Box, an die PIFs binden können (Toledo-Ortiz et al., 2003). Die Linie MYB m hat eine Mutation in einem potenziellen MYB-Bindemotiv -108 bis Die entsprechenden Promotorsequenzen sind in Abbildung 3-31 B dargestellt, wobei die Mutationen in rot hervorgehoben sind. Abbildung 3-31 P HY5 -LUC-Konstrukte. A zeigt die Fusionskonstrukte des Luziferasegens (LUC) mit dem HY5- Promotor. Das Konstrukt des gesamten Promotors full-length beinhaltet den Promotor von bp -565 vor dem Startcodon bis bp +192 nach dem Startcodon. Δ beinhaltet eine verkürzte Promotorsequenz von bp -157 bis B zeigt die Übersicht der vier Konstruktsequenzen im full-length Promotorkonstrukt. Δ = Wildtypsequenz; ACGT m1 = Mutation um das ACGT-Element (bp -87 bis -81); ACGT m2 = Mutation um das ACGT-Element (bp -94 bis -88); MYB m = Mutation in der putativen MYB-Bindestelle an den bp -108 bis Die betreffenden Sequenzmotive im Wildtyppromotor sind in blau und die mutierten Sequenzen in rot dargestellt. Die oberflächensterilisierten Samen wurden in Petrischalen auf vier Lagen Filterpapier mit 4,5 ml 2 %iger Saccharoselösung 4 Tage lang im Dunkeln aufgezogen und dann vor der Lichtbehandlung mit Luziferin besprüht. Die Keimlinge wurden im Dunkeln gehalten (cd) oder erhielten je eine Hellrot- (2 min Puls, LFR) oder Dunkelrotpulsbehandlung (5 min Puls, VLFR). Die LUC-Aktivität wurde 45 min nach der Pulsbehandlung unter einer CCD-Kamera mit (soweit nicht anders angegeben) saturierender Autobelichtung aufgenommen. Die Abbildungen 3-32 und 76

89 Ergebnisse 3-33 zeigen von jeder Petrischale die Auflicht- und Biolumineszenzaufnahme. Hierbei entspricht ein größeres Lumineszenzsignal einer erhöhten Promotoraktivität. Ler und eid3 ohne LUC-Gen dienten als Hintergrundkontrollen. Im Dunkeln (Abbildung 3-32, cd) zeigen alle Konstrukte im Wildtyphintergrund außer ACGT m1 eine Reportergenaktivität. Die gekreuzten transgenen Linien eid3 full-length und eid3 MYB m lumineszieren auch ohne Lichtinduktion. eid3 Δ, eid3 ACGT m1 und eid3 ACGT m2 haben keine auszumachende LUC-Aktivität. Die eid3-mutation scheint die LUC-Aktivität in diesen Mutanten zu unterdrücken. Abbildung 3-32 Biolumineszenz der transgenen HY5-Promotorlinien im Wildtyp- und eid3-hintergrund im Dunkeln und nach einem Hellrotpuls. Die Arabidopsis-Samen wurden oberflächensterilisiert, auf 4 Lagen Filterpapier mit Saccharoselösung ausgesät, stratifiziert, 4 Tage im Dunkeln aufgezogen und entweder im Dunkeln belassen (linke Bildhälfte, cd) oder einem 2 min HR-Puls ausgesetzt und 45 min im Dunkeln inkubiert (rechte Bildhälfte, 2 HR 45 cd). Danach wurde die Lichtemmission der Luziferase mit einer CCD-Kamera aufgenommen. Es sind das Auflichtbild und die Biolumineszenzaufnahmen gezeigt. Als Kontrollen dienten der Wildtyp Ler, die eid3-mutante und die Promotorlinien full-length, Δ, ACGT m1, ACGT m2 und MYB m. Die Resultate der im Wildtyp-Hintergrund vorliegenden Linien sind in der oberen und die der Kreuzungen in der unteren Bildhälfte zu sehen. Nach einem Hellrotlichtpuls (Abbildung 3-32, 2 HR 45 cd) ist der Promotor in den Linien des Wildtyp-Hintergrundes außer ACGT m1 ähnlich aktiv wie ohne Lichtbehandlung. In den Linien im eid3-hintergrund Δ, ACGT m1 und ACGT m2 ist keine Lumineszenz detektierbar. Ein starker Effekt ist in den eid3-linien full-length mit dem gesamten Promotor und dem MYB m - Konstrukt, dem die putative MYB-Bindestelle fehlt, zu erkennen. Die LUC-Aktivität steigt 77

90 Ergebnisse deutlich an, wobei das fehlende MYB-Motiv (AACGGC) in Verbindung mit eid3 den negativen Effekt aufhebt. Bei Gabe eines DR-Pulses (Abbildung 3-33) zeigen von den Linien im Wildtyphintergrund nur die Linien full-length, Δ, ACGT m2 und MYB m Lichtsignale, nicht jedoch ACGT m1. Die Promotoraktivität scheint durch den Dunkelrotlichtpuls unterdrückt zu werden. Wie im cd und nach HR zeigen die Linien im eid3-hintergrund eid3 Δ, eid3 ACGT m1 und eid3 ACGT m2 keine LUC-Aktivität. Eine - selbst im Vergleich zum HR-Puls - noch stärkere Lumineszenz konnte mit dem MYB m -Konstrukt in der eid3-mutante detektiert werden (Abbildung 3-33, rechts unten). Abbildung 3-33 Biolumineszenz der transgenen HY5-Promotorlinien Wildtyp- und eid3-hintergrund nach einem Dunkelrotpuls. Die Arabidopsis-Samen wurden oberflächensterilisiert, auf 4 Lagen Filterpapier mit Saccharoselösung ausgesät, stratifiziert, 4 Tage im Dunkeln aufgezogen und einem 5 min HR-Puls ausgesetzt und 45 min im Dunkeln inkubiert. Danach wurde die Lichtemmission der Luziferase mit einer CCD-Kamera aufgenommen. Es sind das Auflichtbild (links) und die Biolumineszenzaufnahmen (rechts) der Kreuzungen und der Kontrollen Wildtyp (Ler), eid3 und die Promotorlinien full-length, Δ, ACGT m1, ACGT m2 und MYB m gezeigt. Die untere Bildhälfte beinhaltet zwei Aufnahmen mit unterschiedlicher Belichtungszeit einer Petrischale (16 sec und 15 min). 78

91 Ergebnisse Der HY5-Promtor und PFT1/PFT1 eid3 Um eine mögliche Bindung von PFT1 an den HY5-Promotor direkt zu testen, wurde eine Chromatinimmunopräzipitation (ChIP) mit den Linien, die stabil mit dem PFT1-YFP bzw. PFT1 eid3 -YFP-Protein unter nativem Promotor in pft1-2 transformiert waren, durchgeführt. Es wurden von jeder Linie zum einen im Dauerdunkel und zum anderen nach einem 5-minütigen Hellrotpuls und folgenden 15 min Dunkelheit Proben entnommen. Nach sofortigem crosslinken der DNA mit den assoziierten Proteinen wurde diese isoliert und eine Immunopräzipitation (IP) mit einem Anti-GFP-Antikörper durchgeführt. Um zu überprüfen, ob die IP erfolgreich war, wurden vor (Input) und nach der IP Proben entnommen und ein Western Blot mit einem Anti- GFP-Antikörper durchgeführt. Als weitere Kontrolle dienten Proben, die bei der IP ohne AK prozessiert wurden (Mock). Abbildung 3-34 zeigt den entwickelten Blot. Nur bei den Proben der IP mit Anti-GFP sind die passenden Banden von ca. 120 kda (Molekulargewicht von PFT1 + YFP) zu erkennen. Außerdem ergab der Blot Banden bei 50 kda. Abbildung 3-34 Western Blot der ChIP in den beiden PFT1 (eid3) -YFP-Linien unter dem nativen Promotor. Zwei Wochen alte Arabidopsis-Pflanzen wurden für zwei Tage ins Dunkle gestellt. Am Tag des Experiments wurde je eine Hälfte der Pflanzen im Dunkeln belassen, bzw. mit einem 2 min Hellrotpuls und 15 min Dunkelheit behandelt. Danach wurde die DNA mit den assoziierten Proteinen gecrosslinkt und das Chromatin extrahiert. Es wurde eine Inputprobe (Input) vor der IP und je eine mit (+ AK) und ohne Anti-GFP (- AK) behandelte Probe nach der IP entnommen, denaturiert und ein Western Blot mit dem Anti-GFP-Antikörper durchgeführt. Die obere Bildhälfte zeigt den Blot der Proben aus P PFT1 :PFT1:YFP (in pft1-2) und die untere Hälfte den der Proben aus P PFT1 :PFT1 eid3 :YFP (in pft1-2) im Dunkeln (cd) und nach Hellrotbehandlung (HR). Die passende Bande bei ca. 120 kda ist mit einem Pfeil markiert. Die 70 kda Markerbande ist in rot angedeutet. 79

92 Ergebnisse Abbildung 3-35 qrt-pcr der ChIP in den beiden PFT1 (eid3) -YFP-Linien unter dem nativen Promotor. Aus zwei Wochen alten Arabidopsis-Keimlingen, die am Morgen im Dunkeln belassen bzw. mit einem 2 min Hellrotpuls und 15 min Dunkelheit behandelt worden waren, wurde nach dem Crosslinking das Chromatin extrahiert, immunopräzipitiert, die DNA aufgereinigt und eine quantitative Real-Time-PCR mit SYBR-Green durchgeführt. Die Inputwerte wurden relativ zu den mit und ohne Antikörper behandelten Proben gesetzt (% Input) (obere Hälfte der Abbildung). Die untere Hälfte zeigt zum einen die Werte der PCR mit den Primern für den Promotor, die relativ zu denen der Exonprimer gesetzt wurden und zum anderen die Relativwerte der PCRs der Proben mit und ohne Antikörperbehandlung. Balken = SEM. Nach der Real-Time-PCR mit Primern im HY5-Promotor, die auch die MYB-Bindestelle überspannten, und Kontrollprimern in einem HY5-Exon wurden die Inputwerte relativ zu den Werten mit und ohne AK gesetzt (% Input). Zudem wurden die Werte der Proben mit AK relativ zu denen ohne und die Werte des Promotors relativ zu denen des Exons gesetzt. Es zeigten sich keine Unterschiede zwischen den Linien und den verschiedenen Lichtbehandlungen. (Abbildung 3-35) 80

93 Ergebnisse HY5 und LAF Interaktionstests von HY5 mit LAF1 Da sich LAF1 als Interaktionspartner von PFT1 und PFT eid3 zeigte und auch HY5 in enger Relation zur PFT1-Funktion zu stehen scheint, wurde mit der BiFC getestet, ob LAF1 und HY5 miteinander in planta interagieren. Hierfür wurden vier Tage alte, etiolierte Senfkeimlinge biolistisch transformiert und mit einem zwei-minütigen Hellrot- oder einem fünf-minütigen Dunkelrotpuls behandelt und nach 40 min in Dunkelheit unter dem Mikroskop betrachtet. Zusätzlich wurde eine Dunkelkontrolle ohne Lichtbehandlung untersucht. Abbildung 3-36 zeigt die epifluorenszenz-mikroskopischen Aufnahmen des Interaktionstests. Die beiden Proteine zeigten sowohl mit als auch ohne Lichtbehandlung BiFC-Signale, wobei die Signale im cd ein wenig schwächer waren. Abbildung 3-36 BiFC von HY5 und LAF1 im Dunkeln und nach einem HR- bzw. DR- Puls. 4 Tage alte etiolierte Senfkeimlinge wurden biolostisch mit der CPRF2-CFP-Positivkontrolle und den beiden zu testenden, mit YC/YN-fusionierten Proteinen transformiert und am nächsten Tag nach entsprechender Lichtbehandlung mikroskopiert. Es werden je ein repräsentativer Zellkern im YFP-Filter-Set (A-C), im CFP-Filter-Set (A -C ) und das jeweilige Durchlichtbild (A -C ) gezeigt. Balken = 10 µm. 81

94 Ergebnisse Interaktionstest mit HY5, LAF1 und PFT1/ PFT1 eid3 LAF1 interagierte mit HY5 und schwach mit PFT1/ PFT1 eid3. HY5 selbst zeigte keine Interaktion mit PFT1/PFT1 eid3. Es sollte nun getestet werden, ob die Anwesenheit von HY5 trotzdem die Interaktion von LAF1 und PFT1/PFT1 eid3 verstärkt oder stabilisiert. Hierzu wurden etiolierte Senfkeimlinge mit HY5-CFP und den BiFC-Klonen YN-LAF1 und PFT1-YC bzw. PFT1 eid3 -YC biolistisch transformiert. Es wurde unter dem Epifluoreszenzmikroskop zuerst ein Bild einer Probe aufgenommen, die vorher nur im Dunkeln inkubiert worden war (cd). Die Probe wurde dann nach der ersten Exposition des Mikroskoplichtes (WL) weitere 30 min auf dem Mikroskoptisch im Dunkeln belassen und dann noch einmal untersucht. Abbildung 3-37 zeigt die Aufnahmen im YFP- und CFP-Filter sowie im Durchlicht. Wie zu sehen ist (Abbildung 3-37), sind immer CFP-Signale des HY5- CFP-Fusionsproteins im Kern vorhanden, was der normalen Verteilung des Transkriptionsfaktors HY5 in der Zelle entspricht. Die BiFC-Signale treten schon im Dunkeln im Kern auf, wobei dies bei PFT1 schwächer war als bei PFT1 eid3. Nach Lichtexpositionen und 30 min Dunkelheit verstärkten sich die YFP-Signale in beiden Fällen deutlich. Zum Vergleich eines Interaktionstests von YN- LAF1 mit PFT1/PFT1 eid3 YC ohne das HY5-CFP-Konstrukt siehe Abbildung Abbildung 3-37 PFT1 (eid3), LAF1 und HY5 im Dunkeln und nach einem WL-Puls. 4 Tage alte etiolierte Senfkeimlinge wurden biolostisch mit CFP-HY5, den YCfusionierten PFT1-Varianten und YN-LAF1 transformiert und am nächsten Tag nach entsprechender Lichtbehandlung mikroskopiert. Es werden je ein repräsentativer Zellkern im YFP-Filter-Set (A-C), im CFP-Filter-Set (A -C ) und das jeweilige Durchlichtbild (A -C ) gezeigt. Balken = 10 µm. 82

95 Ergebnisse Die Doppelmutante hy5 laf1 Nach dem Nachweis der Interaktion von HY5 und LAF1, den Ergebnissen der Phänotypen der eid3 laf1 bzw. eid3 hy5 Doppelmutanten im Hinblick auf die Photomorphogenese und der quantitativen Real-Time-PCRs wurden die beiden Einzelmutanten laf1 und hy5-1 gekreuzt. Die Samen der F2-Generation wurden auf MS-Agar in Petrischalen ausgesät, um homozygote Doppelmutanten zu finden. Von den ausgesäten 1628 Samen keimten 66,1 % normal und hatten nach 10 Tagen Sekundärblätter. 28,4 % wuchsen nur zu kleinen Pflänzchen mit Kotyledonen heran, während 5,4 % nicht keimten. Unter den gekeimten Pflanzen wurden nur heterozygote laf1 HY5 oder LAF1 hy5 und wildtypische Keimlinge per PCR identifiziert. Nach den Mendelschen Regeln sollten 6,25 % der Samen homozygote Doppelmutanten sein, was den im Versuch nicht gekeimten Samen in etwa entspricht. Um zu sehen, ob die Keimung ggf. durch die Mutationen verspätet sei, wurden die Petrischalen weiter im Weißlicht-Schrank belassen. Die zur Kontrolle ausgesäten Wildtypsamen und Einzelmutanten keimten alle und wuchsen normal heran (Sekundärblätter nach 10 Tagen). Nach weiteren 10 Tagen begannen die gekeimten Pflanzen zu blühen. Die 5,4 % Samen waren nun auch gekeimt und hatten blasse Kotyledonen entwickelt (entsprechend Monat 1 in Abbildung 3-38). Nach weiteren vier Wochen hatten sie auch Sekundärblätter gebildet, die schwach grün waren. Allerdings wurden die Pflänzchen nach insgesamt mehr als drei Monaten nicht mehr größer und starben nach Transfer auf Erde ab. Es wurden zu verschiedenen Zeitpunkten Gewebeproben aller gekeimten Pflanzen entnommen, um per PCR den Genotyp festzustellen, wobei nur heterozygote mit nur einer Knock-out-Mutation in HY5 oder LAF1 und wildtypische Pflanzen nachgewiesen werden konnten, bzw. nicht genug DNA isoliert werden konnte, sodass in diesem Falle keine PCR-Produkte entstanden. Die vermutlich homozygoten Pflanzen haben somit ein Defizit in der Keimlingsentwicklung, sodass die Ausbildung adulter Pflanzen nicht möglich zu sein scheint. Abbildung 3-38 Entwicklung der F2-Generation der Kreuzungen aus laf1 und hy5. Die Samen der F2-Geneartion wurden oberflächensterilisiert, auf MS- Agar ausgesät, stratifiziert und im Lichtschrank 4 Monate lang wachsen gelassen. Nach jeweils 4 Wochen wurden die Petrischalen eingescannt. Balken = 1 cm. 83

96 Diskussion 4 Diskussion 4.1 Die PFT1-Mutanten Die T-DNA-Insertionslinie pft1-1 wurde zum ersten Mal von Cerdan und Chory (2003) beschrieben. Sie zeigte bei der Photomorphogenese der Keimlinge eine leichte Hypersensitivität im hellroten Licht und eine marginale Hyposensitivität im dunkelroten Licht. Die pft1-2-linie verhält sich im hellroten Licht wie pft1-1, weist im dunkelroten Licht allerdings keinen veränderten Phänotyp auf (Klose, 2011). Diese beiden T-DNA-Insertionslinien besitzen die Insertion im Bereich der von Willebrand Factor Type A-Domäne (vwa) und bilden beide verkürzte mrnas. Somit könnten auch PFT1-Proteinfragmente gebildet werden (Klose, 2011). Es existiert ein alternatives Splice-Produkt, bei dem ein Teil des N-Terminus fehlt. In dieser Arbeit sollte eine Linie pft1-3 charakterisiert werden, die die T-DNA-Insertion in der Nähe der eid3-mutation in der minimal VP16 Interaction-Domäne (VP16) besitzt, um zu überprüfen, ob diese einen ähnlichen Licht-Phänotyp zeigt wie die eid3-mutante. Beim Screening nach homozygoten Pflanzen zeigte sich jedoch, dass nur heterozygote Exemplare überlebensfähig waren. Die nach Mendel zahlenmäßig entstandenen homozygoten Samen bildeten zwar Keimblätter, starben dann jedoch ab. PFT1 könnte als Teil des Mediatorkomplexes schon sehr früh in der Entwicklung zur Genexpression nötig sein, wobei PFT1 als Vermittler zur Protein-Protein-Interaktion und somit zur Assemblierung des gesamten Komplexes am Promotor dient. Würde es nicht zum Aufbau des Mediatorkomplexes kommen, könnte die RNA-Polymerase II nicht zur Transkription entwicklungsspezifischer Gene herangezogen werden. Ein verkürztes Proteinfragment (vwa) wie in pft1-1 und pft1-2 könnte für eine basale Aktivität des Komplexes ausreichend sein. Wenn nun ein größeres Fragment exprimiert würde, wie es bei pft1-3 der Fall sein könnte, so könnte das Protein zwar in den Komplex eingebaut werden Aufgrund der fehlerhaften VP16-Domäne, die zur Interaktion mit weiteren Proteinen notwendig wäre, könnte die Vervollständigung des Komplexes jedoch verhinder werden. Mit einem kleineren Fragment könnten weitere benötigte Proteine trotzdem einen Mediator bilden, da es Interaktionsstellen nicht blockieren würde. Das alternative Splicing findet in der Region der pft1-1- bzw. pft1-2-t-dna-insertion statt, sodass es möglich ist, dass ein mehr oder weniger komplettes Protein vorhanden ist, das auch eine Funktion ermöglicht. Im Gegensatz zu meinen Ergebnissen eines lethalen Phänotyps steht die Veröffentlichung von Kidd et al. (2009), die die pft1-3-linie für ihre Forschungszwecke nutzten. Es könnte nun sein, 84

97 Diskussion dass die erhaltenen Samen bspw. durch Duplikationen mehrere T-DNA-Insertionen an wichtigen Stellen im Genom hatten, was zur Lethalität führen könnte oder die Aufzuchtbedingungen hinsichtlich Lichtquantität, Temperatur, Zusammensetzung des Mediums bzw. der Erde einen großen Einfluss auf die Keimlingsentwicklung dieser speziellen Linie haben. So wurden alle Experimente bei 22 C durchgeführt, während Kidd et al. 24 C nutzten. 4.2 Kinetik der lichtregulierten Genexpression von eid3 und pft1-2 Da pft1-2 auf physiologischer Ebene im hellroten Licht keinen Phänotyp zeigte, wurden quantitative Real-Time-PCRs mit lichtinduzierten Markergenen durchgeführt, um mögliche frühe Effekte auf die lichtabhängige Genexpression zu untersuchen. Die Markergene gehören zur Gruppe der frühen Gene, die 45 min nach einer Lichtpulsbehandlung stark exprimiert werden (Peschke und Kretsch, 2011). In vorangegangenen Veröffentlichungen wurde die Expression von Markergenen nur nach mindestens 45 min Bestrahlung bzw. 45 min nach einer Pulsbehandlung untersucht. Um die Lücke zwischen der Pulsbehandlung und den Endpunktdaten nach 45 min zu schließen, wurden hier frühere Zeitpunkte gewählt, um zu untersuchen, ob die Kinetik der Genexpression im Vergleich zum Wildtyp verändert ist. Klose zeigte für HY5 und PKS1 in semiquantitativen PCRs eine erhöhte Expression dieser Gene in eid3 (2011). Diese Messungen wurden jedoch frühestens nach 30 min durchgeführt. In dieser Arbeit sollten die Ergebnisse von Klose mit der sensitiveren Methode der qrt-pcr bestätigt werden bzw. auch Zeitpunkte vor der maximalen Genexpression näher untersucht werden. Die Kinetiken der Transkriptakkumulation der beiden Gene HY5 und PKS1 in den verschiedenen Genotypen Col, Ler, eid3 und pft1-2 verliefen über eine Zeitspanne von 30 min ähnlich (Abbildung 3-11), d.h. die eid3-mutante besitzt keine veränderte Expressionskinetik und die Transkription wird im gleichen Zeitrahmen normal gestartet. Es ist auffallend, dass eid3 erhöhte Transkriptlevel zeigt, was darauf schließen lässt, dass die Mutation zu einer Erhöhung der Promotoraktivtität und Genexpression führt. PFT1 eid3 ist aktiver und verstärkt höchstwahrscheinlich die RNA-Polymerase II-Aktivität, indem die Interaktion mit allen regulatorischen Elementen verstärkt oder stabilisiert sein könnte oder PFT1 langsamer abgebaut wird (Iñigo et al., 2012a). Die pft1-2-mutation wirkt sich wie eine Knock-out-Mutante aus, da hier HY5 und PKS1 keine Veränderung in ihrer Expression zeigen. Dieser Befund weist darauf hin, dass PFT1 für die Expression lichtabhängiger Gene essenziell ist. 85

98 Diskussion Im Gegensatz zu den Expressionsmustern von HY5 und PKS1 steht das Gen APRR5, einem circadian-assoziierten Gen. Es wirkt als transkriptioneller Repressor auf circadian exprimierte Gene wie z.b. CCA1 (Nakamichi et al., 2010) und wird nach 8 h ab Tagesanbruch maximal exprimiert (Michael et al., 2008). Es zeigt einen extrem schnellen und transienten Anstieg seiner Expression nach 15 min in den beiden Wildtypen. Da das Gen circadian wirkt, könnte es bei der beginnenden Signaltransduktion am Tagesanfang wichtig sein, um weitere zelluläre Prozesse, die im Licht ablaufen zu induzieren bzw. Prozesse, die nur bei Nacht ablaufen, zu stoppen. Das Gen könnte also für den pflanzlichen Stoffwechsel als ein Schalter zwischen Tag und Nacht fungieren, der nur sehr kurz aktiv ist, da die Transkriptmenge nach 20 min wieder fast auf das Dunkelniveau absinkt. Die beiden Mutantenlinien eid3 und pft1-2 zeigen nur eine schwache Erhöhung der Genexpression nach dem Lichtpuls und stellen somit Loss-of-Function-Mutanten dar. Die Mutationen haben eine negative Wirkung auf die Expression von APRR5, was auf kein einfaches Bild bzgl. der PFT1-Funktion hinweist, da das Protein sowohl ein Schalter für die Induktion als auch für die Repression der Genexpression zu sein scheint. Für eine korrekte Regulation kurz nach Lichtgabe scheint ein unverändertes PFT1 notwendig zu sein. PFT1 wirkt hier also positiv auf die Expression von APRR5, indem es womöglich einen weiteren Faktor reguliert, der nur mit dem wildtypischen Protein interagieren kann. Dies könnte darauf hindeuten, dass PFT1 eid3 womöglich eine andere Tertiärstruktur besitzt als PFT1, indem während der Proteinbildung durch die veränderte Ladung der mutierten Aminosäure eine andere Faltung zustande kommt. Die Expression von PKT1, einem HIR-Markergen (Peschke und Kretsch, 2011), ist in der eid3 Mutante im Dunkeln und nach 15 min viermal so hoch wie bei den anderen Genotypen. Die starke Aktivität im Dunkeln wird allerdings durch den HR-Puls nach 20 min inaktiviert. Der HR- Puls scheint somit die konstitutive PFT1 eid3 -Wirkung auf PKT1 aufzuheben und somit hat eid3- Mutation eine negativ regulatorische Wirkung, was ein weiterer Hinweis auf eine lichtabhängige Schalterfunktion von PFT1 ist. Da die Versuchsbedingungen mit einem 2 min HR-Puls nicht den HIR-Bedingungen von kontinuierlichem dunkelroten Licht entsprechen und PKT1 im Wildtyp erst nach mehreren Stunden exprimiert wird (Peschke und Kretsch, 2011), ist in den Wildtypen keine erhöhte Genexpression zu erkennen. 4.3 Transgene Linien mit Aminosäureaustauschen in PFT1 86

99 Diskussion Klose (2011) untersuchte mittels in vitro Phosphorylierungsstudien, ob die mutierte Aminosäure T650M in der eid3-mutante womöglich eine Phosphorylierungsstelle darstellt und so die Regulation von PFT1 beeinflusst. Dies konnte jedoch in den in vitro Experimenten nicht gezeigt werden, wobei weitere Mutationen des Threonins zu Glutamat oder Isoleucin ähnliche Phänotypen zeigten wie eid3. Um zu ermitteln, ob Mutationen in der konservierten Aminosäuresequenz - unter Annahme einer Phosphorylierungsstelle - welche die eid3-mutation umgibt, in einer veränderte Keimlingsentwicklung resultieren, wurden auch hier transgene Linien mit modifizierten YFP- Konstrukten unter dem nativen PFT1-Promotor hergestellt. Diese Konstrukte und weitere Kontrollen wurden in die Linie pft1-2 eingebracht, da diese einen Knock-out-Phänotyp aufweist, wodurch eine Überexpression von PFT1 vermieden werden sollte. Ein Western-Blot zum Nachweis des YFP-Fusionproteins wurde aufgrund des nativen Promotors nicht durchgeführt, da die Proteinmengen zu gering sind, um detektiert zu werden. Klose demonstrierte (2011) die Lokalisation von P PFT1 -PFT1 eid3 -YFP im Zellkern. Zum Vergleich des mutierten Proteins wurden nun auch das YFP-Wildtyp-Protein und die Linien T650A, S656A und L653Q unter dem Fluoreszenzmikroskop auf ihre Lokalisation hin untersucht (Abbildung 3-4). Hierbei zeigten sich keine Unterschiede zwischen den verschiedenen Linien in der zellulären Lokalisation der YFP-markierten Proteine. Im Dunkeln lag ein gleichmäßiges YFP-Signal vor, während sich, wie schon von Klose beobachtet, nach Lichtbehandlung körnige Strukturen im Zellkern bildeten. Diese könnten den Aufbau der durch Licht induzierten Transkriptionsmaschinerie mit vermehrter Bildung von Mediatorkomplexen darstellen. Die einzelnen Mutationen scheinen beim Kerntransport somit nicht ausschlaggebend zu sein. Die T-DNA-Mutante pft1-2 zeigt sowohl im DR als auch im HR eine Hyposensitivität, die durch das eingebrachte Wildtypprotein in Form von PFT1 T650T -YFP aufgehoben wird. Der methodische Ansatz zeigte somit die erhoffte Rescue-Wirkung. Die Linie PFT1 T650M, die der eid3-mutation entspricht, zeigte den entsprechenden Phänotyp der eid3-mutante, sodass auch dieser Phänotyp reproduziert werden konnte. Die transgenen Linien T650A, L653Q und S656A zeigen im Vergleich zu pft1-2 eine leichte Hypersensitivität, die jedoch nicht an die von T650M heranreicht, sodass diese Mutationen nur einen geringen Einfluss haben. Eine mögliche Phosphorylierung in diesem Bereich hätte somit nur einen geringen Einfluss auf die PFT1-Funktion in der DR-HIR. 87

100 Diskussion In dieser Arbeit wurde das T 650 zu Alanin mutiert, welches keine OH-Gruppe als Phosphorylierungsstelle besitzt. Die Kurve für die Inhibition des Hypokotyllängenwachstums in Abbildung 3-5 (A) der YFP-Linie T650A verläuft bei sehr geringen Photonenflussraten dunkelroten Lichts zwischen denen der eid3-kontrolle und der entsprechenden transgenen YFP- Linie T650M, was den Ergebnissen von Klose (T650I und T650E) ähnelt. Es scheint, als ob das Threonin im dunkelroten Licht für eine wildtypische Proteinfunktion nötig ist, was auf eine spezifische Wirkung der Aminosäure mit dem PhyA-Signalweg hindeutet. Im hellroten Licht werden die Reaktionen der Keimlinge von PhyA und PhyB gesteuert und die Kurve von T650A verläuft ähnlich der von pft1-2, d.h. die Funktion von PFT1 wird durch die Mutation unterdrückt und der hyposensitive Phänotyp nicht komplementiert. Im hellroten Licht verläuft die Kurve von S656A entsprechend dem Wildtyp und verschieden zum Hintergrund-Genotyp pft1-2, sodass unter dieser Lichtqualität, gesteuert vorwiegend durch PhyB die Proteinfunktion wiederhergestellt werden kann. Der Austausch des Serins einer putativen Phosphorylierungsstelle durch Alanin (S656A) bei höheren Photonenflüssen im DR resultiert in einer Hyposensitivität ähnlich der pft1-2-mutante, sodass der pft1-2-phänotyp nicht aufgehoben wird. Dies deutet an, dass diese Aminosäure essentiell für die PFT1-Funktion ist, was eher auf eine aktivierende Funktion des PFT1 in der Signaltransduktion im dunkelroten Licht hinweist, die vorwiegend von PhyA gesteuert wird. Die Mutation des Leucins zu Glutamin (L653Q) hat im DR keine Auswirkung auf die Hypokotyllänge und das Protein ist in der Lage, seine Funktion korrekt auszuführen. Dagegen reagiert die PFT1 L653Q -Linie auf hellrotes Licht hyposensitiv. Die Säureamidgruppe des Glutamins anstelle des neutralen Leucins könnte die Funktion von PFT1 dahingehend beeinflussen, dass ein potentieller Interaktionspartner, der nur bei kürzeren Wellenlängen und somit bei starker Aktivierung über das PhyB-Signalsystem hinzugezogen wird, evtl. aufgrund statischer Veränderungen nicht mehr mit PFT1 interagieren kann. Es zeigten sich in den Versuchen mit hell- und dunkelrotem Licht sehr konträre Ergebnisse, die auch in der Studie von Klose (2011, Klose et al., 2012) zu erkennen waren. Dort wurde vermutet, dass PFT1 down-stream von PhyA als positiver Regulator und down-stream von PhyB als negativer Regulator wirkt. Zudem wurde gemutmaßt, dass PFT1 in einer PhyA-abhängigen Signalkaskade, die PhyB-Funktionen kontrolliert, wirkt. Bei der mutierten Version PFT1 eid3 wurde vermutet, dass sie down-stream von PhyB eine positive Funktion einnimmt (Klose et al., 2012). Die Ergebnisse meiner Arbeit lassen die Vermutung zu, dass jede putative Phosphorylierungsstelle eine separate Rolle in der PFT1-Funktion, abhängig von PhyA- oder 88

101 Diskussion PhyB-vermittelten Reaktionen, übernimmt. Insbesondere das Leu 653 ist wichtig für die korrekte Proteinfunktion im hellroten Licht, also der PhyB-abhängigen Hypokotylentwicklung, was auf eine negative Funktion von PFT1 in diesem Weg hindeutet. Dagegen hat diese Aminosäure keine Funktion in der PhyA-vermittelten Entwicklung. 4.4 Untersuchungen zur Funktion der verschiedenen PFT1-Domänen Es stellte sich heraus, dass die von Willebrand Factor Type-A-Domäne (vwa) am N-terminalen Ende des PFT1-Proteins in Hefe transaktivierend wirkt (Klose, 2011). Von Willebrand-Domänen sind an verschiedenen zellulären Prozessen beteiligt und vermitteln Protein-Protein-Interaktionen (Hinshelwood und Perkins, 2000). Von der minimal VP16-Interaction-Domäne (VP16) ist bekannt, dass der homologe Abschnitt der MED25-Untereinheit des Menschen mit dem Transkriptionsinitiator VP16 des Herpes simplex Virus interagiert (Mittler et al., 2003, Yang et al., 2004). FH1-Domänen (Forminhomology 1-Domäne, FH) spielen eine Rolle bei der Organisation des Cytoskeletts (Pruyne et al., 2002) und vermitteln Interaktionen mit einer Vielzahl verschiedener Proteine. Die verschiedenen Domänen (cdna) wurden mit YFP fusioniert und unter dem 35S-Promotor in stabil transformierten Pflanzen (Col) exprimiert. Keimlinge dieser Linien wurden verschiedenen Photonenflüssen ausgesetzt, um einen etwaigen dominant positiven oder negativen Effekt auf die Photomorphogenese auszumachen. Die Linie des gesamten Proteins PFT1 (cdna) unter dem 35S-Promotor hatte denselben Phänotyp wie der Wildtyp und es traten keine Effekte auf. Für die Linie des mutierten Proteins PFT1 eid3 ergab sich eine Aufspaltung der Keimlinge in Wildtyp- und eid3-ähnlichen Phänotyp und es traten dominant negative Effekte auf (Klose, 2011). Hier wurde spekuliert, dass das endogen vorhandene PFT1 mit dem überexprimierten PFT1 eid3 interferiert, bzw. ein zu hoher Proteingehalt zur Inaktivierung der Proteinfunktion führt (s.u.). Die Linien, die in dieser Arbeit hergestellt wurden, zeigten im Vergleich zum Wildtyp Col, der auch der Transformationshintergrund war, keinen Unterschied in der Entwicklung des Hypokotyls bei verschiedenen Photonenflüssen und Lichtqualitäten (Abbildung 3-7). Wie auch die Studien zur Lokalisation der Domänen innerhalb der Zelle zeigten, kann das Fehlen der Phänotypen weder auf eine fehlende Akkumulation der Fusionsproteine noch auf einen Ausschluss aus dem Zellkern zurückgeführt werden. 89

102 Diskussion Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die einzelnen Domänen von PFT1 auch ohne zusätzliche NLS in den Kern transportiert werden und bei Überexpression keinen Einfluss auf die Keimlingsentwicklung und somit auch keine dominant negativen oder positiven Effekte haben. Sie könnten ihre Funktionen, die sie als Teil des PFT1 haben, verlieren, was dann durch das endogen vorhandene Protein keinen Einfluss auf das Hypokotylwachstum hätte. Daher sollten weitere Experimente mit stabil transformierten Pflanzen der Mutante pft1-2 durchgeführt werden. Die Überexpression von PFT1 bzw. PFT1 eid3 resultierte in Aggregaten im Cytosol. Klose (2011) spekulierte, dass die Inaktivierung des PFT1 bzw. PFT1 eid3 durch die Bildung solcher Proteinaggregate zustande kommt. Dieses Phänomen ähnelt dem Verhalten anderer glutaminreicher Proteine, die z. B. an der Entstehung neurodegenerativer Erkrankungen wie der Chorea- Huntington Disease im Menschen beteiligt sind. Das für diese Erkrankung verantwortliche Huntingtin neigt bei Überschreiten einer kritischen Länge der Polyglutamin-Einheiten infolge einer Mutation ebenfalls zur Bildung von Aggregaten und schädigt bestimmte Hirnzellen (Cattaneo et al., 2001). In dieser Arbeit wurde ein Versuch durchgeführt, der die Rolle der glutaminreichen Region von PFT1 auf dessen Lokalisation in der Zelle und die cytoplasmatische Aggregatbildung aufklären sollte. An die genomische DNA von PFT1 wurde ein zusätzlicher Abschnitt der Sequenz, die für die Gln-reiche Region codiert, angefügt, sodass ein Protein mit einer verdoppelten Polyglutamindomäne entstand (2Qn). Das Konstrukt enthielt den nativen PFT1-Promotor aus Arabidopsis und ein C-terminal fusioniertes YFP. Es wurde transient in Senf eingebracht und unter verschiedenen Lichtbedingungen unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Hierbei ergab sich im Dunkeln, sowie nach Hell- und Dunkelrotbestrahlung eine Lokalisation im Zellkern ohne Bildung von granulären Strukturen oder größeren Aggregaten. Dies lässt vermuten, dass die Bildung von Aggregaten bei Verwendung des schwachen PFT1-Promotors nicht wesentlich durch die Polyglutamindomäne verursacht wird. 4.5 Untersuchungen zur Wechselwirkung von Jasmonat und PFT1 Das Pflanzenhormon Jasmonat (JA) ist an der Regulation der Antwort auf biotischen und abiotischen Stress, dem eine Pflanze ausgesetzt sein kann, beteiligt. Außerdem ist es an der Regulation des Wurzelwachstums beteiligt. Die Regulation der JA-Synthese unterliegt einem positiven Feedback-Loop (Turner et al., 2002). Auch PFT1 ist an der Jasmonat- 90

103 Diskussion Siganaltransduktion beteiligt und es wurde gezeigt, dass pft1-mutanten resistenter gegen Pilzbefall sind, indem die Expression JA-induzierter Gene geringer ist (Kidd et al., 2009) Der Einfluss von Methyljasmonat auf die Wurzellänge Da das Wurzelwachstum bei höheren Konzentrationen von MeJA inhibiert wird (Staswick et al., 1992), wurden Keimlinge des Wildtyps, sowie eid3 und pft1-2 auf MeJA aufgezogen und ihre Wurzellänge gemessen. Bei steigender Konzentration nahm die Länge der Hauptwurzel in allen getesteten Genotypen ab. Es ergab sich das Problem, dass die eid3-keimlinge und deren Wurzeln immer kleiner waren als diejenigen des Wildtyps und der pft1-2-t-dna-linie, was den Vergleich der drei Genotypen erschwert. Der Jasmonat-Effekt ist beim relatven Wurzelwachstum ähnlich, wobei eid3 sensitiver zu sein scheint als der Wildtyp und die T-DNA-Mutante. Aufgrund der kleineren Pflanzen könnte es auch sein, dass das Jasmonat stets einen Effekt auf die eid3- Mutation hat. Kidd et al. (2009) zeigten, dass pft1-2 im Vergleich zu einer komplementierten pft1-2-mutante weniger sensitiv auf die wachstumshemmende Wirkung von MeJA reagiert. Jedoch wurde in deren Veröffentlichung kein Vergleich mit dem Wildtyp gezeigt Interaktion mit MYC2 Nachdem auf physiologischer Ebene bzgl. Jasmonat kein Effekt durch eid3 zu sehen war, wurde ein Interaktionstest mit MYC2, einem wichtigen Regulator der JA-Signalkette (Lorenzo et al., 2004, Dombrecht et al., 2007), durchgeführt. Publikationen deuten an, dass MYC2 seine Funktion in der Signalkette unterhalb der Blaulichtrezeptoren CRY1 und CRY2 erfüllt (Yadav et al., 2005). MYC2 bindet an G-Box-Motiven in Promotoren, die an der Lichtregulation beteilgt sind (Yadav et al., 2005). Im Yeast-two-Hybrid ergab sich eine Interaktion mit PFT1 und PFT1 eid3, wobei die Interaktion mit PFT1 eid3 stärker war, da hier ein Kolonienwachstum auch auf dem hochselektiven Medium zu beobachten war (Abbildung 3-21). Die VP16-Domäne zeigte jedoch keinen Unterschied in der Stärke der Interaktion zwischen der mutierten und der Wildtyp-Version. Beide Formen wuchsen in Kombination mit MYC2 auf dem hochselektiven Medium. MYC2 bindet nach Eingang des JA-Signals an die Promotoren und Enhancer von JA-induzierten Genen (Dombrecht et al., 2007, Gangappa et al., 2010, Hong et al., 2012) und interagiert dort evtl. 91

104 Diskussion mit PFT1, um die Transkription zu starten. Wenn nun PFT1 fehlt, könnte MYC2 weniger gut als Transkriptionsfaktor an einem Promotor wirken und die Transkription der pathogeninduzierten Gene wäre verändert, was der Pflanze die von Kidd et al. (2009) gezeigte erhöhte Resistenz in pft1-2 verleihen könnte. PFT1 eid3 ist im Hinblick auf die Keimlingsentwicklung stärker aktiv als das Wildtyp-Protein, was auch auf seine Rolle in anderen Signalwegen übertragen werden könnte. So ist die Interaktion mit MYC2 stärker, was in einer erhöhten Aktivität JA-induzierter Gene, die durch MYC2 aktiviert werden, resultieren könnte Expression Methyljasmonat-induzierter Gene Hierzu wurde eine semi-quantitative PCR mit dem JA-Markergen VSP1 durchgeführt. Chen et al. (2012b) zeigten, dass dieses Gen in der pft1-mutante nach MeJA-Behandlung weniger stark exprimiert wird als im Wildtyp. In der eid3-mutante ergab sich eine leicht verringerte Expression des Gens im Vergleich zum Wildtyp. Die Mutation scheint also wie in pft1 die Expression JAinduzierter Gene herabzusetzen, wobei dieser Effekt nicht so stark ausgeprägt ist. Der Vorgang am Promotor könnte durch PFT1 eid3 zwar verändert werden, jedoch nicht so extrem wie in der T- DNA-Linie, was die Eigenschaft von PFT1 eid3 als Protein mit erhöhter Aktivität bestärken würde. VPS1 ist allerdings kein direkt von MYC2 aktiviertes Gen, weswegen in der eid3-mutante noch JAZ6 oder JAZ8 getestet werden sollten, an deren Promotoren MYC2 direkt bindet (Chen et al., 2012b). Um gemeinsame Funktionen von MYC2 und PFT1 zu finden, sollten Doppelmutanten myc2 pft1 und myc2 eid3 hergestellt werden. Deren Reaktion auf MeJA sollte dann sowohl auf der Ebene der Genexpression als auch der Physiologie untersucht werden. Interessant wären hier auch Experimente in verschiedenen Lichtqualitäten bei der Keimlingsentwicklung, da sich myc2- Mutanten als sensitiv gegenüber blauem Licht gezeigt haben und auch die Genexpression im dunkelroten Licht verändert ist (Yadav et al., 2005). In der hy5-mutante waren die Expressionslevel von VSP1 im Vergleich zum Wildtyp erhöht, was darauf hinweist, dass HY5 einen negativen Regulator in der VSP1-Expression darstellt (Prasad et al., 2012). Die Doppelmutante eid3 hy5 zeigte dieselben Level wie hy5, was auch in Bezug auf die Signaltransduktion nach Jasmonat-Behandlung auf eine Epistasie von hy5 über eid3 hinweist. Beide Proteine spielen vermutlich nicht nur im Lichtsignalweg eine gemeinsame Rolle, sondern auch im Hinblick auf die Jasmonatantwort. Die Doppelmutante sollte in weiteren Experimenten auch physiologisch auf ihre Reaktion nach MeJA-Behandlung untersucht werden, indem z.b. die Wurzellängen bei verschiedenen Konzentrationen gemessen werden. 92

105 Diskussion 4.6 Identifizierung neuer Interaktionspartner von PFT1 Um neue Interaktionspartner vom PFT1 zu identifizieren, wurden zwei Hefe-Library-Screens mit verschiedenen cdna-banken von Wildtyp-Arabidopsis-Pflanzen durchgeführt und verschiedene Transkriptionsfaktoren per Split-YFP in Senf bzw. im Yeast-Two-Hybrid in Hefe getestet Screening nach möglichen PFT1-Interaktoren mit Hilfe der Bimolekularen Fluoreszenz-Komplementation (BiFC) Verschiedene bekannte Transkriptionsfaktoren wurden mit PFT1 bzw. PFT1 eid3 in Senf auf eine Interaktion hin getestet. Der Interaktionstest erfolgte in vivo mit der BiFC. Hierbei wurde auch der etwaige Einfluss von Licht auf die Interaktion berücksichtigt, indem die Proben einem Hellrot- oder Dunkelrotlichtpuls ausgesetzt wurden, um nach 40 min Dunkelinkubation analysiert zu werden. Als Kontrolle dienten Proben, die in Dunkelheit belassen wurden Untersuchungen mit G-Box Binding Faktoren (GBF) GBF-Proteine haben eine NLS (Nuclear Localization Signal) und sind somit vorwiegend im Kern lokalisiert (Terzaghi et al., 1997, Sibéril et al., 2011). In A. thaliana sind 75 Transkriptionsfaktoren bekannt, die zur Familie der bzip (basic leucine zipper) gehören. GBF1, 2, 3 und ZIP68 gehören zur Untergruppe G (G-Box Binding Factors), da sie als Homo- oder Heterodimere an G-Boxen von Promotoren binden (Jakoby et al., 2002, Schindler et al., 1992). HY5 gehört zur Untergruppe H der bzip-faktoren (Jakoby et al., 2002) und bildet Heterodimere mit GBF1, 2 und ZIP68 (Pauron, 2011). Weder PFT1 noch PFT1 eid3 zeigten YFP-Signale im BiFC mit GBF1, was eine Interaktion der beiden Proteine unwahrscheinlich macht. Pauron zeigte 2011 die Interaktion von GBF1 mit PhyA in vivo und stellte somit eine direkte Wirkung von GBF1 im PhyA-vermittelten Lichtsignaltransduktionsweg fest. PFT1 wird mit PhyA- und PhyB-vermittelten Reaktionen auf Licht in Verbindung gebracht (Cerdan und Chory, 2003). Da keine Interaktion zu detektieren 93

106 Diskussion war, wurde gezeigt, dass die gewählte Methode spezifisch ist und nur bestimmte Proteine aus der gleichen Subfamilie mit PFT1 bzw. PFT1 eid3 interagieren. GBF2 ist im Dunkeln zu 50 % im Cytoplasma und zu 50 % im Zellkern lokalisiert und wird unter blauem Licht in den Zellkern transportiert, nicht jedoch unter rotem Licht (Terzaghi et al., 1997). Terzaghi et al. (1997) zeigten die Lokalisation von GBF2 allerdings in Protoplasten und nicht im Zellverband, was den Unterschied zu den Ergebnissen von Pauron (2011), die eine Lokalisation im Zellkern auch im Dunkeln nachwies, erklären könnte. Die Ergebnisse in Abbildung 3-13 zeigen eine Interaktion von GBF2 mit dem PFT1-Wildtyp-Protein sowohl im Dunkeln als auch nach Hell- und Dunkelrotlichtbehandlung, wobei das Signal nach der Lichtbehandlung stärker ist. Dies könnte auf einen aktiven Transport von GBF2 in den Zellkern nach Lichtgabe hindeuten, oder auf einen anderweitigen Aktivierungsschritt durch den Lichtsignalweg. GBF2 interagierte mit PFT1 eid3 nur nach einem DR-Puls. PhyA als wichtiger Sensor für DR interagiert auch mit GBF2 (Pauron, 2011), wobei die PhyA-Lokalisation in der eid3-mutante nicht beeinträchtigt ist (Klose et al., 2012). Hier könnte die eid3-mutation die Interaktion mit GBF2 im HR verhindern, indem andere endogen vorhandene Faktoren die Bindestelle verdecken, die nur nach DR-Licht für eine Interaktion freigegeben wird. Die hellrotspezifische Wirkung von PhyB auf die Interaktion könnte inhibitorisch sein und die dunkelrotspezifische über PhyA könnte eine Aktivierung der Interaktion hervorrufen. Somit könnte PFT1 sowohl einen negativen als auch einen positiven Faktor darstellen. GBF3 wird durch ABA induziert (Lu et al., 1996) und zeigte mit dem Wildtyp- und dem mutierten Protein eine Interaktion nach Lichtbehandlung, nicht jedoch im Dunkeln, sodass anzunehmen ist, dass die Interaktion durch Licht über die Phytochrome aktiviert wird und die eid3-mutation keinen Einfluss hat. ZIP68 scheint immer mit PFT1 und PFT1 eid3 zu interagieren, wobei hier die Belichtungszeiten zum Nachweis der BiFC deutlich länger waren als bei den anderen G-Box-binde-Faktoren GBF2 und GBF3. Die Interaktionen mit ZIP68 bedürfen keiner Induktion durch Licht Untersuchungen mit transkriptionellen Regulatoren der Anthocyansynthese Wie in Abschnitt gezeigt, akkumuliert eid3 auch unter niedrigeren Photonenflüssen deutlich mehr Anthocyan als der Wildtyp. Deshalb wurden BiFC-Experimente mit unterschiedlichen MYB-Transkriptionsfaktoren (PAP) durchgeführt, die up-stream des 94

107 Diskussion Schlüsselenzyms CHS an dessen Regulation und somit an der gesamten Anthocyanbiosynthese beteiligt sind (Borevitz et al., 2000, Gonzales et al., 2008). Die Analysen ergaben eine Interaktion von PFT1 mit PAP3 (MYB113) im Dunkeln und auch nach den Lichtpulsen. PFT1 eid3 zeigte nur nach hell- oder dunkelrotem Licht eine Interaktion. PAP3 wird nach Gabe von MeJA stark hochreguliert (Goda et al., 2008), mittels sirnas reguliert (Willmann et al., 2011) und interagiert mit TT8 (Zimmermann et al., 2004). Im Versuch von PFT1 und PFT1 eid3 mit TT8 zeigte sich das gleiche Interaktionsmuster: PFT1 zeigte eine Interaktion ohne und mit Lichtpulsen, während PFT1 eid3 einen Lichtreiz zur Interaktion benötigte. Hierbei könnte man auf eine enge Zusammenarbeit der drei Proteine PFT1 eid3, PAP3 und TT8 im Hinblick auf die Anthocyansynthese schließen, wobei die Interaktion durch Licht induziert wird und die Lichtantwort darauf die verstärkte Bildung von Anthocyan ermöglicht. Wie die qrt-pcr- Ergebnisse zeigen, wird das Gen CHS in der eid3-mutante schon nach einem kurzen Hellrotlichtpuls stärker transkribiert als im Wildtyp. Die verstärkte Transkription nach dem HR- Puls könnte durch die, erst nach Lichtgabe, induzierte Interaktion mit den Regulatoren der Anthocyanbiosynthese zusammenhängen. Dies steht im Gegensatz zur bereits vermehrten Transkriptakkumularion von CHS im Dunkeln, was darauf hindeutet, dass die Transkription im Dunkeln über einen anderen Kontrollweg über PFT1 eid3 koordiniert wird. Das wildtypische PFT1 interagiert mit PAP3 und TT8 dagegen auch ohne Licht, was eine repressive Wirkung von PFT1 bei der Anthocyansynthese im Dunkeln impliziert. Die Repression wäre so unabhängig von der Bindung an den Promotor, die sich auch nach einem Lichtreiz bezüglich einer Interaktion nicht ändert. Der Lichtreiz selbst sollte auf der Ebene des PFT1-Faktors wirksam werden, womöglich über eine Proteinmodifikation. PFT1 eid3 könnte wiederum nur eine positive Reaktion nach Lichtgabe auslösen, nicht jedoch die Repression im Dunkeln. Um weiter auf Transkriptionsebene zu gehen, kommt der Gedanke auf, dass der Mediatorkomplex auch an der Expression von RNA-abhängigen RNA-Polymerasen (RDRs) beteiligt sein könnte. Diese RDRs synthetisieren sirna, die die Proteinmengen von MYB113 herabsetzen (Willmann et al., 2011). Wenn nun durch die eid3-mutation die Expression der RDRs verändert wäre und mehr MYB113 zur Verfügung stünde, würde, wie von Gonzales et al. (2008) bei Überexpression von MYB113 gezeigt, mehr Anthocyan gebildet werden. 95

108 Diskussion 4.7 LAF1 LAF1 ist ein kernlokalisiertes Protein der R2R3-MYB Proteinfamilie. Es wird im Dunkeln von COP1 abgebaut, indem es an das RING-Motiv von COP1 bindet (Seo et al., 2003). LAF1 ist eine positive Signalkomponente im PhyA-Weg, da die rezessive Ds-Insertionslinie laf1 hyposensitiv auf dunkelrotes Licht reagiert (Ballesteros et al., 2001). Es interagiert mit anderen positiven Komponenten des PhyA-Signalweges (Seo et al., 2003), indem es mit seiner R3-Domäne an den zweiten Faktor bindet (Yang et al., 2009). Solche R2R3-Domänen sind bei anderen MYB- Faktoren für die Interaktion mit bhlh-faktoren notwendig (Grotewold et al., 2000). Die laf1 Knock-out-Mutanten haben einen hyposensitiven Phänotyp in der Keimlingsentwicklung im dunkelroten Licht, d.h. die Mutation bewirkt den gegenteiligen Effekt wie die eid3-mutation. eid3 zeigt dagegen im dunkelroten Licht einen hypersensitiven Phänotyp (Klose, 2011). Dies ist eine optimale Voraussetzung für Epistasieanalysen Interaktion von LAF1 und PFT1 Um eine mögliche Interaktion von PFT1 mit LAF1 zu testen, wurden zwei unabhängige Methoden verwendet, die beide die Interaktion zeigten. Im Yeast-two-Hybrid-System zeigten sich transaktivierende Eigenschaften beider Proteine, sodass nur Deletionskonstrukte Verwendung fanden. PFT1 und LAF1 interagieren jedoch auch ohne ihre transaktivierenden Domänen vwa bzw. dem C-Terminus miteinander. Hierbei ist zu beachten, dass die VP16- oder die FH- Domäne von PFT1 alleine nicht zu einer Interaktion ausreichen. In folgenden Experimenten sollte auch die verbleibende Polyglutamindomäne auf ihre Interaktion mit LAF1 getestet werden, um zu sehen, ob die Interaktion mit nur einer Domäne stattfindet oder ob weitere Teile des PFT1 (ohne vwa) nötig sind. Die eid3-mutation spielt bei der Interaktion eine Rolle, da die Interaktion von LAF1 mit PFT1 eid3 im Yeast-two-Hybrid-System stärker war als mit dem Wildtypprotein. Die Mutation scheint die beiden Proteine fester aneinander zu binden. Dagegen war im BiFC kein Unterschied von PFT1 bzw. PFT1 eid3 bei der Interaktion mit LAF1 zu erkennen. Die Interaktion war im Dunkeln und nach einem Hellrotpuls, nicht jedoch nach DR, vorhanden. Im Dunkeln sind beide Proteine permanent unabhängig von Licht aneinander gebunden, was höchstwahrscheinlich an Promotoren der Fall ist. Dies ist für den gesamten Mediatorkomplex bereits gezeigt worden (Courey, 2008). Nach einem hellroten Lichtpuls wird 96

109 Diskussion PhyA in der Zelle abgebaut und PhyB-E werden aktiviert, was die Verbindung von PFT1 und LAF1 nicht auflöst. Die Interaktion der beiden Proteine verschwindet nach Gabe eines DR- Pulses innerhalb von 45 min, was darauf hindeutet, dass PhyA die Trennung beider Proteine voneinander induziert. Dies könnte über eine schnell eingeleitete Modifikation eines oder beider Faktoren vonstattengehen. LAF1 wird von COP1 nach Gabe von Licht abgebaut (Seo et al., 2003), was eine Möglichkeit der Modifikation sein könnte. Es existieren jedoch keine Publikationen, die zeigen, in welchen Zeitrahmen dieser Abbau stattfindet. Da LAF1 ein positiver Faktor in der PhyA-Signaltransduktion (Ballesteros et al., 2001) ist, deutet der Befund auf eine inhibitorische Funktion des PFT1-LAF1-Komplexes hin. Iñigo et al. (2012b) zeigten die Aktivierung von PFT1 über dessen Abbau, was einen Widerspruch ergibt, jedoch zu der verstärkten Transkript-Akkumulation, die in diskutiert werden wird, passt Hypokotyllängenwachstum und Photomorphogenese in der eid3 laf1- Doppelmutante LAF1 ist in der PhyA-Signaltransduktion ein Aktivator von Genexpression. Die Mutante zeigt einen hyposensitiven Phänotyp im dunkelroten Licht, der sich in einem, gegenüber dem Wildtyp, verlängerten Hypokotyl ausbildet (Ballesteros et al., 2001). Dieser Phänotyp konnte in dieser Arbeit mit Hilfe von Photonenflusseffektkurven der Wellenlänge 715 nm (dunkelrot) bestätigt werden. Im dunkelroten Licht verlief die Hypokotylentwicklung der Keimlinge der Doppelmutante eid3 laf1 gleich der von eid3, d.h. der dominant positive Effekt der eid3-mutation wird durch das Fehlen von LAF1 nicht beeinflusst die Mutation ist epistatisch. Dies könnte an der erhöhten Aktivität PFT1 eid3 -regulierter Gene liegen, die auch ohne den Aktivator LAF1 genügend exprimiert werden, um den eid3-phänotyp auszubilden. Im hellroten Licht ist laf1 in der Keimlingsentwicklung nicht beeinflusst, sodass LAF1 als PhyA-spezifischer Regulator eingestuft werden kann (Ballesteros et al., 2001). Die Doppelmutante entwickelt sich auch im hellroten Licht wie die eid3-einzelmutante, was nicht erstaunlich ist, da die laf1-mutante in HR auch keinen veränderten Phänotyp zeigt. Beide Versuche deuten darauf hin, dass PFT1 in der Kette der Signalweiterleitung auf Ebene des Hypokotylwachstums im DR dominant gegenüber und im HR unabhängig von LAF1 ist. PFT1 steht somit entweder unterhalb von LAF1, da PFT1 Einfluss auf die Keimlingsentwicklung nach dem dunkelroten Lichtreiz hat, oder PFT1 eid3 ersetzt die LAF1-Funktion. Die Proteine LAF1 und PFT1 bzw. PFT1 eid3 interagierten nicht mehr nach Gabe 97

110 Diskussion eines Dunkelrotlichtpulses, was darauf hindeutet, dass die Signalkette unterhalb von PhyA in der VLFR nicht von der Interaktion abhängt Anthocyanakkumulation in der eid3 laf1-doppelmutante Die Anthocyanakkumulation ist wie das Hypokotyllängenwachstum eine klassische FR-HIR. Unter dunkelrotem Licht ist LAF1 ein positiver Effektor, da die Mutante hyposensitiv für die Inhibition des Hypokotyllängenwachstums ist (Ballesteros et al., 2001, diese Arbeit). Die eid3- Mutation ist dominant negativ und hypersensitiv in der Keimlingsentwicklung und ein gain-offunction Allel eines positiven Effektors (Klose et al., 2012). Die Befunde des Hypokotyllängenwachstums der eid3-mutante decken sich mit den Ergebnissen der Messung der Anthocyanakkumulation mit einer Hypersensitivität. laf1 zeigte dagegen keine Veränderungen. Die Doppelmutante eid3 laf1 ist strikt epistatisch und der Effekt somit unabhängig von LAF1. Einerseits könnten andere Effektoren (z.b. andere MYB-Faktoren) LAF1 ersetzen. Andererseits könnte PFT1 eid3 selbst die Funktion ersetzen. Im konstanten hellroten Licht hat LAF1 keinen Einfluss auf die Anthocyanakkumulation, jedoch zeigen sich sehr komplexer Phänotypen der Doppelmutante und eid3. Auch bei der Anthocyanakkumulation ist eid3 epistatisch gegenüber laf1, da die Ergebnisse der Versuche bezüglich der Anthocyanakkumulation denen der Keimlingsentwicklung ähneln, indem eid3 und eid3 laf1 hypersensitiv gegenüber dunkel- und hellrotem Licht sind, während laf1 im DR hyposensitiv reagiert und im HR dem Wildtyp entspricht. Gene der Anthocyansynthese (z.b. CHS) sind durch LAF1 gesteuert (Jang et al., 2007), sodass laf1 im Dunkelrot weniger Anthocyan bildet als der Wildtyp. Es zeigt sich wieder die Unabhängigkeit von PFT1 von LAF1. Auffällig im dunkelroten Licht ist die erhöhte Anthocyanakkumulation der Doppelmutante im Vergleich zu eid3. Das Fehlen von LAF1 verstärkt hier die hypersensitive Reaktion zusätzlich, was wiederum auf die erhöhte Expression PFT1 eid3 -regulierter Gene zurückzuführen ist (siehe unten), sodass bei dunkelrotem Licht im Wildtyp LAF1 PFT1 in seiner Funktion hemmen könnte. Nach einem DR-Puls kam es allerdings zu keiner detektierbaren Interaktion auf Molekülebene, was darauf hindeutet, dass PFT1 bei Interaktion mit LAF1 im HR verstärkt aktiv ist. Im hellroten Dauerlicht akkumuliert die Doppelmutante weniger Anthocyan als eid3. LAF1 hat im hellroten Licht bei der Bildung von Anthocyan evtl. eine positive Wirkung auf PFT1 eid3, die bei fehlendem LAF1 geringer ist. Jedoch muss hier beachtet werden, dass die Akkumulation von Anthocyan eine HIR ist und nicht durch Lichtpulse induziert wird. Auf Ebene der Genexpression von CHS, einem an 98

111 Diskussion der Anthocyanbildung entscheidend beteiligten Enzym (Shirley et al., 1995), zeigt sich das gleiche Muster wie bei den physiologischen Untersuchungen zur Anthocyanakkumulation. Hier muss darauf hingewiesen werden, dass letztere im Dauerlicht und die qrt-experimente nach einem kurzen Lichtpuls und 45 min Dunkelinkubation durchgeführt wurden. Nach der Behandlung mit hellrotem Licht, ist die Genexpression in eid3 stark erhöht im Vergleich zum Wildtyp, der anderen Einzel- und auch der Doppelmutante, was dem oben genannten Phänomen entspricht und so die Interpretation unterstützt, dass LAF1 bei der Bildung von Anthocyan eine positive Wirkung auf PFT1 eid3 hat. Auch liegt hier die Expression von CHS in der Doppelmutante eid3 laf1 über der des Wildtyps. Bei dem Versuch mit dunkelrotem Licht zeigt sich wieder das gleiche Muster wie auf physiologischer Ebene: mit einer höheren Genexpression und Anthocyanakkumulation in eid3, die von der Doppelmutante noch überschritten wird. LAF1 scheint also PFT1 eid3 bei der Aktivierung der Transkription zu hemmen Expressionsmuster lichtregulierter Gene in eid3 laf1 Im Gegensatz zu HY5 interagiert LAF1 direkt mit PFT1 und PFT1 eid3, was im BiFC und Yeasttwo-Hybrid gezeigt wurde. So ist denkbar, dass beide Proteine direkt an einem Promotor interagieren, um dessen Expression zu steuern. Auf physiologischer Ebene ergab sich in der eid3 laf1-doppelmutante der entgegengesetzte Effekt wie in eid3 hy5 mit einer Epistasie von eid3 gegenüber laf1. Die Entwicklung der Hypokotyllänge ist somit unabhängig von der laf1-mutation oder up-stream von PFT1 eid3. Bei den Genexpressionsstudien von Lichtmarkergenen zeigten sich überraschende und sehr uneinheitliche Befunde. Die früh lichtinduzierten Markergene in eid3 zeigten eine bereits im Dunkeln erhöhte Expression, was den leichten cop-phänotyp der Mutante erklärt. Die Mutation ergibt eine konstitutive Expression dieser Gene, welche die Photomorphogenese einleiten. Die laf1-einzelmutante zeigt zwar eine geringere Expression der lichtregulierten Gene als der Wildtyp, was sich jedoch nicht in einem Phänotyp äußert. Da LAF1 als Transkriptionsfaktor lichtregulierter Gene in der laf1-mutante fehlt, führt dies zum Absinken von deren Transkriptlevel. Nach Gabe eines dunkelroten Lichtpulses sollte die VLFR über PhyA gesteuert werden. Im Falle der beiden Gene HY5 und CHS ist eid3 hypersensitiv, während die Doppelmutante eid3 laf1 eine überaus starke Induktion zeigt, was einen synergistischen Effekt darstellt. Ähnlich wie bei der 99

112 Diskussion Mutation der putativen MYB-Bindestelle im HY5-Promotor scheint LAF1 für PFT1 eid3 als negativer Regulator zu dienen. Die laf1-mutante scheint keinen oder nur einen geringen Einfluss auf die Genexpression zu haben. Hier ersetzen evtl. andere Faktoren LAF1 oder die positive und negative Regulation von PFT1 edi3 hält sich die Waage. Im Falle von PKS1 wirkt eid3 auch epistatisch zu laf1, während im Gegensatz dazu bei APRR5 laf1 epistatisch zu eid3 zu sein scheint. Bei beiden Genen hat die laf1-mutation einen sehr starken Einfluss auf die Transkript-Akkumulation, die im Vergleich zur eid3-mutante deutlich reduziert ist. LAF1 kann hier vorwiegend als positiver Effektor angesehen werden, der die Wirkung der eid3-muation über die Interaktion mit LAF1 möglicherweise noch verstärkt. APRR5 ist unter den getesteten frühen Genen das einzige, das circadian exprimiert und reguliert wird. Es könnte sein, dass dieses Gen im PhyA-Signalweg abhängig von PFT1 und LAF1 ist. Die eid3-mutation könnte hier nicht als konstitutiver Aktivator wirken, sondern abhängig von LAF1 als Repressor für die PhyA-abhängige APRR5-Expression. Die beiden Gene HY5 und CHS zeigen eine deutliche dunkelrot-hir nach vier Stunden, während dies bei PKS1 und APRR5 nicht der Fall ist, was auf Unterschiede in der PhyA- Reaktion hinweist. Im BiFC ergab sich nach einem dunkelroten Lichtpuls eine Reduktion des Fluoreszenzsignals bei der Interaktion von LAF1 mit PFT1 bzw. PFT1 eid3, was ein Hinweis darauf ist, dass beide Proteine bei der Transkriptionskontrolle zusammen agieren. Nach einem hellroten Lichtpuls laufen sehr komplexe Signalwege in der Pflanze auf Ebene der Phytochrome ab. PhyA wird induziert und gleichzeitig zu SAPs (Sequestered Areas of Phytochrome) akkumuliert und dort abgebaut (Kircher et al., 1999, Wolf et al., 2011). Dahingegen werden die Phytochrome B bis E aktiviert, was bei einem Dunkelrotlichtpuls nicht der Fall ist (Franklin und Quail, 2010). Auf die früh induzierten Markergene wirkt ein synergistischer Effekt in der eid3 laf1-doppelmutante. LAF1 scheint unter Hellrotlichtpuls-Bedingungen eher ein negativer Regulator zu sein. Eine Idee ist die gegenseitige Inhibition von PhyA und PhyB. LAF1 wirkt speziell im Phytochrom A-Weg (Ballesteros et al., 2001) und vermittelt möglicherweise die Inhibition von PhyA auf PhyB, wie es von uns (Klose et al., 2012) schon für PFT1 postuliert wurde. Hierber könnte LAF1 als ein Schalter zwischen Hell- und Dunkelrotlichtsignalwegen dienen. Für das spät induzierte Gen nach dem hellroten Lichtpuls zeigt sich eine Epistasie von laf1 über eid3, allerdings hat der Rotlichtpuls auch keine Wirkung auf den Wildtyp, was von Peschke und 100

113 Diskussion Kretsch (2011) schon gezeigt wurde, d.h. PhyB reicht für die Genexpression hier nicht aus. Die eid3-wirkung steht somit doch über der von laf1. SPA1 ist in seinem Expressionsmuster anders als die anderen früh induzierten Gene. In allen Genotypen wird auch im Dunkeln Transkript akkumuliert. Das konstitutiv aktive PFT1 eid3 hat eine vermindernde Wirkung auf die Expression von SPA1. SPA1 ist ein negativer Regulator im PhyA-Signalweg (Höcker et al., 1998) und die Expression von SPA1 wird durch MYC2 aktiviert (Gangappa et al., 2010). Da PFT1 mit MYC2 interagiert, könnten beide Proteine wichtig für die Expression von SPA1 sein. Da PFT1 eid3 eine stärkere Interaktion zeigte, könnte das mutierte Protein die Genexpression unterdrücken, während das wildtypische PFT1 sie aktiviert. Wenn nun aufgrund der Mutation weiniger SPA1 exprimiert wird, wird die Signalleitung nicht gehemmt und ein stärkerer Phänotyp kann sich ausbilden, was dem verkürzten Hypokotyl der eid3-mutante entspricht. Die Doppelmutante eid3 laf1 zeigt ähnliche Transkriptlevel wie die eid3-einzelmutante, was auch den eid-gleichen Phänotyp erklären kann. Nach einem Hellrotlichtpuls wird das Gen verstärkt exprimiert, wobei eid3 den höchsten Wert hat. Dies deckt sich so nicht mehr mit der Erklärung des Phänotyps im Dunkeln. Es könnte sein, dass das mutierte Protein PFT1 nach einem Lichtpuls eine andere Funktion bzw. Wirkungsweise annimmt, z.b. nicht mehr oder schwächer mit MYC2 interagiert. So würde die Expression von SPA1 nicht mehr gehemmt, sondern die eid3-mutation würde sie, wie bei allen anderen Genen, aktivieren, sodass die Überlegung aufkommt, dass PFT1 und PFT1 eid3 je nach Lichtbedingung, Zielgen oder zu regulierendem Protein ein Aktivator oder Suppressor sein kann. Der Anstieg der SPA1- Expression ist in der Doppelmutante nicht so stark ausgeprägt. Das fehlende LAF1 scheint hier die Aktivität des PFT1 eid3 herabzusetzen. SPA1 ist also in der laf1-mutante in der Ausbildung des hyposensitiven Phänotyps nicht involviert. Nach dem Dunkelrotlichtpuls zeigt sich die Epistasie von eid3 über laf1. Das fehlende LAF1 verändert nach dem DR-Puls nicht die Funktion von PFT1 eid HY5 HY5 ist ein essentieller Faktor bei vielerlei Lichtantworten (Ang und Deng, 1994). Ähnlich der laf1-mutante bewirkt die hy5-mutation eine erniedrigte Expression lichtregulierter Markergene, ist jedoch epistatisch gegenüber eid3. Auch auf Ebene der Physiologie bei der Keimlingsentwicklung zeigte sich diese Epistasie (Klose et al, 2012, Klose, 2011), was darauf hindeutet, dass HY5 in der Lichtsignalkette unterhalb von PFT1 cid3 steht. 101

114 Diskussion Es wurde keine direkte Interaktion von HY5 mit PFT1 oder PFT1 cid3 nachgewiesen (Klose, 2011). Deswegen wurden Studien zur Aktivität des HY5-Promotors in eid3 durchgeführt (s.u.). Es könnte eine indirekte Interaktion von PFT1 und HY5 über andere bzip-faktoren aus der GBF-Gruppe stattfinden. Pauron (2011) zeigte eine Bildung von Heterodimeren bestehend aus HY5 und GBF2 bzw. ZIP68. Letztere interagierten auch mit PFT1 und PFT1 eid3 und könnten so eine indirekte Interaktion herstellen. Um hier weitere Fragen zu klären, sind Doppel- und Tripelmutanten notwendig. Andererseits könnte eine Interaktion nur über die Regulation der HY5-Expression auf Transkriptionsebene stattfinden. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass in eid3 mehr HY5- Transkript gebildet wird, was darauf hindeutet, dass PFT1 und PFT1 eid3 die Genexpression regulieren, was die hypersensitive Lichtantwort in Form des verkürzten Hypokotyls erklären könnte Die eid3 hy5 Doppelmutante Klose et al. zeigten 2012, dass hy5 in Bezug auf das Auslösen der Photomorphogenese bei der Keimlingsentwicklung epistatisch gegenüber eid3 ist, d.h. PFT1 eid3 benötigt HY5, um den spezifischen eid-phänotyp auszubilden, was darauf hindeutet, dass HY5 down-stream von PFT1 eid3 liegt. Die beobachtete Epistasie sollte in dieser Arbeit auch auf Ebene der Genexpression getestet werden. Die beiden Gene PKS1 und CHS brauchen HY5 für ihre lichtinduzierte Transkription, da in der hy5-mutante keine Transkript-Akkumulation nachgewiesen werden konnte. In der eid3 hy5-doppelmutante zeigt sich deutlich die Epistasie von hy5, sodass HY5 für die Ausprägung des hypersensitiven eid3-phänotyps auch auf Ebene der Genexpression notwendig ist. Diese enge Korrelation lässt vermuten, dass die Proteine HY5 und PFT1 bzw. PFT1 eid3 miteinander interagieren. Dies konnte jedoch weder im BiFC noch im Yeasttwo-Hybrid-System nachgewiesen werden (Klose, 2011). Eine indirekte Interaktion könnte jedoch durch GBFs oder LAF1 vermittelt werden, die sowohl mit HY5 als auch mit PFT1/ PFT1 eid3 interagieren. Die Anthocyan-Akkumulation ist in hy5 vermindert (Shin et al., 2007), was auch für eid3 hy5 gelten könnte, jedoch durch ein Experiment verifiziert werden sollte. Die vermehrte Expression von CHS in eid3 könnte durch die schon gezeigte erhöhte HY5- Transkription erklärt werden, da in der Mutante mehr HY5 vorhanden ist, das CHS exprimieren kann und so mehr Anthocyan gebildet wird. 102

115 Diskussion Auch APRR5 benötigt zu seiner Expression HY5, da in der hy5-mutante weniger Transkript akkumuliert wird. Hier ist der Epistasie-Effekt geringer als bei den anderen Genen PKS1 und CHS. Der Promotor von APRR5 besitzt einen anderen Aufbau, der nicht typisch für lichtregulierte Gene ist. Das Gen ist Teil eines Zyklus der inneren Uhr und wird kaskadenförmig von anderen APRR-Proteinen reguliert (Wang und Ma, 2012) Analysen zur Regulation des HY5-Promotors Unveröffentlichte Daten des Labors Nagy grenzen die lichtabhängige Regulation auf zwei Elemente im Promotor von HY5 ein - zum einen auf die Sequenz AACGGC, die Ähnlichkeit zu MYB-Bindedomänen hat (Ko et al., 2008), und zum anderen auf ein ACGT-Element, das oft von bzip-faktoren auch in Form von Homo- und Heterodimeren erkannt wird (Foster et al., 1994). Hierbei spielen vor allem die Basenpaare vor und nach dem ACGT-Element eine Rolle. Es wurden Kreuzungen mit den von Nagy erhaltenen HY5-Promotor-LUC-Linien mit eid3 durchgeführt. Die Beobachtungen zeigen, dass das ACGT-Element für die Genexpression essentiell ist, da keine Promotoraktivität festgestellt werden konnte. Im Wildtyp-Hintergrund konnte keine oder nur eine sehr geringe Promotoraktivität festgestellt werden, während diese im eid3-hintergrund vollständig unterdrückt war. Hinweise auf eine HY5-Autoregulation durch einen positiven Feed-back-Loop gibt es nicht, jedoch könnten andere Transkriptionsfaktoren mit dem Promotor interagieren. Beispielsweise ist bekannt, dass bzips (Foster et al., 1994) speziell an ACGT-Elemente binden. Die Transkriptionsfaktoren, die den Promotor normalerweise aktivieren, scheinen bei Mutationen im ACGT-Element in ihrer Bindung gehemmt zu sein. So könnte ein Teil eines Dimers, bestehend aus bzip-/gbf-faktoren, bei der Mutation des AC im ACGT-Element nicht mehr binden, was dem Konstrukt ACGT m1 entspricht, das nur geringe Promotoraktivität zeigt. Bei der Mutation des GT im Element könnte der zweite bzip/gbf- Faktor, der ein Teil des Dimers ist, nicht mehr binden und der Promotor verliert vollständig seine Funktion, sodass die Basen GT essentiell für die Expression sind. Im dunkelroten Licht konnte im Wildtyphintergrund eine Promotoraktivität mit dem full-length- Konstrukt und auch dem verkürzten Konstrukt detektiert werden. Dahingegen ergaben die Versuche unter diesen Lichtbedingungen im eid3-hintergrund nur LUC-Signale des full-length- Konstruktes, während der verkürzte Promotor hier keine Aktivität zeigte. Im eid3-hintergund lässt der gesamte Promotor die Interaktion von Transkriptionsfaktoren, die wahrscheinlich an 103

116 Diskussion den Basenpaaren -40 bis -100 binden, zu, während die verkürzte Version im dunkelroten Licht nicht ausreicht, was darauf hinweist, dass im eid3-hintergrund weitere Faktoren die dunkelrotspezifisch sind, zur Expression hinzugezogen werden müssen. So könnten up-stream vom Basenpaar -157 gelegene Promotormotive eine mögliche Repression aufheben. Die Mutation im MYB-Element ergab eine hypersensitive Reaktion, was als Hinweis auf die Funktion eines negativen Regulators gedeutet werden kann, der lichtabhängig an den Promotor bindet. Die Bindung eines Repressors, der normalerweise an das MYB-Element bindet und die Transkription behindert, könnte durch die Mutation des Elementes in seiner Bindung gehemmt werden und so die Transkription nicht mehr blockieren. Diese hypersensitive Reaktion der Linien mit Mutation im MYB-Element war im eid3-hintergrund wesentlich stärker ausgeprägt als im Wildtyp-Hintergrund, was darauf hindeutet, dass die Repressor-Funktion von PFT1 unterdrückt wird. Die eid3-mutation im PFT1-Protein könnte möglichweise von der Repression der Genexpression entkoppelt sein. Ein im Licht negativ wirkender Transkriptionsfaktor könnte bei der Mutation im MYB-Motiv nicht mehr binden. Oder ein positiv wirkender Transkriptionsfaktor, der an einem Sequenzmotiv in der Nachbarschaft des MYB-Motivs bindet, könnte einen negativen Regulator heranziehen, wobei die eid3-mutation mit letzterem interagiert und dessen negative Regulation inaktiviert, sodass diese Funktion fehlt. PFT1 eid3 würde so die Transkription selbst regulieren. So stellt sich die Frage, ob von den interagierenden Proteinen, die in dieser Arbeit identifiziert wurden, ein spezielles Protein für solch eine Funktion in Frage kommt und an das MYB-Motiv bindet. Mögliche Kandidaten hierfür sind PAP3 (MYB113) und LAF1, wobei diese bisher nicht als Repressoren beschrieben worden sind. Die markantesten Luziferasesignale zwischen den Linien im Wildtyp- und eid3-hintergrund ergaben sich nach einem Dunkelrotlichtpuls, wobei diese frühen Reaktionen hier vorwiegend von PhyA gesteuert werden (Tepperman et al., 2001). Eid3-Keimlinge sind zwar auch im hellroten Licht hypersensitiv, jedoch nicht so stark wie im dunkelroten Licht (Klose et al., 2012). Die verstärkte Reaktion auf den DR-Puls entspricht daher auch der hohen Hypersensitivität der Mutante im dunkelroten Licht auf Ebene der Keimlingsentwicklung und auch der Anthocyanakkumulation, wobei hier darauf hingewiesen werden muss, dass es sich bei letzterem um eine HIR und keine VLFR handelt. Die verstärkte Promotoraktivität von HY5 deckt sich auch mit den beobachteten erhöhten Transkript-Akkumulationen des Gens in der eid3-mutante. 104

117 Diskussion Es könnte auch sein, dass PFT1 eid3 solche Transkriptionsaktivatoren vor dem Abbau durch COP1 schützt und auch auf diesem Wege die Expression lichtregulierter Gene verstärkt. Dies könnte z.b. mit LAF1 geschehen, da die beiden Proteine miteinander interagieren. Kreuzungen der Luziferase-HY5-Promotorlinien im eid3-hintergrund mit der hy5-mutante könnten zeigen, ob der Effekt der eid3-mutation auf den HY5-Promotor, wie der eid3-phänotyp, auch strikt von der Anwesenheit von HY5 abhängig ist. Nach den Ergebnissen der Luziferase-Assays wurde getestet, ob PFT1 oder PFT1 eid3 selbst direkt an den HY5-Promotor binden und so dessen Expression regulieren. Die ChIP-Ergebnisse zeigten dies jedoch nicht. So könnten andere Faktoren zwischen PFT1 und dem HY5-Promotor liegen. Der Mediatorkomplex am Promotor ist sehr groß, sodass nicht ausgeschlossen werden kann, dass nicht alle Faktoren durch das Crosslinking fixiert wurden bzw. es könnten auch weitere Fehler in der Versuchsdurchführung geschehen sein. Der Versuchsansatz wurde zudem nur mit einem biologischen Replikum durchgeführt, was somit statistisch nicht signifikant ist. 4.9 Mögliche Funktionsweisen von LAF1 und PFT1 am HY5-Promotor Abbildung 4-1 zeigt verschiedene Modelle zur Funktionsweise von LAF1 und PFT1. Im Modell A binden LAF1 und/oder andere MYB-Faktoren einen Inhibitor an den Promotor, der die Genexpression verhindert. Dies wäre ähnlich den Funktionen der JAZ- und DELLA-Proteine in der Jasmonat- und GA-Signaltransduktion. Es könnten zwei verschiedene Typen von MYBs bestehen: Zum einen solche, die mit einem Inhibitor interagieren und so aktivierende und deaktivierende Auswirkungen auf die Transkription haben können (MYB +/- ) und zum anderen solche, die nicht mit einem Inhibitor interagieren und nur positive Wirkungen haben können (MYB +/+ ). Nach Eingang eines Lichtreizes könnte der Inhibitor entfernt werden und der Mediator-Komplex inkl. PFT1 an den Promotor binden, um die Transkription von z.b. HY5 zu starten. Alternativ könnten inhibierende MYB-Faktoren am Promotor durch aktivierende ersetzt werden. Das PFT1 eid3 könnte im Gegensatz zum wildtypischen PFT1 die Genexpression trotz einem gebundenen Inhibitor aktivieren (Abbildung 4-1 B). Wenn LAF1 oder andere MYBs fehlen, könnte ein Inhibitor überhaupt nicht mehr binden, was dazu führen würde, dass die ohnehin aktive Funktion von PFT1 eid3 weiter verstärkt würde (Abbildung 4-1 C). So hätte PFT1 eid3 eine erhöhte Wirkung in Zusammenhang mit rein aktivierenden MYBs (MYB +/+ ). 105

118 Diskussion Bei der Mutation eines MYB-Bindemotivs in der Promotor-Sequenz sollte keine Bindung von MYB-Faktoren möglich sein (Abbildung 4-1 D), was einen Hinweis auf eine von MYBs unabhängige Wirkung von PFT1 eid3 gibt. Das ACGT-Element im HY5-Promotor ist sehr wichtig für die PFT1 eid3 -Funktion (Abbildung 4-1 E). HY5 bindet vermutlich als Heterodimer an dieses Element, was dem Epistasie-Effekt in vielerlei Lichtreaktionen entspricht. Eine andere Mutation im ACGT-Element hat geringere Folgen für die PFT1 eid3 -Funktion. Ein Bindepartner eines bzip- Heterodimers könnte an die eine Hälfte des Elementes binden und so eine partielle Aktivität des Promotors ermöglichen (Abbildung 4-1 F). 106

119 Diskussion Abbildung 4-1 Schematische Modelle zum Zusammenwirken von PFT1 und LAF1 am HY5-Promotor. In grau ist der Promotor von HY5 dargestellt, in dem einzelne spezifische DNA-Sequenzen im Ein-Buchstabencode angedeutet sind. AACGGC bildet hierbei ein MYB-Bindemotiv, ACGT ein Bindemotiv für bzip-faktoren und ATG das Startcodon. MYB: MYB-Transkriptionsfaktor; LAF1: LONG AFTER FAR-RED 1; PFT1: PHYTOCHROME AND FLOWERING TIME 1; eid3: empfindlicher im dunkelroten Licht 3; bzip: basic Leucin Zipper; HY5: LONG HYPOKOTYL 5; RNA Pol II: RNA-Polymerase II, MYB m : mutiertes MYB-Bindemotiv, ACGT m1/2 : mutierte ACGT-Elemente. 107