Analyse transkriptioneller Netzwerke während der Oligodendrozyten- Differenzierung und zentralnervöser Myelinisierung in der Maus

Transkript

1 Analyse transkriptioneller Netzwerke während der Oligodendrozyten- Differenzierung und zentralnervöser Myelinisierung in der Maus Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. vorgelegt von Julia Hornig aus Bückeburg

2 Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät vom Fachbereich Biologie der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg. Tag der mündlichen Prüfung: 11. April 2014 Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Johannes Barth Gutachter: Prof. Dr. Michael Wegner Prof. Dr. Robert Slany

3 Für die Wissenschaft!

4 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis...I Abbildungsverzeichnis... V Tabellenverzeichnis... VII Zusammenfassung...1 Summary Einleitung Das Nervensystem in Vertebraten Das zentrale Nervensystem Die Entwicklung des zentralen Nervensystems Die Gliazellen des zentralen Nervensystems Das periphere Nervensystem Die Entwicklung des peripheren Nervensystems Die Gliazellen des peripheren Nervensystems Sox-Proteine SoxE-Proteine Sox Sox Sox Problemstellung Ergebnisse Untersuchung der ZNS-spezifischen Deletion von Sox10 in Oligodendrozyten Die konditionale Deletion von Sox10 im ZNS führt zur Beeinträchtigung der Fortbewegung und zum verfrühten Tod Auswirkung der konditionalen Deletion von Sox10 im ZNS auf die Mitglieder der SoxE-Gruppe Einfluss des Verlusts von Sox10 im ZNS auf die Anzahl oligodendroglialer Zellen Die konditionale Deletion von Sox10 im ZNS führt zum terminalen Differenzierungsdefekt der Oligodendrozyten Der Verlust von Sox10 im ZNS blockiert die Myelinbildung I

5 Inhaltsverzeichnis Die kombinierte Deletion von Sox10 und Sox8 führt zum vollständigen Ausfall der terminalen Differenzierung Der Verlust von Sox10 führt zur Störung der Oligodendrozytenentwicklung in der späten promyelinisierenden Phase Analyse der Sox10 abhängigen Aktivierung der Myrf Expression Untersuchung des Myrf Enhancers EKR Analyse der Interaktion von Myrf mit Sox Herstellung von α-myrf-antikörpern Generierung von Epitopen Charakterisierung der α-myrf Antikörper Diskussion Die Bedeutung von Sox10 für die Entwicklung myelinbildender Zellen Partielle Redundanz von Sox8 und Sox Induktion der Sox10-abhängigen terminalen Differenzierung von Oligodendrozyten EKR9-abhängige Aktivierung von Myrf durch Sox Interaktion von Sox10 und Myrf Funktionalität der generierten α-myrf-antikörper Fazit Material und Methoden Material Bakterienstämme Zelllinien Mausstämme Hühnerstamm Chemikalien und allgemeine Reagenzien Puffer und Lösungen Bakterienmedien Oligonukleotide Oligonukleotide für Genotypisierung Oligonukleotide für Klonierung Oligonukleotide für quantitative realtime PCR In situ Sonden Antikörper II

6 Inhaltsverzeichnis Primärantikörper Sekundärantikörper Methoden Molekularbiologische Methoden Standard Methoden Isolierung genomischer DNA zur Genotypisierung Polymerase-Kettenreaktion (PCR) RNA Präparation aus Gewebe Reverse Transkription und RT-PCR Quantitative real time PCR (qpcr) DIG-Markierung von crna-sonden durch in vitrotranskription Biochemische Methoden Heterologe Genexpression in Bakterien Proteinaufreinigung SDS-Gelelektrophorese Western Blot Zellkulturmethoden Kultivierung von eukaryontischen Zellen Transfektion von HEK293 Zellen und S16 Zellen Präparation von Gesamtzellextrakten Transfektion von Neuro2a-Zellen Luziferase-Aktivitätstest Generierung transgener Mäuse In ovo Elektroporation von Hünchenembryonen Histologische Methoden Präparation von Embryonen und Organentnahme Immunhistochemie Immunzytochemie In situ Hybridisierung Richardson-Färbung und Transmissionselektronenmikroskopie X-Gal-Färbung Bildbearbeitung und statistische Analyse Abkürzungsverzeichnis Literaturverzeichnis III

7 Inhaltsverzeichnis Publikationen Danksagung IV

8 Abbildungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Bildung einzelner ventraler Domänen im Neuralrohr... 4 Abbildung 2: Schematische Darstellung von Gliazellen und Neuronen im ZNS... 5 Abbildung 3: Die Entwicklung der Oligodendrozyten... 6 Abbildung 4: Die Entwicklung der Schwann-Zelle Abbildung 5: Schematische Darstellung der SoxE-Proteine Abbildung 6: Überprüfung der ZNS-spezifischen Deletion von Sox10 und dessen Auswirkung auf die Expression von Sox9 und Sox Abbildung 7: Auswirkung der ZNS-spezifischen Deletion von Sox10 auf die Anzahl oligodendroglialer Zellen Abbildung 8: Terminaler Differenzierungsdefekt durch die ZNS-spezifische Deletion von Sox Abbildung 9: Fehlende Myelinisierung nach ZNS-spezifischer Deletion von Sox Abbildung 10: Vollständiger Verlust der terminalen Differenzierung bei kombinierter Deletion von Sox8 und Sox Abbildung 11: Verlust der Myrf-Expression in Sox10- und Sox8/Sox10-doppeltdefizientem Rückenmark Abbildung 12: Störung der Oligodendrozytenentwicklung in der promyelinisierenden Phase durch die ZNS-spezifische Deletion von Sox Abbildung 13: Die Expression von Gpr17 zeigt keine Beeinflussung durch den ZNSspezifischen Verlust von Sox Abbildung 14: Auswirkung der ZNS-spezifischen Sox10-Deletion auf Oligodendrozytenmarker an den postnatalen Tagen P7 und P Abbildung 15: Sox10 induziert in vivo die Expression von Myrf Abbildung 16: Sox10 kann Myrf nicht in S16 Schwann-Zellen aktivieren Abbildung 17: Sox10 bindet an die EKR Abbildung 18: Mutationen an den Sox10-Bindestellen beeinflussen das Bindungsverhalten von Sox Abbildung 19: Mutationen an den Sox10-Bindestellen reduzieren die Funktionalität und die Sox10-Sensitivität der EKR Abbildung 20: Schema der Transgenkonstrukte zur Pronukleusinjektion Abbildung 21: EKR9 ist ein Oligodendrozyten-spezifischer Enhancer Abbildung 22: Sox10 interagiert physiologisch mit Myrf über die Sox10-Dim/HMG- Domäne und dem C-Terminus von Myrf V

9 Abbildungsverzeichnis Abbildung 23: Sox10 and Myrf interagieren funktionell in N2a-Zellen Abbildung 24: Schematische Darstellung von Myrf und den ausgewählten Epitopen Abbildung 25: Kontrolle der eluierten Antigene und Western Blots zur Charakterisierung der generierten Myrf-Antikörper Abbildung 26: Koimmunhistochemische Färbungen von Myrf mit Pdgfra bzw. Sox VI

10 Tabellenverzeichnis Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Übersicht des lacz-expressionsmusters der EKR9wt-lacZ- und EKR9mtlacZ-transgenen Mäuse Tabelle 2: Übersicht der generierten Antikörper und deren Funktionalität Tabelle 3: Verwendete Zellinien Tabelle 4: genetisch veränderte Mauslinien Tabelle 5: Puffer und Lösungen Tabelle 6: Bakterienmedien Tabelle 7: Oligonukleotide für Genotypisierung Tabelle 8: Oligonukleotide für Klonierung Tabelle 9: Oligonukleotide für quantitative realtime PCR Tabelle 10: In situ Sonden Tabelle 11: Primärantikörper Tabelle 12: Sekundärantikörper Tabelle 13: Reaktionsansätze der GenotypisierungsPCRs Tabelle 14: PCR-Programme zur Genotypisierung Tabelle 15: Reaktionsansätze zur KlonierungsPCR Tabelle 16: PCR-Programme zur Klonierung Tabelle 17: Rektionsansatz zur in vitrotranskription Tabelle 18: Zusammensetzung von SDS-PAA-Gelen VII

11 Zusammenfassung Zusammenfassung Viele Entwicklungsprozesse werden zur spezifischen Regulation nicht nur durch einzelne Transkriptionsfaktoren gesteuert, sondern vielmehr durch ein Zusammenspiel mehrerer Transkriptionsfaktoren. In der Entwicklung des zentralen Nervensystems der Wirbeltiere nimmt das SoxE-Protein Sox10 eine essentielle Rolle ein. Dies wurde in der Embryonalentwicklung bereits intensiv studiert. Jedoch wurde der Einfluss von Sox10 im postnatalen Rückenmark bisher wenig analysiert. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit der postnatale Einfluss von Sox10 auf die Oligodendrozytenentwicklung mittels zentralnervöser Sox10-Deletion in der Maus untersucht. Sox10-defiziente Mäuse zeigten ab der zweiten Lebenswoche starke motorische Einschränkungen, und keines der Tiere überlebte den postnatalen Tag 24. Im Rückenmark dieser Mäuse lag kein Myelin vor, auch wenn einige Oligodendrozyten die Expression von Myelingenen induzieren und zumindest zeitweise aufrechterhalten konnten. Sobald neben Sox10 noch das nah verwandte SoxE-Gen Sox8 deletiert wurde, ging auch diese restliche Myelingenexpression verloren. Der Verlust von Sox10 führte dazu, dass Oligodendrozyten in ihrer Entwicklung nicht über das promyelinisierende Stadium hinauskamen. Dabei war der Verlust der Myrf-Expression der früheste in dieser Arbeit beobachtete Defekt. Myrf wurde als direktes Zielgen von Sox10 identifiziert, und besaß einen evolutionär konservierten Enhancer mit einer monomeren und einer dimeren Bindestelle für Sox10. Die spezifische Bindung von Sox10 an diese Region ließ sich durch Gelretardierungsexperimente, Chromatin-Immunpräzipitationen (ChIP) und Reportergenanalysen nachweisen. Zusätzlich wurde die Funktionalität der Sox10- Bindung durch die Mutagenese der Bindestellen in vitro und in vivo belegt. Durch Reportergen-Analysen in der Maus konnte dem Myrf-Enhancer in vivo Oligodendrozyten-spezifische Aktivität zugewiesen werden. Myrf interagierte mit Sox10 in vitro, und beide Transkriptionsfaktoren konnten Myelin-assoziierte Gene synergistisch aktivieren so dass davon auszugehen ist, dass Sox10 seine Wirkung im Rahmen der zentralnervösen Myelinisierung nach ähnlichen Prinzipien ausübt wie im peripheren Nervensystem. 1

12 Summary Summary Many developmental processes do not only depend for specific regulation on one transcription factor but rather rely on combinations of interacting transcription factors. In the development of the vertebrate central nervous system the SoxE protein Sox10 is an essential player. This was intensely studied during embryonic development. In the postnatal spinal cord however the influence of Sox10 has been less analysed so far. Therefore the postnatal influence of Sox10 of oligodendrocyte development was analysed using a CNS-specific deletion of Sox10 in mice. Sox10-deficient mice suffered from strong motor disturbances and no animal survived postnatal day 24. Myelin was not found in the spinal cord of these mice, although some oligodendrocytes could induce and maintain at least temporarily the expression of myelin genes. When the related SoxE gene Sox8 was deleted in addition to Sox10, even this residual myelin gene expression was lost. In the absence of Sox10 oligodendrocytes did not progress beyond the promyelinating state. Loss of myrf expression was the earliest defect detected in this work. Myrf was identified as a direct target gene by Sox10 and possessed an evolutionary conserved enhancer, with one monomeric and one dimeric Sox10 binding site. Specific binding of Sox10 to this region was confirmed in gel retardation and chromatin immunoprecipitation assays as well as in reporter gene analyses. The functionality of Sox10 binding was proven in vitro and in vivo by mutagenesis of binding sites. An oligodendrocyte specific activity could be assigned in vivo to the myrf enhancer by reporter gene analyses in mice. Myrf interacted with Sox10 in vitro and both transcription factors activated myelin associated genes synergistically, so that it can be assumed that Sox10 influences myelination in the CNS along similar principles as in the peripheral nervous system. 2

13 Einleitung 1 Einleitung 1.1 Das Nervensystem in Vertebraten Das zentrale Nervensystem Die Entwicklung des zentralen Nervensystems Das zentrale Nervensystem (ZNS) setzt sich aus Gehirn und Rückenmark zusammen und wird früh in der Embryonalentwicklung gebildet. Bei dem Prozess der Gastrulation entstehen die drei Keimblätter, das Ektoderm, das Mesoderm und das Endoderm. Dabei ist das Ektoderm die äußere der drei Schichten und bildet unter anderem das spätere ZNS. Die Bildung des Neurahlrohrs wird als Neurulation bezeichnet. Während dieses Vorganges bildet sich an der dorsalen Seite des Embryos die Neuralgrube, an deren Seiten sich die Neuralfalten befinden. Nach weiterem Absinken der Neuralgrube verschmelzen die beiden Neuralfalten und aus der Neuralgrube entsteht das Neuralrohr. Die im Neuralrohr vorliegenden Zellen sind die Vorläuferzellen der Neuronen und Gliazellen des ZNS (Copp et al., 2003; Jessen and Mirsky, 2005; Sauka-Spengler and Bronner-Fraser, 2008). Zur Generierung der verschiedenen Vorläufer kommt es zunächst durch die Ausbildung eines gegenläufigen Gradienten von zwei identitätsbestimmenden Faktoren im Neuralrohr. In der dorsalen Deckplatte werden BMPs (bone morphogenetic proteins) und in der Chorda dorsalis das Signalmolekül Shh (sonic hedgehog) exprimiert. Dadurch bildet sich eine dorsoventrale Achse aus, bei der die Expression verschiedener Transkriptionsfaktoren im ventralen Rückenmark, in Abhängigkeit von der vorherrschenden Shh-Konzentration, induziert wird. Die gebildeten Transkriptionsfaktoren sind charakteristisch für verschiedene Domänen. Dabei werden die Grenzen dieser Bereiche meist durch hemmende Wechselwirkungen verschiedener Faktoren geschärft und aufrechterhalten. Diese Transkriptionsfaktoren sind Homeodomänen (HD) Proteine, welche die Shhabhängige Bildung von fünf ventralen Domänen (p0, p1, p2, pmn, p3) vermitteln (siehe Abbildung 1). Diese Faktoren unterteilt man in zwei Klassen, wobei man unterschiedet, ob sie durch Shh reprimiert werden (Klasse 1), wie beispielsweise Pax6 (paired box gene 6), oder aber wie Nkx2.2 (NK2 homeobox 2) induziert werden (Klasse 2) (Briscoe et al., 2000; Rowitch, 2004; Wegner, 2008). 3

14 Einleitung Im ventralen Bereich des Neuralrohrs werden neben Pax6 auch die Proteine Nkx6.1 (NK6 homeobox 1) und Nkx6.2 (NK6 homeobox 2) exprimiert (siehe Abbildung 1). Diese beiden Transkriptionsfaktoren wiederum sind verantwortlich für die Expression des bhlh (basic helix-loop-helix) Transkriptionsfaktors Olig2 (oligodendrocyte transcription factor 2). Olig2 ist ausschließlich in Zellen der pmn- (motor neuron progenitor) Domäne zu finden. Dies wird durch inhibierende Faktoren erreicht, die Olig2 auf die pmn-domäne begrenzen. Hier wurde Irx3 (iroquois related homeobox 3 (Drosophila)) identifiziert, welches dorsal von Olig2 in der p2, p1 und p0-domäne vorkommt. Ventral, in der p3-domäne, begrenzt Nkx2.2 die Expression von Olig2 (Liu et al., 2003; Novitch et al., 2001; Rowitch, 2004; Wegner, 2008). Abbildung 1: Bildung einzelner ventraler Domänen im Neuralrohr Die Expressionsorte der Transkriptionsfaktoren sind in schwarzen Balken links dargestellt und erstrecken sich entsprechend über die jeweiligen Domänen. Rechts ist das Neuralrohr mit Shh-Gradient (lila) und den einzelnen ventralen Domänen abgebildet. DP: Deckplatte, BP: Bodenplatte. Modifiziert nach Rowitch (2004) und Wegner (2008). 4

15 Einleitung Aus den gebildeten Domänen entstehen bei der Neurogenese verschiedene Unterklassen von Neuronen, beispielsweise Motoneurone aus der pmn-domäne. In der Gliogenese bilden sich dann aus dieser Domäne die Oligodendrozytenvorläuferzellen (OLVZ) (Anderson, 2001) Die Gliazellen des zentralen Nervensystems Im Jahr 1846 beschrieb Rudolf Virchow zum ersten Mal nicht-nervöse Zellen im Gehirn und ordnete ihnen die Funktion von Bindegewebe zu, daher bezeichnete er diese als Nervenkitt. Heute ist bekannt, dass die Neuroglia verschiedene Funktionen ausüben. Sie sind notwendig für eine korrekte Bildung und die Funktionalität von Neuronen. Sie wurden in verschiedene Zelltypen unterteilt (siehe Abbildung 2), wobei man zwischen Mikro- und Makroglia unterscheidet (Baumann and Pham-Dinh, 2001; Virchow, 1846). Abbildung 2: Schematische Darstellung von Gliazellen und Neuronen im ZNS Interaktion der verschiedenen Zellen untereinander. Astrozyten stehen in Kontakt mit Blutgefäßen, Neuronen, Oligodendrozyten und anderen Astrozyten. Oligodendrozyten myelinisieren die Axone von Neuronen. Mikroglia sind Immunzellen. Modifiziert nach Baumann and Pham-Dinh (2001). 5

16 Einleitung Die Gruppe der Makroglia umfasst neben den großen Populationen von Astrozyten und Oligodendrozyten auch ependymale Zellen und Radialglia. Astrozyten bilden eine heterogene Klasse und werden daher aufgrund ihrer Morphologie, ihres Antigenphänotyps und ihrer Lage in zwei verschiedene Gruppen unterteilt. Die fibrillären Astrozyten sind vor allem in der weißen Substanz aufzufinden. Sie bedecken die Oberflächen von Blutgefäßen und die nichtmyelinisierten Axonbereiche, die Ranvier`schen Schnürringen. Dagegen befinden sich die protoplasmatischen Astrozyten vor allem in der grauen Substanz. Ihre Fortsätze umhüllen neben Blutgefäßen auch Synapsen. Astrozyten sind in der Lage Neurotransmitter freizusetzen und können dadurch neuronale Aktivität modulieren. Sie unterstützen Neurone in ihrem Stoffwechsel, indem sie Glukose aufnehmen, in Lactat umwandeln und dieses an die Neurone abgeben (Barres, 2008; Halassa and Haydon, 2010). Die zweitgrößte Gruppe der Gliazellen im ZNS sind die Oligodendrozyten. Sie bilden Myelinscheiden um die Axone der Neurone, wobei eine Oligodendrozyte bis zu 50 Axonabschnitte mit Myelin umwickeln kann. Sie sind somit essentiell für die saltatorische Erregungsleitung im ZNS (Baumann and Pham-Dinh, 2001). Ihr Entwicklungsprozess von der pluripotenten Vorläuferzelle zur reifen Oligodendrozyte ist schematisch in Abbildung 3 dargestellt. Abbildung 3: Die Entwicklung der Oligodendrozyten Schematische Darstellung der Oligodendrozytenentwicklung. Aus pluripotenten Vorläuferzellen der pmn-domäne entwickeln sich Oligodendrozytenvorläuferzellen (OLVZ), die sich über das Stadium der promyelinisierenden Oligodendrozyte (OL) zur reifen OL differenzieren. Modifiziert nach Fancy et al. (2011). 6

17 Einleitung OLVZ entstehen nach der Generierung der Motoneurone in der pmn-domäne. Dieser Wechsel erfolgt in der Maus zwischen 11,5 und 12,5 dpc (days post coitum) (Richardson et al., 2000). Dies bedeutet, dass aus pluripotenten Vorläufern einer Domäne nacheinander zwei verschiedene Zelltypen entstehen. Daher müssen weitere Faktoren beteiligt sein, die entweder die Bildung von Neuronen oder die von Oligodendrozyten fördern. Bei der Neurogenese, die in der Maus ab 9 dpc beginnt, sind diese Faktoren die proneuronalen Transkriptionsfaktoren Ngn1 (neurogenin 1) und Ngn2 (neurogenin 2). Sie begünstigen zusammen mit Olig2 die Bildung von Motoneuronen und unterdrücken die Generierung von Oligodendrozyten. Diese erfolgt erst durch das Herunterregulieren der Expression von Ngn1 und Ngn2 (Mizuguchi et al., 2001; Scardigli et al., 2001; Zhou et al., 2001). Ein Inhibitor der Neurogenese, der die Bildung von Gliazellen unterstützt, ist NFIA (nuclear factor I/A). Dieser Transkriptionsfaktor ist wichtig für die Bildung von Vorläuferzellen von Oligodendrozyten und Astrozyten (Deneen et al., 2006). Sox9 ist am Wechsel von Neurogenese zur Gliogenese essentiell beteiligt. Im Rückenmark von Sox9-defizienten Mäusen bilden die pluripotenten Zellen der pmn- Domäne statt OLVZ weiterhin Motoneurone (Stolt et al., 2003). Taylor et al. (2007) zeigten auf, dass auch der Notch-Signalweg bei der Gliogenese beteiligt ist, da er die Expression von Genen unterstützt, die bei der Spezifizierung von Gliazellen beteiligt sind. Die Expression des Transkriptionsfaktors Sox9 im murinen Rückenmark scheint dabei nicht nur vom Notch-, sondern auch vom NFIA-Signalweg beeinflusst zu werden. (Deneen et al., 2006; Taylor et al., 2007). Ab dem Embryonaltag 12,5 können bereits determinierte, aus der pmn-domäne auswandernde OLVZ durch die Rezeptor-Tyrosin-Kinase Pdgfra (platelet derived growth factor receptor, alpha polypeptide) markiert werden. Pdgfra ist essentiell für die Migration, die Proliferation und das Überleben der OLVZ (Armstrong et al., 1990; Barres et al., 1992; Fruttiger et al., 1999). In knock out Experimenten wurde gezeigt, dass bei dem Fehlen von Sox9 und Sox10 keine Expression von Pdgfra erfolgt und als Folge davon verstärkte Apoptose und ein verändertes Wanderungsverhalten der OLVZ auftritt (Finzsch et al., 2008). Im Jahr 2005 erkannte man, dass OLVZ nicht nur im ventralen Bereich des Rückenmarks entstehen, sondern auch in den dorsalen Domänen dp3-dp5. Dabei ist diese Quelle der OLVZ, aus der die Zellen ungefähr ab 14,5 dpc entstehen, 7

18 Einleitung unabhängig von Shh und den HD Transkriptionsfaktoren Nkx6.1 und Nkx6.2 (Cai et al., 2005; Vallstedt et al., 2005). OLVZ wandern aus der Ventrikulärzone aus und verteilen sich über das Rückenmark. Dabei scheint das Molekül Netrin-1 sowohl für die Verteilung der Zellen als auch für ihre anschließende Reifung in der prospektiven weißen Substanz verantwortlich zu sein (Tsai et al., 2006). Die Entwicklung der Oligodendrozyten von proliferierenden Vorläuferzellen zu reifen, myelinbildenden Oligodendrozyten wird durch ein Netzwerk von inhibierenden und aktivierenden Faktoren beeinflusst und somit präzise gesteuert (Li et al., 2009). Zu den Inhibitoren gehört der bhlh Transkriptionsfaktor Hes5 (hairy and enhancer of split 5), der durch den Notch-Signalweg aktiviert wird. In Hes5-defizienten Mäusen erfolgt ein Anstieg der Expression von Myelingenen wie beispielsweise Mbp (myelin basic protein). Vice versa kann durch die Überexpression von Hes5 in Vorläuferzellen ein Herrunterregulieren der Myelingenexpression nachgewiesen werden. Hes5 vermindert die Expression von Sox10, einem entscheidenden Transkriptionsfaktor der terminalen Differenzierung, wodurch eine verringerte Menge des Sox10-Proteins in der Zelle vorhanden ist. Es interagiert aber auch mit dem Sox10-Protein, wodurch es Sox10 davon abhält, die Expression von Myelingenen zur terminalen Differenzierung der Oligodendrozyten zu aktivieren (Liu et al., 2006; Ohtsuka et al., 1999). Auch durch den Wnt-Signalweg wird die Differenzierung der Oligodendrozyten gehemmt. Der Transkriptionsfaktor Tcf4 (auch genannt TCF7L2: transcription factor 7-like 2 (T-cell specific, HMG-box)) ist ein Effektor dieses Signalwegs. In Reportergenexperimenten zeigt Tcf4 eine stark inhibierende Wirkung auf den Promotor von Mbp. Auch in vivo ist Tcf4 ein wichtiger Regulator für die Differenzierung von Oligodendrozyten (Fancy et al., 2009; He et al., 2007; Leung et al., 2002; Ye et al., 2009). Wie komplex das regulatorische Netzwerk ist, zeigen auch die beiden BMPabhängigen Id (inhibitor of DNA binding) Proteine Id2 und Id4. Sie sind Inhibitoren der Differenzierung von OLVZ, können aber auch aktivierend wirken, da sie die Proliferation der Vorläuferzellen stimulieren können. Id4 kann spezifisch die Aktivität von Myelinpromotoren beeinflussen. Beispielsweise verringert Id4 die Aktivität des Mbp-, aber gennicht des Plp-(proteolipid protein) Promotors. In neugeborenen Id4- defizienten Mäusen kann man dementsprechend eine erhöhte Expression von Mbp 8

19 Einleitung erkennen. Die Expression von Plp dagegen ist in diesen Mäusen verringert. Somit liegt also eine spezifische Regulation der Expression von verschiedenen Myelingenen vor. Des Weiteren ist bekannt, dass Id2 und Id4 mit Olig2 und dessen Heterodimerisierungspartnern E12 und E47 interagieren können und dadurch das Aktivieren von Zielgenen durch Olig2 verhindern (Kondo and Raff, 2000; Marin- Husstege et al., 2006; Samanta and Kessler, 2004; Wang et al., 2001). Im Jahr 2009 entdeckten Chen und Kollegen den Rezeptor Gpr17 (G protein-coupled receptor, 17), der spezifisch in Oligodendrozyten exprimiert wird. Auch wenn der entsprechende Ligand noch nicht gefunden ist, so ist bekannt, dass der Rezeptor Gpr17 für den Übergang von unreifen zu reifen Oligodendrozyten wichtig ist. Die Expression von Gpr17 steigt von Tag P1 bis P14 an, wird dann in reifen Oligodendrozyten herrunterreguliert und ist im adulten Rückenmark kaum mehr nachzuweisen. Experimente mit Mäusen, die Gpr17 überexprimieren, zeigen eine Hemmung der Oligodendrozytenreifung und somit der Myelinisierung im ZNS. Umgekehrt weisen Gpr17-defiziente Mäuse eine verfrühte Myelinbildung auf. Der hemmende Einfluss des Rezeptors auf die Differenzierung von Oligodendrozyten scheint außerdem von Id2 und Id4 abhängig zu sein (Chen et al., 2009). Das Enzym CNPase (2`,3`-cyclic nucleotide 3`phosphodiesterase) liegt im Zytoplasma von noch nicht ganz kompakt um Axone gewickeltem Myelin der Oligodendrozyten vor. Die Überexpression von CNPase im Mausmodell beeinflusst das Komprimieren des Myelins und die Anreicherung von Mbp negativ. Jedoch zeigten umgekehrte Studien, bei denen das Enzym in Mäusen fehlte, keine Veränderung des Myelins (Baumann and Pham-Dinh, 2001; Lappe-Siefke et al., 2003; Yin et al., 1997). CNPase zählt somit zu den Faktoren, deren Rolle während der Myelinisierung nicht vollständig geklärt ist. Der bhlh Transkriptionsfaktor Olig2 wird während der gesamten Entwicklung der Oligodendrozyten exprimiert. Daher liegt es nahe, dass Olig2 nicht nur essentiell ist für die Entstehung der OLVZ in der Ventrikulärzone, sondern auch in den weiteren Schritten der Differenzierung benötigt wird. Olig2 kann die Expression von Myelingenen, wie Mbp, Plp und Mag (myelin-associated glycoprotein) stimulieren. Jüngst wurde die Regulation der Expression von Sox10 durch Olig2 mittels direkter Bindung des Transkriptionsfaktors an den Sox10 Enhancer U2 nachgewiesen (Kuspert et al., 2011; Ligon et al., 2006; Lu et al., 2002; Wegner, 2008). Ferner kann das Zinkfingerprotein Zfp488 (zinc finger protein 488) mit Olig2 interagieren und 9

20 Einleitung durch die Zusammenarbeit beider Proteine wird die Differenzierung von Oligodendrozyten unterstützt. Durch RNAi-knock down Experimente wurde gezeigt, dass durch den Verlust von Zfp488 die Expression von Myelingenen herrunterreguliert ist. Aufgrund der in vivo Daten kann man Zfp488 als einen aktivierenden Faktor für die terminale Differenzierung und Myelinisierung von Oligodendrozyten einordnen, auch wenn in vitro Experimente auf eine hemmende transkriptionelle Aktivität des Proteins hinwiesen (Wang et al., 2006). Bei Abwesenheit des Homeoboxproteins Nkx2.2 ist die terminale Differenzierung von Oligodendrozyten im Rückenmark der Maus deutlich retardiert. Vice versa kann durch dessen Überexpression eine Induktion der Plp-Expression nachgewiesen werden. Nkx2.2 wird zunächst in differenzierenden Oligodendrozyten exprimiert und sobald die Zellen die terminale Differenzierung durchlaufen haben, wird die Expression stark verringert (Cai et al., 2010; Qi et al., 2001). Ohne den Transkriptionsfaktor YY1 (YY1 transcription factor) findet im murinen Rückenmark keine erfolgreiche Myelinisierung statt, da OLVZ in ihrer Differenzierung gestoppt werden. Die terminale Differenzierung und damit einhergehend die Myelinbildung der Oligodendroyten erfolgt nur, wenn der Transkriptionsfaktor YY1 reprimierend auf Inhibitoren der Expression von Myelingenen, wie Id4 oder Tcf4, wirkt. Neben dieser hemmenden Eigenschaft zeigen andere Analysen, dass YY1 das Myelingen Plp aktiviert. Dies ist auf eine aktivierende und zwei hemmende Domänen im YY1-Protein zurückzuführen und den Einlfluss von posttranslationellen Modifikationen, die dafür verantwortlich sind (Berndt et al., 2001; He and Casaccia- Bonnefil, 2008; He et al., 2007). Einer der wichtigsten Transkriptionsfaktoren für eine erfolgreiche terminale Differenzierung zu myelinbildenden Oligodendrozyten ist der HMG Transkriptionsfaktor Sox10. Mäuse ohne Sox10 zeigen eine Ausbleiben der terminalen Differenzierung von Oligodendrozyten (Stolt et al., 2002). Bei in ovo Experimenten wurde Sox10 in das Neuralrohr von Hühnchenembryonen elektroporiert mit der Folge, dass Sox10 allein die frühzeitige Differenzierung von Oligodendrozyten auslösen und die ektope Expression von Olig2 und Nkx2.2 induzieren konnte (Liu et al., 2007). Sox10 aktiviert dabei nicht nur Aktivatoren wie Olig2 und Nkx2.2, sondern kontrolliert auch direkt die Expression von vielen Myelinassoziierten Genen. Hierzu zählen Mbp, Plp, Mag, Cx32 (connexin 32) oder Cx47 (connexin 47) (Bondurand et al., 2001; LeBlanc et al., 2007; Schlierf et al., 2006; 10

21 Einleitung Stolt et al., 2002). Da Sox10 in Oligodendrozyten durchgängig exprimiert wird, sind weitere Mechanismen nötig, um die von Sox10 regulierten Elemente erst in den differenzierenden Oligodendrozyten zu aktivierten. Neben dem Inhibitor Hes5 wurden die beiden Sox-Proteine Sox5 und Sox6 identifiziert, die bis zum Beginn der Differenzierung exprimiert werden und ebenfalls reprimierend auf die Differenzierung von Oligodendrozyten einwirken. Dies geschieht indem sie an dieselben Bindestellen im Mbp-Promotor binden, wie Sox10. Somit konkurrieren die beiden SoxD-Proteine mit Sox10 um die Bindestellen, wobei Sox5 und Sox6 die Expression von Mbp nach erfolgreicher Bindung an das genregulatorische Element im Gegensatz zu Sox10 nicht aktivieren. In Sox5- und Sox6-defizienten Mäusen kann man eine verfrühte Differenzierung der Oligodendrozyten im Rückenmark beobachten, da die inhibierende Wirkung der SoxD-Proteine auf Sox10 fehlt (Stolt et al., 2006). Ein neu identifizierter Regulator der Myelinisierung im ZNS ist der Transkiptionsfaktor Myrf (myelin gene regulatory factor, Gm98). Er wird spezifisch in postmitotischen Oligodendrozyten exprimiert. Durch verschiedene Überexpressionsstudien ist gezeigt worden, dass Myrf die Expression von Myelingenen unterstützt. In Myrf-defizienten Mäusen sind promyelinisierende Oligodendrozyten nachgewiesen worden, jedoch ist in diesen Zellen die Expression von Myelingenen stark beeinträchtigt, so dass keine Myelinisierung stattfinden konnte (Emery et al., 2009). Bei der konditionalen Deletion von Myrf in reifen Oligodendrozyten kann weder das Myelin noch die Identität der reifen Oligodendrozyten im adulten ZNS aufrechterhalten werden (Koenning et al., 2012). Des Weiteren scheint Myrf eine wichtige Rolle bei der autosomal rezessiven Erbkrankheit Npc1 (Niemann-Pick type C 1) einzunehmen. Bei dieser Krankheit liegt ein Defekt des Cholesterintransports vor, woraus ein Verlust von Myelin resultiert. Weiterführende Analysen mit Mäusen, bei denen das Npc1-Gen mutiert ist, zeigen im ZNS eine Reduktion an Myelinproteinen. Die Menge an Sox10 ist in diesen Tieren nicht reduziert, jedoch die von Myrf (Yan et al., 2011). Myrf spielt somit eine entscheidende Rolle bei der Reifung von Oligodendrozyten und bei der Myelinisierung im ZNS, wobei der genaue Mechanismus noch nicht aufgeklärt ist. 11

22 Einleitung Das periphere Nervensystem Die Entwicklung des peripheren Nervensystems Das periphere Nervensystem (PNS) gewährleistet die Verbindung von Muskeln und Organen mit dem ZNS und ist somit entscheidend für die Funktionsfähigkeit des Körpers. Die Zellen des PNS sind Derivate der transienten Neuralleiste, welche aus multipotenten, embryonalen Zellen besteht, die Stammzellen-ähnliche Eigenschaften besitzen. Die Neuralleiste entsteht zwischen dem Neuralrohr und dem Ektoderm. Die Neuralleistenzellen wandern von dort in die Peripherie und differenzieren unter anderem zu Melanozyten, Neuronen und Gliazellen. Die verschiedenen Derivate entstammen dabei aus unterschiedlichen Bereichen der Neuralleiste, aus welchen die Zellen migrierten. Bei der Wanderung zu ihrem Bestimmungsort werden sie durch chemische Stoffe entweder angelockt oder abgeschreckt, so dass die Zellen den ihnen entsprechenden Weg zurücklegen können. Dabei entscheiden die Faktoren und Gewebe, mit denen sie auf ihrem Weg interagieren, zu welchem Derivat die Zellen differenzieren. Beispielsweise können die Neuralleistenzellen aus der Rumpfregion zwei verschiedene Wege einschlagen. Ein Weg folgt der dorsolateralen Richtung, wodurch aus den Zellen Melanozyten entstehen. Folgen die Zellen aber dem ventralen Pfad, so differenzieren sie zu Neuronen und Gliazellen, beziehungsweise zu Fibroblasten oder glatten Muskelzellen (Jessen and Mirsky, 2005; Knecht and Bronner-Fraser, 2002; Le Douarin et al., 2004; Le Douarin and Dupin, 2003; Sauka-Spengler and Bronner-Fraser, 2008) Die Gliazellen des peripheren Nervensystems Auch im PNS gibt es verschieden Gliazellen, wobei die größte Population der peripheren Gliazellen die Schwann-Zellen darstellen. Sie sind das Pendant zu den Oligodendrozyten des ZNS (Jessen, 2004; Jessen and Mirsky, 2005). Ihre Entwicklung aus pluripotenten Neuralleistenzellen verläuft jedoch völlig unterschiedlich zu der der Oligodendrozyten. Dabei gibt es drei Entwicklungsstadien, die Schwann-Zell-Vorläuferzelle (SZVZ), die unreife Schwann-Zelle und je nach Differenzierung, die nicht-myelinisierende, oder die myelinisierende Schwann-Zelle (siehe Abbildung 4). Der Übergang zwischen den verschiedenen Zellstadien ist dabei 12

23 Einleitung von verschiedenen Faktoren abhängig, anhand derer der Entwicklungszustand der Schwann-Zelle genau charakterisiert werden kann. Abbildung 4: Die Entwicklung der Schwann-Zelle Schematische Darstellung der Schwann-Zellen-Entwicklung. Sie erfolgt über mehrere Schritte, wobei der Übergang von unreifer zu reifer Schwann-Zelle reversibel ist. Dies ist durch gestrichelte Pfeile angedeutet. Modifiziert nach Jessen and Mirsky (2005). Die aus migrierenden Neuralleistenzellen entstandenen SZVZ können in der Maus ab ungefähr 12 dpc nachgewiesen werden. Dabei sind sie über ihre Fortsätze miteinander verbunden und umgeben große Gruppen von Axonen (Dong et al., 1999; Woodhoo and Sommer, 2008). Für die Gliogenese ist der Transkriptionsfaktor Sox10 essentiell, denn in Mäusen ohne Sox10 können keine SZVZ gebildet werden (Britsch et al., 2001). Der Transkriptionsfaktor Sox10 wird während der gesamten Entwicklung der Schwann-Zelle exprimiert und ist daher nicht alleine für die Spezifizierung der Schwann-Zellen zuständig. Es sind verschiedene Faktoren bekannt, die entweder die gliale Differenzierung unterstützen oder hemmen. Inhibitoren sind dabei extrazelluläre Signale wie BMP2 und BMP4. Dagegen wird die Differenzierung von Neuralleistenzellen zu Gliazellen durch Neuregulin-1 oder auch Notch unterstützt (Jessen and Mirsky, 2005; Morrison et al., 2000; Shah et al., 1996; Shah et al., 1994). Der Übergang von SZVZ zu unreifen Schwann-Zellen erfolgt zwischen 13 dpc und 15 dpc. Dem liegt eine koordinierte Veränderung im Expressionsprofil beteiligter 13

24 Einleitung Gene zu Grunde, da die unreife Schwann-Zelle nicht mehr auf axonale Faktoren angewiesen ist, sondern ihr Überleben durch autokrine Sekretion sichert (Jessen and Mirsky, 2005). Dabei konnten in vitro verschiedene Faktoren wie IGF2 (insulin-linke growth factor 2), NT3 (neurotrophin3), PDGFB (platelet-derived growth factor-β) oder LIF(leukaemia inhibitory factor) identifiziert werden (Dowsing et al., 1999; Meier et al., 1999). Ein wichtiger Faktor bei der Kontrolle der Schwann-Zell-Entwicklung ist AP-2α (activating enhancer binding protein 2 alpha). Die Expression des Transkriptionsfaktors wird in der unreifen Schwann-Zelle herrunterreguliert. Wird die Expression in vitro künstlich verlängert, so ist dadurch die Entwicklung der Schwann- Zellen verzögert (Stewart et al., 2001). Ein weiterer negativer Regulator ist Sox2. Dieses Sox-Protein wird transient in der unreifen Schwann-Zelle exprimiert und spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung dieses Entwicklungsstadiums und verhindert das verfrühte Myelinisieren der Axone (Le et al., 2005). Im PNS der Maus lassen sich während dem Entwicklungszeitraum 15 dpc und 16 dpc Gruppen von Axonen finden, die von unreifen Schwann-Zellen umgeben werden. Die Entwicklung von der unreifen Schwann-Zelle zur reifen myelinisierenden, oder nicht-myelinisierenden Schwann-Zelle geht mit einem radialen Sortierungsprozess einher. Dabei können der Schwann-Zelle je nach axonaler Umgebung zwei verschiedene Schicksale widerfahren. Zur Ausbildung einer myelinisierenden Schwann-Zelle muss diese ein 1:1 Verhältnis mit einem großkalibrigen Axon eingehen, welches einen Durchmesser von über 1 µm aufweist. Bei Axonen mit kleineren Durchmessern kommt es zur Ausbildung von Axonbündeln, die von einer Schwann-Zelle umgeben werden, welche kein Myelin bildet (Woodhoo and Sommer, 2008). Wird nun der Weg zur Myelinisierung eines groß-kalibrigen Axons eingeschlagen, so differenziert die unreife Schwann-Zelle zunächst zur pro-myelinisierenden Schwann- Zelle. Dabei sind die beiden Transkriptionsfaktoren Oct6 (Octamer binding transcription factor 6) und Brn2 (brain-specific homeobox/pou domain protein 2) beteiligt (Jaegle et al., 2003; Jaegle and Meijer, 1998). In Mäusen mit Oct6-Defizienz ist ein retardierter Beginn der Myelinisierung zu beobachten. Wird neben Oct6 auch noch Brn2 ausgeschaltet, welches ein ähnliches Expressionsmuster wie Oct6 aufweist, so kommt es zu einer schweren Hypomyelinisierung der Nerven. Daher kann man annehmen, dass Brn2 und Oct6 in ihrer Funktion überlappend den Übergang von der pro-myelinisierenden zu myelinisierenden Schwann-Zelle steuern 14

25 Einleitung (Jaegle et al., 2003). Der Transkriptionsfaktor Sox10 steuert dabei die Expression von Oct6. In einer hypomorphen Sox10-Mausmutante liegt ein Verlust der Dimerisierungsdomäne vor. Als Folge kann die Expression von Oct6 nicht angeschaltet werden, da die dimere Bindung von Sox10 an die genregulatorische Sequenz stromabwärts des Oct6-Locus, dem SCE (schwann cell enhancer) nicht mehr möglich ist (Ghazvini et al., 2002; Mandemakers et al., 2000; Schreiner et al., 2007). Unlängst konnte für diesen Enhancer in vivo gezeigt werden, dass dessen Aktivität essentiell abhängig ist von der dimeren Bindung von Sox10 an ein Kernelement des SCE (Jagalur et al., 2011). Oct6 wiederum steuert die Expression von Krox20 (Egr2, early growth response 2), dem Hauptregulator der Myelinisierung in Schwann-Zellen. Für Krox20 konnte gezeigt werden, dass dieser Zinkfinger-Transkriptionsfaktor die Expression von Myelingenen wie beispielsweise Mbp und Mpz (myelin protein zero) steuert (Ghislain et al., 2002; Topilko et al., 1994). Die transkriptionelle Regulation von Krox20 erfolgt über das genregulatorische Element MSE (myelinating Schwann cell element), welches stromabwärts des Krox20-Gens lokalisiert ist. Daran binden Oct6 und Sox10 und induzieren den Enhancer synergistisch (Ghislain and Charnay, 2006; Ghislain et al., 2002; Reiprich et al., 2010; Topilko et al., 1994). Jüngste Untersuchungen zeigen, dass Sox10 und Med12 (mediator of RNA polymerase II transcription, subunit 12 homolog (yeast)) funktionell interagieren und dass beide Proteine gemeinsam benötigt werden um Krox20 zu induzieren (Vogl et al., 2013). Im Jahr 2012 konnte gezeigt werden, dass Sox10 mit Brg1 (brahma related gene 1) interagiert und durch Bindung an die Enhancer SCE und MSE die Expression von Oct6 und Krox20 steuert (Weider et al., 2012). Desweitern interagiert Sox10 mit Krox20, um die Genexpression von Myelingenen synergistisch zu steuern (Jones et al., 2007). Der HMG Transkriptionsfaktor Sox10 ist somit während der gesamten Schwann-Zell-Entwicklung exprimiert und viele seiner Kooperationspartner sind bekannt, welche mit ihm gemeinsam die spezifischen Entwicklungsstufen der Schwann-Zellen-Entwicklung steuern und die Differenzierung zur funktionellen Schwann-Zelle ermöglichen. 15

26 Einleitung 1.2 Sox-Proteine Das erste Sox-Protein Sry wurde im Jahr 1990 entdeckt (Gubbay et al., 1990; Sinclair et al., 1990) und ist in der Ontogenese mitverantwortlich für die Festlegung des männlichen Geschlechts. Das entsprechende Gen ist auf dem Y Chromosom lokalisiert, daher erfolgte die Namensgebung als Sry, eine Abkürzung für sex determining region on chromosom Y. Aufgrund seiner aus 79 Aminosäuren bestehenden DNA-Bindedomäne, der HMG- (high mobility group) Box, gehört Sry zur Superfamilie der HMG-Box-Proteine. Zu dieser Proteinfamilie gehören viele weitere Transkriptionsfaktoren, wie beispielsweise die der TCF- (transcription factor, T cell specific) Familie. Stimmt die Aminosäuresequenz der HMG-Domäne eines Proteins zu mindestens 50% mit der von Sry überein, so wird dieses Protein zur Sox- (Sry related HMG box) Protein-Familie gezählt (Laudet et al., 1993; Wegner, 1999; Wright et al., 1993). Gemeinsam ist allen Sox-Proteinen zudem, dass sie an die DNA durch ein übereinstimmendes DNA-Konsensusmotiv 5 -(A/T)(A/T)CAA(A/T)G-3 binden (Harley et al., 1994). Die Bindung an DNA erfolgt dabei nicht wie bei den meisten DNAbindenden Proteinen in der großen, sondern in der kleinen Furche. Dadurch kommt es zu einer Konformationsänderung der DNA, wobei die kleine Furche geweitet und die große Furche komprimiert wird. Die Folge ist eine architektonische Veränderung der DNA. Somit entsteht zum Beispiel die Möglichkeit, dass sich Proteinkomplexe an genregulatorische Sequenzen anlagern können, welche vorher nicht zugänglich waren. Somit kann die Transkription beeinflusst werden (Lefebvre et al., 2007; Wegner, 1999). Die Familie der Sox-Proteine umfasst in Säugetieren 20 Mitglieder (Schepers et al., 2002). Sie sind aufgrund der Ähnlichkeit ihrer Aminosäuresequenzen in der HMG- Box in verschiedene Untergruppen (A-H) eingeteilt, wobei innerhalb der einzelnen Gruppen eine Homologie von mindestens 80% vorliegt (Schepers et al., 2002; Wegner, 1999). Allen Mitgliedern gemeinsam sind zwei Kernlokalisierungssignalen innerhalb der HMG-Box, welche zu einer Lokalisation der Sox-Proteine im Kern führen. Dies ermöglicht ihre Funktion als Transkriptionsfaktoren (Sudbeck and Scherer, 1997). Des Weiteren besitzen die Proteine der Untergruppen A, B1, C, E, F und H zusätzlich eine Transaktivierungsdomäne im C-Terminus. Jedoch ist hier die Transaktivierungsfähigkeit zumeist recht schwach ausgeprägt und wird durch 16

27 Einleitung verschiedene Faktoren beeinflusst (Kamachi et al., 2000; Kuhlbrodt et al., 1998; Lefebvre et al., 2007). Dies begründet auch, weshalb ein Sox-Protein bei unterschiedlichen Entwicklungsprozessen verschiedene Aufgaben erfüllen kann, also unterschiedliche Zielgene steuern kann. Beispielhaft wird hier Sox2 aus der Gruppe B1 genannt. Sox2 ist ein wichtiger Faktor in embryonalen Stammzellen und sorgt für die Aufrechterhaltung der Stammzell-Identität und -Pluripotenz (Avilion et al., 2003). Nur mit Oct4, einem HD Transkriptionsfaktor der POU-Familie, kann Sox2 mittels Enhancer die Expression von Fgf4 (Fibroblast growth factor 4) aktivieren. Dabei ist es wichtig, dass beide Proteine benachbart an den Enhancer binden (Ambrosetti et al., 1997; Yuan et al., 1995). Der Transkriptionsfaktor Sox2 ist aber auch an vielen weiteren Entwicklungsschritten beteiligt, unter anderem auch an der Entwicklung der Linse im Auge. Hierbei ist bei Untersuchungen im Huhn das erste Zielgen von Sox2 gefundenen worden, δ-crystallin (Kamachi et al., 1995; Kamachi et al., 1998). Auch hier wird die Regulation des Enhancers DC5 durch eine kooperative Aktivierung durch Sox2 mit einem weiteren Transkriptionsfaktor gesteuert. In diesem Fall ist es Pax6, welches in unmittelbarer Nachbarschaft zu Sox2 an den entsprechenden Bindestellen auf der DC5-Sequenz bindet und durch den Enhancer das Linsenspezifische Gen δ-crystallin anschaltet (Kondoh et al., 2004). Andere Sox-Proteinen weisen dagegen eine Transrepressionsdomäne auf, die ebenso wie die Transaktivierungsdomäne im C-terminalen Bereich des Proteins lokalisiert ist und bei Mitgliedern der Untergruppen B2 und G zu finden ist. Für die Mitglieder der Gruppe D konnte keine spezifische Transaktivierungs- oder Transrepressionsdomäne nachgewiesen werden, die diese Funktion erfüllt, jedoch sind sie unter anderem an transkriptioneller Repression beteiligt (Melichar et al., 2007; Stolt et al., 2008; Stolt et al., 2006; Uchikawa et al., 1999). Zusätzlich besitzen die Sox-Proteine der Gruppen D und E konservierte Domänen zur Dimerisierung. Bei SoxD-Proteinen ist gezeigt worden, dass sie in Lösung durch die Interaktion eines Leuzin-Zipper-Motives dimerisieren, wobei sich Hetero- und Homodimere bilden können (Lefebvre et al., 1998). Die Dimerisierungsdomäne von SoxE-Proteinen befindet sich im N-terminalen Bereich vor der HMG-Box. SoxE- Proteine binden kooperativ, dimer an die DNA. Dies ist essentiell für die Aktivierung von einigen Zielpromotoren, wohingegen andere durch monomere Bindung von SoxE-Proteinen aktiviert werden (Peirano et al., 2000; Schlierf et al., 2002; Schlierf et al., 2006). 17

28 Einleitung Die Relevanz der Sox-Proteine zeigt sich darin, dass in den meisten Geweben und Zelltypen an wenigstens einem Zeitpunkt ihrer Entwicklung mindestens ein Sox- Protein exprimiert wird. Sie sind folglich wichtige Regulatoren vieler entwicklungsspezifischer Prozesse, wie beispielsweise der Keimblattbildung, Organentwicklung oder der Spezifizierung zu unterschiedlichen Zelltypen (Wegner, 1999). In vielen Fällen lassen sich sogar überlappende Expressionsmuster erkennen, wobei Mitglieder derselben Untergruppe oft redundant wirken. Sind die Proteine jedoch aus verschiedenen Gruppen, so üben sie oft unterschiedliche Funktionen aus. Sox14 und Sox21 sind die Transkriptionsfaktoren der Untergruppe B2 (Bowles et al., 2000). Für Sox21 wurde gezeigt, dass es in der Neurogenese die neuronale Differenzierung unterstützt, indem es den Mitgliedern der Untergruppe B1, Sox1-3, entgegenwirkt (Sandberg et al., 2005). Zudem können Sox-Proteine aus unterschiedlichen Untergruppen je nach Gewebe und Entwicklungszeitpunkt auf der einen Seite zusammen arbeiten und sich auf der anderen Seite auch hemmen. Die SoxD-Proteine Sox5 und Sox6 agieren mit Sox9 aus der Gruppe E in der Knorpelentwicklung gemeinsam, um einen Chondrozyten-spezifischen Enhancer zu steuern (Lefebvre et al., 1998). Im ZNS jedoch konkurrieren Sox5 und Sox6 mit dem SoxE-Protein Sox10, um Glia-spezifische Gene zu kontrollieren (Stolt et al., 2006) SoxE-Proteine Zur Untergruppe der SoxE-Proteine gehören die Transkriptionsfaktoren Sox8, Sox9 und Sox10. Alle drei zeigen eine hohe Übereinstimmung in ihrer Aminosäuresequenz, in der HMG-Box liegt sie bei über 90 % (Wright et al., 1993). Die SoxE-Proteine besitzen, wie alle Mitglieder der Sox-Familie, in ihrer HMG-Box zwei Kernlokalisierungssequenzen. Diese ermöglichen den Proteinen ihre Funktion als Transkriptionsfaktoren. Für Sox9 konnten diese im N-terminalen und im C- terminalen Bereich der HMG-Box lokalisiert werden (Sudbeck and Scherer, 1997). Aufgrund der hohen Homologie der SoxE-Proteine sind die beiden Sequenzen auch bei Sox8 und Sox10 konserviert. Des Weiteren besitzen sie ein Kernexportsignal, welches ebenfalls in der HMG-Box liegt und den Proteinen ein Wechseln zwischen Kern und Zytoplasma ermöglicht (Gasca et al., 2002; Rehberg et al., 2002). Dadurch können Prozesse effizient reguliert werden, ohne in die Expression der Proteine einzugreifen. Für Sox9 konnte dies während der Gonadenentwicklung gezeigt werden. In diesem Fall ist Sox9 im Zytoplasma von undifferenzierten Gonaden junger 18

29 Einleitung Embryonen beider Geschlechter und in früh-differenzierenden weiblichen Zellen lokalisiert. In den männlichen embryonalen Gonaden dagegen kann Sox9 im Kern detektiert werden (Morais da Silva et al., 1996). Im aminoterminalen Bereich der SoxE-Proteine befindet sich eine DNA-abhängige Dimerisierungsdomäne (siehe Abbildung 5). Untersuchungen von Mäusen mit mutierter Dimerisierungsdomäne von Sox10 zeigen deren wichtige Funktion in Melanozyten, enterischen Gliazellen und Schwann-Zellen. In Oligodendrozyten ist die Diemerisierungsdomäne hingegen weniger (Schreiner et al., 2007). Die Relevanz dieser Domäne zeigt sich außerdem darin, dass deren Verlust beim Transkriptionsfaktor Sox9 campomelische Dysplasie verursacht (Sock et al., 2003). Eine weitere Besonderheit der SoxE-Proteine zeigt sich darin, dass sie zwei Transaktivierungsdomänen besitzen. Zum einen die TA- (Transaktivierungs) Domäne am C-Terminus und zusätzlich eine zentrale K2-Domäne (Kuhlbrodt et al., 1998; Schepers et al., 2000; Sudbeck et al., 1996). Die K2-Domäne des Sox10-Proteins ist essentiell für die Entwicklung vieler Neuralleistenderivate (Cossais et al., 2010; Reiprich et al., 2008; Schreiner et al., 2007). Seit kurzem kann der K2-Domäne von Sox10 erstmals auf molekularer Ebene eine Funktion zugeschrieben werden. Sie interagiert mit dem Neuralleisten-spezifischen Transkriptionsfaktor AP-2α (Wahlbuhl et al., 2012). Durch eine Deletion von K2 im Sox10-Protein ist in vitro das Transaktivierungsvermögen an dem in Melanozyten aktiven Promotor von Dct (Dopachrome tautomerase) und dem in Schwann-Zellen aktiven Promotor von Mpz deutlich reduziert. Dies ist im murinen Tiermodell bestätigt, da durch das Fehlen der K2-Domäne von Sox10 die Entwicklung von Melanozyten und Schwann-Zellen stark beeinflusst ist. Dagegen sind die Oligodendrozyten weniger beeinflusst. Dies zeigt sich auch daran, dass der Promotor von Mbp, der in Schwann-Zellen und Oligodendrozyten aktiv ist, durch die K2-Deletion keine Beeinflussung erfährt (Schreiner et al., 2007). K2 Abbildung 5: Schematische Darstellung der SoxE-Proteine Allen SoxE-Proteinen sind folgende Domänen gemeinsam: Die Dimerisierungs (Dim)- Domäne, die DNA-bindende HMG Domäne, die Transaktivierungsdomäne K2 und die C- terminale Transaktivierungs (TA)-Domäne. Modifiziert nach Wegner and Stolt (2006). 19

30 Einleitung SoxE-Proteine zeigen eine große Redundanz in ihrem Expressionsmuster und in ihrer Funktionalität (Chaboissier et al., 2004; Cheung and Briscoe, 2003; Kellerer et al., 2006; Maka et al., 2005; Stolt et al., 2004). Sie sind an vielen Entwicklungsprozessen beteiligt, wie der Entwicklung von Gonaden, des Skeletts, der Neuralleistenzellen und deren Derivaten, sowie von myelinisierenden Gliazellen (Guth and Wegner, 2008). Dabei zeigen sie nicht nur gemeinsame Funktionen, sondern erfüllen während der Embryogenese auch spezifische Aufgaben Sox8 Der Transkriptionsfaktor Sox8 ist das zuletzt identifizierte SoxE-Protein (Bell et al., 2000; Pfeifer et al., 2000; Schepers et al., 2000). Es zeigt Expression in vielen verschiedenen Geweben wie der Neuralleiste, dem Nervensystem, in Muskeln, Knorpel, Nebenniere, Niere oder Hoden. Daher ist es erstaunlich, dass Sox8- defiziente Mäuse überleben und außer einem reduzierten Körpergewicht keine schweren Funktionsverluste erkennbar sind (Guth et al., 2009; Sock et al., 2001). Dieser schwache Phänotyp kann durch die funktionelle Redundanz von Sox8 mit Sox9 und Sox10 begründet werden. Beispielsweise werden bei der Entwicklung der männlichen Gonaden um den Zeitpunkt der Geschlechtsfestlegung sowohl Sox8 als auch Sox9 exprimiert (Schepers et al., 2003). Des Weiteren werden beide Transkriptionsfaktoren bei der Differenzierung von Osteoblasten gemeinsam exprimiert (Schmidt et al., 2003). Untersuchungen an transgenen Mäusen, bei denen Sox8 unter der Kontrolle des osteoblastenspezifischen Col1a1 Promotorfragments steht, zeigen schwere Defekte in der Knochenbildung. Dies belegt, dass das Herunterregulieren von Sox8 wichtig ist für die Osteoblastendifferenzierung und Knochenbildung (Schmidt et al., 2005). Somit gibt es hier überlappende Expression der SoxE-Proteine Sox8 und Sox9. Während der Hodenentwicklung sind ebenfalls beide SoxE-Proteine relevant (Barrionuevo et al., 2009; Chaboissier et al., 2004; Georg et al., 2012). Bei Sox8-defizienten Männchen wurde jedoch eine fortschreitende Unfruchtbarkeit festgestellt (O'Bryan et al., 2008). Eine Redundanz von Sox8 mit Sox10 zeigt sich auch im enterischen Nervensystem (ENS) und bei der Oligodendrozytenentwicklung im ZNS. Im ENS sind beide SoxE-Proteine dafür verantwortlich, dass die Stammzellen der Neuralleiste aufrechterhalten werden. Bei der Entwicklung der Oligodendrozyten können Sox8 und Sox10 beispielsweise die selben Myelingene aktivieren (Maka et al., 2005; Stolt et al., 2004). Jedoch scheint 20

31 Einleitung Sox8 in diesen Fällen nur eingeschränkt zur Kompensation eines Sox10-Verlustes beitragen zu können (Kellerer et al., 2006). Während der Oligodendrozytenentwicklung ist Sox8 nicht nur bei der terminalen Differenzierung sondern bereits bei der Spezifizierung beteiligt, wenn auch in geringerem Ausmaß als die beiden Protagonisten Sox9 und Sox10 (Kellerer et al., 2006; Stolt et al., 2005). Weiterhin scheint dieses SoxE-Protein auch bei Tumoren bedeutsam zu sein, da seine Expression in Oligodendrogliomen und Astrozytomen hochreguliert ist (Schlierf et al., 2007) Sox9 Sox9 als weiterer Vertreter der SoxE-Proteine wurde intensiv untersucht, weil Mutationen von Sox9 im Zusammenhang mit campomelischer Dysplasie stehen. Bei dieser Krankheit kommt es zu schweren Skelettfehlbildungen, oft einhergehend mit der Umkehr des männlichen Geschlechtsphänotyps (Foster, 1996; Foster et al., 1994; Wagner et al., 1994). Wie daraus zu erwarten, ist Sox9 an einer Vielzahl von Entwicklungsprozessen beteiligt und somit in vielen Geweben exprimiert, wie in Knorpel und im Hoden, (Akiyama et al., 2005; Barrionuevo et al., 2006; Bi et al., 1999; Kobayashi et al., 2005; Ng et al., 1997). Bei der Festlegung des männlichen Geschlechts wird das Sox-Protein Sry benötigt. Es sorgt dafür, dass embryonale Vorläuferzellen zu Sertoli-Zellen differenzieren. Ebenso ist für diesen Entwicklungsschritt Sox9 essentiell (Chaboissier et al., 2004; Viger et al., 2005). Dabei ist Sox9 selbst ein Zielgen von Sry. Zuerst reguliert Sry zusammen mit Sf1 (steroidogenic factor 1) die Expression von Sox9 hoch und anschließend, wenn Sry nicht mehr exprimiert wird, kann Sox9 zusammen mit Sf1 selbst für die Aufrechterhaltung seiner eigenen Expression sorgen (Sekido and Lovell-Badge, 2008). Sox9 kann an den AMH- (Anti-Müller-Hormon) Promotor binden und die Expression von AMH, einem entscheidenden Hormon für die männliche Geschlechtsentwicklung, in Kooperation mit Sf1 aktivieren (De Santa Barbara et al., 1998). In der Knorpelentwicklung aktiviert Sox9 zusammen mit den beiden SoxD-Proteinen, Sox5 und Sox6, verschiedene knorpelspezifische Gene wie Col2a1 (collagen, type II, alpha 1) oder Aggrecan. Dies erfolgt durch die Bindung von Sox9 an den 21

32 Einleitung entsprechenden Enhancer, wobei das Heterodimer Sox5/Sox6 an seine spezifische Erkennungsstelle auf der DNA bindet und somit Sox9 unterstützt (Han and Lefebvre, 2008; Lefebvre et al., 1997; Lefebvre et al., 1998). Desweitern ist Sox9 auch in Zellen des Nervensystems zu finden, da es die Neuralleistenentwicklung steuert und für den Wechsel von Neurogenese zur Gliogenese im sich entwickelnden Rückenmark verantwortlich ist (Cheung and Briscoe, 2003; Stolt et al., 2003). Im ZNS ist Sox9 ein entscheidender Transkriptionsfaktor für die Spezifikation von Gliazellen (Stolt et al., 2003). Die Expression von Sox9 wird zuerst am Embryonaltag 8,5 dpc detektiert und schon zwei Tage später erstreckt sie sich über die ganze Ventrikulärzone des Rückenmarks. Mit Hilfe einer spezifischen Sox9-Deletion in neuroepithelialen Stammzellen der Ventrikulärzone ist gezeigt worden, dass Sox9 sowohl für die Bildung von Astrozyten, als auch für die Generierung von Oligodendrozyten aus der pmn-domäne wichtig ist. Bei auswandernde Zellen aus der pmn-domäne mutierter Mäuse konnten weniger Oligodendrozyten, aber mehr Motoneurone detektiert werden. Daher ist Sox9 eine entscheidende Komponente beim Umschalten von Neurogenese zu Gliagenese im sich entwickelnden Rückenmark (Stolt et al., 2003). Es konnte außerdem gezeigt werden, dass nur wenn Sox9 und Sox10 gemeinsam spezifisch deletiert sind, OLVZ ein verändertes Wanderungsverhalten und eine erhöhte Apoptoserate aufweisen. Dies ist darauf zurückzuführen, dass beide SoxE-Proteine zusammen die Expression von Pdgfra steuern. Dieser Rezeptor ist sowohl für das Überleben als auch die Migration der Vorläuferzellen wichtig (Finzsch et al., 2008). Somit ist hier ein weiteres Beispiel aufgezeigt, in dem die Zusammenarbeit von Sox-Proteinen in einer funktionell redundanten Art und Weise nötig ist Sox10 Das dritte Mitglied der Gruppe der SoxE-Proteine ist der Transkriptionsfaktor Sox10. Auch dieses Sox-Protein wird in vielen verschiedenen Zelltypen exprimiert. Es wird früh in der Entwicklung in Neuralleistenzellen gefunden, aber auch den Derivaten der Neuralleiste, wie in Melanoblasten, in Gliazellen des enterischen Nervensystems, des PNS, sowie in Gliazellen des ZNS (Britsch et al., 2001; Kapur, 1999; Kuhlbrodt et al., 1998; Roach et al., 1985; Stolt et al., 2002). Bereits in prämigratorischen Zellen der Neuralleiste wird Sox10 exprimiert. Diese Expression bleibt dabei in den auswandernden Neuralleistenzellen erhalten und ist 22

33 Einleitung für die Zellen während der Migration essentiell (Paratore et al., 2002; Sonnenberg- Riethmacher et al., 2001). Erreichen sie ihren Zielort, so verlieren einige der spezifizierten Zellen die Expression von Sox10, wie beispielsweise Neuronen, andere wiederum halten die Expression aufrecht, zum Beispiel Gliazellen (Wegner and Stolt, 2005). Im ENS, einem Derivat der Neuralleiste, erfüllt Sox10 ebenfalls eine bedeutende Rolle. Ist dieses Sox-Protein im Menschen mutiert, so kommt es zu einer Aganglionose im distalen Colon, zur Ausbildung eines Megacolons. Man spricht von der Hirschsprung Erkrankung (Pingault et al., 1998). Ebenfalls durch einen heterozygoten Sox10-Verlust können Pigmentierungsdefekte und Taubheit vorliegen, hier liegt das Waardenburg Syndrom vor (Read and Newton, 1997) Treten beide Fälle kombiniert auf, so spricht man von der Waardenburg-Hirschsprung Erkrankung (Pingault et al., 1998). Wenn in der Maus ein Allel von Sox10 verloren geht, oder inaktiviert wird, kommt es abhängig vom genetischen Hintergrund zu einer Aganglionose im distalen Colon (Maka et al., 2005; Paratore et al., 2002). Die spontane Mutation in der Dom- (Dominant megacolon) Maus führt zu einem verkürzten Sox10-Protein, welches dadurch funktionell inaktiv ist. Der einhergehende Phänotyp dieser Maus ist vergleichbar mit der Waardenburg-Hirschsprung Erkrankung (Herbarth et al., 1998; Southard-Smith et al., 1998). Es gibt auch eine schwerwiegendere Auswirkung der Sox10-Mutation. In diesem Fall ist die fehlerhafte mrna von Sox10 so stabil, dass sie in ein mutiertes Protein translatiert wird. Daraus resultiert eine dominant negative Wirkung, bei der nicht nur die Symptome der Waardenburg-Hirschsprung Erkrankung auftreten, sondern zusätzlich Myelinisierungsdefekte des peripheren und zentralen Nervensystems. Man spricht in einem solchen Fall vom PCWH-Syndrom (peripheral demyelinating neuropathy, central dysmyelinating leukodystrophy, Waardenburg syndrome, Hirschsprung disease) (Inoue et al., 2004; Touraine et al., 2000). Diese schwerwiegenden Symptome zeigen die hohe Relevanz des Transkriptionsfaktors Sox10 in den verschiedenen Zelltypen auf. Sox10 ist bereits in Neuralleistenzellen wichtig, aber auch bei der Entwicklung der Gliazellen des PNS nimmt das Sox-Protein eine wichtige Funktion ein. Sox10 ist der entscheidende Faktor für deren Spezifizierung. Ist Sox10 mutiert, so werden in Mäusen weder Schwann-Zellen noch Satellitenzellen gebildet (Britsch et al., 2001). 23

34 Einleitung Jedoch wird Sox10 auch nach der Spezifizierung in Gliazellen des peripheren Nervensystems exprimiert. Dies bedeutet, dass Sox10 während der gesamten Entwicklung der Schwann-Zelle vorliegt (Kuhlbrodt et al., 1998). Sox10 hat neben der Spezifizierung noch weitere Aufgaben bei der Entwicklung der Schwann-Zellen. In der Arbeitsgruppe sind durch Deletionsstudien des Sox10-Gens weitere entwicklungsspezifische Aufgaben gefunden worden. Durch das spezifische Ausschalten von Sox10 in unreifen Schwann-Zellen kam es zu einem Stopp der Entwicklung in diesem Stadium. Daher erfolgte auch keine radiale Sortierung und einhergehend damit fehlte die periphere Myelinisierung. Des Weiteren legt diese Arbeit dar, dass Sox10 essentiell ist für die Erhaltung der Schwann-Zell-Identität (Finzsch et al., 2010). Ebenso ist Sox10 für die Etablierung von myelinisierenden Schwann-Zellen verantwortlich und auch in der adulten Maus wird Sox10 benötigt, um die Myelinisierung der peripheren Nerven aufrechtzuerhalten (Bremer et al., 2011; Frob et al., 2012). Vor kurzem konnte die erste nicht-zellautonome Funktion von Sox10 während der Entwicklung der peripheren Nerven festgestellt werden. Sox10 aktiviert die Dhh- (Desert hedgehog) Expression in Schwann-Zellen, indem es an einen Enhancer bindet, der im ersten Intron des Dhh-Gens lokalisiert ist. Durch diese Bindung kommt es zu einer Schwann-Zell-spezifischen Aktivierung dieser genregulatorischen Sequenz. Somit beeinflusst Sox10 direkt die Expression von Dhh und damit die Bildung der Nervenscheide (Kuspert et al., 2012). Sox10 ist wie beschrieben verantwortlich für die Spezifizierung, die Progression der Schwann-Zellen-Linie und ihre terminale Differenzierung. Da Sox10 dabei kontinuierlich exprimiert ist, liegt es nahe, dass es zu dem jeweiligen Entwicklungszeitpunkt mit einem spezifischen Partner interagiert und dadurch entsprechende Gene an- oder abschaltet. Schon bei der ersten Charakterisierung von Sox10 konnte in vitro gezeigt werden, dass es mit dem POU-Domänen Protein Oct6 synergistisch interagiert (Kuhlbrodt et al., 1998). Oct6 wird spezifisch in der promyelinisierenden Schwann-Zelle exprimiert und bindet ebenso wie Sox10 an den Krox20-Enhancer MSE. Dieser Enhancer wird von beiden synergistisch aktiviert und induziert damit die Expression von Krox20, wodurch wiederum die Expression vieler Myelingene im peripheren Nervensystem aktiviert wird (Ghislain and Charnay, 2006; Reiprich et al., 2010; Topilko et al., 1994). 24

35 Einleitung Vor kurzem konnte in der Arbeitsgruppe außerdem die Beteiligung von Med12 aufgezeigt werden. Med12 ist ein Mitglied des Mediator Komplexes, der eine Verbindung zwischen RNA Polymerase II und einem an die DNA gebundenen Transkriptionsfaktor bildet. Sox10 scheint diesen Mediator Komplex durch Interaktion mit Med12 zu rekrutieren und somit kommt es zu einer erhöhten Expression von Krox20. Bei der Deletion von Med12 kann kaum noch Krox20-Protein nachgewiesen werden. Damit einhergehend kommt es zu einem Arrest der Schwann-Zellen Entwicklung kurz vor der Myelinisierung. Für diesen Entwicklungsschritt ist es somit essentiell, dass sowohl Sox10 als auch Med12 in der Schwann-Zelle vorliegen. (Vogl et al., 2013). Bei der Analyse von Sox10 im ZNS kann im Rückenmark ab 11,5 dpc, dem Zeitpunkt der Spezifizierung von neuroepithelialen Vorläuferzellen zu OLVZ, Sox10 in der pmn-domäne nachgewiesen werden. Seine Expression ist im ZNS auf oligodendrogliale Zellen beschränkt (Kuhlbrodt et al., 1998; Stolt et al., 2002). Die Expression des Sox10-Proteins selbst wird unter anderem durch den evolutionär konservierten U2 Enhancer reguliert, wobei dieser nur in OLVZ und nicht in reifen Oligodendrozyten aktiv ist. Dabei bindet der oligodendrogliale Transkriptionsfaktor Olig2 an das genregulatorische Element und ermöglicht dessen Aktivität. Olig2 wird allerdings während der gesamten oligodendrozytären Entwicklung exprimiert und kann den Enhancer folglich nicht alleine genau im OLVZ-Stadium anschalten. Der Transkriptionsfaktor Nkx6.2 wird zum Zeitpunkt der Spezifikation und in differenzierten Oligodendrozyten exprimiert und hemmt den U2-Enhancer (Kuspert et al., 2011). Somit wird durch das Zusammenspiel der beiden Transkriptionsfaktoren die spezifische Aktivität des Enhancers und folglich die Regulation der Expression von Sox10 ermöglicht. In Sox10-defizienten Mäusen kann keine Veränderung in der Anzahl der OLVZ festgestellt werden. Bei der Analyse der reifen Oligodendrozyten zeigt der Mangel von Sox10 jedoch einen starken Einfluss. Kurz vor der Geburt kann weder das Myelingen Mbp, noch Plp oder Mag nachgewiesen werden. Somit hat Sox10 eine essentielle Funktion bei der terminalen Differenzierung von myelinbildenden Oligodendrozyten (Stolt et al., 2002). Da der Transkriptionsfaktor jedoch schon vor diesem Entwicklungsschritt exprimiert ist, kann man annehmen, dass auch dieser Prozess von einem Kooperationspartner unterstützt wird. 25

36 Problemstellung 2 Problemstellung Im ZNS ist der Transkriptionsfaktor Sox10 entscheidend für die terminale Differenzierung von Oligodendrozyten, die Myelinisierung der Axone und folglich die saltatorische Erregungsleitung. Fehlt Sox10, so kommt es zu einem schweren terminalen Differenzierungsdefekt der Oligodendrozyten. Die Rolle von Sox10 im ZNS wurde bisher nur embryonal untersucht und sollte daher in dieser Arbeit postnatal analysiert werden. Zu diesem Zweck sollte eine konditionale Sox10-knock out Mauslinie mit Brn4::Cre-Mausmutanten gekreuzt werden, um einen spezifischen Verlust von Sox10 im ZNS zu erzeugen. Mittels immunhistochemischer Untersuchungen und in situ Hybridisierungen sollte der Phänotyp an unterschiedlichen Zeitpunkten auf Gefrierschnitten des Rückenmarks als Modellregion des ZNS untersucht werden. Durch elektronenmikroskopische und molekularbiologische Analysen sollte dieser weiter charakterisiert werden. Da Sox- Proteine oft funktionelle Redundanz aufweisen, sollte der kombinierte Verlust der beiden SoxE-Proteine Sox10 und Sox8 zusätzlich in die Untersuchungen eingeschlossen werden. Dazu sollten die Sox10-defizienten Mäuse mit einer konstitutiven Sox8-knock out Mauslinie gekreuzt werden. Neben Sox10 ist auch Myrf ein wichtiger Transkriptionsfaktor zur Ausbildung von Myelin im ZNS. Es sollte geprüft werden, ob Sox10 analog seiner Wirkweise im PNS Myrf als zentralen Aktivator der Myelinisierung aktiviert, um anschließend mit ihm funktionell zu interagieren. Dies sollte geschehen durch: 1. Generierung von α-myrf- Antikörpern, 2. Nachweis der Myrf-Induktion nach in ovo Elektroporation von Sox10, 3. Identifizierung eines Sox10-abhängigen Enhancers im Myrf-Genlokus, 4. Analyse dieser Region mit Gelretardierungsexperimenten und ChIP-Assays sowie Reportergenanalysen in Zelllinien und in der Maus, 5. Interaktionsnachweis mittels Ko-Immunpräziptiationen und GST- (Glutathion-S-Transferase) pull down- Experimenten und 6. Reportergenanalysen zum Nachweis des Zusammenwirkens von Sox10 und Myrf bei der Expression Myelin-assoziierter Gene. 26

37 Ergebnisse 3 Ergebnisse 3.1 Untersuchung der ZNS-spezifischen Deletion von Sox10 in Oligodendrozyten Der Transkriptionsfaktor Sox10 besitzt im ZNS eine Schlüsselfunktion bei der Differenzierung von OLVZ zu reifen, myelinbildenden Oligodendrozyten. In Abwesenheit von Sox10 kommt es zu einem schweren terminalen Differenzierungsdefekt der Oligodendrozyten. Dies konnte durch eine konstitutive Deletion von Sox10 in Mäusen gezeigt werden, bei denen an den Embryonalstadien 16,5 dpc und 18,5 dpc keine Expression der Myelingene Mbp und Plp nachzuweisen war (Stolt et al., 2002). Diese Tiere starben kurz nach der Geburt, da aufgrund schwerer Defekte im PNS eine Atemdefizienz vorlag (Britsch et al., 2001). Die terminale Differenzierung von Oligodendrozyten und die damit einhergehende Myelinbildung beginnen um den Zeitpunkt der Geburt (Stolt et al., 2002). Somit war eine weitreichende postnatale Untersuchung des Einflusses von Sox10 auf die Myelinisierung im zentralen Nervensystem mit dem beschriebenen Mausmodell nicht möglich. Um dieses Problem zu umgehen, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein Mausmodell mit konditionaler Deletion von Sox10 genutzt. Diese Deletion erfolgte durch die enzymatische Reaktion der Cre Rekombinase, welche spezifisch DNA-Bereiche entfernt. Dazu benötigt sie charakteristische Erkennungssequenzen, die loxp- (locus of crossing over of P1 phage) Sequenzen. Daher wurde eine Mauslinie benutzt, die direkt vor und nach dem offenen Leserahmen von Sox10 jeweils eine loxp-sequenz trägt (Sox10 fl ) (Finzsch et al., 2010). Diese wurden mit Mäusen verpaart, welche das Brn4::Cre-Transgen besitzen (Ahn et al., 2001). Die Expression der Cre Rekombinase wird hier durch den Promotor von Brn4 (Brainspecific homeobox/pou domain protein 4) gesteuert. Folglich entfernt Cre das Sox10-Gen spezifisch nur in den Zellen, in denen der Brn4-Promotor aktiv ist. Dies erfolgt in Geweben, welche vom Neuralrohr abstammen, wie beispielsweise dem Vorder- und Hinterhirn, sowie dem Rückenmark. Damit kommt es zu einer Deletion von Sox10 im ZNS, jedoch nicht im PNS, wodurch die Mäuse nach der Geburt lebensfähig sind und eine postnatale Untersuchung von Sox10 in Oligodendrozyten möglich wird. Die bei der Kreuzung der beiden Mauslinien Sox10 fl und Brn4::Cre erhaltene Sox10-Deletion im ZNS wird im folgenden Sox10 ZNS benannt. 27

38 Ergebnisse Die konditionale Deletion von Sox10 im ZNS führt zur Beeinträchtigung der Fortbewegung und zum verfrühten Tod Im Gegensatz zu Mäusen mit einer konstitutiven Deletion von Sox10 (Britsch et al., 2001) waren Mäuse mit konditionaler Deletion von Sox10 im ZNS lebensfähig. In der ersten Woche nach der Geburt konnten zwischen Wurfgeschwistern unterschiedlichen Genotyps keine phänotypischen Unterschiede festgestellt werden. Jedoch zeigten sich die Sox10 ZNS -Geschwistertiere ab der zweiten Woche unsicher und zitterig in ihrer Fortbewegung. Das Zittern verstärkte sich rapide mit zunehmendem Alter, wobei die meisten Mäuse nicht älter als drei Wochen wurden und kein Sox10 ZNS -Tier den postnatalen Tag P24 überlebte. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Ursache des verfrühten Ablebens der Sox10- defizienten Tiere nicht untersucht. Jedoch wurde auch bei Mäusen eine zitternde Fortbewegung und verringerte Lebensdauer festgestellt, bei denen ein Gen zur Myelinregulation, wie Myrf, oder ein Myelingen selbst mutiert war, wie beispielsweise Mbp oder Plp (Emery et al., 2009; Readhead and Hood, 1990; Werner et al., 2013). Die Beispiele deuten somit darauf hin, dass dies ein typischer Phänotyp ist, der im Zusammenhang mit Myelinisierungsdefekten steht Auswirkung der konditionalen Deletion von Sox10 im ZNS auf die Mitglieder der SoxE-Gruppe Die Gruppe der SoxE-Proteine umfasst neben dem Transkriptionsfaktor Sox10 auch die beiden Transkriptionsfaktoren Sox9 und Sox8. Sox9 ist für die Spezifikation der Oligodendrozyten zuständig, wohingegen Sox10 eine Schlüsselfunktion bei der terminalen Differenzierung und Myelinbildung erfüllt (Stolt et al., 2003; Stolt et al., 2002). Ein Verlust von Sox8 zeigte geringeren Einfluss auf Oligodendrozyten während der embryonalen Entwicklung als der von Sox9 und Sox10, führte jedoch zu einer verzögerten terminalen Differenzierung. Diese Retardierung verstärkte sich drastisch, wenn Sox8-defizienten Mäusen zusätzlich ein Sox10-Allel fehlte (Stolt et al., 2004). Daher wurde die Auswirkung des zentralnervösen Sox10-Verlusts auf die Mitglieder der SoxE-Gruppe durch immunhistochemische Färbungen untersucht. 28

39 Ergebnisse In Vorarbeiten an Sox10 ZNS -Mäusen wurde festgestellt, dass bei diesen Tieren ab einem Alter von 12,5 dpc Sox10 im Rückenmark vollständig deletiert war (Rübner, 2007). Um zu kontrollieren, ob dies im postnatalen Rückenmark nach wie vor zutraf wurde im Rahmen dieser Arbeit auf transversalen Rückenmarksschnitten die Expression von Sox10 in den ersten drei Wochen nach der Geburt analysiert. Auf Wildtypgewebe konnte Sox10 im Rückenmark detektiert werden (siehe Abbildung 6 A-D, S), wohingegen bei der Mutante Sox10 vollständig fehlte (siehe Abbildung 6 E- H, S). Die Deletion von Sox10 zeigte keinen Einfluss auf die Expression von Sox9 (siehe Abbildung 6 Q, R, T). Sox9 wurde während des Zeitraumes der aktiven Myelinisierung in beiden Genotypen in gleicher Weise herunter reguliert. Auch der Transkriptionsfaktor Sox8 wurde in Abwesenheit von Sox10 exprimiert (siehe Abbildung 6 I-P, U). Ab dem Tag P7 zeigten sich jedoch im Rückenmark der Mutante weniger Sox8-positive Zellen als im Wildtyp. Die Anzahl der Sox8-positiven Zellen stieg folglich nicht weiter an und blieb konstant auf diesem Niveau. Mit Hilfe von immunhistochemischen Färbungen konnte somit nachgewiesen werden, dass Sox10 im perinatalen Rückenmark vollständig deletiert wurde. Ebenfalls zeigte sich, dass die Abwesenheit von Sox10 sich nicht auf die Expression von Sox9 auswirkte und somit Sox10 im postnatalen Rückenmark keinen Einfluss auf Sox9 ausübte. Die Anzahl von Sox8-positiven Zellen in Sox10 ZNS -Mäusen war im Vergleich zu den entsprechenden Wildtypmäusen leicht reduziert. Die schwache Reduktion gibt Hinweis auf einen geringen Verlust von oligodendroglialen Zellen im Rückenmark von Sox10-defizienten Tieren. 29

40 Ergebnisse Abbildung 6: Überprüfung der ZNS-spezifischen Deletion von Sox10 und dessen Auswirkung auf die Expression von Sox9 und Sox8 Es wurden immunhistochemische Färbungen auf transversalen Gefrierschnitten des Rückenmarks an P3 (A, E, I, M, Q, R), P7 (B, F, J, N), P14 (C, G, K, O) und P21 (D, H, L, P) von Wildtyp- (wt) (A-D, I-L, Q) und Sox10-defizienten (ko) Tieren (E-H, M-P, R) mit Antikörpern gegen Sox10 (A-H), Sox8 (I-P) und Sox9 (Q, R) durchgeführt. Die Anzahl positiver Zellen für Sox10 (S), Sox9 (T) und Sox8 (U) auf Rückenmarkschnitten von Wildtypund Sox10 ZNS -Mäusen wurde während der ersten drei Wochen nach der Geburt quantifiziert. Dazu wurden mindestens neun Schnitte des Rückenmarks von drei verschiedenen Tieren pro Alter und Genotyp gezählt. Die erhaltenen Daten wurden als Mittelwert ± Standardfehler angegeben und die Signifikanz mit dem student`s t test ermittelt (***, P 0,001). Der Messbalken entspricht jeweils 100 µm. 30

41 Ergebnisse Einfluss des Verlusts von Sox10 im ZNS auf die Anzahl oligodendroglialer Zellen Die reduzierte Anzahl von Sox8-positiven Zellen im Rückenmark Sox10-defizienter Mäuse im Vergleich zu ihren Wildtypgeschwistern war ein Anzeichen für eine verringerte Menge an Oligodendrozyten im Sox10-defizienten Rückenmark. Um einen eventuellen Verlust von oligodendroglialen Zellen als Folge der Deletion von Sox10 zu überprüfen, wurden sowohl OLVZ als auch die Gesamtzahl an Oligodendrozyten untersucht. Zur Analyse der Anzahl oligodendroglialer Vorläufer wurde der Marker Pdgfra verwendet, da dieser nur auf Vorläuferzellen und nicht auf reifen Oligodendrozyten vorkommt. Auf transversalen Gefrierschnitten von Embryonen im Alter von 18,5 dpc wurde eine in situ Hybridisierung durchgeführt, um die Expression der Pdgfra-RNA zu überprüfen. Dabei zeigte sich kein Unterschied in der Zahl der Pdgfraexprimierenden Zellen zwischen Wildtyp und Mutante (siehe Abbildung 7 A-C). Somit war kurz vor der Geburt die Anzahl der Vorläuferzellen unverändert. Da sich kurz vor der Geburt im Rückenmark die weitgehende Mehrheit der Oligodendrozyten im Vorläuferstadium befindet, ließ sich postulieren, dass somit nicht nur die Anzahl der Vorläufer, sondern auch die Gesamtzahl der Oligodendrozyten in der Embryogenese unverändert war. Dies deckte sich auch mit den Ergebnissen bei der konstitutiven Deletion von Sox10. Bei diesen Untersuchungen zeigten Sox10-defiziente Embryonen im Rückenmark zwar eine verringerte Expressionsstärke von Pdgfra, jedoch keine Reduktion der Anzahl an Pdgfra-positiven Zellen (Stolt et al., 2002). Anschließend an die Untersuchung der Anzahl oligodendroglialer Zellen im embryonalen Rückenmark wurde postnatales Gewebe untersucht. Dazu wurden immunhistochemische Färbungen auf transversalen Rückenmarkschnitten mit dem Oligodendrozytenmarker Olig2 durchgeführt. Dieser markiert nicht nur OLZV, sondern auch promyelinisierende und reife Oligodendrozyten, da er während der gesamten Oligodendrozytenentwicklung exprimiert wird. Am früh postnatalen Tag 3 zeigte sich kein Unterschied in der Olig2-Expression zwischen Wildtyp- und Sox10 ZNS -Mäusen (siehe Abbildung 7 D, E, I). Die Anzahl an Olig2-positiven Zellen nahm im Rückenmark von Wildtyptieren an den späteren Untersuchungszeitpunkten weiter zu (siehe Abbildung 7 D, F-H). Im Rückenmark von Sox10-defizienten Mäusen konnte nur eine minimale Zunahme von Olig2-positiven Zellen beobachtet werden. In 31

42 Ergebnisse diesem Fall blieb die Expression von Olig2 weitestgehend konstant auf dem Niveau vom postnatalen Tag 3 (siehe Abbildung 7 D, I-L). Insofern waren in den ersten drei Wochen nach der Geburt Oligodendrozyten im Rückenmark von Sox10 ZNS -Mäusen vorhanden, wenn auch ihre Anzahl ab dem postnatalen Tag P7 im Vergleich zu den Wildtyptieren etwas reduziert war. Dies kann somit die in Abschnitt beschriebene schwache Reduktion von Sox8-positiven Zellen im Sox10-defizienten Rückenmark im Gegensatz zum Wildtyp erklären. Abbildung 7: Auswirkung der ZNS-spezifischen Deletion von Sox10 auf die Anzahl oligodendroglialer Zellen Auf transversalen Gefrierschnitten des Rückenmarks an 18,5 dpc von Wildtyp- (wt) (A) und Sox10-defizienten (ko) (B) Mäusen wurden Pdgfra + OLVZ mittels in situ Hybridisierung markiert. Der Messbalken entspricht jeweils 200 µm. Die Anzahl der Pdgfra + OLVZ wurde auf Rückenmarksschnitten beider Genotypen an 18,5 dpc quantifiziert (C). Die Anzahl Olig2 + Zellen auf Schnitten des Rückenmarks von Wildtyp- (wt) (schwarze Balken) und Sox10- defizienten (ko) (weiße Balken) Tieren wurde während der ersten drei Wochen nach der Geburt quantifiziert (D). Für die Quantifizierungen wurden mindestens neun Schnitte des Rückenmarks von drei verschiedenen Tieren pro Alter und Genotyp gezählt. Die erhaltenen Daten wurden als Mittelwert ± Standardfehler angegeben und die Signifikanz mit dem student`s t test ermittelt (**, P 0,01; ***, P 0,001). Die immunhistochemischen Färbungen gegen den Oligodendrozytenmarker Olig2 wurden auf transversalen Gefrierschnitten des Rückenmarks an P3 (E, I), P7 (F, J), P14 (G, K) und P21 (H, L) von Wildtyp- (wt) (E-H) und Sox10 ZNS - (ko) Tieren (I-L) durchgeführt. Der Messbalken entspricht jeweils 100 µm. 32

43 Ergebnisse Die konditionale Deletion von Sox10 im ZNS führt zum terminalen Differenzierungsdefekt der Oligodendrozyten Da Olig2-positive Oligodendrozyten in Sox10 ZNS -Mäusen vorhanden waren und in diesem Zeitraum die Myelinisierung im Rückenmark von Wildtyptiern erfolgte, wurde im Folgenden untersucht, ob das Fehlen von Sox10 die terminale Differenzierung der vorhandenen Oligodendrozyten beeinträchtigte. Mbp und Plp sind frühe Marker der terminalen Differenzierung von Oligodendozyten und somit gut geeignet, diesen Entwicklungszeitpunkt auf Rückenmarksschnitten in der frühen postnatalen Phase zu untersuchen. Somit wurden auf transversalen Gefrierschnitten durch in situ Hybridisierung die mrnas von Mbp und Plp mit antisense-sonden nachgewiesen. An P3 konnten kaum Mbp-positive oder Plp-positive Zellen in der weißen Substanz des Rückenmarks von Sox10 ZNS -Mäusen nachgewiesen werden. Dagegen waren diese im Rückenmark von Wildtyptieren in signifikanter Menge vorhanden (vergleiche Abbildung 8 A, I mit Abbildung 8 E, M). An P7 hatten die Mbp- und Plp-exprimierenden Zellen im Rückenmark von Sox10-defizienten Mäusen zugenommen, wenn auch ihre Anzahl immer noch wesentlich geringer war als die im Rückenmark von Wildtyptieren (vergleiche Abbildung 8 B, J mit Abbildung 8 F, N). Dieser Trend setzte sich auch an P14 und P21 fort. Das Rückenmark der Sox10 ZNS -Mäuse zeigte ansteigende Mengen von Mbp-positiven und Plp-positiven Zellen, jedoch konnte bis zum Tod der Tiere die Zahl der positiven Zellen im Wildtyp nie erreicht werden (vergleiche Abbildung 8 C, K mit Abbildung 8 G, O und Abbildung 8 D, L mit Abbildung 8 H, P). Insgesamt zeigten nach ZNS-spezifischer Deletion von Sox10 Oligodendrozyten eine verringerte Expression der Myelingene Mbp und Plp und somit einen ausgeprägten Defekt in der terminalen Differenzierung. Diese Analysen konnten somit frühere Ergebnisse der konstitutiven und konditionalen Deletion von Sox10 bestätigen und auf ältere Entwicklungszeitpunkte erweitern (Rübner, 2007; Stolt et al., 2002). 33

44 Ergebnisse Abbildung 8: Terminaler Differenzierungsdefekt durch die ZNS-spezifische Deletion von Sox10 Es wurden in situ Hybridisierungen auf transversalen Gefrierschnitten des Rückenmarks an P3 (A, E, I, M), P7 (B, F, J, N), P14 (C, G, K, O) und P21 (D, H, L, P) von Wildtyp- (wt) (A-D, I-L) und Sox10-defizienten (ko) Tieren (E-H, M-P) mit antisense Sonden gegen Mbp (A-H) und Plp (I-P) durchgeführt. Der Messbalken entspricht jeweils 200 µm Der Verlust von Sox10 im ZNS blockiert die Myelinbildung Aufgrund einer reduzierten Expression der Myelingene Mbp und Plp war eine Veränderung bei der Ausbildung der Myelinscheide wahrscheinlich. Um dies zu analysieren, wurden im Rahmen dieser Arbeit in Kollaboration mit Prof. Dr. Ernst Tamm und seiner Arbeitsgruppe in Regensburg histologische und ultrastrukturelle Untersuchungen des Rückenmarks von Wildtyp- und Sox10-defizienten Mäusen an den Stadien P7 und P14 durchgeführt. Zum einen wurde eine Richardson Färbung durchgeführt, mit der Myelin detektiert werden kann. Diese wurde lichtmikroskopisch analysiert (siehe Abbildung 9 A-C). Zum anderen wurden transmissionselektronenmikroskopische Untersuchungen durchgeführt (siehe Abbildung 9 D-F). 34

45 Ergebnisse Beide Untersuchungsansätze zeigten in der weißen Substanz des Rückenmarks von Wildtypmäusen erwartungsgemäß myelinisierte Axone. Diese ließen sich jedoch nicht in Sox10-dezifienten Mäusen nachweisen (vergleiche Abbildung 9 A mit Abbildung 9 B, Abbildung 9 D mit Abbildung 9 E und nicht gezeigte Daten). Im PNS, welches durch die zentralnervöse Deletion von Sox10 nicht beeinflusst war, wurde auch in den mutierten Tieren Myelin nachgewiesen. In Mäusen beider Genotypen ließen sich myeliniserende Schwann-Zellen detektieren (siehe Abbildung 9 B, C und F). Dementsprechend lag in der Abwesenheit von Sox10 im ZNS nicht nur ein Defekt in der terminalen Differenzierung vor, sondern es resultierte daraus ebenso ein Fehlen der gesamten Myelinbildung im Rückenmark. Abbildung 9: Fehlende Myelinisierung nach ZNS-spezifischer Deletion von Sox10 A-C zeigen lichtmikroskopische Aufnahmen von 1 µm semidünnen Schnitten des ventralen Rückenmarkhorns, nach Richardson gefärbt, in Wildtyp- (wt) (A) und Sox10- defizienten (ko) Mäusen (B) am postnatalen Tag P14. C zeigt eine stärkere Vergrößerung des in B durch eine schwarze Box markierten Bereichs. WS: Weiße Substanz, GS: Graue Substanz, OL: Oligodendrozyte. Der Messbalken entspricht jeweils 100 µm. D-F zeigen transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen des ventralen Rückenmarkhorns an P14 eines Wildtyp- (wt)tieres mit myelinisierten Axonen (D, schwarze Pfeile) und eines Sox10 - defizienten (ko) Tieres mit nicht-myelinisierten Axonen (E, F, schwarze Pfeile). Myelinscheiden in der anterioren Wurzel (AW) des Sox10 ZNS (ko) Tieres (F, weißer Pfeil). Der Messbalken entspricht jeweils 2,5 µm. 35

46 Ergebnisse Die kombinierte Deletion von Sox10 und Sox8 führt zum vollständigen Ausfall der terminalen Differenzierung Trotz des Fehlens von Myelinscheiden konnte wenn auch nur in geringen Mengen Expression der Myelingene Mbp und Plp in Sox10 ZNS -Mäusen festgestellt werden (siehe Abbildung 8). Einige Oligodendrozyten konnten somit scheinbar ungeachtet des Sox10-Verlusts die Expression von Myelingenen induzieren und wenigstens zeitweise aufrechterhalten. Der Transkriptionsfaktor Sox8 unterstützt Sox10 während der Oligodendrozytenentwicklung, auch wenn er dessen Verlust nicht vollständig kompensieren kann. (Kellerer et al., 2006; Stolt et al., 2004). Somit lag es nahe zu überprüfen, ob Sox8 für die schwache verbleibende Expression von Myelinproteinen in Oligodendrozyten verantwortlich war. Dazu wurden Sox8-defiziente Mäuse gezüchtet, die gleichzeitig eine Deletion von Sox10 im ZNS aufwiesen. Diese waren kleiner als ihre Wurfgeschwister und zeigten ebenso wie Sox10 ZNS -Mäuse motorische Beeinträchtigungen. Jedoch war das Zittern dieser doppelt-defizienten Tiere stärker ausgeprägt und keine Maus überlebte den Tag P18. Um zu überprüfen, ob der terminale Differenzierungsdefekt in Sox8/Sox10-doppelt-defizienten Mäusen stärker ausgeprägt war, wurden erneut in situ Hybridisierungen gegen die Transkripte der Myelingene Mbp und Plp durchgeführt. An beiden analysierten Tagen P7 und P16 zeigte das Rückenmark in Abwesenheit von Sox8 und Sox10 ein vollständiges Fehlen Mbp-positiver und Plppositiver Zellen (vergleiche Abbildung 10 A, E mit Abbildung 10 C, G und Abbildung 10 B, F mit Abbildung 10 D, H). Diese Untersuchungen bestätigten eindrücklich, dass Sox8 an der terminalen Differenzierung von Oligodendrozyten beteiligt war. 36

47 Ergebnisse Abbildung 10: Vollständiger Verlust der terminalen Differenzierung bei kombinierter Deletion von Sox8 und Sox10 Es wurden in situ Hybridisierungen auf transversalen Gefrierschnitten des Rückenmarks an P7 (A, C, E, G) und P16 (B, D, F, H) von Wildtyp- (wt) (A, B, E, F) und doppelt-defizienten (dko) Mäusen (C, D, G, H) mit antisense Sonden gegen Mbp (A-D) und Plp (E-H) durchgeführt. Gezeigt ist das ventrale Rückenmarkshorn. Der Messbalken entspricht 200 µm Der Verlust von Sox10 führt zur Störung der Oligodendrozytenentwicklung in der späten promyelinisierenden Phase Aus der Beobachtung, dass die terminale Differenzierung der Oligodendrozyten durch den ZNS-spezifischen Verlust von Sox10 gestört war, folgte die Fragestellung, zu welchem Zeitpunkt in der Oligodendrozytenentwicklung dieser Defekt auftrat. Um den Übergang in das promyelinisierende Stadium zu überprüfen, wurde die Expression von Myrf analysiert. Myrf ist ein Transkriptionsfaktor der für die Myelinisierung im ZNS benötigt wird und spezifisch in postmitotischen Oligodendrozyten exprimiert wird (Emery et al., 2009). Er ist somit ein geeigneter Marker zur Untersuchung von promyelinisierenden Oligodendrozyten. Die Expression von Myrf wurde auf transversalen Rückenmarksschnitten überprüft, indem in situ Hybridisierungen mit einer Sonde gegen die mrna von Myrf durchgeführt wurden. In Mäusen ohne Sox10 im ZNS war die Expression von Myrf 37

48 Ergebnisse drastisch reduziert, so dass erst ab dem postnatalen Tag 7 Myrf-positive Zellen gut erkennbar detektiert wurden. Dagegen waren im Wildtyp-Rückenmark schon ab P3 Myrf-positive Zellen deutlich sichtbar (vergleiche Abbildung 11 A, B mit Abbildung 11 E, F). Die Myrf Expression nahm an P14 und P21 in Sox10 ZNS -Tieren stetig zu, erreichte jedoch niemals das Expressionsniveau der Wildtyptiere (vergleiche Abbildung 11 C, D mit Abbildung 11 G, H). Da in Sox10 ZNS -Tieren jeweils noch eine geringe Transkriptmenge von Myrf nachweisbar war, lag auch hier die Vermutung nahe, dass dies ebenso auf die Expression von Sox8 zurückzuführen war, wie es bei den schwachen Transkriptmengen der Myelingene der Fall war. Daher wurde die Expression von Myrf mittels in situ Hybridisierung auch auf Sox8/Sox10-doppelt-defizientem Rückenmark untersucht. Deutlich war zu erkennen, dass bei einer kombinierten Deletion von Sox8 und Sox10 keine Myrf-positiven Zellen mehr detektierbar waren (vergleiche Abbildung 11 I, J mit Abbildung 11 K, L). Demnach ist die Regulation der Myrf-Expression Sox10-abhängig, und wie bei der Expression von Mbp und Plp ist auch hier Sox8 beteiligt. Die Ergebnisse zeigten, dass bei einem Verlust von Sox8 und Sox10 im Rückenmark die Oligodendrozyten nicht über das promyelinisierende Stadium herauskommen. 38

49 Ergebnisse Abbildung 11: Verlust der Myrf-Expression in Sox10- und Sox8/Sox10-doppeltdefizientem Rückenmark Es wurden in situ Hybridisierungen gegen Myrf auf transversalen Gefrierschnitten des Rückenmarks an P3 (A, E), P7 (B, F), P14 (C, G) und P21 (D, H) von Wildtyp- (wt) (A-D) und Sox10-defizienten (ko) Tieren (E-H) durchgeführt. Ebenso wurden in situ Hybridisierungen auf transversalen Gefrierschnitten des Rückenmarks an P7 (I, K) und P16 (J, L) von Wildtyp- (wt) (I, J) und doppelt-defizienten (dko) Mäusen (K, L) durchgeführt. Gezeigt ist jeweils das ventrale Rückenmarkshorn. Der Messbalken entspricht 200 µm. Um die reduzierte Expression von Myrf in Abwesenheit von Sox10 im ZNS nicht nur auf Transkriptebene zu untersuchen, sondern auch auf Proteinebene, wurden immunhistochemische Färbungen durchgeführt. Da jedoch kein Antikörper gegen Myrf verfügbar war, wurden polyklonale α-myrf-antikörper mit Hilfe der Firma Pineda Antikörper-Service (Berlin) selbst generiert (siehe Abschnitt 3.5). Bei Färbungen von transversalen Gefrierschnitten des Rückenmarks zeigte sich bei Wildtyptieren eine Zunahme von Myrf-positiven Zellen mit fortschreitender Entwicklung. Dagegen konnten im Rückenmark von Sox10-defizienten Mäusen am Tag P3 nur vereinzelt Myrf-positive Zellen detektiert werden. Zwar konnte an späteren Entwicklungszeitpunkten ein Anstieg an Myrf-positiven Zellen festgestellt werden, jedoch blieb die Anzahl der positiven Zellen mit großem Abstand unter der 39

50 Ergebnisse Anzahl der Myrf-positiven Zellen des Wildtyps (vergleiche Abbildung 12 A-C mit Abbildung 12 D-F und Abbildung 12 Y). Aufgrund der Tatsache, dass Myrf spezifisch in postmitotischen Oligodendrozyten vorliegt, wurde damit gezeigt, dass der Verlust von Sox10 zu einer Störung der Oligodendrozytenentwicklung in der späten promyelinisierenden Phase führte. Daraufhin wurden neben Myrf noch weitere oligodendrozytäre Marker analysiert, um diese Aussage genauer zu untersuchen. Hierfür standen CC1 (auch Apc genannt, Adenomatosis polyposis coli), ein Marker für frühe Differenzierung zu myelinbildenden Oligodendrozyten, CNPase, wodurch promyelinisierende Oligodendrozyten markiert werden (Emery, 2010), und ein weiterer Marker für Oligodendrozyten im promyelinisierenden Stadium Nkx2.2 (Qi et al., 2001) zur Verfügung. Bei den immunhistochemische Färbungen auf transversalen Gefrierschnitten wurde im Rückenmark von Sox10-defizienten Mäusen an allen untersuchten Entwicklungszeitpunkten eine stark reduzierte Anzahl an CC1-positiven und CNPase-positiven Zellen festgestellt (vergleiche Abbildung 12 G-I mit Abbildung 12 J-L und Abbildung 12 M-O mit Abbildung 12 P-R). Dies spiegelte die Ergebnisse der Färbungen mit Myrf deutlich wider. Die Anzahl Nkx2.2-positiver Zellen war in Abwesenheit von Sox10 im Vergleich zum Wildtyp ebenfalls reduziert (vergleiche Abbildung 12 S-U mit Abbildung 12 V-X und Abbildung 12 Z). Jedoch war diese Reduktion nicht so stark wie bei den Markern Myrf, CC1 oder CNPase. Die Ergebnisse bestätigten, dass die Entwicklung der Oligodendrozyten in der Phase der frühen Differenzierung gestört war, wenn Sox10 fehlte. 40

51 Ergebnisse Abbildung 12: Störung der Oligodendrozytenentwicklung in der promyelinisierenden Phase durch die ZNS-spezifische Deletion von Sox10 Es wurden immunhistochemische Färbungen auf transversalen Gefrierschnitten des Rückenmarks an P3 (A, D, G, J, M, P, S, V), P7 (B, E, H, K, N, Q, T, W) und P14 (C, F, I,L, O, R, U, X) von Wildtyp- (wt) (A-C, G-I, M-O, S-U) und Sox10 defizienten (ko) (D-F, J-L, P- R, V-X) Tieren mit Antikörpern gegen Myrf (A-F), CC1 (G-L), CNPase (M-R) und Nkx2.2 (S- X) durchgeführt. Gezeigt ist jeweils das ventrale Rückenmarkshorn. Die Gesamtzahl Myrf + Zellen (Y) und Nkx2.2 + Zellen der weißen Substanz (Z) auf Rückenmarkschnitten von Wildtyp- (wt) (schwarze Balken) und Sox10-defizienten (ko) (weiße Balken) Mäusen wurde während der ersten zwei Wochen nach der Geburt quantifiziert. Dazu wurden mindestens neun Schnitte des Rückenmarks von drei verschiedenen Tieren pro Alter und Genotyp gezählt. Die erhaltenen Daten wurden als Mittelwert ± Standardfehler angegeben und die Signifikanz mit dem student`s t test ermittelt (*, P 0,05; ***, P 0,001). Der Messbalken entspricht 75 µm. 41

52 Ergebnisse Der Defekt der terminalen Differenzierung in Sox10-defizienten Mäusen lag im promyelinisierenden Stadium vor. Anschließend wurde analysiert, ob bereits zu einem früheren Zeitpunkt Differenzierungsdefizite vorlagen. Dafür wurden Färbungen mit einem Antikörper gegen Gpr17 durchgeführt. Der Rezeptor Gpr17 wurde gewählt, weil er einen entscheidenden Faktor für den Übergang von unreifen zu reifen Oligodendrozyten darstellt (Chen et al., 2009). Mit diesem Marker wurden immunhistochemische Färbungen auf transversalen Gefrierschnitten an den Tagen P7 und P14 durchgeführt. Alle Gpr17-positive Zellen überlappten mit den Sox8-positiven Oligodendrozyten (siehe Abbildung 13). Des Weiteren unterschied sich die Anzahl der Gpr17/Sox8-doppelt-positiven Zellen nicht zwischen Wildtyp und Mutante. Dies traf auf die beiden untersuchten Zeitpunkte P7 und P14 zu (vergleiche Abbildung 13 A mit B und Abbildung 13 C mit D). Die Expression des Proteins Gpr17 war somit nicht von der ZNS-spezifischen Deletion von Sox10 beeinflusst. Demnach lag zu diesem Zeitpunkt noch kein Defekt in der Oligodendrozytenentwicklung vor. Abbildung 13: Die Expression von Gpr17 zeigt keine Beeinflussung durch den ZNSspezifischen Verlust von Sox10 Es wurden immunhistochemische Färbungen wurden auf transversalen Gefrierschnitten des Rückenmarks an P7 (A, B) und P14 (C, D) von Wildtyp- (wt) und Sox10-defizienten (ko) Mäusen mit Antikörpern gegen Gpr17 (rot) und Sox8 (grün) durchgeführt. Gezeigt ist eine Vergrößerung aus dem ventralen Rückenmarkshorn. Der Messbalken entspricht 50 µm. Um die Aussagen der immunhistochemischen Experimente zu bestätigen und weiter zu vertiefen, wurde zusätzlich die Expression verschiedener Marker mittels quantitativer real time PCR (qpcr) auf Ebene der Transkripte quantifiziert. Damit wurde analysiert, inwieweit der Verlust von Sox10 die Expression verschiedener, am Myelinisierungsprozess beteiligter Gene verändert. 42

53 Ergebnisse Dazu wurde das Rückenmark von Wildtyp- und Sox10 ZNS -Mäusen am Tag P7 entnommen, daraus RNA isoliert und cdna synthetisiert. Anschließend wurde eine qpcr durchgeführt. Für Mbp und Myrf konnte gezeigt werden, dass die relative Expression in Sox10-defizienten Mäusen signifikant herunter reguliert war (siehe Abbildung 14 A). Dadurch wurden die Ergebnisse der histologischen Untersuchungen von Mbp und Myrf bestätigt (vergleiche Abschnitt und Abbildung 12). Ebenfalls konnte für den oligodendrozytenspezifischen Transkriptionsfaktor Zfp488, welcher spezifisch in differenzierten Oligodendrozyten vorliegt (Wang et al., 2006), eine signifikant reduzierte relative Expression in Sox10-defizienten Tieren nachgewiesen werden. Dagegen zeigte der Verlust von Sox10 geringeren Einfluss auf die Expression von Nkx2.2, was ebenfalls die bisherigen immunhistochemischen Ergebnisse von Nkx2.2 bestätigte (siehe Abbildung 12). Ebenso konnten die bisherigen Ergebnisse über die unveränderte Expression von Olig2 und Pdgfra zwischen mutierten und Wildtyptieren mittels qpcr bestätigt werden (vergleiche Abschnitt 3.1.3). Auch die Expression von Zfp191 (zinc finger protein 191), Tcf4, Yy1 und Hes5 war von der Sox10-Deletion unbeeinflusst. Dementgegen zeigte Id2 eine Tendenz zur erhöhten Expression in Sox10-defizienten Tieren. Für die relative Expression von Id4 wurde für die Mutante eine statistisch signifikante Erhöhung festgestellt. Diese beiden Gene mit erhöhter Expression, Id2 als auch Id4, kodieren für Inhibitoren der Myelinisierung (Kondo and Raff, 2000; Wang et al., 2001). 43

54 Ergebnisse Abbildung 14: Auswirkung der ZNS-spezifischen Sox10-Deletion auf Oligodendrozytenmarker an den postnatalen Tagen P7 und P14 Die quantitative realtime PCR wurde mit Rückenmark-cDNA von sieben (A) und 14 Tage alten (B) Wildtyp- (wt, schwarze Balken) bzw. Sox10-defizienten (ko, weiße Balken) Tieren durchgeführt. Dazu wurden Primer gegen Mbp, Myrf, Zfp488, Nkx2.2, Olig2, Pdgfra, Zfp191, Yy1, Tcf4, Hes5, Id2 und Id4 Transkripte verwendet. Die Transkriptlevel wurden gegen β- Aktin normalisiert und jeweils der Wildtyp als 1 gesetzt. Die entsprechende Mutante wurde relativ dazu berechnet und jeweils als Mittelwert ± Standardfehler angegeben und die Signifikanz mit dem student`s t test ermittelt (*, P 0,05; **, P 0,01). Die Experimente wurden jeweils mindestens dreimal durchgeführt; pro Genotyp wurde aus drei unabhängigen Präparationen Rückenmark entnommen. Untersuchungen am Tag P14 wiesen weitgehend ähnliche Ergebnisse auf (siehe Abbildung 14 B). Die Gene für Myelinproteine respektive für Aktivatoren des Myelinisierungsprogramms Mbp, Myrf, Zfp488 und an diesem Zeitpunkt auch Nkx2.2 waren signifikant herunter reguliert. An diesem späteren Entwicklungszeitpunkt war ebenso die Expression von Olig2 in Sox10 ZNS -Tieren signifikant reduziert, dies bestätigte die Ergebnisse auf Proteinebene (vergleiche Abschnitt 3.1.3). Pdgfra, Tcf4, Yy1 und Hes5 blieben in ihrer Expression unverändert. Die Expressionslevel von Id2 und Id4 zeigten hier eine Veränderung zum vorherigen Untersuchungszeitpunkt. Beide Marker für nicht differenzierte Oligodendrozyten waren in ihrer Expression nicht mehr erhöht (siehe Abbildung 14 B). Somit konnten die Untersuchungen mit quantitativer real time PCR die bisherigen Ergebnisse für Mbp, Myrf, Nkx2.2, Olig2 und Pdgfra bestätigen und mit Zfp488 ein weiteres Zielgen aufzeigen, welches von der zentralnervösen Deletion von Sox10 betroffen war. 44

55 Ergebnisse Die meisten Marker für Oligodendrozytenvorläufer sowie Nkx2.2 und Gpr17, beides Marker für promyelinisierende Oligodendrozyten, zeigten nur geringe Veränderungen im Expressionsprofil auf. Dagegen waren Regulatorgene der Myelinisierung und Myelingene sehr stark durch den Verlust von Sox10 betroffen. Daher war bei der ZNS-spezifischen Deletion von Sox10 die Entwicklung der Oligodendrozyten am Übergang von der promyelinisierenden zur myelinisierenden Stufe blockiert. Hierbei war in der Oligodendrozytenentwicklung in Sox10 ZNS -Mäusen der Verlust der Myrf- Expression der früheste in dieser Arbeit beobachtete Defekt. 45

56 Ergebnisse 3.2 Analyse der Sox10 abhängigen Aktivierung der Myrf Expression Der Transkriptionsfaktor Sox10 ist während der gesamten Oligodendrozytenentwicklung exprimiert und ist gleichzeitig ein essentieller Faktor für die Differenzierung von Oligodendrozyten (Stolt et al., 2002). Sox10 reguliert den Differenzierungsprozess nicht alleine, sondern weitere Faktoren sind dabei beteiligt. Einer davon ist Myrf, ein entscheidender Regulator der Myelinisierung, der spezifisch in postmitotischen Oligodendrozyten exprimiert wird (Emery et al., 2009) und somit genau zum Zeitpunkt der Differenzierung vorliegt. Die in Abschnitt beschriebenen Ergebnisse zeigten, dass Sox10 die Expression von Myrf beeinflusst und erweckten die Vermutung, dass Sox10 auch in der Lage ist die Myrf-Expression anzuschalten. Es wurde ein weiteres Modellsystem gewählt, welches eine Analyse ermöglicht, ob Sox10 die Expression von Myrf induziert. Dazu wurden in ovo Elektroporationen von Hühnchenembryonen im Embryonalstadium HH (Hamburger und Hamilton) 11 durchgeführt. 24 h nach der Elektroporation wurde das Neuralrohr der Hühnchen mittels immunhistochemischer Färbung untersucht. Bei der GFP- (green fluorescent protein) Elektroporationskontrolle konnten weder Sox10-positive noch Myrf-positive Zellen unter den GFP-positiven Zellen im Neuralrohr detektiert werden (siehe Abbildung 15 A-C). Wurde jedoch zusätzlich Sox10 elektroporiert, so konnte neben Sox10 auch Myrf auf der elektroporierten Seite des Neuralrohrs erkannt werden, wobei Myrf offenbar nur dann exprimiert wurde, wenn in den Zellen besonders viel Sox10 vorlag (siehe Abbildung 15 D-F). Die Ergebnisse der in ovo Elektoporationen zeigten demnach, dass Sox10 prinzipiell die Fähigkeit besitzt, Myrf in vivo zu induzieren. 46

57 Ergebnisse Abbildung 15: Sox10 induziert in vivo die Expression von Myrf Elektroporation des Neuralrohrs von Hühnchenembryonen mit einem GFP- (A-C) oder einem Sox10- und GFP-Expressionsvektor (D-F). Die immunhistochemischen Färbungen auf transversalen Gewebsschnitten zeigen das Neuralrohr 24h nach der Elektroporation, wobei jeweils die rechte Seite elektroporiert wurde. Dies wurde durch die GFP Expression (grün) sichtbar gemacht (A, D). Die Schnitte wurden immunhistochemisch mit Antikörpern gegen GFP (grün) (A,D), Sox10 (weiß) (B, E) und Myrf (rot) (C, F) gefärbt. Der Messbalken entspricht 25 µm. Zwar konnte durch eine Überexpression von Sox10 im Neuralrohr des Hühnchens die Induktion von Myrf gezeigt werden, daraufhin stellte sich jedoch die Frage, ob dies auch in peripheren Gliazellen möglich war. Dazu wurde die Schwann-Zell-Zelllinie S16 untersucht. Diese wurde mit Expressionsplasmiden für Sox10 und für egfp (enhanced green fluorescent protein) als Kontrolle zur Transfektionseffizienz transfiziert. Die Zellen wurden 48 h nach der Transfektion fixiert und anschließend immunzytochemisch gefärbt. Im Kontrollversuch, bei dem nur GFP transfiziert wurde, konnten keine Myrf positiven Zellen detektiert werden (siehe Abbildung 16 A-C). Bei Kotransfektion von GFP mit Sox10 wurden ebenso keine Myrf-positiven Zellen gefunden (siehe Abbildung 16 D-F). Dies zeigte, dass auch eine hohe Konzentration von Sox10 in diesem Zelltyp Myrf nicht induzieren konnte. Zusammenfassend ließ sich schlussfolgern, dass es grundsätzlich möglich war, die Expression von Myrf durch Sox10 anzuschalten, dies aber nicht in jedem Zellsystem 47

58 Ergebnisse möglich war. Wie die Induktion von Myrf im murinen System erfolgt, sollten die weiteren Analysen zeigen. Abbildung 16: Sox10 kann Myrf nicht in S16 Schwann-Zellen aktivieren Die S16 Schwann-Zellen wurden mit GFP- (A-C) bzw. einer Kombination von Sox10- und GFP- (D-F) Expressionsvektor transfiziert. Nach 48 h wurden die transfizierten Zellen analysiert. Dazu wurden die Zellen immunzytochemisch mit Antikörpern gegen GFP (grün) (A,D) und Myrf (rot) (B, E) gefärbt. Die Zellkerne wurden mit DAPI gegengefärbt (blau) (C, F). Der Messbalken entspricht 75 µm. 48

59 Ergebnisse 3.3 Untersuchung des Myrf Enhancers EKR9 Da eine Induktion von Myrf durch Sox10 prinzipiell möglich war, wurden in der Arbeitsgruppe weitere Experimente durchgeführt. Dazu wurden evolutionär konservierte, nicht kodierende Regionen (EKR) des Myrf-Gens in der Maus gesucht, welche diese Induktion vermitteln könnten. Dabei wurde im ersten Intron des Myrf- Gens das genregulatorische Element EKR9 identifiziert, welches putative Sox10- Bindestellen besitzt und in Luziferase-Aktivitätsassays Sox10-abhängige Aktivität aufweist (Hornig et al., 2013). Zur Analyse, ob Sox10 tatsächlich an die EKR9 bindet, wurden ChIP-Experimente mit Chromatin aus dem Rückenmark von 14 Tage alten Wildtypmäusen und einem α- Sox10-Antikörper durchgeführt. Dabei war die EKR9-Region spezifisch angereichert (siehe Abbildung 17). Bei der Kontrolle, mit Prä-Immunserum (PI) an Stelle des α- Sox10-Antikörpers war diese Anreicherung wesentlich geringer. Für die anderen getesteten Regionen, dem Minimalpromotor von Myrf und die EKR11/12, konnte keine spezifische Anreicherung festgestellt werden. Eine Anreicherung blieb ebenso bei den Kontrollregionen in den 5 - und 3 -flankierenden Bereichen des Myrf-Gens und im benachbarten Dagla-Gen aus. Wurde das ChIP-Experiment mit Chromatin aus dem Rückenmark von Mäusen mit zentralnervöser Sox10-Deletion durchgeführt, so war keine Anreicherung der EKR9-Region nachweisbar. Somit wurde mit Hilfe der ChIP-Experimente bestätigt, dass spezifisch Sox10 in situ an die EKR9 bindet. 49

60 Ergebnisse Abbildung 17: Sox10 bindet an die EKR9 Schematische Darstellung der Lokalisierung der per PCR amplifizierten Bereiche des Myrf- Genlokus, des Myrf-Minimalpromotors (myrf), der EKR9 und EKR11/12, sowie der Kontrollregionen des 5 (fl5)- und 3 (fl3)-flankierenden Bereichs und des benachbarten Dagla-Gens (dagla). Die ChIP-Experimente wurden mit einem Sox10-spezifischen Antikörper (α-sox10) und Prä-Immunserum (PI) durchgeführt. Das Chromatin stammte aus Rückenmark von 14 Tage alten Wildtypäusen (wt) oder entsprechenden Tieren mit Sox10- Defizienz im ZNS (ko). Mittels qpcr wurde der prozentuale Anteil der durch Chromatin Immunpräzipitation gewonnenen DNA an der Gesamtmenge der eingesetzten DNA bestimmt. Die Anreicherung ist als Mittelwert ± Standardfehler angegeben. Abbildung mit freundlicher Genehmigung von Franziska Fröb, entnommen und modifiziert aus (Hornig et al., 2013). Da durch ChIP-Analysen keine Aussagen darüber getroffen werden können, ob die Bindung von Sox10 an die EKR9 direkt oder indirekt erfolgt, wurden nachfolgend Gelretardierungsexperimente durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden radioaktiv markierte Oligonukleotide, welche die potentiellen Sox10-Bindestellen der EKR9 enthielten, mit Proteinextrakten inkubiert, in welchen Sox10 überexprimiert vorlag. Die Proben wurden anschließend im nativen Gel aufgetrennt. Die Oligonukleotid- Protein-Komplexe zeigen im Gelretardierungsexperiment spezifische Mobilität. Somit kann einerseits unterschieden werden, ob überhaupt Protein an die DNA gebunden hat, andererseits kann das unterschiedliche Laufverhalten Aufschluss darüber geben wie viele Proteine gebunden wurden. Die bereits bekannten Sox10-Bindestellen C/C` und B des Mpz-Promotors wurden als Positivkontrollen für dimere und monomere Bindung verwendet (Peirano et al., 2000). Obwohl für die EKR9 elf Bindestellen postuliert wurden, konnte Sox10 nur an zwei Oligonukleotide binden (Hornig et al., 2013). Diese umfassen die Binderegionen 3 und 4, wobei die Bindung von Sox10 an 50

61 Ergebnisse das Oligonukleotid 3 bevorzugt als Dimer erfolgte und an das Oligonukleotid 4 als Monomer (siehe Abbildung 18). Um zu überprüfen, ob die Bindestellen essentiell sind für die Sox10-Bindung, wurden sie in den Oligonukleotiden mutiert und erneut in Gelretardierungsexperimenten getestet. Es zeigte sich, dass im Oligonukleotid 3, welches drei potentielle Sox10-Bindestellen besitzt, die Mutation 3a keine Auswirkung auf die Bindung von Sox10 als Dimer ausübte. Die Mutationen 3b und 3c ließen jedoch keine Dimerbindung mehr zu, es wurde eine veränderte Bindungsaffinität vom Dimer zum Monomer festgestellt. Bei der doppelten Mutation 3bc fand gar keine Bindung mehr statt. Das Oligonukleotid 4, welches eine potentielle Sox10-Bindestelle besitzt, zeigte in der mutierten Variante 4a keine Bindung von Sox10. Demnach wurde für das Oligonukleotid 3 eine Bindung von zwei Sox10-Molekülen und für das Oligonukleotid 4 eine monomere Bindestelle für Sox10 nachgewiesen. 51

62 Ergebnisse Abbildung 18: Mutationen an den Sox10-Bindestellen beeinflussen das Bindungsverhalten von Sox10 (A) Die Gelretardierungsexperimente wurden ohne Zellextrakt (-), mit HEK293- Kontrollzellextrakt (c) und mit Zellextrakt von HEK293-Zellen durchgeführt, welche mit Expressionsplasmiden für Sox10 transfiziert wurden (Sox10). Sox10-Dimerkomplexe mit dem entsprechenden Oligonukleotid sind durch ein d und die Sox10-Monomerkomplexe mit dem entsprechenden Oligonukleotid sind durch ein m markiert. (B) Es sind die Sequenzen der Oligonukleotide 3 und 4 dargestellt. Bei den Mutanten 3a, 3b, 3c, 3bc und 4a sind die mutierten Nukleotide in Kleinbuchstaben dargestellt. Die potentiellen Sox10-Bindestellen sind mit schwarzen Balken über der Oligonukleotidsequenz dargestellt. Abbildung mit freundlicher Genehmigung von Franziska Fröb, entnommen und modifiziert aus Hornig et al. (2013). Der nächste Schritt war die Klärung, in wieweit die identifizierten Bindestellen für die Funktionalität der EKR9 relevant sind. Dazu wurde die Mutation 3bc, die Mutation 4a und ebenso eine Kombination der beiden, also eine Mutation der dimeren und monomeren Bindestelle (mt), in die EKR9 eingebracht. Mit diesen mutierten Enhancern wurden Luziferase-Aktivitätstests mit oligodendroglialen 33B-Zellen durchgeführt, wobei als Promotor vor dem Luziferasegen der potentielle Myrf- Promotor gewählt wurde (siehe Abbildung 19). Somit wurden die Versuchsbedingungen der Situation in vivo angepasst, um mit diesem Assay zu klären, ob die Luziferase unter der Kontrolle der ERK9 mit den unterschiedlichen Mutationen noch Aktivität zeigt und wie Sox10 diese beeinflussen kann. Durch die Mutation der dimeren oder monomeren Sox10-Bindestelle kam es zu einer 52

63 Ergebnisse Reduktion der Luziferase-Aktivität um etwa 50% (siehe Abbildung 19). Ungefähr ein Viertel der Luziferase-Aktivität vom Wildtyp konnte bei der kombinierten Mutation festgestellt werden. Weiter wurde neben dem EKR9-Konstrukt zusätzlich eine shrna gegen Sox10 transfiziert. Die Luziferase-Aktivitätstests zeigten, dass nicht nur die Wildtyp-EKR9 Sox10-sensitiv ist, sondern auch die beiden Mutanten 3bc und 4a (siehe Abbildung 19). Nur durch die Mutation mt, bei der alle funktionellen Sox10- Bindestellen mutiert waren, kam es zu einem vollständigen Verlust der Sensitivität für Sox10. Durch die Mutationsanalysen wurden somit die Sox10-Sensitivität und die Funktionalität der Sox10-Bindestellen bestätigt. Abbildung 19: Mutationen an den Sox10-Bindestellen reduzieren die Funktionalität und die Sox10-Sensitivität der EKR9 Es wurden transiente Transfektionen in 33B-Zellen mit EKR9-myrf-luc-Reporterplasmiden durchgeführt, wobei entweder die Wildtyp- (wt) oder die mutierte (3bc, 4a, mt) Version verwendet wurde. Zusätzlich wurde entweder leerer shrna-expressionsvektor (-) oder shsox10-expressionsvektor (shsox10) transfiziert. Die mutierte Version mt beinhaltet eine Kombination der Mutationen 3bc und 4a. Die Luziferaseaktivität in Extrakten von transfizierten Zellen wurde in drei unabhängigen Experimenten bestimmt, die jeweils in vierfacher Ausführung durchgeführt wurden. Die Aktivität des Wildtyp-Luziferasereportergens in Anwesenheit des leeren shrna-expressionsvektors wurde gleich 1 gesetzt. Die Luziferaseaktivität wurde relativ dazu berechnet und jeweils als Mittelwert ± Standardfehler angegeben. Abbildung mit freundlicher Genehmigung von Franziska Fröb, entnommen und modifiziert aus Hornig et al. (2013). 53

64 Ergebnisse Zusammenfassend wurde sowohl in vitro mittels Gelretardierungsexperimenten als auch in situ durch ChIP-Assay und ebenso in Zellkulturexperimenten anhand von Luziferase-Aktivitätstests Bindung von Sox10 an den Myrf-Enhancer EKR9 nachgewiesen. Daher sollte nun der Frage nach der Relevanz dieses Enhancers in vivo mittels Reportergenanalysen im murinen System nachgegangen werden. Da die EKR9 ein genregulatorisches Element des Myrf-Gens ist, sollte durch sie die Myrf-Expression in den Zellen aktiviert werden, in denen Myrf normalerweise exprimiert ist. Folglich ist dies in promyelinisierenden Oligodendrozyten zu erwarten. Um dies zu überprüfen wurden transgene Mauslinien mit der EKR9 und dem Reportergen lacz generiert. Hierzu wurde sowohl die Wildtyp-Variante des Enhancers als auch die mutierte Version mt verwendet. Die jeweilige Variante wurde in ein Plasmid zur Pronukleusinjektion kloniert, bei dem nach der EKR9 ein Hsp68- Minimalpromotor und ein lacz-reportergen lokalisiert waren (siehe Abbildung 20). Abbildung 20: Schema der Transgenkonstrukte zur Pronukleusinjektion Schematische Darstellung der Konstrukte, die von EKR9 entweder die Wildtyp- (EKR9wt- LacZ) oder die mutierte (EKR9mt-LacZ) Version tragen. Sie beinhalten zusätzlich den Hsp68-Minimalpromotor (hsp68), das Reportergen lacz (lacz) und das SV40 PolyA Signal (pa). Diese Konstrukte wurden von Frau Dr. Irm Hermans-Borgmeyer aus Hamburg und Herrn Dr. Dieter Engelkamp aus Erlangen für die Generierung von transgenen Mäusen mittels Vorkerninjektion verwendet. Insgesamt konnten für die Wildtyp-EKR9 acht transgene Mäuse generiert werden, welche am postnatalen Tag 7 untersucht wurden. Dazu wurden transversale Gefrierschnitte des Rückenmarks hergestellt und die lacz-expression durch X-Gal- Färbung analysiert. Bei fünf von acht Tieren konnte die Expression des lacz- Transgens nachgewiesen werden, wobei sich die Transgenexpression in ihrer Stärke und dem jeweiligen Ort der Expression unterschieden (siehe Tabelle 1). Alle Tiere zeigten eine Aktivierung des Reportergens in Oligodendrozyten (siehe Tabelle 1 und Abbildung 21). Bei vier Mäusen konnte zusätzlich die Expression des Transgens in 54

65 Ergebnisse einigen Neuronen des Rückenmarks detektiert werden. Auch in Gliazellen des peripheren Nervensystems konnte eine lacz-expression bei vier Tieren nachgewiesen werden und bei einer Maus zusätzlich Expression im Knorpelgewebe, wobei Myrf in diesen Zelltypen normalerweise nicht vorkommt (Emery et al., 2009). Oligodendrozyten Innerhalb des ZNS Astrozyten Neuronen Außerhalb des ZNS EKR9wt-lacZ # PNS Glia # PNS Glia # # # # PNS Glia # PNS Glia, Knorpel # EKR9mt-lacZ # Knorpel # Knorpel # Knorpel # Knorpel # Knorpel Tabelle 1: Übersicht des lacz-expressionsmusters der EKR9wt-lacZ- und EKR9mtlacZ-transgenen Mäuse Eine tabellarische Zusammenstellung des lacz-expressionsmusters der EKR9wt-lacZ- und EKR9mt-lacZ-transgenen Mäuse. Die Analyse erfolgte durch X-Gal-Färbungen und immunhistochemische Färbungen auf transversalen Gefrierschnitten des Rückenmarks an P7. + bedeutet, dass eine Expression detektiert wurde; - bedeutet, dass keine Expression detektiert wurde. Weiterführende Analysen zeigten, dass die Expression in den Oligodendrozyten bei allen Tieren auf differenzierende Zellen begrenzt war. Dies ist in Abbildung 21 A beispielhaft für ein transgenes Tier gezeigt. Dort erkennt man, dass sich die meisten X-Gal gefärbten Zellen des ZNS in der weißen Substanz des Rückenmarks befinden. Diese Aussage wurde auch mittels immunhistochemischer Färbungen bestätigt. β-galaktosidase war mit den Oligodendrozytenmarkern Sox10 und Olig2 und ebenso 55

66 Ergebnisse mit Myrf kolokalisiert (siehe Abbildung 21 C, D, E). Dagegen konnte man keine Überlappung der β-galaktosidase mit dem OLZV-Marker Pdgfra und dem Astrozytenmarker Gfap (glial fibrillary acidic protein) feststellen (siehe Abbildung 21 F, G). Im Rückenmark des gezeigten Tieres (#1) konnte auch keine Kolokalisation der β-galaktosidase mit dem neuronalen Marker NeuN festgestellt werden (siehe Abbildung 21 H). Somit wurde durch die Analyse transgener Mäuse gezeigt, dass der Enhancer EKR9 in vivo in differenzierenden Oligodendrozyten aktiv ist. Es wurden zusätzlich fünf transgene Mäuse generiert, bei welchen das lacz- Reportergen unter der Kontrolle der mutierten EKR9 stand (siehe Abbildung 20). Bei keinem dieser Tiere konnte eine Expression des EKR9mt-lacZ Transgens in Oligodendrozyten nachgewiesen werden (siehe Tabelle 1 und Abbildung 21 B). Es wurden nur ektope Expressionsorte detektiert, Neurone im Rückenmark und Knorpelgewebe, ebenso wie es bei transgenen Tieren mit der Wildtyp-EKR9 schon festgestellt worden war. Zusammenfassend legten die Ergebnisse somit dar, dass Sox10 die Expression von Myrf über die EKR9 aktivierte. 56

67 Ergebnisse Abbildung 21: EKR9 ist ein Oligodendrozyten-spezifischer Enhancer (A-B) Das LacZ-Expressionmuster wurde mittels X-Gal-Färbung auf transversalen Rückenmarksschnitten an P7 bei EKR9wt-lacZ-(Tier #1) (A) und EKR9mt-lacZ-(Tier #2) (B) transgenen Mäusen nachgewiesen. Der Messbalken entspricht 200 µm. (G-H) Die Ko- Immunhistochemie wurde auf transversalen Gewebsschnitten des Rückenmarks von Tier #1 mit Transgen EKR9wt-lacZ durchgeführt, indem Antikörper gegen β-galaktosidase (rot) in Kombination mit verschiedenen Antikörpern (grün) verwendet wurden. Dies waren Antikörper gegen die Oligodendrozytenmarker Sox10 (C) und Olig2 (D), gegen den Marker für postmitotische OL Myrf (E), gegen den OLVZ-Marker Pdgfra (F), den Astrozytenmarker Gfap (G) und neuronalen Marker NeuN (H). Gezeigt sind jeweils Zellen aus dem dorsalen Funikulus (C-G) und der ventralen grauen Substanz (H). Der Messbalken entspricht 10 µm. 57

68 Ergebnisse 3.4 Analyse der Interaktion von Myrf mit Sox10 Nachdem gezeigt wurde, dass der Myrf-Enhancer EKR9 direkt durch Sox10 aktiviert wird, sollte in einem nächsten Schritt eine potentielle Interaktion von Myrf und Sox10 genauer untersucht werden. Denn Sox10 induziert häufig Faktoren, mit denen es dann interagiert, wie beispielsweise die beiden Regulatoren der Schwann-Zell- Entwicklung im PNS Oct6 oder Krox20 (Ghislain and Charnay, 2006; Ghislain et al., 2002; Jagalur et al., 2011; Reiprich et al., 2010; Schreiner et al., 2007; Topilko et al., 1994). Yeast 2 Hybrid Analysen gaben erste Hinweise auf eine potentielle Interaktion der Proteine Sox10 und Myrf (Kosian, 2007), die beide essentiell für die terminale Differenzierung von Oligodendrozyten und die Myelinisierung sind (Emery et al., 2009; Koenning et al., 2012; Stolt et al., 2004; Stolt et al., 2002). Daher wäre es möglich, dass sie bei diesen Prozessen zusammen agieren, sobald Sox10 Myrf induziert hat. Um dies zu überprüfen, wurden zunächst Immunpräzipitationen aus einem Zellextrakt der oligodendrozytären OLN93-Zelllinie mit einem Antiserum gegen Sox10 und mit Prä-Immunserum durchgeführt. Dabei wurde Sox10 unter Verwendung des spezifischen Antikörpers präzipitiert (siehe Abbildung 22 A). Im Präzipitat wurde Myrf mit einem Antikörper, der gegen den C-Terminus des Myrf- Proteins gerichtet ist, detektiert. Dies war bei Verwendung des Prä-Immunserums für keines der beiden Proteine möglich. Hiermit erfolgte ein erster Nachweis der Interaktion von Sox10 und Myrf. Um dieses Ergebnis zu bestätigen und um herauszufinden welche Regionen der beiden Proteine miteinander wechselwirken, wurden GST-pull down Experimente durchgeführt. Zur Vorbereitung wurden verschiedene myc-markierte Fragmente des Myrf-Proteins erzeugt (siehe Abbildung 22 B). Zellextrakte wurden aus HEK293- Zellen hergestellt, in denen diese verschiedenen Peptide überexprimiert wurden. Ebenso wurden GST-Fusionsproteine mit konservierten Domänen von Sox10, der Dimerisierungs- und HMG-Domäne (Dim/HMG), der K2-Domäne und der C- terminalen Transaktivierungsdomäne (TA) bakteriell exprimiert. Diese GST-Sox10- Fusionsproteine wurden mittels Glutathion beschichteten Sepharoseküglchen aufgereinigt, mit den verschiedenen Fragmenten inkubiert und anschließend präzipitiert. Die Ergebnisse der GST-pull down Experimente zeigten, dass zum einen nur das Dim/HMG-Fusionsprotein mit Myrf interagierte und zum anderen, dass von 58

69 Ergebnisse den Myrf-Fragmenten nur der C-terminale Bereich an der Interaktion mit Sox10 beteiligt war (siehe Abbildung 22 C). Dieser interagierende Bereich konnte auf die Aminosäuren 960 bis 1049 eingegrenzt werden. Die Interaktionsstudien zeigten, dass beide Proteine physiologisch miteinander interagieren konnten. Abbildung 22: Sox10 interagiert physiologisch mit Myrf über die Sox10-Dim/HMG- Domäne und dem C-Terminus von Myrf A Es wurden Ko-Immunpräzipitationen (IP) von endogenem Myrf aus OLN93-Zellextrakten mit Antiserum gegen Sox10 (αsox10) oder Prä-Immunserum (PI) durchgeführt. In der oberen Zeile wurde Sox10 im Präzipitat mittels Western Blot (WB) detektiert, in der unteren Zeile Myrf, mit einem spezifischen Antikörper gegen den C-Terminus des Proteins. Als Kontrolle wurde 1/10 des eingesetzten Extrakts verwendet (Input). B zeigt die schematische Darstellung der von Emery et al. (2009) identifizierten Myrf-Isoform mit der NCBI accession number Q3UR85.2 (oberer Balken) und der untere Balken zeigt die in dieser Arbeit verwendeten Variante (NCBI accession number AAI ). Die DNA-Bindedomäne ist jeweils grau markiert. Darunter sind die verschiedenen Myrf-Fragmente dargestellt, die in den Interaktionsstudien verwendet wurden. Die angegebenen Zahlen repräsentieren die Positionen der Aminosäuren. C Es wurden GST-pull down Experimente mit bakteriell überexprimierten GST-Sox10-Fusionsproteinen und myc-markierten überexprimierten Myrf- Fragmenten in HEK293-Zellextrakten durchgeführt. Die verwendeten Sox10-Domänen, die an GST gekoppelt wurden, waren die Dimerisierungs- und HMG-Domäne (Dim/HMG), die K2-Domäne und die C-terminale Transaktivierungsdomäne (TA). Die Myrf-Fragmente wurden durch Western Blot mit einem gegen das myc-epitop gerichteten Antikörper nachgewiesen. Als Kontrolle wurde 1/10 des eingesetzten Extrakts verwendet (Input). Abbildung mit freundlicher Genehmigung von Michael Vogl, entnommen aus Hornig et al. (2013). 59

70 Ergebnisse Aufgrund dieser Erkenntnisse lag die Fragestellung nahe, ob Myrf und Sox10 auch funktionell miteinander interagieren. Um dies zu überprüfen, wurden transiente Transfektionen in N2a Neuroblastomzellen mit anschließenden Luziferase- Aktivitätstests durchgeführt. Hierbei wurden Reporterplasmide verwendet, bei denen das Luziferasegen durch regulatorische Sequenzen von Genen gesteuert wurde, die in differenzierenden Oligodendrozyten exprimiert werden. Dies waren der Cx47 (Connexin-47) 1b-Promotor, der Cx32 (Connexin-32) P2-Promotor, der Mag- Promotor, der WmN1 Enhancer aus dem Intron 1 des Plp Gens, eine 3 kb große Sequenz stromaufwärts des Mbp Gens und eine evolutionär konservierte Sequenz 17 kb stromaufwärts des Mbp Gens (Bondurand et al., 2001; Bujalka et al., 2013; Schlierf et al., 2006; Srinivasan et al., 2012; Tuason et al., 2008). In den verwendeten N2a-Zellen liegt keine endogene Expression von Sox10 und Myrf vor. Deshalb wurden die offenen Leserrahmen der beiden Gene mit Expressionsplasmiden in die Zellen transfiziert. Bei allen regulatorischen Sequenzen konnte eine starke Aktivierung der Luziferaseaktivität gemessen werden, sobald Sox10 kotransfiziert wurde. Wurde hingegen Myrf kotransfiziert, so ließen sich nur schwache bis keine Effekte erkennen. Jedoch führte die kombinierte Kotransfektion von Sox10 und Myrf zu einem starken Synergismus, der durch einen sehr starken Anstieg der Luziferaseaktivität mit dem Cx47 1b-, Cx32 P2- und dem Mag-Promotor deutlich wurde (siehe Abbildung 23 A-C). Dagegen zeigten der Plp WmN1 Enhancer und die 3 kb stromaufwärts des Mbp Gens liegende regulatorische Sequenz bei Überexpression von Sox10 und Myrf keine synergistische Aktivierung (siehe Abbildung 23 D, E). Jedoch konnte mit der 17 kb stromaufwärts von Mbp liegenden Sequenz bei einer Kotransfektion von Sox10 und Myrf ein sehr deutlicher Anstieg der Luziferaseaktivität gemessen werden (siehe Abbildung 23 F). In diesem Fall lag also ein Synergismus vor. Dies bedeutet, dass das Mbp Gen durch diese Region von Sox10 und Myrf gemeinsam reguliert wird. Ob das Plp-Gen nicht zusammen von Sox10 und Myrf reguliert wird, kann man aus den vorliegenden Daten nicht schlussfolgern, da die beiden Transkriptionsfaktoren auch durch andere regulatorische Sequenzen die Expression des Gens steuern könnten. Die Luziferase-Aktivitätstests konnten somit zeigen, dass Sox10 und Myrf gemeinsam Myelingene aktivieren, die in Oligodendrozyten exprimiert sind. Um diese Spezifität genauer zu überprüfen, wurden auch Schwann-Zell spezifische regulatorische Sequenzen untersucht. Zum einen wurde der Mpz-Promotor 60

71 Ergebnisse untersucht, zum anderen der Enhancer MSE des Krox20-Gens (Ghislain and Charnay, 2006; Peirano et al., 2000). Die Luziferase-Aktivitätstests zeigten für beide ähnliche Ergebnisse. Bei einer Kotransfektion mit Myrf wurde eine Reduktion der Aktivität festgestellt und bei der Kontransfektion von Myrf und Sox10 wurde die Sox10-bedingte Aktivierung gehemmt (siehe Abbildung 23 G, H). Eine naheliegende Schlussfolgerung hieraus war, dass Myrf die Expression von Schwann-Zell-Genen in Oligodendrozyten aktiv hemmen könnte. Insgesamt kann man zusammenfassen, dass die beiden Transkriptionsfaktoren Sox10 und Myrf physiologisch und funktionell miteinander interagieren und gemeinsam oligodendrozytenspezifische Genexpression aktivieren konnten. 61

72 Ergebnisse Abbildung 23: Sox10 and Myrf interagieren funktionell in N2a-Zellen Es wurden transiente Transfektionen in N2a-Zellen mit dem Luziferasereportergen unter der Kontrolle des Cx-47 1b- (A), des Cx-32 P2- (B), und des Mag- (C) Promotors, sowie des Enhancers WmN1 des Plp-Gens (D), der 3 kb stromaufwärts liegenden Sequenz des Mbp- Gens (E), einer konservierten Region 17 kb stromaufwärts des Mbp-Gens (F), des Mpz- Promotors (G) und des Enhancers MSE des Krox20-Gens durchgeführt. Zusätzlich wurden, wie unter den Balken angezeigt, Expressionsplasmide für Sox10 und Myrf oder leeres Expressionsplasmid (-) kotransfiziert. Die Luziferaseaktivität in Extrakten von transfizierten Zellen wurde in mindestens vier unabhängigen Experimenten bestimmt, die jeweils in Triplikaten durchgeführt wurden. Die Aktivität des Luziferasereportergens ohne ektopische Transkriptionsfaktoren wurde gleich 1 gesetzt. Die Induktion in Gegenwart der Transkriptionsfaktoren wurde relativ dazu berechnet und jeweils als Mittelwert ± Standardfehler angegeben. 62

73 Ergebnisse 3.5 Herstellung von α-myrf-antikörpern Generierung von Epitopen Erste Untersuchungen in der Arbeitsgruppe mittels Yeast 2 Hybrid Analysen hatten Hinweise erbracht, dass Myrf ein potentieller Interaktionspartner von Sox10 ist (Kosian, 2007). Eine weitere Studie beschrieb Myrf als wichtigen Regulator von Myelingenen (Emery et al., 2009). Jedoch war zu Beginn dieser Arbeit kein kommerzieller α-myrf-antikörper verfügbar, somit war ein Ziel dieser Arbeit, einen funktionellen Antikörper gegen Myrf zu generieren, um dieses Protein besser charakterisieren zu können. Für die Herstellung spezifischer Antikörper erfolgte zunächst eine Überprüfung der Aminosäuresequenz von Myrf auf geeignete Epitopsequenzen. Dazu wurde mit Hilfe des NCBI Conserved Domain Search ( die Aminosäuresequenz von Myrf auf konservierte Domänen überprüft, um diese als potentielle spezifische Regionen auszuschließen. Die Analyse zeigte eine DNA-Bindedomäne der NDT80_PhoG-Superfamilie als einen konservierten Bereich (siehe Abbildung 24). Des Weiteren musste bei der Auswahl der Epitope beachtet werden, dass für Myrf drei verschiedene Isoformen bekannt sind. Demzufolge sollte ein potentielles Epitop alle drei Varianten des Proteins repräsentieren. Aufgrund der Erfahrungen der Arbeitsgruppe bei der Herstellung von Antikörpern wurde sowohl eine Sequenz am amino (N)-termialen als auch am carboxy (C)-terminalen Bereich des Proteins ausgewählt. Somit wurden für das Epitop des N-terminalen Bereichs die Aminosäuren 1-45 und ausgewählt und für den C-Terminus die Aminosäuren (jeweils bezogen auf die NCBI accession number Q3UR85.2) (siehe Abbildung 24). 63

74 Ergebnisse Abbildung 24: Schematische Darstellung von Myrf und den ausgewählten Epitopen Der obere Balken entspricht der von Emery et al. (2009) identifizierten Isoform mit der NCBI accession number Q3UR85.2, der mittlere Balken der in dieser Arbeit verwendeten Variante (NCBI accession number AAI ). Die DNA-Bindedomäne ist jeweils grau markiert. Die für die Epitope ausgewählten Aminosäuren sind als schwarze Balken gekennzeichnet. Die angegebenen Zahlen repräsentieren die Positionen der Aminosäuren. Die beiden ausgewählten Bereiche wurden mittels PCR amplifiziert und hinter den 6- fachen His-tag des pet28-vektors kloniert. Anschließend wurde die Expression beider Fragmente in BL21 und Rosetta plyss Bakterien überprüft, da erfahrungsgemäß beide Stämme verschiedene pet28-konstrukte unterschiedlich stark exprimieren. Für den N-terminalen Bereich wurden die BL21 Bakterien und für den C-terminalen die Rosetta plyss Bakterien als geeigneter Stamm zur Überexpression der gewünschten Peptide ausgewählt. Anschließend erfolgte eine His-Epitop-abhängige Aufreinigung der überexprimierten Peptide mittels Nickel- Kügelchen. Nach der Elution der aufgereinigten Peptide wurde die Effizienz der Elutionen mittels Coomassiegel überprüft (siehe Abbildung 25 A und B). Mit den aufgereinigten Peptiden erfolgte die Immunisierung von jeweils zwei Kaninchen und zwei Meerschweinchen durch die Firma Pineda Antikörper-Service (Berlin) Charakterisierung der α-myrf Antikörper Im Verlauf des Immunisierungsprotokolls konnten sowohl für den N-terminalen als auch für den C-terminalen Teil von Myrf Antikörper aus Kaninchen und aus Meerschweinchen gewonnen werden. Sie wurden sowohl biochemisch mittels Western Blot als auch histologisch durch immunhistochemische Färbungen getestet. Eine Übersicht der Analysen ist in Tabelle 2 wiedergegeben: 64

75 Ergebnisse Antikörper Funktional für Western Blot Funktional für Immunhistochemie α-n-gm98 rb1,1 + + α-n-gm98 rb1,2 + + α-n-gm98 rb2 Nicht getestet + α-n-gm98 gp1 Nicht getestet + α-n-gm98 gp2 + + α-c-gm98 rb1,7 + - α-c-gm98 rb1,13 Nicht getestet - α-c-gm98 rb2 + - α-c-gm98 gp1 + - α-c-gm98 gp2, Tabelle 2: Übersicht der generierten Antikörper und deren Funktionalität Tabellarische Zusammenstellung der generierten Antikörper gegen den aminoterminalen (N), bzw. den carboxyterminalen (C) Teil von Myrf (GM98), gewonnen aus Kaninchen (rb) oder Meerschweinchen (gp). + : Der Antikörper kann das Antigen detektieren; - : Der Antikörper kann das Antigen nicht detektieren. Bei der biochemischen Charakterisierung der α-myrf-antikörper wurden die generierten Antikörper auf ihre Funktionalität mittels Western Blot analysiert. Dazu wurden Zellextrakte aus HEK293-Zellen hergestellt, in denen Myrf überexprimiert wurde. Die Detektion war für alle getesteten Myrf Antikörper erfolgreich (siehe Tabelle 2), wobei jedoch nicht die erwartete Bandenhöhe von ~ 114 kda detektiert werden konnte. Vielmehr detektierten alle N-terminalen Antikörper eine Bande von ~ 45 kda und alle C-terminalen Antikörper eine Bande von ~ 60 kda (siehe Abbildung 25 D, exemplarisch ist die Detektion mit jeweils einem N- und einem C- terminalen Antikörper gezeigt). Dies deutete darauf hin, dass das Myrf-Protein gespalten wurde, da die Summe der Bandengrößen 45 kda und 60 kda eine Größe 65

76 Ergebnisse von 104 kda und damit ungefähr die theoretisch erwartete Größe von 114 kda ergab. Um dies weiter zu überprüfen, wurde Zellextrakt aus der Rattenzelllinie OLN93 hergestellt. Damit wurde durch Western Blot mit dem α-n-gm98 rb1, 1 Antikörper das Myrf-Protein nachgewiesen. Es zeigten sich drei prominente Banden, wobei zwei davon ähnliche Größen aufwiesen, wie die mit HEK293-Zellextrakten detektierten Banden von ~ 45 kda und von ~ 60 kda. Die dritte Bande zeigte eine Größe von ~ 70 kda (siehe Abbildung 25 E). Da die Zellextrakte aus einer oligodendroglialen Zelllinie stammten, die Mbp, Plp und Mag exprimiert (Richter-Landsberg and Heinrich, 1996), war es naheliegend, dass Myrf als wichtiger Regulator dieser Myelingene auch in Zellextrakten ohne Überexpression detektierbar war. Da jedoch drei Banden nachweisbar waren, zeigte dies, dass das Protein wohl nicht nur gespalten, sondern auch anderweitig posttranslational modifiziert wurde. Eventuelle posttranslationale Modifikationen wurden im Rahmen dieser Arbeit nicht weiter untersucht. Ein weiterer Punkt bei der Analyse der Antikörper war die Untersuchung der Spezifität der Antikörper. Dazu wurden die überexprimierten, aufgereinigten Peptide, die entweder der Sequenz für das N-terminale oder für das C-terminale Epitop von Myrf entsprachen, durch SDS-PAGE aufgetrennt und Western Blot durchgeführt. Dabei erkannte der α-n-gm98 rb1, 1 Antikörper spezifisch nur das N-terminale Peptid und nicht das C-terminale und genauso umgekehrt erkannte der α-c-gm98 rb1,7 Antikörper nur das C-terminale und nicht das N-terminale Antigen (siehe Abbildung 25 C). Somit konnte dargestellt werden, dass die getesteten Antikörper für Western Blot Analysen spezifische Funktionalität aufwiesen, wenn auch die detektierten Banden nicht den erwarteten Größen entsprachen. 66

77 Ergebnisse Abbildung 25: Kontrolle der eluierten Antigene und Western Blots zur Charakterisierung der generierten Myrf-Antikörper Mit Coomassieblau gefärbtes SDS-Gel, beladen mit den Eluaten E1-E4 des N-terminalen (A) und des C-terminalen (B) Peptids (Antigens) zur Herstellung der α-myrf-antikörper. (C) Der α-n- und α-c-gm98 Antikörper wurden mittels Western Blot mit den dialysierten N- und C- terminalen Antigenen auf seine Spezifität überprüft. (D) Westernblot mit HEK293 Zellextrakten mit (+) oder ohne (-) überexprimiertem Myrf. (E) Western Blot mit OLN93 Zellextrakten. Alle Banden wurden detektiert mit den Antikörpern α-n-gm98 rb1,1 bzw. α-c- GM98 rb1,7. Im Rahmen der Funktionalitätsprüfung der Antikörper wurden ebenso immunhistochemische Färbungen auf murinen, transversalen Rückenmarksschnitten durchgeführt. Dabei war nur mit den Antikörpern, die gegen den N-terminalen Teil des Proteins gerichtet waren, ein spezifisches Signal zu detektieren (siehe Tabelle 2). Es wurden in der weißen Substanz des Rückenmarks Myrf-positive Zellen 67

78 Ergebnisse detektiert, die im Verlauf der ersten Wochen nach der Geburt stark zunahmen (siehe exemplarisch die Detektion mit dem α-n-gm98 rb1, 1 Antikörper in Abbildung 12 A- C). Es konnte für alle N-terminalen Antikörper eine Funktionalität auf murinen Gewebsschnitten nachgewiesen werden. Die Spezifität der Antikörper wurde in verschiedenen ko-immunhistochemischen Färbungen überprüft. Da Myrf in postmitotischen Oligodendrozyten exprimiert wird (Emery et al., 2009), sollten die Antikörper keine Kolokalisation mit einem Marker für OLZV aufweisen. Daher wurden Kofärbungen von Myrf mit Pdgfra auf Rückenmark von Wildtyptieren durchgeführt, bei denen aber keine Überlappung mit Pdgfra festgestellt werden konnte (siehe Abbildung 26 A, B, exemplarisch ist nur die Detektion mit dem α-n-gm98 gp2 Antikörper gezeigt). Jedoch zeigten sich Überlagerungen von Myrf-Signal mit dem des Oligodendrozyenmarkers Sox10, wobei nicht alle Sox10-positiven Zellen mit Myrfpositiven Zellen überlappend gefärbt waren (siehe Abbildung 26 C, D, exemplarisch ist nur der α-n-gm98 rb1, 1 Antikörper gezeigt). Dies zeigte ebenfalls die Spezifität des Antikörpers, da Sox10 auch in OLVZ exprimiert wird und nicht ausschließlich in postmitotischen Zellen. Somit färbten die Antikörper keine OLVZ, sondern spezifisch postmitotische Oligodendrozyten. Zusammenfassend konnten somit im Rahmen dieser Promotionsarbeit Antikörper gegen Myrf hergestellt werden, die alle Funktionalität für Western Blot Analysen aufwiesen und von denen die gegen den N-Terminus gerichteten Antikörper zusätzlich in histologische Untersuchungen funktionsfähig waren. 68

79 Ergebnisse Abbildung 26: Koimmunhistochemische Färbungen von Myrf mit Pdgfra bzw. Sox10 Immunhistochemische Färbungen wurden auf transversalen Gefrierschnitten des Rückenmarks von Wildtyptieren an P7 mit Antikörpern gegen Myrf (rot) und Pdgfra bzw. Sox10 (grün) durchgeführt. Gezeigt ist eine Vergrößerung aus dem ventralen Rückenmarkshorn. Der Messbalken entspricht 50 µm. 69