Evolutionäre Verfahren 3 : Yeast Two Hybrid System. Biochemiepraktikum II WS 2007/ Januar Februar 2008

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1 Evolutionäre Verfahren 3 : Yeast Two Hybrid System Biochemiepraktikum II WS 2007/ Januar Februar 2008 AG Bernd Groner Corina Heinz Astrid Weiß

2 Protein-Protein Interaktionen Protein-Protein Interaktionen sind die Basis von vielen wichtigen zelluläre Prozessen z.b. Signaltransduktion Apoptose Langlebige Interaktionen (Zytoskelett) Transiente Interaktionen (Kinasen, Proteasen) Veränderungen von Protein-Protein- Interaktionen können zu Krankheiten führen z.b. HPV16 Proteine (p53 wird degradiert) Neue therapeutische Ansätze Inhibitorische Peptide mittels YTH-System z.b. gegen Stat3 und Survivin (Überexpression in vielen Tumoren)

3 Analyse von Protein-Protein Interaktionen Identifizierung => Charakterisierung => Manipulation In vitro Methoden: (Co-)Immunpräzipitation Affinitätschromatographie Cross-linking Protein-probing Phage-display zwei interagierenden Proteinen im Lysat potentieller Interaktionspartner ist immobilisiert chemische Verknüpfung von Partnern markiertes Protein beweist eine Bindung Suche nach Partner in einer Bibliothek In vivo Methoden: Fluorescence energy transfer (FRET) Hefe-Zwei-Hybrid Reverse-Zwei-Hybrid-System Hefe-Tribrid-System (Dual-Bait-System)

4 Yeast-Two-Hybrid : Das Prinzip I Transkriptionsfaktoren haben eine DNA-Bindedomäne (DBD) und eine Transaktivierungsdomäne (AD), die von einander getrennt werden können. Co-Aktivatoren, HAT, RNA-Pol II GAL4- Transkriptionsfaktor Gal4-Zielgen Fields & Song (1989): Die DBD und AD müssen nicht in einem Protein vorliegen, sondern können auch nach indirekter Assoziierung die Transkription aktivieren.

5 Yeast-Two-Hybrid : Das Prinzip II Transkriptionsrepressoren haben zwar eine DNA-Bindedomäne (DBD) aber keine Transaktivierungsdomäne (AD). Sie unterdrücken die Transkription. { } GAL80 Repressor Gal4-Zielgen AD {+} BD GAL4/GAL80- Fusion Gal4-Zielgen Ma & Ptashne (1988): Die AD von GAL4 kann mit der DBD von GAL80 fusioniert werden. In dem Fall ist GAL80 kein Repressor sondern ein Aktivator. D.h. die AD bestimmt, ob es sich um einen Aktivator oder einen Repressor handelt.

6 Yeast-Two-Hybrid : Das Prinzip III Gal4 AD Protein 2 L W Gal4 DBD Protein 1 His3 Ade2 Gal4 RE Selektionsmarker Wichtig: S. cerevisiae Stämme fehlern wesentliche Enzyme für die Synthese von den Aminosäuren Leu, Trp, His und Ade Grundlage bilden zwei Vektoren, die für das Protein1 und 2 (bilden zusammen den Gal4-Transkriptionsfaktor) Transformation ermöglicht Wachstum auf Leu- und Trp-Mangelmedium Expression der Enzyme für die Synthese von His und Ade steht unter der Kontrolle der Gal4 response elements (RE)

7 Yeast-Two-Hybrid : Hefe Genotyp: MATa, his3 200, trp1-901, leu2-3,112, ura3-52, gal4, gal80, ade-2, LYS2::(GAL1 UAS )-HIS3, LEU2::(GAL2 UAS )-ADE2, URA3::(GAL1 UAS )-LacZ Deletion Modifikation MATa oder α (mating type) His-3: Ade-2: Ura-3: LacZ: IGP-dehydratase, ist an der Biosynthese von Histidin beteiligt Phosphoribosylamino-imidazole-carboxylase ist an der Biosynthese von Adenin beteiligt Orotidine-5 -phosphat decarboxylase, die an der Biosynthese der Pyrimidinbase Uracil beteiligt ist Kann verwendet werden, um die Interaktion im ß-Gal Test nachzuweisen

8 Yeast-Two-Hybrid : Arbeitsablauf Konstruktion vom DBD-Protein1-Vektor: Bait (Köder) Konstruktion vom AD-Protein2-Vektor: Prey (Beute) Transformation in Hefe Selektion von Hefe-Transformanten auf Selektionsmedium Zurück-Isolation des Protein2-Plasmids Sequenzierung Charakterisierung der Interaktion

9 Yeast-Two-Hybrid : Der DBD-Vektor Nach der DBD-Protein1-Konstruktion: 1. Transformation in Hefen 2. Überprüfen, ob das Fragment als Fusionsprotein exprimiert wird 3. Sicherstellen, daß das Fragment nicht von sich aus schon als Aktivierungsdomäne fungiert Hier: Survivin als Protein 1

10 Yeast-Two-Hybrid : Der DBD-Vektor Überprüfen, ob das Potein1 als Fusionsprotein mit Gal4-DBD exprimiert wird. Expressionsplasmid: DBD-Protein1 mit c-myc epitope tag (pgbkt7) Expression von Gal4-DBD-cMyc-Survivin im Hefestamm AH 109 S. cerevisiae OD 600 0,680 OD 600 0,468 OD 600 0,669 OD 600 0,445 OD 600 0, kda Survivin 50 kda α-tubulin NK Surv Klon1 Surv Klon2 Erfolgreiche Expression des Köderproteins in den Hefen

11 Yeast-Two-Hybrid : Der DBD-Vektor A B C D E lag-phase Beschleunigungsphase exponentielles Wachstum (log) limitiertes Wachstum stationäre Phase

12 Yeast-Two-Hybrid : Der DBD-Vektor Sicherstellen, daß das DBD-Fragment nicht von sich aus schon als AD fungiert.? His Gal4-Zielgen pgbk_gal4 DBD Survivin 1 DD BIR DD coiled coil Bir1 DBD-Vektor: Trp AD-Vektor: Leu Interaktion: Trp, Leu, His -Trp -Trp/-His Gal4-DBD + Bir2 Birc SCC Surv 0 10x 100x 1000x Verdünnungen 0 10x 100x 1000x Verdünnungen

13 Yeast-Two-Hybrid : Die AD-Vektoren (Beute) Prey: 1. Ein zweites bekanntes Protein, oder ein Fragment dieses Proteins Gal4-AD Protein2 * Subdomäne 2. cdna Bank Gal4-AD cdna 3. Peptid Bank integriert in einem Gerüstprotein Gal4-AD Peptid Gerüst Alle Vektoren haben einen ADH1 Promoter: hohe Expression in der frühen Log-Phase.

14 Yeast-Two-Hybrid : Transformation Doppeltes Mangelmedium Interaktion: dreifaches Mangelmedium

15 Yeast-Two-Hybrid : Kommerzielle Vektoren

16 Yeast-Two-Hybrid : Reporter I Hefegene: Deletionen: TATA-Box (transkriptionellen Startpunkt) Upstream Activating Sequences (cis-elemente) endogene Gene für GAL4, GAL80, LEU2, TRP1, HIS3, ADE2 Interaktionsstärke: GAL1-4xUAS TAF TF TF GAL1-TATA His-3 schwach TF TAF TF Ade-2 stark GAL2-2xUAS GAL2-TATA Promotor

17 Yeast-Two-Hybrid : Reporter II ß-Galactosidase Substrat oder TF TAF TF α-galactosidase Farbe GAL2-UAS GAL2-TATA LacZ oder Mel1 Gal-Assays Methode Substrat Produkt Detektion Aus Flüssigkulturen Zellen lysieren Zugabe von ONPG o-nitrophenol (gelb) Photometer (420 nm) Zellen lysieren Zugabe von CPRG Chlorophenolrot Photometer (578 nm) Medium abnehmen Zugabe von PNP-αGal p-nitrophenol Photometer (410 nm) Auf Platte Kolonien auf Filter- Papier transferrieren und lysieren Filter auf X-Gal Blaues Präzipitat Blaue Kolonien Hefe umstreichen X-α-Gal in Platte Blaues Präzipitat Blaue Kolonien

18 Übersicht : cdna-screen DBD Gal4 gene Bait cdna for protein (bait) to be tested for ability to interact with other proteins is fused to DBD Bait DBD Express the library of hybrid cdnas in cells Activation domain fused to many cdnas Test for the ability to activate expression of LacZ Bait DBD Gal1 lacz Gal1 lacz Gal1 lacz

19 Plasmid-Rescue Hefe Gal1 His3 Gesamt DNA Isolation Bait Vektor: Amp R Prey-Vektor: Kan R Transformation in E. coli LB-Amp LB-Kan

20 Nachprüfung der Interaktion : Mating-Assay Mat a Mat α Umstreichen

21 Variationen : Reverse-Yeast-Two-Hybrid System Zur Identifizierung von Molekülen/Proteinen/Mutationen, die eine Interaktion stören AD TetR His-3 LexA operator Tet operator AD TetR His-3 LexA operator Tet operator

22 Variationen : Reverse-Yeast-Two-Hybrid System Zur Identifizierung von Molekülen/Proteinen/Mutationen, die eine Interaktion stören DB LexA operator AD Ura-3 + FOA (Fluoroorotsäure) Fluoro-Uracil = Death AD + FOA DB LexA operator Ura-3 = Life Fluoro-Uracil: Antimetabolit, wird statt Uracil in RNA eingebaut (Cytosin / Thymin in DNA)

23 Übersicht : Systeme und cdna-banken Erfinder System DB D - AD Selektion cdna-b ank S.Fields S. Elledge Clontech Two-Hybrid Improved Two Hybrid Matchmaker Gal4 His3, LacZ His3, Ade2, LacZ His3, Ade2, LacZ >51 R. B rent Interaction Trap LexA - B 42 Leu2, LacZ >105 S. Hollenberg Modified Two-Hybrid LexA - VP16 His3, LacZ GibcoB RL ProQuest Gal4 His3, Ura3, LacZ 18 E. Golemis Dual B ait LexA - B 42 ci - B 42 Leu2, LacZ Lys2, GusA >105 R. B rent Two B ait LexA - B 42 TetR - B 42 Leu2 Ura3 >105

24 Vorteile des Hefe-Zwei-Hybrid Systems 1. In vivo 2. Es ist relativ einfach hiermit anzufangen und benötigt nicht viel Aufwand. Für biochemische Methoden wird oft aufgereinigtes Protein in sehr gute Qualität benötigt. Hier wird höchstens cdna benötigt. 3. Hiermit können auch die schwachen Interaktionen noch detektiert werden, da mehrfache Promoterelemente vor dem Reportergen geschaltet sind, was zur Amplifikation des Signals führt. 4. Es können ganz einfache semi-quantitative Tests durchgeführt werden, um die Affinität interpretieren zu können. 5. Nach dem Screen kann sofort die DNA des Interaktionspartners isoliert werden.

25 Zu beachten : Potentielle Nachteile 1. Das Target-Protein darf keine eigene Aktivierungsdomäne besitzen. 2. Die Konformation des Target-Proteins kann im Fusionsprotein geändert sein. Wird nur eine Domäne verwendet, soll unbedingt die Bindung am gesamten Protein untersucht werden. 3. Wird nur eine bestimmte Domänen des Target-Proteins an die DBD fusioniert (weil das Target zu groß ist oder weil es sich um ein Membranprotein handelt) dann soll beachtet werden, dass so normal nicht zugängliche Bindungsstellen vielleicht jetzt an der Oberfläche liegen. 4. Ein Protein, wovon bekannt ist, dass es das Target-Protein bindet, sollte als Positiv-Kontrolle verwendet werden (bei Interaktion ist die Faltung der Domäne korrekt). 5. Manche post-translationale Modifikationen finden nicht statt. 6. Die Fusionsproteine müssen in den Kern gelangen. Sind stärkere Translokationssignale im Fusionsprotein vorhanden (z.b. Sekretion)? 7. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass ein drittes Protein für die Interaktion benötigt wird. 8. Hefe wird als Wirt benutzt. Nachteil: Ist die Faltung korrekt und das Protein in Hefen stabil? Vorteil: Gleicht mehr der Situation in höheren Eukaryoten als bei in vitro Experimenten oder Systemen mit Bakterien als Wirt

26 Vielen Dank für Eure Aufmerksamkeit!