Analyse der Zellmorphologie

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1 Praktikum IV, SS 07 Biologieversuch Analyse der Zellmorphologie Wirkung von Ni 2+ und Ag + auf das Überlebens- und Haftverhalten von Fibroblasten Zahner Michele (zahnerm@student.ethz.ch) Büchi Luca (lbuechi@student.ethz.ch) Reibisch Philipp (rephilip@student.ethz.ch) Bigler Sandro (biglers@student.ethz.ch) Assistentin: Tessa Lühmann

2 Zusammenfassung Die toxische Wirkung der untersuchten Metallionen scheint die Haftfähigkeit der Fibroblasten zu beeinträchtigen. Während Ag + schon ab einer Konzentration von 10 mm toxisch wirkt, ist die Toleranz der Zellen gegenüber Ni 2+ mit 100 mm bedeutend grösser. 1. Einführung Im folgenden Versuch wurde die Toxizität von Nickel- und Silberionen auf Mäusefibroblasten (NIH 3T3) untersucht. Dazu wurden NIH3T3-Zellkulturen je unterschiedlichen Metallion-Konzentrationen ausgesetzt und mit verschiedenen Farbstoffen angefärbt. Zur Auswertung wurde die Anzahl lebenden und toten Zellen mit Hilfe des Fluoreszenzmikroskops bestimmt und mit der Kontrolle verglichen Anfärbemittel: Hoechst nuclear stain Das verwendete Anfärbemittel Hoechst färbt Zellen an, indem es sich zwischen den DNA-Strängen einlagert (interkaliert)(s. Abb. 1). Der Vorgang findet sowohl bei toten wie auch bei lebenden Zellen statt. Dieses Anfärbemittel wurde daher als unspezifischer Marker verwendet. Das Molekül fluoresziert blau unter UV-Licht und kann somit im Fluoreszenz- Mikroskop detektiert werden. Abb. 1: DNA-Strang mit interkaliertem Hoechst-Farbstoffmolekül [1] 1.2. Anfärbemittel: Life and Dead stain Dieses Anfärbemittel ist ein Gemisch aus Ethidiumbromid und Fluoresceindiazetat. Die beiden Moleküle färben prinzipiell spezifisch nur tote bzw. lebende Zellen an. Ethidiumbromid interkaliert wie der Hoechst stain zwischen den DNA-Strängen, kann jedoch lediglich die Zellmembran von toten Zellen passieren. Lebende Zellen werden daher durch Ethidiumbromid kaum gefärbt. Ethidiumbromid fluoresziert unter UV-Licht rötlich. Vorsicht: Die Verbindung gilt als giftig und potentiell krebserregend [2]! Fluoresceindiazetat ist für die Entfaltung seiner Fluoreszenz auf lebende Zellen angewiesen, welche durch enzymatische Vorgänge die Azetatgruppen abspalten. Es entsteht Fluorescein, welches im Fluoreszenzmikroskop grün fluoresziert. 2

3 2. Materialien und Methoden 2.1. Vorbereitung Es wurden insgesamt 28 Zellkulturen in Nährlösung (DMEM und 10% FCS) hergestellt. Diese wurden 2 Tage lang bei 37 C und 5% CO2 folgenden Ionenkonzentrationen ausgesetzt: Ni 2+ : 0.1 mm, 1 mm, 10mM und 100 mm (je 2 Proben) Ag + : 0.1 mm, 1 mm, 10mM und 100 mm (je 2 Proben) Referenz: keine Metallionen (4 Proben) Negativkontrolle (später Ethanolzugabe): keine Metallionen (8 Proben) Anfärbemittel: Hoechst stain: Life/dead stain: 1!L Stocklösung in 2 ml Nährmedium 10!g/mL Ethidiumbromid und 2.5!g/mL Fluoresceindiazetat in Nährmedium 2.2. Methoden kurz vor dem Versuch wurden die Lösungen auf 37 C gebracht, um einen Temperaturschock der Zellen zu verhindern. Die Zellkulturen wurden kurz unter dem Lichtmikroskop betrachtet um sicherzustellen, dass auch Zellen vorhanden sind und um deren Beschaffenheit zu betrachten. Anschliessen wurde wie folgt vorgegangen: Negativproben Die Nährlösung wurde abgesaugt. Dann wurde den Proben 1 ml PBS zugegeben und wieder abgesaugt (gespült). Anschliessend wurde je 4 Proben 50%ige Ethanol-Lösung in PBS und je 4 Proben reines Ethanol zugegeben und 5 Minuten lang einwirken gelassen. Nach Entfernen der Ethanollösung wurde die Probe mit PBS gespült und wieder mit Nährlösung aufgefüllt. Je zwei Proben pro Ethanol-Konzentration wurden mit dem Höchst stain angefärbt, die anderen mit dem life/dead stain (je 200!L pro Probe). Restliche Proben Die Nährlösung wurde abgesaugt und die Proben mit PBS gespült. Anschliessend wurde das Anfärbemittel zugegeben (200!L pro Probe) und 5 Minuten lang gewartet. Dann wurde die Farbstofflösung abgesaugt, die Probe gespült und mit Nährlösung aufgefüllt. Pro Metall-Konzentration wurde je eine Probe mit dem Hoechst stain und je eine Probe mit dem life/dead stain angefärbt. Die Auswertung erfolgte unter dem Fluoreszenzmikroskop: Es wurden pro Probe und Farbstoff je zwei Bilder aufgenommen und die Zellen ausgezählt. Die Auswertung erfolgte separat nach Ionensorte (s. Kap. 3. Resultate). 3

4 3. Resultate Die Zählung der Zellen hat sich als ziemlich trickreich erwiesen. Besonders schwierig machte es die Tatsache, dass die Zellen sehr inhomogen über den Gefässboden vereilt waren. Die Werte, die in den folgenden Tabellen zusammengestellt sind, sind die Mittelwerte der Zählungen bzw. Schätzungen der Zellzahlen, die aus dem Vergleich der einzelnen Färbungen hervorgegangen sind Kontroll- und Negativproben Diese Proben zeigen die erwartete Wirkung der Färbung am schönsten auf. In der Ansicht des Höchst stain zeigt sich bei allen Proben ein sehr ähnliches Bild: ein durchgehender (blauer) Zellteppich. Unterschiede zwischen den lebenden und toten Zellen sind in dieser Ansicht nicht auszumachen. Der Unterschied zeigt sich erst, wenn man die anderen Farbstoffe fluoreszieren lässt. Während bei den Kontrollproben alle Zellen noch am Leben sind (grüne Fluoreszenz), sind bei den Ethanolproben alle Zellen tot (rote Fluoreszenz). In Abb. 2 ist eine Reihe aus diesen Fluoreszenzaufnahmen zusammengestellt. Abb. 2a: Fluoreszenzaufnahmen der Kontrollproben. Die grüne und die rote Aufnahme stammen aus dem gleichen Ausschnitt. Man erkennt, wie die Zellen nur auf dem grünen Fluoreszenzkanal zu erkennen sind. Abb. 2b: Fluoreszenzaufnahmen der Negativproben (50% EtOH). Obwohl die Höchst-Färbung der Kontrollprobe sehr ähnlich ist, verraten die beiden weiteren Aufnahmen (gleicher Ausschnitt), dass die Zellen tot sind. 4

5 3.2. Silberionen In Abb. 3 sind die Ergebnisse zu den Silberionen zusammengestellt. Auffällig ist die kleine Anzahl an toten Zellen, die registriert werden konnte. Auszählung der Silberionen ausgesetzten Proben Abb. 3: Gemittelte Anzahl Zellen pro Aufnahmefenster (Silbersalz-Lösung). Die Zahlen wurden aus den Proben gewonnen, die mit dem life/dead stain angefärbt wurden (grüne/rote Fluoreszenz entspricht lebend/tot) 3.3. Nickelionen Aus unbekannten Gründen hat in dieser Probenserie die life/dead-färbung nicht funktioniert. Auf allen grünen und roten Fluoreszenzaufnahmen war absolut nichts zu sehen. Die Höchst-Markierung hat keine Probleme bereitet. Aus diesem Grund wurden Durchsichtaufnahmen (Bsp. Abb. 5) der falsch gefärbten Proben gemacht und ohne Unterscheidung zwischen tot und lebendig das Mittel der Anzahl Zellen im Aufnahmefenster bestimmt. Das Ergebnis ist in Abb. 4 zusammengefasst. Auszählung der Nickelionen ausgesetzten Proben Abb. 4: Gemittelte Anzahl Zellen pro Aufnahmefenster (Nickelsalz-Lösung). Diese Zahlen basieren auf die mit Höchst stain gefärbten sowie auf die mit Durchsicht aufgenommenen Proben. 5

6 4. Diskussion Anhand der graphischen Zusammenstellung der Daten werden grobe Aussagen über die Toxizität der jeweiligen Metallionen möglich. Allgemein scheint die toxische Wirkung der Metallionen besonders die Haftfähigkeit zu betreffen. Sogar in den Schaubildern mit den höchsten Konzentrationen sind kaum tote Zellen auszumachen. Das ist damit zu begründen, dass die Zellen bereits kurz nach Zugabe der Metallionen absterben und gar nicht erst die Zeit haben, sich am Gefässboden festzusetzen. Diese Zellen wurden daher bei den Spülvorgängen weggewaschen, so dass nur die haftfähigen lebenden Zellen zurückgeblieben sind. Die Abnahme der Gesamtzellenzahl bei höheren Konzentrationen lässt sich bei den mit Höchst stain gefärbten Proben beobachten. Im Gegensatz dazu hatten die erst nachträglich mit Ethanol behandelten Zellen genügend Zeit, schon vorher zu adhärieren und waren daher auch gut in der Ethidiumbromid-Färbung zu sehen. Damit relativiert sich der Informationsverlust, der durch die misslungene Färbung der Nickel-Proben entstanden ist, da die toten Zellen ohnehin kaum registriert worden wären. Für die Interpretation wurde daher die Anzahl lebenden Zellen mit der Anzahl vorhandenen Zellen gleichgesetzt. Damit ergeben sich folgende Schlussfolgerungen: Silberionen scheinen bei gleicher Konzentration bedeutend toxischer zu sein als Nickelionen. Während die letale Konzentration an Silberionen bei einer Konzentration um 10 mm zu liegen kommt, scheint die Toleranz gegenüber Nickelionen bedeutend grösser zu sein. Die Grenze kann in diesem Fall um 100 mm geschätzt werden. 5. Referenzen [1] [2] [3] Versuchsanleitung, Heike Hall 6

7 6. Anhang Abb. 5: Durchsichtaufnahme einer Zellprobe (10 mm Nickelionen) 7