Bio FM Bio FM V.C.A

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1 Bio FM Bio FM V.C.A MEDIUM FÜR DIE SCHNELLE ISOLIERUNG VON MYKOBAKTERIEN / SELEKTIVER ZUSATZ

2 1- VERWENDUNGSZWECK Mykobakterien sind säurefeste Bazillen (AFB), die auf herkömmlichen Festmedien (Lowenstein-Jensen, Coletsos, Middlebrook 7H10 und 7H11) sehr langsam wachsen: Die Isolierung von Mycobacterium tuberculosis kann 2 bis 8 Wochen dauern. Bio FM ist ein angereichertes flüssiges Kulturmedium, das für die signifikante Beschleunigung des Wachstums von Mykobakterien entwickelt wurde (1, 2). Auf Bio FM-Medium gezüchtete Kulturen eignen sich für die Identifizierung (konventionelle biochemische Tests und Untersuchungen) und Antibiogramme. 2- PRINZIP Bio FM-Bouillon ist ein nicht-selektives Middlebrook 7H9-Medium, das mit OADC (Ölsäure, Albumin, Dextrose, Katalase) angereichert und für das Wachstum von Mykobakterien optimiert wurde. Bio FM ermöglicht die Isolierung von Mykobakterien aus allen Arten von biologischen Proben. Die Selektivität des Bio FM-Mediums wird durch Zugabe von Bio FM V.C.A.- selektivem Zusatz (Vancomycin, Colistin, Amphotericin B) gewonnen, der das Wachstum der wichtigsten Gram-negativen und Gram-positiven Mikroorganismen hemmt, sowie von Hefen, zu denen die Flora der wesentlichen pathologischen Proben zählt. Das Wachstum von Mykobakterienstämmen wird durch einen Positiv- Indikator nachgewiesen, der den Kulturen eine dunkelblaue bis violette Färbung verleiht. 3- DARREICHUNGSFORM Gebrauchsfertiges Medium: Bio FM - 24 Röhrchen mit Schraubverschluss für 5 ml Bouillon Kat.-Nr Gebrauchsfertiger selektiver Zusatz: Bio FM V.C.A. - 1 Tropffläschchen für 3 ml Kat.-Nr ZUSAMMENSETZUNG Bio FM-Bouillon - KH2PO4 - Biotin - Na2HPO4 - Natriumcitrat - NH4SO4 - Aminosäuren - MgSO4 - Casein - ZnSO4 - Rinderalbumin 24

3 - CuSO4 - Glycerin - CaCl2 - Glucose - NaCl - Fettsäure - Ammoniumeisencitrat - Katalase - Pyridoxin - Wachstumsindikator - Destilliertes Wasser Bio FM V.C.A. - Vancomycin - Colistin - Amphotericin B 5- LAGERUNG Gebrauchsfertiges Medium: bei +2-8 C lichtgeschützt lagern. Gebrauchsfertiger selektiver Zusatz: bei +2-8 C lichtgeschützt lagern. Nach dem Öffnen muss das Reagenz innerhalb von 45 Tagen verwendet werden. Das Reagenz nach jedem Gebrauch wieder in den Kühlschrank stellen. Das Verfallsdatum und die Chargennummer sind auf der Verpackung angegeben. 6- TESTVERFAHREN Material: Geliefertes Material: Bio FM, Bio FM V.C.A. Vorsichtsmaßnahmen / Sicherheitsvorschriften Die Vorsichtsmaßnahmen und Sicherheitsvorschriften bezüglich Keime der Klasse 3 müssen beim Umgang mit biologischen Proben, die Mykobakterien enthalten können, befolgt werden (3, 4). Dieses Medium kann mit allen biologischen Proben beimpft werden, vorausgesetzt, sie wurden zuvor verflüssigt und dekontaminiert. Die Lagerbedingungen für biologische Proben entnehmen Sie bitte den aktuellen Empfehlungen (6). Da die Menge der Bakterien in der Probe gering sein kann, muss die Probe durch Zentrifugation konzentriert werden, um die Empfindlichkeit des Nachweises zu erhöhen. 25

4 Beimpfung des Bio FM-Mediums Unter aseptischen Bedingungen zu 5 ml Bio FM-Bouillon* zugeben: - 0,5 ml dekontaminierte Probe; homogenisieren, µl (2 Tropfen) Bio FM V.C.A. selektiver Zusatz. Liegt ein Verdacht auf M. haemophilum vor, muss dem Medium Hämin zugesetzt werden. * Das Bio FM-Medium ist gebrauchsfertig und enthält OADC als Zusatz. Nach Verschwinden des Inokulums (nach 3 oder 4 Tagen) werden die Röhrchen mit einem Schraubverschluss oder einem Kunststoffverschluss fest verschlossen. Inkubation Bei 37 C 5 bis 6 Wochen inkubieren. Ablesen - Interpretation der Ergebnisse Ablesezyklus: Innerhalb von 3 bis 4 Wochen jede Woche 2 bis 4 Mal ablesen, anschließend weitere 2 Wochen zweimal pro Woche ablesen. Methode zum Ablesen und Interpretieren der Ergebnisse Das Ablesen der Ergebnisse auf Bio FM-Medium umfasst im Allgemeinen 2 Phasen: 1. Phase: Untersuchung des Sedimentes und des Flüssigmediums ohne Schwenken des Röhrchens Den Boden des Röhrchens und das Flüssigmedium sorgfältig untersuchen: - Bei keinem Anzeichen für Wachstum (keine Trübung, dunkelblaue/violette Körnchen oder Flocken): Mit der zweiten Phase des Ablesens fortfahren. - Bei Anzeichen für Wachstum:. Dunkelblaue/violette Körnchen oder kleine Flocken haben sich am Boden des Röhrchens abgesetzt: Verdacht auf M. tuberculosis. Trübung, mit einer Farbe zwischen dunkelblau und violett und einer Tendenz zur Bildung von Ablagerungen am Boden des Röhrchens: Verdacht auf atypische Mykobakterien. Dies kann unter Umständen in der zweiten Phase des Ablesens bestätigt werden. 26

5 2. Phase: Untersuchung des Sedimentes nach Schwenken des Röhrchens Nehmen Sie das Röhrchen auf Augenhöhe (vorzugsweise bei Tageslicht untersuchen) und die Ablagerungen auf dem Boden des Röhrchens durch leichtes Schwenken des Röhrchens resuspendieren: - Bei keinem Anzeichen für Wachstum (keine Trübung, dunkelblaue/violette Körnchen oder Flocken): negative Kultur, Inkubation des Mediums fortführen. - Bei Anzeichen für Wachstum:. dunkelblaue/violette Körnchen oder kleine Flocken: Verdacht auf M. tuberculosis.. Trübung, mit dunkelblauer/violetter Färbung: Verdacht auf atypische Mykobakterien. - Bei Vorliegen einer homogenen Trübung (möglicherweise mit einer hellblauen Färbung des Mediums) nach 3 Tagen nach der Inkubation kann eine Kontamination vermutet werden. Bitte beachten: Die dunkelblaue Färbung, die auf ein Wachstum von Mykobakterien hinweist, ist selbst bei vorhandenen Zellpartikeln oder unlöslichen Partikeln sichtbar. Es wird empfohlen, zwischen der 2. und 8. Woche nach der Beimpfung eine Zählung und eine morphologische Untersuchung der Kolonien durchzuführen. Identifizierung, Antibiogramm. Wird Bakterienwachstum auf Bio FM-Medium nachgewiesen, die Farbpartikel mit einer Pasteur-Pipette entnehmen und auf das Vorliegen von säurefesten Bazillen (AFB) untersuchen. Auf Bio FM-Medium gewonnene Kulturen eignen sich für die Identifizierung (konventionelle biochemische Tests und Untersuchungen) sowie für das Antibiogramm. 27

6 7- LEISTUNG DES TESTS Eine Prospektivstudie von 34 für Mykobakterien positiven Proben ergab, dass kein signifikanter Unterschied (p>>0,05 - χ 2 Mac Nemard s c2 bei übereinstimmenden Daten) zwischen der Isolierungsrate eines konventionellen Referenzmediums (Lowenstein-Jensen) und der des Bio FM-Mediums existiert. Dennoch ist die Zeit, in der positive Ergebnisse erzielt wurden, signifikant (p = 0, < 0,05 Wilcoxon-Test für übereinstimmende Paare) für Bio FM kürzer (mittlere Nachweiszeit auf Bio FM = 18,4 Tage) als für Lowenstein-Jensen (mittlere Nachweiszeit auf LJ = 24,0 Tage). 8- QUALITÄTSKONTROLLE DES TESTS Bio FM Die Leistung der Bio FM-Bouillon werden mit folgenden Stämmen kontrolliert: STÄMME Mycobacterium bovis BCG Mycobacterium tuberculosis CIP Mycobacterium avium CIP Mycobacterium gordonae KULTURERGEBNIS NACH 21 TAGEN BEI 37 C UNTER ANAEROBEN BEDINGUNGEN Wachstum, blaue Körner Wachstum, blaue Körner Wachstum, Trübung, blaue Körner Wachstum, blaue Trübung Bio FM V.C.A. Die Selektivität des V.C.A.-Zusatzes wurde mit verschiedenen Grampositiven und Gram-negativen Bakterienstämmen und Hefen getestet: Durch Hemmung des Wachstums wird die Konformität des selektiven Zusatzes bewiesen. STÄMME Mycobacterium tuberculosis CIP Mycobacterium avium CIP Staphylococcus aureus ATCC Pseudomonas aeruginosa ATCC Candida albicans ATCC SELECTIVITÄTSERGEBNIS Wachstum Wachstum Inhibition Inhibition Inhibition 28

7 9- GRENZEN DES TESTS Bei einer deutlichen Trübung des Mediums überprüfen, ob eine Kontamination in Verbindung mit einem Mykobakterium durch direkte Untersuchung vorliegt. In diesem Fall sollten, sofern möglich, neue Kulturen aus der bei +4 C gelagerten Originalprobe angelegt werden. Jedes Wachstum (dunkelblaue/violette Trübung, Körner, Flocken), das durch Ziehl-Stamm als charakteristisch für ein Mykobakterium bestätigt wurde, muss gemäß den üblichen Verfahren (biochemische Identifizierung, Untersuchungen) identifiziert werden. Jede Fertigproduktcharge wird einer Qualitätskontrolle unterzogen und nur dann verkauft, wenn sie den Abnahmekriterien entspricht. Die Unterlagen bezüglich Herstellung und Kontrolle der einzelnen Chargen werden bei Bio-Rad aufbewahrt. 10- QUALITÄTSKONTROLLE DES HERSTELLERS Alle von der Firma Bio-Rad hergestellten Reagenzien unterliegen einem Qualitätssicherungssystem vom Rohstoffeingang bis zur Vermarktung der Fertigprodukte. Jede Fertigproduktcharge wird einer Qualitätskontrolle unterzogen und nur dann verkauft, wenn sie den Freigabekriterien entspricht. Die Unterlagen bezüglich Herstellung und Kontrolle der einzelnen Chargen werden bei Bio-Rad aufbewahrt. 11- LITERATUR Siehe französische Version. 29

8 11- RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. SAVAGE C., FACON J.P., VERMEULEN M. : Comparaison du milieu liquide Bio FM et de son supplément sélectif par rapport à la méthode de référence sur milieux solides ème Congrès de la SFM, Lille, France. 2. TOUZARD M., PERELLO M., FOSSE T. : Bilan d'utilisation du BioArgos (V2) en parallèle avec la technique classique pour la culture des Mycobactéries en routine. Vème journées de Mycobactériologie Novembre 1996, Nice, France. 3. Mesures techniques de prévention, notamment de confinement, à mettre en œuvre dans les industries et les laboratoires de recherche et d'enseignement où les travailleurs sont susceptibles d'être exposés à des agents biologiques pathogènes - Arrêté du 13 août Journal Officiel de la République Française. 4. Kent P.T., and KUBICA G.P Public health mycobacteriology a guide for the level III laboratory. USDHMS, Centers for Disease Control, Atlanta. 5. Basic Laboratory Procedures in Clinical Bacteriology. World Health Organization. Geneva st edition. 6. Annual Meeting of the International Union Against Tuberculosis and Lung Diseases (IUATLD), October 1997, Paris, France. 7. CERNOCH P.L., ENNS R.K., SAUBOLLE M.A., and WALLACE R.J., JR. : Laboratory Diagnosis of the Mycobacterioses. Oct. 1994, CUMITECH 16A. 8. SALFINGER M., PFYFFER G.E. : The New Diagnostic Mycobacteriology Laboratory :

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