2. Humorale Tumormarker
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- Nele Böhm
- vor 7 Jahren
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1 1. Molekulare Diagnostik 1.1. Methodische Grundlagen der DNA/RNA- Analytik 1.2. Anwendungen der molekularen Diagnostik: Assoziation von DNA-Polymorphismen mit Krankheiten oder Krankheitsrisiken Pharmakogenetik Tumordiagnostik auf Grundlage von molekularbiologischen Methoden 2. Humorale Tumormarker
2 Untersuchung von DNA Southern-Blot Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus- PCR Allel-spezifische Oligonukleotid-Hybridisierung Sreeningmethoden für Punktmutationen Single-Strand Conformation Polymorphism PCR DNA-Sequenzierung
3 Polymerase Chain Reaction (PCR) cycle 1 cycle 2 94 C 1min 72 C 1min 94 C 1min 72 C 1min 55 C 1min 55 C 1min denaturation annealing elongation DNA-Template, Primer (sense, antisense) Nukleotide, Puffer, Mg 2+, thermostabile DNA-Polymerase
4 Ermittlung eines Genotyps durch die Analyse einer bekannten Mutation RFLP (Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus)-PCR (Häufigkeit des Einsatzes etwa 25%) Allel-spezifische Oligonukleotid-Hybridisierung (Häufigkeit des Einsatzes etwa 50%) Genchip-Analyse zur gleichzeitigen Erfassung vieler unterschiedlicher Mutationen kommerziell bedingt erhältlich (z.b. CYP450-Array mit 33 versch. Mutationen)
5 RFLP-PCR Ermittlung der Punktmutation (C/T) bei Nukleotid 677 im MTHFR-Gen (Methylentetrahydrofolsäure-Reduktase) Bedeutung für den VitB 12 /Folsäure-Stoffwechsel (Artheroskleroserisiko über Einfluss auf Homocystein-Konzentration im Serum) HE N N N N N HO HE N M bp Amplifikation des DNA Bereiches DNA-Fragment von 198 bp Verdauung der DNA mit Hinf I Wildtyp: 198 bp Homozyg. Mutation: 175 bp Heterozyg. Mutation: bp
6 Real-Time-PCR Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) zwischen Hybridisierungssonden Methode geeignet zur Quantifizierung von PCR-Produkten Messung eines zunehmenden Fluoreszenzsignals während der laufenden PCR. Beginn des Signalanstiegs ist das Maß für die Ausgangskonzentration des betreffenden DNA-Bereiches. Methode geeignet zur Mutationsanalyse Nach der abgeschlossenen PCR wird das Schmelzverhalten der FRET- Sonden geprüft. Mutation und Wildtyp haben aufgrund von Basen- Fehlpaarungen verschiedene Schmelzpunkte.
7 Genotypisierung mittels Schmelzkurvenanalyse HE WT Schmelzkurve C HO HO WT Im Beispiel: FRET-Sonden haben eine 100%ige Übereinstimmung mit der Wildtyp-Sequenz HE Ableitung -d[fluoreszenz]/dt
8 Aufspüren einer bislang unbekannten Mutation SSCP-PCR (single strand conformation polymorphism) DNA-Sequenzierung
9 Increasing role of environment and stochastic factors Assoziation von DNA-Polymorphismen mit Krankheiten oder Krankheitsrisiken G6PD deficiency Hemochromatosis Acute intermittent porphyria α 1 -Antitrypsin ZZ Phenylketonuria Sickle-cell anemia Cystic fibrosis Huntington disease Duchenne dystrophy Tay Sachs Type I diabetes mellitus Apo E-2/E-2 hyperlipoproteinämie Increasing role of genotype at other loci
10 Automatisierte DNA-Sequenzierung Diodenlaser zur Detektion eines Fluoreszenz-Labels einer automatisierten DNA-Sequenzierung mit Online-Übertragung der Sequenzdaten
11 Hochdurchsatzsequenzierung Basenbestimmung durch Analyseeiner Serie von Bildern Source: 454
12 Gegenüberstellung Sanger Next Gen Erste Generation (Sanger Sequenzierung): 100kb/Lauf, mittlere Read Länge 1000bp, Preis: 500$/Mb Zweite Generation: Roche(454): 450Mb/Lauf, 400bp, 20$/Mb Illumina: 35Gb/Lauf, 100bp, 0.50$/Mb SOLiD: 50Gb/Lauf, 50bp, 0.50$/Mb Heliscope: 37Gb/Lauf, 32bp, <0.50$/Mb Dritte Generation: PacBio SMRT: 25Gb/Lauf, >1000bp,?$/Mb Ganz neu: Ion Torrent: 100bp/Lauf, 10x billiger als Roche(454)
13 Häufig untersuchte Gene Alpha-1-Antitrypsin Angiotensin converting enzyme (ACE) Apolipoprotein B100 Apolipoprotein E Faktor II-Leiden (Prothrombin) Faktor V-Leiden HFE (HLA-H) HLA (Klasse I und Klasse II, zur Typisierung) Laktase (Laktosetoleranzstörung) MTHFR Mukoviszidose UDP-Glucuronosyltransferase (Gilbert-Meulengracht)
14 Nachweis (und Quantifizierung) von RNA Hybridisierungsverfahren (semiquantitativ) Northern-Blot Amplifikationsverfahren (qualitatitv-quantitativ) Reverse Transkription (RT)-PCR Isolierung von RNA Synthese einer cdna (enzymatische Erststrangsynthese mittels reverser Transkriptase) Durchführung einer (real time) PCR
15 Methoden zur Aufdeckung monogener Erkrankungen
16 Netzwerk aus bekannten und neuen Genen (z.b. für geistige Behinderung)
17 Epigenomik Die Epigenomik ist ein neues Wissenschaftsgebiet aus der Fusion der Epigenetik und der Genomik, dessen Ziel es ist die genetische Regelung auf Genomebene kenenzulernen. Die Epigenetik untersucht die Chromatin-modifikationen auf der Ebene der einzelnen Gene. 1. DNA Methylierung(5-Methyl-Cytosin) 2. Histonmodifikationen: Methylierung, Acetylierung, Phosphorilierung, SUMOylierung(Small Ubiquitinrelated MOdifier kleiner Ubiquitinverwandter Modifikator) P Ac Met
18 Pharmakogenomik Untersucht, wie das genetische Profil die Reaktionen des Organismus auf Medikamente beeinflusst. Wirksamere Medikamente Bessere und sicherere Medikamente Genauere Methoden zum Feststellen der notwendigen Dosis Entwickeltere Untersuchung auf Erkrankungen Besserer Impfstoff Verbesserung in der Fortentwicklung der Medikamente und dem Genehmigungsprotokoll Senkung der durchschnittlichen Kosten der Heilkunde Viele stellen die Pharmakogenomik mit der individualisierten Medizin gleich
19 Pharmakogenetik Enzym Häufigkeit Medikamente Probleme Cytochrom P450 CYP2D6 3-10% viele (Antidepressiva Meist verstärkte CYP2C19 2-5% Neuroleptika, Beta-Blocker...) Wirkung CYP1A2 12% N-Acetyltransferase NAT2 50% Isoniazid, Sulfapyridin Dapson, Koffein, Hydralazin Überempfindlichkeitsreaktionen Thiopurinmethyltransf. TPMT 0,3% Azathioprin, Mercaptopurin Leukopenie Dihydropyrimidin-Dehydr. (DPD, DPYD) 5% (Het.) 5-Fluoruracil verstärkte Wirkung Glukose-6-Phos.-Dehydr. 1% Sulfonamide, Primaquin Hämolyse Serum-Cholinesterase 0,04% Succinylcholin Apnoe Ca-Transport im ER 0,005% Inhalationsanästhetika Maligne Hyperthermie
20 Mutationsnachweise in der molekulargenetischen Tumordiagnostik Keimbahnmutationen somatische Mutationen
21 Tumordiagnostik: Keimbahn-Mutationen (Familiäre Disposition: 2% aller Krebserkrankungen) Erkrankung Fam. Retinoblastom Fam adenomatöse Polyposis (FAP) Heredit. kolorektale Karzinome o. Polyposis Fam. Brust-/Ovarialkrebs Fam. Brustkrebs Li Fraumeni Syndrom Multiple endokrine Neoplasie (MEN) Typ1 Fam. Medulläres Schilddrüsenkarzinom MEN Typ 2A und 2B Fam. Melanom Neurofibromatose Typ 1 Neurofibromatose Typ 2 Gorlin Sydrom, Basalzellkarzinom Von Hippel-Lindau Syndrom Fam. Wilms-Tumor Gen rb apc mlh 1 brca 1 brca 2 p53 men 1 (menin) ret p16 nfl 1 nfl 2 ptch vhl wt 1
22 Tumordiagnostik: somatische Mutationen Genetische Instabilität in malignen Tumoren: Entweder kausal für Tumorgenese verantwortlich, und/oder für Tumorprogression verantwortlich! Wichtige Gene: p53, k-ras Mutationsanalyse zur Früherkennung von Tumoren. Tumorzellnachweise in Körperflüssigkeiten und Stuhl. Problem: Vielzahl möglicher Mutationen, Nachweis eines mutierten Allels unter einem Überschuss von Wildtyp-Allelen. Tumoren: z.b. Kolon-Karzinom, Pankreas-Karzinom
23 Tumordiagnostik: somatische Translokationen Nachweis von Chromosomenanomalien in Tumoren hämatopoetischer Zellen leichter. Große Mehrzahl bisher gesicherter Chromosomenanomalien bei Leukämien und Lymphomen. Gen Rearrangement Erkrankung Rearrangements, kodierende Sequenz exprimiert und nicht verändert BCL2 t(14;18)(q32;q21) follikuläres Lymphom Rearrangements, Hybridgene BCR-ABL t(9;22) (q34;q11) CML, B-ALL Philadelphia-Chromosom zytogenetisch bei bis zu 90% der CML nachweisbar!!! Nachweis mittels PCR /RT-PCR mit Primern von beiden Seiten der chromosomalen Bruchstelle.
24 Tumordiagnostik: zirkulierende Tumorzellen Nachweis residualer Tumorzellen im peripheren Blut, Knochenmark oder Blutprodukten über Marker (Transkripte, Methylierungsgrad der DNA), welche nicht in hämatopoetischen Zellen vorhanden sind. Target: AFP PSA CK19 meist Gene klassischer Tumormarker: z.b. alpha-fetoprotein Prostataspezifisches Antigen Zytokeratin 19 Nachweis mittels RT-PCR o. quantitativer RT-PCR Nachweisgrenzen: ca. 1 Tumorzelle unter 10 6 Zellen Methylierungsgrad der DNA: (neuerer Trend). DNA von Tumoren ist häufig (spez. in Promorbereichen) hypermethyliert (C 5m C). Nachweis des Methylierungsgrades von ausgewählten Indikatorgenen zum sensitiven Nachweis einer Metastasenbildung.
25 Nachweis von Tumorzellen Langes, unsichtbares Vorstadium Monate bis viele Jahre Klinische Diagnose Tumormasse 1µg 1 mg 1g g 1 kg Tumorzellen Immunologische Methoden Biophysikalische Methoden Röntgen CT Ultraschall Diagnostische Schwelle früh spät
26 Der ideale Tumormarker... Tumor/Tumorrezidiv-Früherkennung (hohe Sensitivität >50%) Unterscheidung - maligne vs. gesund/benigne (hohe Spezifität >95%) Gute positive und negative Prädiktion Unterscheidung distinkter Tumorentitäten Unterstützung bei der Therapieentscheidung Korrelation mit Tumormasse Prognostische Aussage
27 Einteilung der humoralen Tumormarker Onkofetale und onkoplazentare Antigene (CEA, AFP, hcg) Mit monoklonalen Antikörpern erkennbare Kohlehydratepitope (CA 19-9, CA 125, CA 15-3) Differenzierungs-und Proliferationsantigene: (NSE, PSA, TPA, 2-Mikroglobulin) Von Tumorzellen gebildete Hormone: Calcitonin beim medullären SD-Karzinom, Insulin beim Insulinom, ektop gebildetes ACTH oder Calcitonin beim SCLC Von Tumorzellen gebildete Proteine: (monoklonales Immunglobulin oder Bence Jones-Protein bei monoklonalen Gammopathien) Von Tumorzellen gebildete Enzyme: (z.b. NSE beim SCLC, PAP beim Prostatakarzinom)
28 TM-Konzentration abhängig von... Tumormasse Tumorzelluläre Syntheserate Freisetzungsrate aus Tumor Iatrogene Maßnahmen (digitale Untersuchung, antineoplastische Therapie) Tumordurchblutung Leberfunktion Nierenfunktion
29 TM-Diagnostik zur. Kontrolle des Therapieerfolgs Verlaufskontrolle von Tumorerkrankungen Rezidiv-Früherkennung Therapeutische Konsequenzen? Lebensqualität? Diagnosesicherung: in Einzelfällen!
30 Patientin (53 J) mit Mammakarzinom Cut-off: 5 µg/l Exitus CEA (µg/l) Remission Lebermetastasen Pleuraerguss Chemotherapie Knochenmetastasen Bilirubin (mg/dl) Monate
31 Wann sollten die Marker bestimmt werden? vor der ersten Therapiemaßnahme: Chirurgie, Chemotherapie, Hormontherapie, Radiotherapie nach der Therapiemaßnahme abhängig von der Höhe des Ausgangswertes und der Halbwertszeit nach etwa 2 bis 14 Tagen anfänglich alle drei Monate, später alle 6 Monate in der Verlaufskontrolle vor jedem Therapiewechsel bei Verdacht auf ein Rezidiv bei Verdacht auf Metastasierung bei neuem Staging bei deutlichem Werteanstieg: 2 4 Wochen später wiederholen Signifikanter Werteanstieg, wenn Anstieg um % jährlich beim PSA-Screening: ab dem 50. Lebensjahr
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