1. Molekulare Labordiagnostik

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1 1. Molekulare Labordiagnostik 1.1. Methodische Grundlagen der DNA/RNA- Analytik 1.2. Anwendungen der molekularen Diagnostik: Assoziation von DNA-Polymorphismen mit Krankheiten oder Krankheitsrisiken Pharmakogenetik Tumordiagnostik auf Grundlage von molekularbiologischen Methoden

2 Untersuchung von DNA Southern-Blot Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus- PCR Allel-spezifische Oligonukleotid-Hybridisierung Sreeningmethoden für Punktmutationen Single-Strand Conformation Polymorphism PCR DNA-Sequenzierung

3 Polymerase Chain Reaction (PCR) cycle 1 cycle 2 94 C 1min 72 C 1min 94 C 1min 72 C 1min 55 C 1min 55 C 1min denaturation annealing elongation DNA-Template, Primer (sense, antisense) Nukleotide, Puffer, Mg 2+, thermostabile DNA-Polymerase

4 Ermittlung eines Genotyps durch die Analyse einer bekannten Mutation RFLP (Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus)-PCR (Häufigkeit des Einsatzes etwa 25%) Allel-spezifische Oligonukleotid-Hybridisierung (Häufigkeit des Einsatzes etwa 50%) Genchip-Analyse zur gleichzeitigen Erfassung vieler unterschiedlicher Mutationen kommerziell bedingt erhältlich (z.b. CYP450-Array mit 33 versch. Mutationen)

5 RFLP-PCR Ermittlung der Punktmutation (C/T) bei Nukleotid 677 im MTHFR-Gen (Methylentetrahydrofolsäure-Reduktase) Bedeutung für den VitB 12 /Folsäure-Stoffwechsel (Artheroskleroserisiko über Einfluss auf Homocystein-Konzentration im Serum) HE N N N N N HO HE N M bp Amplifikation des DNA Bereiches DNA-Fragment von 198 bp Verdauung der DNA mit Hinf I Wildtyp: 198 bp Homozyg. Mutation: 175 bp Heterozyg. Mutation: bp

6 Real-Time-PCR Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) zwischen Hybridisierungssonden Methode geeignet zur Quantifizierung von PCR-Produkten Messung eines zunehmenden Fluoreszenzsignals während der laufenden PCR. Beginn des Signalanstiegs ist das Maß für die Ausgangskonzentration des betreffenden DNA-Bereiches. Methode geeignet zur Mutationsanalyse Nach der abgeschlossenen PCR wird das Schmelzverhalten der FRET- Sonden geprüft. Mutation und Wildtyp haben aufgrund von Basen- Fehlpaarungen verschiedene Schmelzpunkte.

7 Genotypisierung mittels Schmelzkurvenanalyse HE WT Schmelzkurve C HO HO WT Im Beispiel: FRET-Sonden haben eine 100%ige Übereinstimmung mit der Wildtyp-Sequenz HE Ableitung -d[fluoreszenz]/dt

8 Aufspüren einer bislang unbekannten Mutation SSCP-PCR (single strand conformation polymorphism) DNA-Sequenzierung

9 Automatisierte DNA-Sequenzierung Diodenlaser zur Detektion eines Fluoreszenz-Labels einer automatisierten DNA-Sequenzierung mit Online-Übertragung der Sequenzdaten

10 Hochdurchsatzsequenzierung Basenbestimmung durch Analyseeiner Serie von Bildern Source: 454

11 Gegenüberstellung Sanger Next Gen Erste Generation (Sanger Sequenzierung): 100kb/Lauf, mittlere Read Länge 1000bp, Preis: 500$/Mb Zweite Generation: Roche(454): 450Mb/Lauf, 400bp, 20$/Mb Illumina: 35Gb/Lauf, 100bp, 0.50$/Mb SOLiD: 50Gb/Lauf, 50bp, 0.50$/Mb Heliscope: 37Gb/Lauf, 32bp, <0.50$/Mb Dritte Generation: PacBio SMRT: 25Gb/Lauf, >1000bp,?$/Mb Ganz neu: Ion Torrent: 100bp/Lauf, 10x billiger als Roche(454)

12 Nachweis (und Quantifizierung) von RNA Hybridisierungsverfahren (semiquantitativ) Northern-Blot Amplifikationsverfahren (qualitatitv-quantitativ) Reverse Transkription (RT)-PCR Isolierung von RNA Synthese einer cdna (enzymatische Erststrangsynthese mittels reverser Transkriptase) Durchführung einer (real time) PCR

13 Epigenomik Die Epigenomik ist ein neues Wissenschaftsgebiet aus der Fusion der Epigenetik und der Genomik, dessen Ziel es ist die genetische Regelung auf Genomebene kennenzulernen. Die Epigenetik untersucht die Chromatin-modifikationen auf der Ebene der einzelnen Gene. 1. DNA Methylierung(5-Methyl-Cytosin) 2. Histonmodifikationen: Methylierung, Acetylierung, Phosphorilierung, SUMOylierung(Small Ubiquitinrelated MOdifier kleiner Ubiquitinverwandter Modifikator) P Ac Met

14 Pharmakogenetik Enzym Häufigkeit Medikamente Probleme Cytochrom P450 CYP2D6 3-10% viele (Antidepressiva Meist verstärkte CYP2C19 2-5% Neuroleptika, Beta-Blocker...) Wirkung CYP1A2 12% N-Acetyltransferase NAT2 50% Isoniazid, Sulfapyridin Dapson, Koffein, Hydralazin Überempfindlichkeitsreaktionen Thiopurinmethyltransf. TPMT 0,3% Azathioprin, Mercaptopurin Leukopenie Dihydropyrimidin-Dehydr. (DPD, DPYD) 5% (Het.) 5-Fluoruracil verstärkte Wirkung Glukose-6-Phos.-Dehydr. 1% Sulfonamide, Primaquin Hämolyse Serum-Cholinesterase 0,04% Succinylcholin Apnoe Ca-Transport im ER 0,005% Inhalationsanästhetika Maligne Hyperthermie

15 HLA-Typisierung 1. Nachweis von HLAB27 (Allel-spezifische PCR mit Detektion durch Gelelektrophorese; Amplifikation von HLAB27 zweier Allel-spezifischer PCRs, sowie bei Bedarf HLA- B42 und HLA-B73). Name der Erkrankung: Prädisposition fürden M. Bechterew und weitere rheumatol. Erkrankungen 2. Nachweis von HLA-DQ2 und HLA-DQ8 (Allel-spezifische PCR mit Detektion durch Gelelektrophorese / Schmelzkurvenanalyse im LightCycler; Detektion der Allele DQA1*05, DQB1*02 und DQB1*0302; keine Unterscheidung zwischen Homound Heterozygotie). Name der Erkrankung: Prädisposition für die Zöliakie

16 Hereditäre Tumorsyndrome (1) 1. MEN1 (Sequenzierungdes MeninGens, incl. Splice Sites und MLPA). Name der Erkrankung: Multiple Endokrine Neoplasie Typ 1 2. Hypocalcurisches Hypercalcämie-Syndrom FHH und NSHPT (Sequenzierung allerkodierendenexons des CASR-Gens [Exon 2-7]). Name der Erkrankung: Fam. hypocalcurisches Hypercalcämie-Syndrom(FHH1) 3. Hyperparathyreoidismus-Jaw-Tumor-Syndrom HPT JT (Sequenzierung aller kodierenden Exons des CDC73 [Synonyme: HPRT2, Parafibromin] Gens [Exon 1-17 inkl. Splice Sites]). Name der Erkrankung: Hyperparath.-Jaw-Tumor-Syndrom(HPT-JT) 4. MEN2 (Sequenzierungder Exons 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15 und 16 des RETProtoonkogensincl. Splice Sites). Name der Erkrankung: Multiple Endokrine Neoplasie Typ 2A / 2B 5. SDH (Sequenzierung aller Exons der Gene SDHA, SDHB, SDHC, SDHD und SDHAF2 incl. Splice Sites und MLPA) Name der Erkrankung: Paragangliom-Syndrom(PGL)

17 Hereditäre Tumorsyndrome (2) 6. VHL (Sequenzierung und MLPA-Analyse des VHL- Gens). Name der Erkrankung: Von Hippel-Lindau- Syndrom (VHL-Syndrom) 7. TMEM127 (Sequenzierung des TMEM127-Gens [Exon2-4]). Name der Erkrankung: Phäochromocytom- Syndrom (Phaeo) 8. MAX (Sequenzierung des MAX-Gens [Exon1-5]). Name der Erkrankung: Phäochromocytom- Syndrom (Phaeo) 9. CarneyKomplex (Exon4A und Exon4B des PRKAR1A- Gens). Name der Erkrankung: CarneyKomplex Typ 1 (CNC1)

18 Thrombophilie 1. Faktor II (G20210A), Prothrombingenmutation. Name der Erkrankung: Thrombophilie: FII-Mangel / Prothrombin-Mutation 2. Faktor V Leiden Mutation (G1691A). Name der Erkrankung: Thrombophilie: FV-Leiden (G1691A) / APC-Resistenz 3. PAI-1 Polymorphismus (4G/5G Polymorphismus). Name der Erkrankung: Thrombophilie: Plasminogenaktiv.- Inhibitor Typ 1 (PAI 1) 4. MTHFR 677C>T Polymorphismus. Name der Erkrankung: Thrombophilie: MTHFR-Defizienz(677C>T ) 5. MTHFR 1298A>C Polymorphismus. Name der Erkrankung: Thrombophilie: MTHFR-Defizienz(1298A>C)

19 Hämophilie 1. Von Willebrand Syndrom (Sequenzierung aller Exons des VWF Gens incl. Splice Sites und Promotoranteile; MLPA) Name der Erkrankung: Von Willebrand Syndrom

20 Fettstoffwechselstörungen 1. Apolipoprotein B-100 Mutation (10708 G/A, R3500Q). Name der Erkrankung: Apolipoprotein B (Apo B) / Hypercholesterinämie 2. Apolipoprotein E Polymorphismus (Varianten E2, E3, E4). Name der Erkrankung: Hyperlipoproteinämie Typ III. Alternative Erkrankung: Alzheimer-Demenz-Prädisposition (ApoE)

21 Leber-Erkrankungen 1. Hereditäre HämochromatoseTyp IV (Sequenzierung aller Exonsdes Ferroportin-Gens incl. SpliceSites). Name der Erkrankung: Hereditäre Hämochromatose Typ IV 2. Hereditäre HämochromatoseTyp I (HFE-Polymorphismen; AS 282, 63 und 65). Name der Erkrankung: Hereditäre Hämochromatose Typ I. 3. alpha-1-antitrypsinmangel (alpha-1-pi-polymorphismus: Bestimmung der Varianten M, S und Z). Name der Erkrankung: Heredit. Alpha-1-Antitrypsin-Mangel (AAT-Mangel) 4. Gilbert-MeulengrachtSyndrom: Untersuchung des A(TA)xTAAPolypmorphismusim Promoter des Gens fu rugt1a1 (UDP-Glucuronosyltransferase1A1). Name der Erkrankung: Gilbert-Syndrom (Morbus Meulengracht)

22 Pharmakogenomik Untersucht, wie das genetische Profil die Reaktionen des Organismus auf Medikamente beeinflusst. Wirksamere Medikamente Bessere und sicherere Medikamente Genauere Methoden zum Feststellen der notwendigen Dosis Entwickeltere Untersuchung auf Erkrankungen Besserer Impfstoff Verbesserung in der Fortentwicklung der Medikamente und dem Genehmigungsprotokoll Senkung der durchschnittlichen Kosten der Heilkunde Viele stellen die Pharmakogenomik mit der individualisierten Medizin gleich

23 Pharmakogenetik 1. TPMT (Thiopurin-S-Methyltransferase Varianten *1, *2, *3A, *3B, *3C) Name der Erkrankung: Thiopurin-S-Methyltransferase (TPMT) Defizienz 2. DPD (Dihydropyrimidin-Dehydrogenase Exon14 Skipping Mutante IVS14+1G>A). Name der Erkrankung: Dihydropyrimidin-Dehydrogenase (DPD) Defizienz 3. Gilbert-Meulengracht Syndrom: Untersuchung des A(TA)xTAA Polypmorphismus im Promoter des Gens für UGT1A1 (UDP- Glucuronosyltransferase1A1). Name der Erkrankung: Gilbert-Syndrom (Morbus Meulengracht) 4. Marcumar-Profil (Genotypisierung zur Bestimmung der Warfarin bzw. Marcumar-Sensitivität: VKORC1 (Promotor G>A) und CYP2C9 (Variante *1, *2 und *3). Name der Erkrankung: Warfarin / Marcumar Resistenz 5. CYP2D6 Genotypisierung (Genotypisierung zur Beurteilung der Sensitivität auf Medikamente, wie z.b. Psychopharmaka und Tamoxifen (Variante *1- *6, *9, *10, *17,*41, *XxN). Name der Erkrankung: Drug Metabolism CYP2D6 (PM, IM, EM, UM)

24 Stoffwechselerkrankungen(1) 1. M. Fabry (Sequenzierung der Exons des GLA-Gens incl. Splice Sites) Name der Erkrankung: M. Fabry, alpha-galactosidase Defizienz 2. M. Pompe (Sequenzierung der Exons des GAA-Gens incl. Splice Sites; Sequenzierung der GAA-cDNAund Untersuchung ausgewählter intronischer Regionen). Name der Erkrankung: M. Pompe, Glycogen Speicherkrankheit II (GSDII) 3. Laktasepolymorphismus(-13910T>C). Name der Erkrankung: Laktose-Intoleranz 4. Hereditäre Fruktose-Intoleranz (Sequenzierung des Aldolase B Gens incl. Splice Sites). Name der Erkrankung: Heredit. Fruktose-Intoleranz (HFI), AldolaseB Defizienz 5. Hereditäre Fruktose-Intoleranz (Sequenzierung des FBP1 [Fruktose-1,6- Bisphosphatase] Gens incl. Splice Sites) Name der Erkrankung: Fruktose- 1,6-Bisphosphatase (FBP) Defizienz. 6. Mukoviszidose(Untersuchung des CFTR-Gens mithilfe eines PopulationsangepasstenScreening-Tests, Sequenzierung allerexons incl. Splice Sites und MLPA-Analysedes CFTR-Gens). Name der Erkrankung: Mukoviszidose(Zystische Fibrose) Alternative Erkrankung: atyp. Mukoviszidose(Heredit. Pankreatitis, CBAVD)

25 Stoffwechselerkrankungen(2) 7. MODY1 (Sequenzierung aller Exons des HNF4alpha-Gens incl. Splice Sites) Name der Erkrankung: MaturityOnsetDiabetes ofthe Young Typ 1 MODY1) 8. MODY2 (Sequenzierung aller Exons des Glucokinase [GCK]-Gens incl. Splice Sites). Name der Erkrankung: MaturityOnsetDiabetes ofthe Young Typ 2 (MODY2) 9. MODY3 (Sequenzierung aller Exons des HNF1alpha-Gens incl. Splice Sites) Name der Erkrankung: MaturityOnsetDiabetes ofthe Young Typ 3 (MODY3) 10. Hereditäre Pankreatitis durch Mutation im kationischen Trypsinogen (PRSS1) Gen (Sequenzierung aller Exonsdes PRSS1-Gens incl. Splice Sites und MLPA). Name der Erkrankung: Hereditäre Pankreatitis (PRSS1 Mut.) 11. Hereditäre Pankreatitis durch Mutation im Serinprotease-Inhibitor, Kazal- Typ 1 (SPINK1) Gen (Sequenzierung aller Exonsdes SPINK1-Gens incl. Splice Sites und MLPA). Name der Erkrankung: Hereditäre Pankreatitis (SPINK1 Mut.) 12. Hereditäre Pankreatitis durch Mutation im Chymotrypsin C-Gen (CTRC) (Sequenzierung aller Exons des CTRC-Gens incl. Splice Sites) Name der Erkrankung: Hereditäre Pankreatitis (CTRC Mut.)

26 AutoinflammatorischeErkrankungen 1. Familiäres Mittelmeerfieber (FMF); MEFV-Gen: Screen und Sequenzierung aller Exons incl. Splice Sites. Name der Erkrankung: Familiäres Mittelmeerfieber (FMF) 2. Hyper-IgD-Syndrom (HIDS); Mevalonatkinase(MVK)-Gen: Screen und Sequenzierung aller Exons incl. Splice Sites. Name der Erkrankung: Hyper-IgD- Syndrom (HIDS) 3. TNFalpha-Rezeptor assoziiertes Fiebersyndrom (TRAPS); TNFalpha-Rezeptor (TNFR)-Gen: Screen und Sequenzierung aller Exonsincl. Splice Sites. Name der Erkrankung: TNFalpha-Rezeptor assoz. Fiebersyndrom (TRAPS) 4. Cryopyrin-assoziierte Fieber-Syndrome; CIAS1-Gen: Screen und Sequenzierung aller Exons incl. Splice Sites. Name der Erkrankung: Cryopyrin-assoziierte Fieber- Syndrome (CAPS) 5. PAPA (pyogene, sterile Arthritis, Pyoderma gangränosum und Akne)-Syndrom; PSTPIP1- Gen: Sequenzierung von Exon10 und 11. Name der Erkrankung: PAPA (pyogene, sterile Arthritis, Pyoderma gangränosum und Akne)-Syndrom 6. Granulomatöse Erkrankungen BS/EOS/CD (Blau-Syndrom, Early-onset Sarcoidose)-S yndrom; NOD2-Gen: Sequenzierung von Exon1 bis 12. Name der Erkrankung: BS/EOS/CD (Blau-Syndrom, Early-onset Sarcoidose)-Syndrom

27 HCV Prognose 1. IL28B Polymorphismus: Position C/T im Promotor-Bereich(dbSNP: rs ; NT_ :g C>T) Name der Erkrankung: Prognose bzgl. HCV Clearance und Therapie

28 Sonstiges 1. Faktor H Polymorphismus: Position C>T, H402Y (= H384Y) [Exon9] (Prädisposition fürdie senile Makula-Degeneration = AMD). Name der Erkrankung: Senile Makula-Degeneration (AMD) 2. Familiäre hemiplegemigräne und Episodische Ataxie Typ 2 (Sequenzierung der Exons des CACNA1A- Gens incl. SpliceSites; Repeat-Analyse mittels Fragmentanalyse). Name der Erkrankung: Familiäre hemiplegemigräne Typ 1 (FHM1) Alternative Erkrankung: Episodische Ataxie Typ 2 (EA2) 3. Faktor XII Polymorphismus (5'UTR: -4 C>T; auch 46C>T genannt, dbsnp:rs , assoziiert mit aptt- Verlängerung). Name der Erkrankung: Milde Faktor XII Defizienz(verlängerte aptt)