Die Wirkung von Insulin und (-)-Phenylephrin auf ph i# [Na + ] i# [Ca 2+ ] i# [K + ]i und Plasmamembranpotential von Cardiomyocyten adulter Ratten DISSERTATION zur Erlangung des Doktorgrades des Fachbereichs Chemie der Universität Hamburg vorgelegt von Michaela Kohler-Schütz aus BERLIN Hamburg 1997
INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG 1 1.1 Der cytosolische ph-wert 1 1.2 Die Regulation des cytosolischen ph-wertes 2 1.2.1 Protonenanreicherungsprozesse in der Zelle 3 1.2.2 Pufferwirkungen 3 1.2.3 Protonenaustauschmechanismen und H*-ATPasen 4 1.2.3.1 HCO 3"-abhängige Austauschmechanismen und H*-ATPasen 4 1.2.3.2 Der Na*/H*-Antiporter in der Plasmamembran 7 1.2.3.2.1 Vorkommen und Eigenschaften des Na*/H*-Antiporter 7 1.2.3.2.2 Regulation und Stimulation des Na*/H*-Antiporters 12 1.2.3.2.3 Veränderungen der [Na*] 4 und [Ca 2 *], durch den Na*/H*-Antiporter 22 1.3 -"" Effekte von Insulin auf die cytosolischen Ionenkonzentrationen 25 1.3.1 Das Signalsystem des Insulins 25 1.3.1.1 Der Insulinrezeptor und Insulinbindung 25 1.3.1.2 Signaltransduktion von Insulin 26 1.3.2 Effekte von Insulin auf den Na*/H*-Antiporter, phi, [Na'li, [Ca 2 ] lf [K*] i und das Plasmamembranpotential 28 1.3.2.1 Effekte von Insulin auf den Na*/H*-Antiporter und den phj-wert 28 1.3.2.2 Effekte von Insulin auf die cytosolische Natriumionenkonzentration [Na*] j 2 9 1.3.2.3 Effekte von Insulin auf die cytosolische Calciumionenkonzentration [Ca 2 *] t 29 1.3.2.4 Effekte von Insulin auf die cytosolische Kaliumkonzentration [K*] 4 33 1.3.2.5 Effekte von Insulin auf das Plasmamembranpotential 33 2 PROBLEMSTELLUNG : 35 3 MATERIAL UND METHODEN 37 3.1 Tierhaltung 37
3.2 Isolierung und die Herstellung von Cardiomyocytenmonlayern 37 3.2.1 Cardiomyocyten-Isolierung 37 3.2.2 Zellzählung 39 3.3 Vitalitätstest 39 3.3.1 Lichtmikroskopische Untersuchungen und Trypanblaufärbung 3 9 3.3.2 [Ca 2 *] j-messung nach der Depolarisierung der Plasmamembran der Cardiomyocyten mit KC1 40 3.4 Herstellung der Cardiomyocytenmonolayer 40 3. S Fluorimetrische Bestimmungen von cytosolischen lonenkonzentrationen 41 3.5.1 Messung des cytosolischen ph-wertes ph t 43 3.5.2 Messung der [Ca 2 *],, der [Na*] ( und [K*], 47 3.5.3 Messung des Membranpotentials.'. 48 3.6 Statistische Auswertung 50 3.7 Geräte und Chemikalien 50 3.7.1 Geräte 50 3.7.2 Chemikalien 51 4 ERGEBNISSE 52 4.1 Charakterisierung der Cardiomyocyten 52 4.1.1 Morphologie und Zellzahlbestimmung 52 4.1.2 Vitalität der Cardiomyocyten 53 4.2 Cytosolische ph-wert-messung 54 4.2.1 Spektroskopische Eigenschaften und der ph,-wert unstimulierter Cardiomyocyten 54 4.2.2 Aktivitätsbestimmungen des Na*/H*-Antiporter 56 4.2.2.1 Zeitverlauf des phj nach der Zugabe von Natriumpropionat 56 4.2.2.2 Abhängigkeit des Protonennettofluxes J, H1 vom ph, und die Bestimmung der kinetischen Parameter des Na*/H*-Antiporters 57 4.2.2.3 Hemmung und Ionenspezifität des Na*/H'-Antiporters 59 4.2.3 Effekte von Insulin auf den ph,-wert 61 4.2.3.1 Zeitverlauf des Insulineffektes auf den ph,-wert 61
4.2.3.2 Konzentrationsabhängigkeit des Insulineffektes 62 4.2.3.3 Hemmung und Ionenspezifität des Insulineffektes 63 4.2.4 Aktivierung des Na*/H*-Antiporters durch Insulin 66 4.2.4.1 Abhängigkeit des Protonennettofluxes J (HI von der Insulinkonzentration 66 4.2.4.2 Bestimmung der kinetischen Parameter des Na*/H*-Antiporters unter Insulinwirkung 68 4.2.4.3 Hemmbarkeit der durch Insulin verursachten Aktivierung des Na*/H*-Antiporters.. 70 4.2.5 Effekte von (-) -Phenylephrin auf den phi-wert 72 4.2.5.1 Konzentrationsabhängigkeit des (-)-Phenylephrineffektes 72 4.2.5.2 Bestimmung der kinetischen Parameter des Na*/H*-Antiporters unter (-)-Phenylephrinwirkung 73 4.3 Effekte von Insulin auf die cytosolische '^ freie Natriumionenkonzentration [Na*] i 75 i 4.3.1 Zeitverlauf des Insulineffektes auf die [Na*] L 75 4.3.2 Hemmbarkeit des Insulineffektes auf die [Na*] j 76 4.4 Effekte von Insulin auf die cytosolische freie Calciumionenkonzentration [Ca 2 *] t 79 4.4.1 Zeitverlauf des Insulineffektes auf die [Ca 2 *] i 79 4.4.2 Konzentrationabhängigkeit des Insulineffektes auf die cytosolische freie [Ca 2 *] i - 80 4.4.3 Hemmbarkeit des Insulineffektes auf die [Ca 2 *], 81 4.4.3.1 Einfluß der extrazellulären [Ca 2 *] auf den Insulineffekt 81 4.4.3.2 Einfluß von Verapamil und Nifedipin auf den Insulineffekt 82 4.4.3.3 Einfluß von Ryanodin auf den durch Insulin verursachten Anstieg der [Ca 2 *] j 83 4.4.3.4 Abhängigkeit des durch Insulin verursachten Anstiegs der [Ca 2 *] i von der extrazellulären [Na*] 84 4.4.3.5 Einfluß von Amilorid und Ethylisopropylamilorid auf den durch Insulin verursachten Anstieg der [Ca 2 *] i 85
4.4.3.6 Effekt von PKC-Inhibitoren auf den [Ca 2 *]!-Ef f ekt von Insulin 88 4.5 Effekte von Insulin auf die cytosolische freie Kaliumionenkonzentration [K*] i 89 4.5.1 Zeitverlauf des Insulineffektes auf die cytosolische freie Kaliumkonzentration [K*] t 89 4.5.2 Hemmbarkeit des Insulineffektes auf die [K*], 90 4.6 Bestimmung des Plasmamembranpotentials 90 4.6.1 Beladungsverlauf und Kalibration der Fluoreszenzintensitäten von bis-oxonol 90 4.6.2 Einfluß von Insulin auf das Plasmamembranpotential 92 4.6.3 Hemmbarkeit des Insulineffektes auf das Plasmamembranpotential 93 4.6.3.1 Abhängigkeit des Insulineffekts auf das Plasmamembranpotential von der extrazellulären [Na*] 93 4.6.3.2 Wirkung von Glukose auf den Insulineffekt 94 5 DISKUSSION 95 5.1 Methodik 95 5.2 Cytosolische Ionenkonzentrationen und Aktivität des Na*/H*-Antiporters 97 5.2.1 ph, und kinetische Parameter des Na*/H*-Antiporters in unstimulierten Cardiomyocyten 97 5.2.2 Effekte von Insulin auf den ph!-wert und den Na*/H*- Antiporter 101 5.2.3 Effekte von (-)-Phenylephrin auf den phi-wert und den Na*/H*-Antiporter 107 5.2.4 Die Insulineffekte auf die [Na*h, [Ca 2 *h, [K*] i und das Plasmamembranpotential von Cardiomyocyten 110 6 ZUSAMMENFASSUNG 124 7 LITERATURVERZEICHNIS 129