Aus der III. Medizinischen Klinik und Poliklinik (Hämatologie, Internistische Onkologie und Pneumologie) der Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz Auswirkungen von Antimykotika auf die T-Zell-vermittelte Immunantwort im Tiermodell Inauguraldissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz vorgelegt von Jana Kober aus Sangerhausen Mainz, 2015
Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis... 1 Abkürzungsverzeichnis...5 Abbildungsverzeichnis...7 Tabellenverzeichnis...7 1 Einleitung...8 1.1 Invasive Pilzinfektionen und die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation... 8 1.2 Ziel der Arbeit...9 2 Literaturdiskussion... 10 2.1 Invasive Pilzinfektionen... 10 2.1.1 Humanpathogene Pilze...... 10 2.1.2 Invasive Pilzinfektionen im Rahmen der allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation...12 2.1.3 Kandidose und Aspergillose bei HSCT-Patienten... 14 2.1.4 Therapie invasiver Pilzinfektionen mit Antimykotika...16 2.1.5 Immunmodulatorische Effekte von Antimykotika...19 2.2 Grundlagen der Hämatopoese und des Immunsystems...22 2.2.1 Gesunde Blutbildung...22 2.2.2 Angeborene und adaptive Immunität... 25 2.2.3 T-Lymphozyten... 26 2.2.4 Maligne hämatologische Neoplasien... 28 2.3 Allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation...29 2.3.1 Prinzip der allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation... 29 2.3.2 Graft-versus-Host Disease... 31 2.3.3 Graft-versus-Leukemia Effekt... 34 2.3.4 Immunrekonstitution... 36 3 Material...39 3.1 Software... 39 3.2 Geräte... 39 3.3 Verbrauchsmaterialien... 40 3.4 Glaswaren... 41
3.5 Chemikalien, Isotope und Reagenzien... 41 3.6 Zytokine...42 3.7 Kit-Systeme...43 3.8 MACS MicroBeads und Zubehör... 43 3.9 FACS Antikörper... 43 3.10 EliSpot Antikörper...43 3.11 Zellkulturmedien und Zusätze... 44 3.11.1 Zellkulturmedium für murine Zellen...44 3.12 Antimykotika... 45 3.12.1 Posaconazol... 45 3.12.2 Voriconazol... 45 3.13 Allgemeinanästhetische Lösung... 46 3.14 SIINFEKL- Aldara -Creme...46 3.15 FACS Pufferlösung... 46 3.16 FACS Antikörperlösung für den in vivo Zytotoxizitätsassay...46 3.17 CFSE-Lösung... 47 3.18 Murine Zellen... 47 3.18.1 CD8+ T-Zellen aus C57BL/6-Mäusen... 47 3.18.2 Milzzellen aus F1 -Mäusen... 47 3.18.3 Milzzellen aus C57BL/6-Mäusen... 47 3.19 Tumorzelllinie... 48 3.19.1 E.G7-OVA Thymomzelllinie... 48 4 Methoden...49 4.1 Zellkultur... 49 4.1.1 Protokoll der murinen Mixed lymphocyte reaction...49 4.1.2 Mechanische Zellseparation und Erythrozytenlyse... 50 4.1.3 MACS Zellseparation... 50 4.2 Bestimmung der T-Lymphozyten Proliferation in vitro... 51 4.2.1 Zellzählung und Vitalitätstest mit Trypanblau... 51 4.2.2 3H-Thymidin Proliferationsassay... 51 4.3 Bestimmung der T-Lymphozyten Funktion in vitro... 52 4.3.1 Interferon-γ Enzyme-linked immunospot technique Assay... 52
4.4 Applikation von Posaconazol in vivo... 54 4.4.1 Protokoll... 54 4.4.2 Gewichtsadaptierte Applikation von Posaconazol in die Maus... 55 4.4.3 Versuchstiere... 55 4.4.4 Serumgewinnung aus murinem Vollblut... 55 4.4.5 Hochdruckflüssigkeitschromatografie-Massenspektrometrie... 55 4.5 In vivo Durchflusszytometrie und Tumorversuch... 56 4.5.1 Protokoll... 56 4.5.2 Versuchstiere... 56 4.5.3 Transkutane Immunisierung mit SIINFEKL... 57 4.5.4 SIINFEKL-T etramerfárbung... 58 4.5.5 In vivo Zytotoxizitätsassay... 59 4.5.6 Tumormodell... 60 4.6 Statistische Auswertung der Ergebnisse... 62 5 Ergebnisse... 63 5.1 Auswirkungen von Antimykotika auf murine T-Lymphozyten in vitro...63 5.1.1 Einführung in die murine Zellkultur... 63 5.1.2 Proliferation und Funktion von haploreaktiven CD4+ T-Lymphozyten in vitro... 63 5.1.3 Proliferation und Funktion von haploreaktiven CD8+ T-Lymphozyten in vitro... 68 5.2 Dosis-Serumspiegel Beziehung von Posaconazol in vivo... 73 5.3 Auswirkungen von Posaconazol auf murine CD8+ T-Lymphozyten in vivo... 74 5.3.1 Einführung in die murinen in vivo Versuche... 74 5.3.2 Relativer Anteil SIINFEKL-spezifischer CD8+ T-Zellen in vivo nach TCI...74 5.3.3 Mittlere spezifische Lyse SIINFEKL-spezifischer CD8+ T-Zellen... 76 5.3.4 Auswirkungen von Posaconazol auf die Tumorabwehr SIINFEKL-spezifischer CD8+ T-Zellen... 78 6 Diskussion... 81 6.1 In vitro Versuche... 81 6.1.1 Auswirkungen von Antimykotika auf humane und murine T-Zellen in vitro...81 6.1.2 Gründe für die immunmodulatorischen Antimykotika-Effekte in vitro...84 6.2 In vivo Versuche... 86 6.2.1 Etablierung relevanter Posaconazol-Serumspiegel in vivo...86
6.2.2 Diskrepanz zwischen Antimykotika-Effekten in vitro und in vivo... 88 6.3 Bedeutung von Antimykotika-Effekten im Gesamtkontext der allogenen HSCT... 91 6.4 Ausblick... 93 7 Zusammenfassung... 95 8 Literaturverzeichnis... 97 9 Danksagung... 117 10 Lebenslauf... 118