Untersuchung Molybdäncofaktor-haltiger MOSC-Proteine aus Escherichia coli, Homo sapiens, Mus musculus und Arabidopsis thaliana Von der Fakultät für Lebenswissenschaften der Technischen Universität Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigte Dissertation von Debora Anne Reichmann aus Hachenburg
Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 1.1 Der Molybdäncofaktor 1 1.2 Die Familie der MOSC-Proteine 5 1.3 Die prokaryotischen MOSC-Proteine YcbX und YiiM 7 1.4 Das eukaryotische MOSC-Protein marc 10 1.5 Zielsetzungen der Arbeit 12 2 Ergebnisse 14 2.1 Die prokaryotischen MOSC-Proteine YcbX und YiiM 14 2.1.1 Sequenzanalysen von YcbX und YiiM 14 2.1.2 Klonierung, Expression und Aufreinigung von YcbX und YiiM 16 2.1.3 Charakterisierung von YcbX und YiiM als Moco-haltige MOSC-Proteine 18 2.1.4 Untersuchungen zum putativen Eisen-Schwefel-Cluster von YcbX 20 2.1.5 Charakterisierung der putativen Elektronendonoren CysJ und Fre 23 2.1.6 Untersuchungen der Oligomerisierung und Interaktion 29 2.1.7 Untersuchungen zur Reduktion von N-hydroxylierten Verbindungen durch YcbX und YiiM 31 2.1.8 Funktion des 2Fe2S-Clusters von YcbX 35 2.2 Das eukaryotische MOSC-Protein marc 38 2.2.1 Optimierung der Aufreinigung von marc, Cytochrom b; und Cytochrom ^Reduktase 38 2.2.2 Expression und Aufreinigung der nicht-trunkierten humanen marc-proteine in Pichiapastoris 39 2.2.3 Kristallisation des humanen marc-1 Proteins 43 2.2.4 Generierung und Charakterisierung von Einzel-Nukleotid-Polymorphismen in den humanen marc-proteinen und des humanen Cytochrom bs 44 2.2.5 Oligomerisierung von marc 47 2.2.6 Untersuchungen zu Interaktionen von marc aus Mus musculus und Arabidopsis thaliana 49 2.2.7 Lokalisierungs- und Expressionsstudien der pflanzlichen marc-proteine ms Arabidopsis thaliana 51 2.2.7.1 Untersuchung des Expressionslevels von pmarc-1 und pmarc-2 auf mrna-ebene 52
2.2.7.2 Subzelluläre Lokalisierung von mit Venus-fusiomerten pmarc-proteinen in Arabidopsis thaliana und Nicotiana benthatniana 54 2.2.7.3 Isolierung von pmarc-1 aus Arabidopsis thaliana 59 2.2.8 Generierung eines marc-knockout mittels Zink-Finger-NukleasefO Technologie in Mus musculus 2.2.8.1 Transfektion muriner embryonaler Stammzellen mit Zink-Finger-Nukleasen 64 2.2.8.2 Transfektion muriner embryonaler Stammzellen mit Zink-Finger-Nukleasen und Donorplasmid 2.3 Untersuchungen zur Funktion des konservierten MOSC-Cysteins in pro- und eukaryotischen MOSC-Proteinen 68 2.3.1 Biochemische Charakterisierung der MOSC-Cystein-Varianten 68 2.3.2 Die Funktion des konservierten MOSC-Cysteins 7' 3 Diskussion ^ 3.1 Analyse der prosthetischen Gruppen von YcbX und YiiM 75 3.2 Untersuchung der putativen Elektronentransportproteine CysJ und Fre 76 3.3 Reduktion N-hydroxylierter Verbindungen durch YcbX und YiiM 78 3.4 Ist der 2Fe2S-Clusters ein intramolekularer Elektronenüberträger? 80 3.5 Die Funktion des konservierten MOSC-Cysteins in YcbX 81 3.6 Untersuchungen der humanen marc-proteine im Hinblick auf Expression im eukaryotischen System, Oligomerisierung und Interaktion 84 3.7 Einfluss von Einzel-Nukleotid-Polymorphismen der marc-proteine auf die Effizienz der Prodrug-Aktivierung 88 3.8 Expression unter Stressbedingungen und Lokalisierung der pflanzlichen marc-proteine aus Arabidopsis thaliana 89 3.9 Generierung einer Knockout-Maus-Linie zur Untersuchung der physiologischen Funktion der marc-proteine 91 3.10 Mögliche physiologische Funktionen der marc-proteine 91 4 Material und Methoden 94 4.1 Materialien 94 4-1-1 Organismen 94 4.1.2 Plasmide 95 4-1.3 Primer 95 4-' ^ Antikörper und Konjugate 99 4-' 5 Chemikalien und Zellkulturmedien 99 ^
4.1.6 Materialien und Geräte 100 4.2 Molekularbiologische Methoden 101 4.2.1 Herstellung rekombinanter DNA-Konstrukte 101 4.2.2 Isolierung genomischer DNA 102 4.2.2.1 Genomische DNA aus Mus musculus 102 4.2.2.2 Genomische DNA aus Escherichia coli 102 4.2.3 Isolierung von RNA 103 4.2.3.1 Gesamt-RNA aus Pflanzen 103 4.2.4 Gesamt-RNA aus Mus musculus 103 4.2.5 Reverse Transkriptase-Reaktion 103 4.2.6 Polymerase-Kettenreaktion 104 4.2.6.1 Klonierungs-PCR 104 4.2.6.2 Mutagenese-und Fusions-PCR 105 4.2.7 Gateway-Klonierung 105 4.2.8 Cel-I Assay zur Analyse putativ positiver Stammzellklone 105 4.2.9 DNA-Sequenzierung 106 4.3 Biochemische Methoden 107 4.3.1 Überexpression rekombinanter Proteine in Escherichia coli 107 4.3.2 Überexpression rekombinanter Proteine in Pichiapastoris 108 4.3.3 Affinitätschromatographische Aufreinigung His6-getaggter Proteine 109 4.3.4 Affinitätschromatographische Aufreinigung GST-getaggter Proteine 109 4.3.5 Affinitätschromatographische Aufreinigung StrepII-getaggter Proteine 110 4.3.6 Ionenaustauscherchromatographie 110 4.3.6.1 Anionenaustauscherchromatographie 111 4.3.6.2 Kationenaustauscherchromatographie 111 4.3.7 Größenausschlusschromatographie 112 4.3.8 Bestimmung von Proteinkonzentrationen 113 4.3.9 Umpuffern von Proteinen 113 4.3.10 Ankonzentrieren von Proteinen 114 4.3.11 Crosslinking 114 4.3.12 Denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 115 4.3.13 Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese 115 4.3.14 2D-Gelelektrophorese 115 4.3.15 Silberfärbung von Proteingelen 116
4.3.16 Immunologischer Nachweis von Proteinen (Immunblot) 116 4.3.17 Proteinsequenzierung H8 4.3.1g Proteinidentifizierung mittels MALDI-TOF und LC-MS 118 4.3.19 Bestimmung des säurelabilen Schwefels der Eisen-Schwefel-CIuster 118 4.3.20 Bestimmung des Eisengehaltes von Proteinlösungen 119 4.3.21 M/-7-Rekonstitutionsassay H9 4.3.21.1 Quantifizierung des MPT/Moco-Gehaltes 120 4.3.21.2 Nachweis von MPT/Moco-haltigen Fraktionen 120 4.3.22 FormA-dephospho Analyse 121 4.3.23 ICP-MS Analyse 122 4.3.24 FAD/FMN Bestimmung 122 4.3.25 Identifizierung von gebundenem Flavin mittels SDS-Behandlung 123 4.4 Spektroskopische Methoden 123 4.4.1 Zirkulardichroismus-Spektroskopie 123 4.4.2 Elektronenspinresonanz-Spektroskopie 123 4.5 Methoden zur Bestimmung der Proteinaktivität 124 4.5.1 HPLC-basierte Aktivitätsmessung der MOSC-Proteine 124 4.5.2 Methylviologen-basierte Aktivitätsmessung der MOSC-Proteine 124 4.5.3 Superoxid-Dismutase-sensitive Reduktion von Cytochrom c durch O2" 126 4.5.4 In-Gel Aktivitätsassay für Xanthindehydrogenase und Aldehydoxidase 126 4.6 Methoden der tierischen Zellkultur 126 4.6.1 Kulturbedingungen 126 4.6.2 Kultivierung und mitotische Inaktivierung muriner embryonaler Fibroblasten 127 4.6.3 Kultivierung muriner embryonaler Stammzellen 128 4.6.4 Transfektion embryonaler Stammzellen durch Elektroporation 128 4.7 Arbeiten mit Arabidopsis thalianauxid Nicotiana benthamiana 129 4.7.1 Pflanzenanzucht 129 4-7.2 Indirekter Gentransfer durch Infiltration von Agrobacterium tumefaciens in Pflanzen 129 4.7.3 Direkter Gentransfer in Pflanzen mittels Partikelkanone 129 5 Zusammenfassung 131 6 Literaturverzeichnis 132