Inhaltsverzeichnis I Abbildungsverzeichnis VI Tabellenverzeichnis VIII Abkürzungsverzeichnis IX 1 Einleitung 1 2 Material und Methoden 10 2.1 Liste der verwendeten Geräte und Feinchemikalien 10 2.1.1 Geräte 10 2.1.2 Verbrauchsmaterialien 12 2.1.3 Fein- und Radiochemikalien 13 2.2 Enzyme und Antikörper 15 2.2.1 Enzyme 15 2.2.2 Antikörper 15 2.3 Nukleinsäuren 16 2.3.1 Oligonukleotide 16 2.3.2 Plasmid-Vektoren 17 2.4 Biologisches Material 17 2.4.1 Bakterienstämme 17 2.4.2 Pflanzenmaterial 18 2.5 Anzucht und Lagerung des biologischen Materials 18 2.5.1 Anzucht, Transformation und Lagerung von Bakterien 18 2.5.2 Anzucht von Escherichia coli zur heterologen Überexpression von Proteinen 18 2.5.3 Anzucht nicht steriler Pflanzen 19 2.5.4 Sterilisation des Saatguts 19 2.5.5 Aussaat und Anzucht auf Festmedium 19 2.6 Molekularbiologische Methoden 20 2.6.1 Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli 20 2.6.2 Isolierung von Gesamt-RNA aus Pflanzen 20 2.6.3 Enzymatische Manipulation von Nukleinsäuren 20 2.6.4 Erzeugung von komplementärer DNA 21 2.6.5 Polymerase-Kettenreaktion 21 2.6.6 Gelelektrophoretische Trennung von Nukleinsäuren 21 2.6.7 Sequenzierung doppelsträngiger DNA 21 2.7 Biochemische Methoden 22 2.7.1 Kopplung von 5-Hydroxy-L-tryptophan an Rinderserumalbumin 22 I
2.7.2 Synthese von [ 3 H] 3-6-Azido-L-tryptophan 22 2.7.3 Synthese von [ 3 H] 2-6-Azidoindol-3-acetamid 23 2.7.4 Synthese von [ 2 H] 5 -Indol-3-acetamid 24 2.7.5 Kopplung von Immunglobulin G an Sepharose 25 2.8 Präparationsmethoden 25 2.8.1 Gewinnung bakteriell überexprimierter Strep-tag-II- und (His) 6 -Fusionsproteine 25 2.8.2 Präparation einer bakteriellen Tryptophan-2-Monooxygenase 26 2.8.3 Reinigung der Tryptophan-Synthase von Salmonella typhimurium 27 2.8.4 Präparation pflanzlicher Enzymrohextrakte 27 2.8.5 Extraktion indolischer Verbindungen aus Pflanzengewebe 27 2.9 Enzymatische Analysen 28 2.9.1 Photometrische Bestimmung der Aktivität heterolog exprimierter Amidase 28 2.9.2 Bestimmung der Aktivität bakteriell exprimierter Amidase mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie 28 2.9.3 Nachweis des Indol-3-acetamid-Umsatzes in pflanzlichen Proteinextrakten 29 2.9.4 Aktivitätsbestimmung der Nitrilasen 29 2.9.5 Bestimmung der Indol-3-essigsäure-Synthase-Aktivität 30 2.9.6 Analyse der Tryptophanmetabolisierung in pflanzlichen Proteinextrakten mittels gekoppelter HPLC/GC-MS/MS-Technik 30 2.10 Chromatographische Trenntechniken 31 2.10.1 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie 31 2.10.1.1 Präparative Reinigung von [ 3 H] 3-6-Azido-L-tryptophan 31 2.10.1.2 Isolierung indolischer Komponenten aus komplexen Substanzgemischen 31 2.10.2 Flüssigkeitschromatographie 31 2.10.2.1 Präparative Ionenaustauschchromatographie an Hydroxyapatit 32 2.10.2.2 High Q-Anionenaustauschchromatographie 32 2.10.2.3 Hochdruckgelpermeationschromatographie 32 2.10.2.4 Affinitätschromatographie an Strep-Tactin-Sepharose 33 2.10.2.5 Affinitätschromatographische Reinigung von (His) 6 -Fusionsproteinen 33 2.10.2.6 Immunaffinitätschromatographie 33 2.11 Massenspektrometrie 34 2.11.1 Darstellung des Indol-3-essigsäuremethylesters 34 2.11.2 Synthese von Diazomethan 34 II
2.11.3 Trifluoracetylierung des Indol-3-acetamid 34 2.11.4 Gaschromatographisch-massenspektrometrische Darstellung von Indol-3- essigsäure 34 2.11.5 Analyse indolischer Verbindungen mittels gaschromatographisch-massenspektrometrischer Methoden 35 2.11.6 Peptidsequenzierung mittels ESI-QTOF-Massenspektrometrie 36 2.12 Elektrophoretische Trenntechniken 36 2.12.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 36 2.12.2 Zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese 37 2.12.3 Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese 37 2.12.4 Blau-Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese 38 2.12.5 Elektrophoretische Elution geladener Makromoleküle 38 2.13 Immunologische Methoden 39 2.13.1 Elektrophoretischer Transfer von Proteinen auf Nitrocellulose 39 2.13.2 Immunologischer Nachweis immobilisierter Proteine 39 2.13.3 Immunisierung von Kaninchen und Gewinnung von Antiseren 40 2.13.4 Nachweis Strep-tag-II-markierter Fusionsproteine 40 2.13.5 Reinigung spezifischer Antikörper 40 2.14 Photoaffinitätsmarkierung von Proteinen unter Einsatz der Radioliganden [ 3 H] 3-6-Azido-L-tryptophan und [ 3 H] 2-6-Azidoindol-3-acetamid 41 2.15 Proteinbestimmung 41 2.16 Radioaktivitätsbestimmung 41 2.17 Rechnergestützte Sequenzanalysen 42 2.18 Auswertung 42 3 Ergebnisse 43 3.1 Vergleich der Aktivität der IES-Synthase in unterschiedlichen Pflanzenspezies 43 3.2 Anreicherung der tryptophanmetabolisierenden Proteinfraktion aus Arabidopsis thaliana 44 3.2.1 Anreicherung der Indol-3-essigsäure-Synthase mittels Chromatographie an Hydroxyapatit 45 3.2.2 Anreicherung der Indol-3-essigsäure-Synthase-Aktivität mittels High Q- Anionenaustauschchromatographie 46 3.2.3 Molekulargewichtsbestimmung und Anreicherung des Indol-3-essigsäure- Synthase-Komplexes durch Hochdruckgelpermeationschromatographie 47 3.2.4 Chromatographie an einer Tryptophanaffinitätsmatrix zur Reinigung des Indol-3-essigsäure-Synthase-Komplexes 48 III
3.3 Trennung angereicherter Indol-3-essigsäure-Synthase-Fraktionen durch native Gelelektrophorese 49 3.3.1 Separation von Proteinkomplexen über exponentielle Gradientengele 49 3.3.2 Molekulargewichtsbestimmung und Anreicherung der Indol-3-essigsäure- Synthase-Aktivität mittels Blau-Nativer Gelelektrophorese 51 3.4 Beteiligung einer Flavin-Monooxygenase (YUCCA) an der tryptophanabhängigen Indol-3-essigsäure-Biosynthese 54 3.4.1 Konstruktion und Überprüfung eines Expressionssystems zur heterologen Expression eines (His) 6 -YUCCA-Fusionsproteins 55 3.4.2 Gewinnung polyklonaler Antikörper gegen YUCCA-Proteine 58 3.4.3 Immunologischer Nachweis von YUCCA im Pflanzenrohextrakt 59 3.4.4 Immunpräzipitation der Indol-3-essigsäure-Synthase unter Verwendung von α-yucca-antikörpern 60 3.5 Analyse potentieller Metaboliten und Inhibitoren der Indol-3-essigsäure- Biosynthese 62 3.5.1 Wirkung von Indol-3-essigsäurehydrazid auf die Indol-3-essigsäure-Synthase-Aktivität 62 3.5.2 Tryptamin als putative Zwischenstufe der Indol-3-essigsäure-Biosynthese 63 3.5.3 Verdünnung der Indol-3-essigsäure-Synthase-Aktivität durch Indol-3- acetamid 64 3.5.4 Tryptophan als biosynthetische Vorstufe von Indol-3-acetamid 65 3.5.5 Einfluß von Tryptophan auf den in-vitro-umsatz von Indol-3-acetamid zur Indol-3-essigsäure 68 3.5.6 Stereoselektivität der Indol-3-acetamid Synthese 70 3.6 Vorkommen und Bildung von Indol-3-acetamid in Arabidopsis thaliana 72 3.6.1 Endogener Indol-3-acetamid-Gehalt in sterilen Arabidopsis thaliana-keimlingen 72 3.6.2 Indol-3-acetamid als zweites Endprodukt der Nitrilasereaktion 74 3.7 Untersuchungen zur Metabolisierung von Indol-3-acetamid in Arabidopsis thaliana 76 3.7.1 Analyse abgeleiteter Aminosäuresequenzen für Indol-3-acetamid-Hydrolasen aus pflanzenpathogenen Bakterien 77 3.7.2 Analyse der Aminosäuresequenzen der vier putativen Amidasen aus Arabidopsis thaliana 78 3.7.3 Konstruktion und Verifikation von Plasmid-Vektoren zur heterologen Expression von Amidase-Proteinen 80 3.8 Enzymatische Charakterisierung der heterolog exprimierten Amidasen aus Arabidopsis thaliana 84 3.8.1 Substratspezifität der bakteriell exprimierten Amidase-Fusionsproteine 85 IV
3.8.2 Ermittlung enzymatischer Parameter der Amidase 1 87 3.8.3 Untersuchungen zur Tertiärstruktur des Strep-Amidase 1-Fusionsproteins 88 3.8.4 Immunologischer Nachweis der Amidase 1 und 2 aus Arabidopsis thaliana 90 3.8.5 Bestimmung der Amidaseaktivität im Pflanzenrohextrakt und Anreicherung der Enzymaktivität durch Chromatographie an Hydroxyapatit 92 3.9 Amidasen als Bestandteil des Indol-3-essigsäure-Synthase-Komplexes 92 3.9.1 Immunpräzipitation der Indol-3-essigsäure-Synthase unter Verwendung der α-ami-seren 93 3.9.2 Versuche zur immunaffinitätschromatographischen Anreicherung des Indol-3-essigsäure-Synthase-Komplexes 95 3.10 Versuche zur Photoaffinitätsmarkierung der Indol-3-essigsäure-Synthase 97 3.10.1 Markierung der Indol-3-essigsäure-Synthase mit [ 3 H] 3-6-Azido- L-tryptophan 97 3.10.2 Photoaffinitätsmarkierung unter Verwendung von [ 3 H] 2-6-Azidoindol-3-acetamid 98 4 Diskussion 101 5 Zusammenfassung 121 6 Literaturverzeichnis 124 Anhang 141 Danksagung 145 Lebenslauf 146 V