Rolle von CD4 + CD25 + regulatorischen T-Zellen bei der chronischen HCV-Infektion

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1 Aus der Medizinischen Universitätsklinik - Abteilung Innere Medizin II - Der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Rolle von CD4 + CD25 + regulatorischen T-Zellen bei der chronischen HCV-Infektion I N A U G U R A L - D I S S E R T A T I O N zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Vorgelegt: 2005 von: geboren in: Tobias Elmar Böttler Berlin

2 Dekan: Prof. Dr. med. Christoph Peters 1. Gutachter: Prof. Dr. med. Drs. h.c. Hubert E. Blum 2. Gutachter: Prof. Dr. med. Hans-Hartmut Peter Jahr der Promotion: 2007

3 meiner Familie

4 4 Inhalt 1 Abkürzungsverzeichnis 6 2 Einleitung T-Zell-Immunologie Das Hepatitis C Virus T-Zell-Antwort bei der Hepatitis C Virusinfektion Regulatorische T-Zellen Regulatorische T-Zellen bei Infektionskrankheiten Zielsetzung 14 3 Material und Methoden Studienpopulation Zellkulturarbeiten Isolierung von Lymphozyten Zellselektionen Antikörperfärbungen Transwell -Assays Zytokin-Neutralisations-Assays Antigenspezifische Untersuchungen Antigenspezifisches Wachstum Tetramer-Färbung Intrazelluläre Zytokin-Färbung CFSE-Färbung Durchflusszytometrie Statistik 25

5 5 4 Ergebnisse Die Depletion von CD4 + Zellen führt zu einer gesteigerten in vitro Expansion von HCV-spezifischen CD8 + T-Zellen bei Patienten mit einer chronischen HCV-Infektion CD4 + CD25 + T reg -Zellen hemmen die in vitro Expansion HCVspezifischer CD8 + T-Zellen T reg -Zellen hemmen die IFN-γ Produktion von HCV-spezifischen CD8 + T-Zellen T reg -Zellen vermitteln ihre Wirkung dosisabhängig Die Suppression durch T reg -Zellen ist Zell-Zell-Kontakt abhängig Die Inhibition durch T reg -Zellen ist unabhängig von IL-10 und TGF-β Einfluss von IL-2 auf die Wirkung von T reg -Zellen Stärkere Inhibition virusspezifischer T-Zell-Antworten bei Patienten mit chronischer HCV-Infektion im Vergleich zu gesunden Probanden und Personen, die das Virus eliminiert haben Erhöhte Frequenz von T reg -Zellen bei Patienten mit chronischer HCV- Infektion 37 5 Diskussion 39 6 Zusammenfassung 46 7 Literatur 47 8 Originalarbeiten 52 9 Danksagung Lebenslauf 54

6 1 Abkürzungsverzeichnis 6 1 Abkürzungsverzeichnis Ak APC APZ CD Cy-7 FACS FCS Flu FITC HCV HIV HLA IFN Ig IL i.v. MACS MHC n.u. PBMC PBS PE PMA RNA RPMI+++ rpm TGF T reg -Zellen TZR Antikörper Allophycocyanin (FACS-Fluoreszenz) Antigen präsentierende Zellen Cluster of Differentiation Cychrome-7 (FACS-Fluoreszenz) Fluorescence Activated Cell Sorting Fetal Calf Serum Influenza Fluorescein Isothiocyanate (FACS-Fluoreszenz) Hepatitis C Virus Humanes Immundefizienz Virus Humanes Leukozyten Antigen Interferon Immunglobulin Interleukin intravenös Magnetic Cell Sorting Major Histocompatibility Complex nicht untersucht Peripheral Blood Mononuclear Cells Phosphate Buffered Saline Phycoerythrin (FACS-Fluoreszenz) Phorbol Myristate Acetate Ribonucleotid Acid Zellmedium mit definierten Zusätzen (Material und Methoden) revolutions per minute Transforming Growth Factor CD4 + CD25 + regulatorische T-Zellen T-Zell-Rezeptor

7 2 Einleitung 7 2 Einleitung 2.1 T-Zell-Immunologie Der Mensch ist ständig einer Vielzahl von potenziell krankheitserregenden Mikroorganismen ausgesetzt. Der Körper ist jedoch in der Lage, die meisten dieser Erreger zu eliminieren, ohne dass es zu einer Erkrankung kommt. Für die Elimination der Erreger ist das Immunsystem des Menschen verantwortlich. Es wird zwischen einer unspezifischen und einer spezifischen Immunabwehr unterschieden. Zum unspezifischen oder angeborenen Immunsystem gehören natürliche Barrieren wie die Haut, die Schleimhäute oder epitheliale Grenzschichten. Weiterhin werden antimikrobielle Enzyme und Mediatoren wie Interferone, Lysozym oder C-reaktives Protein (CRP) zu der angeborenen Immunabwehr gezählt. Beim spezifischen Immunsystem wird zwischen humoraler und zellulärer Abwehr unterschieden. Spezielle B-Zellen (Plasmazellen) sind als Teil der humoralen Immunität in der Lage, spezifische Antikörper zu bilden. Diese binden den Fremdkörper (Antigen), der anschließend phagozytiert oder durch das Komplementsystem inaktiviert wird. Die zelluläre Immunabwehr wird vor allem durch T-Zellen vermittelt. T-Zellen werden vereinfacht in CD4 + T-Helferzellen und CD8 + zytotoxische T-Zellen eingeteilt. Die T- Helferzellen haben ihre Bedeutung in erster Linie in der T-Zell-B-Zell-Kooperation und der Regulierung der CD8 + T-Zell-Antworten. Die CD4 + T-Zellen erkennen Antigene, die ihnen von professionellen Antigen-präsentierenden Zellen (APZ, u.a. Makrophagen, dendritische Zellen, B-Zellen) über MHC-Klasse-II Moleküle präsentiert werden. Diese präsentieren exogen aufgenommene Antigene, die in Phagolysosomen zu Peptiden fragmentiert werden. CD8 + T-Zellen erkennen Antigene, die von MHC-Klasse-I Molekülen präsentiert werden. MHC-Klasse-I Moleküle werden von allen kernhaltigen Körperzellen exprimiert und präsentieren den CD8 + T-Zellen zellinternes Antigen, das im Proteasom zu Peptidfragmenten prozessiert wurde. CD8 + T-Zellen können zytotoxische und nichtzytotoxische Effektorfunktionen ausüben. Die zytotoxische Wirkung beruht vor allem auf der Sekretion von Perforin. Perforin zerstört die

8 2 Einleitung 8 Zellmembran der Zielzelle, wodurch diese abstirbt. Der nichtzytotoxische Effekt wird u.a. über die Produktion von Zytokinen wie Interferon-γ vermittelt, wodurch der Erreger abgetötet wird, ohne die infizierte Zelle zu zerstören. Das Zusammenspiel der beiden T-Zell-Subpopulationen ist für die Entstehung sowie die Aufrechterhaltung einer suffizienten T-Zell-Antwort von elementarer Bedeutung, wie sie für die Elimination von vielen Krankheitserregern, z.b. dem Hepatitis C Virus (HCV), notwendig ist. 2.2 Das Hepatitis C Virus Das Hepatitis C Virus ist ein hepatotropes RNA-Virus, das zur Familie der Flaviviren gehört. Es wird überwiegend parenteral übertragen. Zu den Risikogruppen für eine HCV-Infektion zählen vor allem i.v. Drogenabhängige (kontaminierte Nadeln), medizinisches Personal (Nadelstichverletzungen) und Patienten, die Bluttransfusionen erhalten, aber auch Promiskuität gilt als Risikofaktor. In 50-70% der Fälle kann die körpereigene Immunabwehr das Virus nicht eliminieren und es kommt zur Ausbildung einer chronischen Infektion. Zurzeit ist die chronische HCV-Infektion mit weltweit ungefähr 200 Millionen Erkrankten eine der häufigsten Erkrankungen überhaupt. In Deutschland wird die Zahl der Virusträger auf Personen geschätzt (Robert- Koch-Institut). Das klinische Spektrum der chronischen HCV-Infektion reicht von einem asymptomatischen oder milden Verlauf bis hin zu einer chronisch aktiven Hepatitis. So entwickeln ca. 20% der Patienten mit chronisch aktiver HCV-Infektion im Laufe der Jahre eine Leberzirrhose, auf deren Boden sich ein hepatozelluläres Karzinom entwickeln kann [Moradpour et al., 2004]. Die Standardtherapie einer chronischen HCV-Infektion besteht zurzeit aus einer Kombination von Interferon-α und Ribavirin, die aber bei nur 50-80% der Patienten zu einer Elimination des Virus führt. Eine prophylaktische oder therapeutische Vakzinierung steht bei der HCV-Infektion derzeit nicht zur Verfügung und ist das Ziel zahlreicher Forschungsarbeiten.

9 2 Einleitung T-Zell-Antwort bei der Hepatitis C Virusinfektion Die grundlegenden Mechanismen, die zur Elimination oder aber der Persistenz des Virus führen, sind noch weitgehend ungeklärt. Der HCV-spezifischen T-Zell-Antwort wird aber allgemein eine entscheidende Rolle zugesprochen. So ist die Elimination des Virus in der akuten Phase der Infektion mit einer multispezifischen T-Zell-Antwort assoziiert, die sich in der virusinfizierten Leber anreichert [Diepolder et al., 1995; Lechner et al., 2000; Thimme et al., 2001]. Weiterhin konnte durch Depletionsstudien von CD4 + und CD8 + T-Zellen die entscheidende Rolle der T-Zellen bei der Viruselimination direkt bewiesen werden [Grakoui et al., 2003; Shoukry et al., 2003]. Bei Patienten mit chronischer HCV-Infektion werden unterschiedliche Gründe für ein Versagen der T-Zell-Antwort diskutiert. Eine Möglichkeit ist das Auftreten von viralen Escape-Mutanten. Das Virus entgeht dabei der virusspezifischen T-Zell-Antwort durch Veränderung der Aminosäurenstruktur innerhalb von Epitopen, die von den T-Zellen erkannt werden, es entstehen sogenannte virale Escapemutationen. Außerdem sind die HCV-spezifischen T-Zell-Antworten bei der chronischen HCV-Infektion meistens schwach ausgeprägt und weisen häufig Dysfunktionen auf, wie einen Defekt in der Proliferationsfähigkeit oder aber ein Unvermögen, antivirale Zytokine wie Interferon-γ zu sezernieren [Gruener et al., 2001; Wedemeyer et al., 2002]. Die Mechanismen, die den Dysfunktionen HCV-spezifischer T-Zellen zu Grunde liegen sind bisher nicht bekannt und sind u. a. Gegenstand dieser Doktorarbeit. So sollte in dieser Arbeit der mögliche Einfluss von regulatorischen T-Zellen auf die Persistenz des Hepatitis C Virus untersucht werden. 2.4 Regulatorische T-Zellen Bereits in den 70er Jahren wurde die Existenz immunregulatorischer T-Zellen postuliert [Gershon et al., 1970]. Es gelang jedoch nicht, eine Population zu charakterisieren, die für die beobachteten immunregulatorischen Effekte verantwortlich gemacht werden konnte. Dies hat dazu geführt, dass dieses Feld für viele Jahre aus dem Fokus der immunologischen Forschung verschwunden ist. Mitte der neunziger Jahre konnten Sakaguchi et al. zeigen, dass die Depletion von CD25 + Zellen zur Entstehung von Autoimmunerkrankungen in Mäusen führt [Sakaguchi et al., 1995].

10 2 Einleitung 10 Mittlerweile wurde für viele verschiedene T-Zellsubpopulationen ein regulatorisches Potenzial beschrieben. Die am besten charakterisierten regulatorischen T-Zellen sind die CD4 + CD25 + T-Zellen. CD4 + CD25 + regulatorische T-Zellen (T reg -Zellen) werden vereinfacht in natürlich vorkommende T reg -Zellen, die im Thymus reifen, und induzierte T reg -Zellen eingeteilt. Induzierte T reg -Zellen entstehen aus CD4 + CD25 - Zellen, die nach Antigenkontakt das CD25-Molekül, die α-kette des Interleukin-2-Rezeptors, exprimieren und ihr regulatorisches Potenzial somit erst in der Peripherie, also außerhalb des Thymus, erhalten. Die Mechanismen, über die T reg -Zellen ihre suppressive Wirkung ausüben, sind bislang nur unzureichend charakterisiert. Diskutiert wird die Beteiligung inhibitorischer Zytokine, wie Interleukin-10 und TGF-β, und eine Zell-Zell-Kontakt abhängige Wirkung. Nahezu alle verfügbaren in vitro Studien aus humanen Modellen beschreiben eine Zell-Zell-Kontakt abhängige Suppression durch T reg -Zellen, die auch durch die Zugabe von neutralisierenden Antikörpern gegen IL-10 und TGF-β nicht aufgehoben werden kann [O'Garra et al., 2004]. Viele Arbeiten mit in vivo Modellen schreiben inhibitorischen Zytokinen wie IL-10 und TGF-β eine Rolle bei der T reg -Zellvermittelten Inhibition zu [Shevach, 2002]. Insgesamt scheinen T reg -Zellen über unterschiedliche Mechansimen zu verfügen, über die sie ihren inhibitorischen Effekt, abhängig von der biologischen Situation, vermitteln. Da das CD25-Molekül als Teil des IL-2-Rezeptors auch von nicht regulatorischen, aktivierten T-Zellen exprimiert wird, ist es kein spezifischer Marker für Zellen mit regulatorischem Potenzial. Bisher ist es jedoch noch nicht gelungen, einen Oberflächenmarker zu identifizieren, der hochspezifisch für Zellen innerhalb der CD4 + CD25 + Population mit regulatorischem Potenzial ist. Als bester intrazellulärer Marker konnte in Mäusen das forkhead box protein P3 (Foxp3) identifiziert werden. Seine Relevanz für die Charakterisierung von humanen T reg -Zellen ist jedoch umstritten [Morgan et al., 2005]. Im Folgenden werden einige Studien dargestellt, in denen die Funktion von T reg -Zellen in unterschiedlichen Modellen untersucht wurde. So beschäftigen sich viele Arbeiten mit der Rolle von T reg -Zellen in Autoimmunerkrankungen. Bereits Anfang der 80er Jahre konnte gezeigt werden, dass Mäuse, denen am dritten Lebenstag der Thymus entfernt wurde, an einem schweren Polyautoimmunsyndrom erkrankten [Kojima et al.,

11 2 Einleitung ]. Bei einer späteren Thymektomie wurde jedoch kein Polyautoimmunsyndrom beobachtet. In einer weiteren Arbeit konnte diese Beobachtung dem Fehlen von CD4 + CD25 + Zellen in den thymektomierten Mäusen zugeordnet werden, da sich durch die Gabe von CD4 + CD25 + Zellen die Entstehung eines Polyautoimmunsyndroms bei früh thymektomierten Mäusen verhindern ließ [Asano et al., 1996]. Viglietta et al. zeigten, dass T reg -Zellen bei Patienten mit Multipler Sklerose eine deutlich schwächere inhibitorische Funktion aufweisen als bei gesunden Probanden. Somit konnte auch in einem humanen Modell gezeigt werden, dass Dysfunktionen von T reg -Zellen zur Entstehung oder Aufrechterhaltung bestimmter Autoimmunerkrankungen beitragen können [Viglietta et al., 2004]. In den letzten Jahren sind die immunmodulatorischen Eigenschaften von T reg -Zellen auch im Gebiet der Transplantattoleranz untersucht worden. In Mausmodellen konnte z.b. gezeigt werden, dass T reg -Zellen sich an ihrem Wirkort, also dem Transplantat, anreichern und Transplantattoleranz vermitteln [Waldmann et al., 2004; Wood et al., 2003]. Inwiefern T reg -Zellen auch im humanen System in der Lage sind Transplantattoleranz zu vermitteln ist momentan Gegenstand der Forschung [Sakaguchi, 2005]. Auch in der Tumorimmunologie wurde eine Rolle von T reg -Zellen beschrieben. Bereits 1999 konnte gezeigt werden, dass die Depletion von CD4 + CD25 + Zellen bei Mäusen, denen unterschiedliche Tumorzellen injiziert wurden, zu einem vollständigen Rückgang der Tumoren führte. In den nicht depletierten Kontrollmäusen zeigte sich jedoch ein progredientes Tumorwachstum, das zum Tod der Mäuse führte [Onizuka et al., 1999; Shimizu et al., 1999]. In unterschiedlichen Tumormodellen konnte mittlerweile gezeigt werden, dass T reg -Zellen die Funktion und die Proliferation autologer, tumorspezifischer T-Zellen in vitro inhibieren [Ormandy et al., 2005; Unitt et al., 2005; Wang et al., 2004]. 2.5 Regulatorische T-Zellen bei Infektionskrankheiten Wie bereits erwähnt, besteht eine der Hauptaufgaben des Immunsystems in der Kontrolle verschiedener Infektionen. Zur Elimination der Krankheitserreger bedarf es einer starken und multispezifischen Immunantwort des Körpers. Diese starken Immunantworten können jedoch nicht nur potenziellen Krankheitserregern, sondern

12 2 Einleitung 12 auch dem eigenen Körper erheblichen Schaden zufügen. Deshalb müssen solche Immunantworten einer adäquaten Kontrolle unterliegen. Verschiedene Arbeiten haben gezeigt, dass T reg -Zellen in der Kontrolle dieser Immunantworten eine entscheidende Rolle spielen können [Belkaid et al., 2005; Mittrucker et al., 2004]. Als Beispiel einer bakteriellen Infektion ist die Rolle von T reg -Zellen bei der Helicobacter pylori-infektion aufgezeigt worden. T-Zell-defiziente Mäuse erhielten entweder CD4 + T-Zellen oder ausschließlich CD4 + CD25 - T-Zellen (also keine T reg - Zellen) bevor sie oral mit H. pylori infiziert wurden. In der Gruppe, die CD4 + CD25 - T- Zellen erhalten hatten, konnte anschließend eine deutlich geringere Kolonialisierung des Keims als in der ersten Gruppe nachgewiesen werden. Allerdings erkrankten diese Mäuse an einer massiven Entzündung des Magens [Raghavan et al., 2003]. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Anwesenheit von CD4 + CD25 + T reg -Zellen zu einer schwächeren T-Zell-Antwort führt, die den Keim nicht eliminieren kann, aber so die Magenschleimhaut vor einer überschießenden Immunantwort geschützt wird. Auch im humanen System konnte gezeigt werden, dass T reg -Zellen Helicobacter-spezifische T-Zell-Antworten in einem in vitro System inhibieren [Lundgren et al., 2003]. Bei parasitären Infektionen konnte ebenfalls eine Wirkung von T reg -Zellen nachgewiesen werden. So scheinen T reg -Zellen eine wichtige Rolle bei der Persistenz von Leishmania major zu spielen, indem sie am Ort der Infektion akkumulieren und dort die T-Zell-Antworten limitieren [Belkaid et al., 2002]. Weiterhin wurde kürzlich gezeigt, dass Mäuse, denen vor der Infektion mit einem letalen Stamm von Plasmodium yoelii die CD4 + CD25 + T reg -Zellen depletiert wurden, überleben, während nicht depletierte Kontrollmäuse versterben. Dieser Schutz ist bedeutenderweise mit einem massiven Ansteigen der pathogenspezifischen T-Zell- Antworten assoziiert [Hisaeda et al., 2004]. Diese Beobachtung zeigt, dass die Versuchstiere in der Abwesenheit von T reg -Zellen eine stärkere T-Zell-Antwort generieren konnten. Eine Vielzahl von Arbeiten hat sich mittlerweile mit der Rolle von T reg -Zellen bei chronisch viralen Erkrankungen beschäftigt, insbesondere bei der HIV-Infektion. Durch Depletionsassays oder Kokultivierung verschiedener T-Zell-Subpopulationen wurde in

13 2 Einleitung 13 diesen Arbeiten gezeigt, dass T reg -Zellen die Expansion von CD4 + und CD8 + Effektor T-Zellen sowohl antigenspezifisch als auch unspezifisch inhibieren [Aandahl et al., 2004; Andersson et al., 2005; Kinter et al., 2004; Weiss et al., 2004]. Ein ähnlicher Effekt von T reg -Zellen auf die virusspezifische T-Zell-Expansion konnte auch für die CMV-Infektion gezeigt werden [Aandahl et al., 2004]. Zu Beginn dieser Doktorarbeit lagen keine Arbeiten vor, die sich mit dem Einfluss von T reg -Zellen auf die HCV-spezifische Immunantwort beschäftigt haben, daraus ergab sich folgende Zielsetzung.

14 2 Einleitung Zielsetzung Ziel dieser Doktorarbeit war es, den Einfluss von CD4 + CD25 + regulatorischen T-Zellen (T reg -Zellen) auf die CD8 + T-Zell-Antwort bei der chronischen HCV-Infektion zu untersuchen. Hierzu sollten folgende Fragestellungen untersucht werden: 1. Haben T reg -Zellen einen inhibitorischen Effekt auf die Expansion und die IFN-γ- Produktion von HCV-spezifischen CD8 + T-Zellen? 2. Ist die Wirkung von T reg -Zellen dosisabhängig? 3. Wird die Wirkung von T reg -Zellen durch inhibitorische Zytokine vermittelt, oder bedarf es bei der Wirkung von T reg -Zellen einem direkten Zell-Zell-Kontakt? 4. Welche Rolle hat das Zytokin Interleukin-2 bei der Wirkung und der Proliferation von T reg -Zellen? 5. Ist die Wirkung von T reg -Zellen bei gesunden Probanden und Personen, die das Virus eliminiert haben, vergleichbar mit der von Patienten mit chronischer HCV-Infektion? 6. Ist der Effekt von T reg -Zellen auf HCV-spezifische T-Zellen beschränkt? 7. Unterscheidet sich die Frequenz von zirkulierenden T reg -Zellen im Blut von Patienten mit chronischer HCV-Infektion von der von gesunden Probanden und Personen, die das Virus eliminiert haben? Insgesamt war es somit das Ziel dieser Doktorarbeit, die biologische Relevanz von CD4 + CD25 + T reg -Zellen bei der chronischen HCV-Infektion zu untersuchen.

15 3 Material und Methoden 15 3 Material und Methoden 3.1 Studienpopulation Vollblutproben von Patienten mit chronischer HCV-Infektion, von Personen, die das Hepatitis C Virus entweder spontan oder therapieinduziert eliminiert haben und von gesunden Blutspendern wurden nach Aufklärung und Einverständnis der Spender zu einer Aufnahme in diese Studie entnommen. Ein positives Votum der lokalen Ethikkommission für diese Untersuchungen liegt vor. Alle in die Studie eingeschlossenen Personen waren positiv für das humane-leukozyten-antigen-a2 (HLA-A2). Eine Zusammenstellung der laborchemischen und virologischen Daten zeigt Tabelle 3.1. Tabelle 3.1 Daten der Patienten Patient (chron. HCV) Alter Geschlecht ALT (U/l) HCV PCR Genotyp Viruslast (GE/ml) C1 38 F C2 41 M C3 25 M C4 47 F C5 49 F C6 30 M n.u. C7 39 M C8 46 M Person (HCV eliminiert) Alter Geschlecht Anti-HCV Ak HCV PCR Elimination R1 44 F + - Therapie R2 31 M + - spontan R3 43 M + - Therapie R4 49 M + - spontan R5 53 M + - spontan R6 36 M + - Therapie R7 53 F + - Therapie R8 27 F + - spontan

16 3 Material und Methoden Zellkulturarbeiten Isolierung von Lymphozyten EDTA-antikoagulierte Vollblutproben wurden im Verhältnis 1:1 mit PBS (Invitrogen, USA) gemischt. Anschließend wurden 15 ml Röhrchen mit je 5 ml Lymphozyten Separations Medium (PAA, Österreich) gefüllt. Das verdünnte Blut wurde vorsichtig in 10 ml Portionen auf das Separationsmedium geschichtet und bei 2000 rpm 20 min. ohne Bremse zentrifugiert. Lymphozyten, Granulozyten und Monozyten (zusammen PBMC: Mononukleare Zellen des Peripheren Blutes) wurden durch die Zentrifugation über den Gradienten von den anderen zellulären Bestandteilen (Erythrozyten, Thrombozyten etc.) und dem Plasma getrennt und konnten so nach der Zentrifugation zwischen Plasma und Separationsmedium vorsichtig entnommen werden. Da bei der Entnahme stets sowohl etwas Plasma als auch Separationsmedium mit entnommen werden, wurden die PBMC zweimal in 50 ml PBS gewaschen. Die Zellen wurden anschließend in PBS gelöst, bei 1600 rpm für 10 min. mit Bremse abzentrifugiert und erneut in PBS resuspendiert. Nach dem zweiten Waschen wurde das Zellpellet in ml PBS resuspendiert. Ein Teil der Zellen wurde im Verhältnis 1:4 mit 0,4 % Trypan-Blau gefärbt und in einer Neubauer Zählkammer gezählt Zellselektionen CD4 Depletion: CD4 + Zellen wurden mit zwei unterschiedlichen Methoden von den PBMC getrennt: CD4 Dynabeads (Dynal Biotech, Norwegen): Es wurden je 10 7 Zellen in 1 ml Dynal- Puffer (PBS + 1% FCS) gelöst und 144 µl CD4 Dynabeads hinzu gegeben. Nach einer Inkubation von 30 min. bei 4 C unter stetiger Rotation wurde das Röhrchen mit der Zellsuspension in einen Dynal-MPC-Magneten gestellt. Die CD4 depletierte Fraktion konnte anschließend am Boden des Röhrchens entnommen werden. CD4 + CD25 + Regulatorische T-Zellen Isolations Kit (Miltenyi Biotec, USA): Die zu selektionierenden Zellen wurden in 90 µl MACS- Puffer (PBS, ph 7,2 plus 0,5% BSA (bovine serum albumine) und 2mM EDTA) je 10 7 Zellen gelöst. Im ersten Antikörper- Schritt wurden alle nicht CD4 + Zellen mit Biotin- Antikörpern markiert. Hierzu wurden 10 µl Antikörper Cocktail (Antikörper gegen: CD8, CD14, CD16, CD19, CD36, CD56,

17 3 Material und Methoden 17 CD123, TZR γ/δ und Glycophorin A) je 10 7 Zellen zur Suspension hinzu gegeben und die Zellsuspension für 10 min. bei 4 C (im Kühlschrank) inkubiert. Im zweiten Antikörper-Schritt wurden Anti-Biotin MicroBeads verwendet, die gegen Biotin gerichtet sind und so an die Biotin-markierten Zellen binden. An die Anti-Biotin Antikörper sind kleine Magneten (MicroBeads) gekoppelt. Nach einer Inkubation von 15 min. im Kühlschrank wurde die Suspension mit 10 ml MACS Puffer gewaschen. Der Überstand wurde abgenommen und das Pellet erneut in 1 ml MACS Puffer gelöst. Zur Vorbereitung der Separation wurde eine LD-Säule in einen MidiMACS-Magneten eingehängt, die die antikörpermarkierten Zellen im Magnetfeld halten soll. Die Säule wurde zunächst mit 2 ml MACS-Puffer gespült, anschließend wurde ein 15 ml Röhrchen unter der Säule platziert, in der die unmarkierten Zellen (CD4 + Zellen) aufgefangen werden sollten. Die Zellsuspension wurde anschließend auf die Säule pipettiert. Nachdem die Suspension durch die Säule gelaufen war, wurde diese zweimal mit je 1 ml MACS-Puffer gewaschen. Die in der Säule verbliebenen antikörpermarkierten Zellen wurden dann in einem zweiten Röhrchen aufgefangen. Dazu wurde die Säule aus dem Magnetfeld entfernt und nach Zugabe von 2 ml Puffer mit einem dazugehörigen Stopfen durchfahren. Somit wurden die CD4 Zellen von der Säule getrennt und in einem separaten Röhrchen aufgefangen (Abbildung 3.1, 1-3). CD25 Selektion: CD4 + T-Zellen wurden für 15 min. in 90 µl MACS- Puffer und mit 10 µl Anti-CD25-MicroBeads je 10 7 Zellen bei 4 C inkubiert. Nach ausführlichem Waschen wurden die Zellen in 500 µl MACS- Puffer resuspendiert. Für die Selektion wurde eine MS-Säule in einen MiniMACS-Magneten gehängt. Die Suspension wurde auf die Säule gegeben und die CD25 - Fraktion aufgefangen. Die CD25 + T-Zellen wurden wie oben beschrieben aus der Säule entfernt und in einem getrennten Gefäß aufgefangen (Abbildung 3.1, 4-6).

18 3 Material und Methoden 18 CD4 + CD25 + CD4-1. CD4 + CD25-4. Magnet Magnet CD4 + Zellen CD4 depletierte Zellen CD4 + CD25 - Zellen CD4 + CD25 + Zellen Abbildung 3.1 Schema der Zellselektionen mit paramagnetischen Microbeads (MACS). 1-3: Trennung der CD4 + Zellen von CD4 - Zellen; 4-6: Isolierung der Treg-Zellen aus der CD4 + Population Antikörperfärbungen Um die Reinheit der Selektionen oder die Frequenz von zirkulierenden CD4 + CD25 + T- Zellen im Blut zu bestimmen wurden Antikörperfärbungen durchgeführt. PBMC oder selektionierte T-Zell-Subpopulationen wurden in PBS gelöst und je 0,1 0,5 x 10 6 Zellen auf einer 96-Loch-Platte ausplattiert. Mit einem Blocking-Antikörper (IgG 1, BD PharMingen, USA) wurden die unspezifischen Bindungsstellen blockiert (15 min. Inkubation). Anschließend wurden die Zellen für 5-10 min. mit Antikörpern gegen CD25 (PE, Miltenyi Biotec) und CD4 (FITC, Miltenyi Biotec) inkubiert. Parallel dazu wurden stets Isotype-Kontrollfärbungen durchgeführt. Nach ausführlichem Waschen wurden die Zellen mit je 100 µl CellFIX (BD PharMingen) fixiert. Anschließend wurden die Proben durchflusszytometrisch gemessen (siehe Kapitel 3.4). Die Reinheit der einzelnen T-Zell-Subpopulationen lag immer über 85% (repräsentativer Plot von selektionierten CD4 + CD25 + T reg -Zellen, Abbildung 3.2).

19 3 Material und Methoden 19 CD4 FITC CD25 PE Abbildung 3.2 Density Plot einer Population von CD4 + CD25 + T reg -Zellen zur Kontrolle der Zellselektion Transwell -Assays Versuche mit Transwell-Platten ermöglichen eine Aussage über die Notwendigkeit von direktem Zell-Zell-Kontakt für immunologische Zell-Zell-Interaktionen, da zwei definierte Zellpopulationen im gleichen Medium kultiviert werden können, ohne dass ein Zell-Zell-Kontakt besteht. Beide Populationen werden durch eine Membran getrennt deren Porengröße 0,4 µm beträgt. Zytokine, die evtl. sezerniert werden, können sich gleichmäßig im Medium verteilen und ihre Zielzellen erreichen. CD4 depletierte PBMC wurden als CD8 + angereicherte Effektorpopulation in dem Medium suspendiert und in eine Vertiefung einer 24-Loch-Platte gegeben. T reg -Zellen wurden auf die Membran gegeben, die anschließend in die Vertiefung mit der Zellsuspension gegeben wurde. Stimulation und Kultur erfolgten wie in Kapitel ausführlich beschrieben Zytokin-Neutralisations-Assays Mithilfe von Antikörpern, die gegen definierte Zytokine gerichtet sind, ist es möglich, die von den entsprechenden Zytokinen vermittelten Signalwege zu unterbinden. Diese

20 3 Material und Methoden 20 Technik wurde angewandt, um den möglichen Einfluss bestimmter Zytokine auf die CD4 + CD25 + T-Zell-vermittelte Inhibition zu untersuchen. Dazu wurden den Kokulturen von CD4 depletierten PBMC und T reg -Zellen Antikörper gegen Interleukin 10 bzw. TGF-β hinzu gegeben. Stimulation und Kultur wurden wie in Kapitel ausführlich beschrieben durchgeführt. 3.3 Antigenspezifische Untersuchungen Zellselektionen PBMC CD4 depletierte PBMC (CD8 + angereichert) CD4 + CD4 + CD25 - CD4 + CD25 + (T reg -Zellen) Kokulturen CD4 depletierte PBMC plus - CD4 + CD25 - CD4 + CD25 + (T reg -Zellen) HCV-Peptid Stimulation und 7 Tage Kultur Abbildung 3.3 Schema der Zellselektionen und der Kokulturen Antigenspezifisches Wachstum Je 2 x 10 6 PBMC oder CD4 depletierte PBMC wurden in 1 ml RPMI+++ Zellmedium (Invitrogen, USA; Zusätze: 10% FCS, 1,5% Hepes-Puffer (1M) und 1% Penicillin/Streptomycin) gelöst und alleine oder mit CD4 + CD25 + T-Zellen oder CD4 + CD25 - T-Zellen in einem bestimmten Verhältnis (z.b. 3:1 oder 10:1) in einer 48- Loch-Platte kultiviert (Abbildung 3.3). Die Stimulation erfolgte mit 0,5 µg/ml anti- CD28 und mit 10 µg/ml synthetischem HCV- oder Influenza-Peptid. Die Aminosäuresequenzen und die Position aller in der Studie angewandten Peptide ist in

21 3 Material und Methoden 21 Tabelle 3.2 angegeben. In einigen Versuchen wurden die CD4 + CD25 + T-Zellen unmittelbar vor der Kultur bestrahlt (30Gy), hierdurch werden Zellteilungen unmöglich gemacht. In einem Experiment wurden die Kokulturen mit 2 U/ml, 20 U/ml und 200 U/ml rekombinantem Interleukin-2 (Hoffmann-La Roche, Schweiz) stimuliert. Nach einmaligem Mediumwechsel am dritten Tag wurden die Zellkulturen nach 7 Tagen mit einem der folgenden antigenspezifischen Nachweisverfahren analysiert. Tabelle 3.2 Immundominante Peptide Virus Peptid Aminosäuresequenz Position HCV 1 CINGVCWTV NS HCV 2 KLVALGINAV NS HCV 3 ALYDVVTKL NS Influenza 4 GILGFVFTL Matrix Tetramer-Färbung Mit dieser Methode ist es möglich, antigenspezifische Zellen direkt zu markieren, so dass sie mit der Durchflusszytometrie detektiert werden können. Die T-Zelle erkennt Antigene, die an MHC-Moleküle gebunden sind. Ein Tetramer besteht aus vier solcher Komplexe, hierdurch wird die Avidität der Wechselwirkung zwischen T-Zell-Rezeptor und MHC-Peptid-Komplex erhöht. Die vier MHC-Peptid-Komplexe sind an eine Fluoreszenz gekoppelt, die es ermöglicht Tetramer-markierte antigenspezifische Zellen mithilfe der Durchflusszytometrie zu visualisieren. Die verwendeten Tetramere korrespondieren mit den in Tabelle 3.2 angegebenen Peptiden. Abbildung 3.4 zeigt das Prinzip einer Tetramer-Färbung und eine entsprechende FACS-Analyse. Für jede T-Zell-Kultur (z.b. PBMC oder CD4 depletierte PBMC + CD4 + CD25 + ) wurde eine Isotype-Kontrolle, eine CD8-Kontrolle ohne Tetramer und 1-2 Proben mit CD8- Färbung und Tetrameren angesetzt. Dazu wurden je 0,2 x 10 6 Zellen pro Vertiefung in 200 µl PRMI+++ Medium gelöst und auf eine 96-Loch-Platte gegeben. Nach 20-minütiger Zentrifugation bei rpm wurden in jede Vertiefung 0,5 µl Tetramer (APC markiert) und 50 µl Stain- Buffer (SB) gegeben und für 20 min. bei 37 C und 5,0% CO 2 inkubiert. Anschließend wurden alle Proben zweimal mit je 100 µl SB gewaschen und mit einem Blocking-Antikörper (IgG 1, BD PharMingen), der die

22 3 Material und Methoden 22 unspezifischen Bindungsstellen belegt, inkubiert. Nach einer Inkubation für 20 min. bei 4 C wurde die CD8-Färbung entweder mit einem PE- oder Cy-7 PE-markierten CD8- Antikörper (BD PharMingen) durchgeführt. Dementsprechend wurde neben dem APC Isotype-Ak entweder ein PE oder ein Cy-7 PE Isotype-Ak verwendet. Die Inkubation erfolgte wie beim Blocking-Ak. Anschließend wurden die Proben dreimal mit 100 µl SB gewaschen und für die Messung an der FACS- Maschine mit je 100 µl CellFIX (BD PharMingen) fixiert. A B Cy7 PE-markierter CD8 Antikörper CD8 TZR TZR APC-markiertes Tetramer Peptid APC MHC-Klasse-I Molekül Tetramer APC CD8 Cy7 Abbildung 3.4 Tetramer-Färbung. (A) Schema einer Tetramer-markierten CD8 + T-Zelle (B) FACS- Analyse einer CD8 + Tetramer + T-Zell-Population (rechter oberer Quadrant) Intrazelluläre Zytokin-Färbung Da die Interferon-γ produzierenden Zellen das gebildete Zytokin aus der Zelle sezernieren, ist es schwierig zu bestimmen, welche Zellen das Zytokin produzieren und welche nicht. Bei der intrazellulären-interferon-γ-färbung wird die Zytokinfreisetzung durch Zugabe von Golgi-Plaque (Brefeldin A) gehemmt, die Zellmembran permeabilisiert und ein Antikörper gegen IFN-γ hinzu gegeben, der somit die Zellen markiert, die auf eine Peptidstimulation mit einer IFN-γ Produktion reagiert haben. Mit dieser Methode können Zellen, die peptidspezifisch IFN-γ produzieren, durchflusszytometrisch erfasst werden. Eine IFN-γ-Färbung ist in Abbildung 3.5 schematisch dargestellt.

23 3 Material und Methoden 23 Die Zellen wurden wie schon bei der Tetramer-Färbung nach 7 Tagen in Kultur in eine 96-Loch-Platte gegeben. Für jede T-Zell-Kultur wurden 4-5 unterschiedliche Färbungen angefertigt. Eine Isotype-Kontrolle. Eine Negativ-Kontrolle, um zu bestimmen, wie viel Prozent der CD8 + T-Zellen ohne erneute Peptid-Stimulation IFN-γ produzieren. Jeweils ein Ansatz für jedes Peptid, mit dem die Kultur zu Beginn stimuliert wurde, so dass die Peptid-induzierte IFN-γ Produktion gemessen werden konnte (max. 2 Peptide). PMA als Positiv-Kontrolle, dies stimuliert die IFN-γ Produktion von T-Zellen unabhängig vom T-Zell-Rezeptor. Nach dem Ausplattieren wurden die Ansätze mit den entsprechenden Peptiden und PMA für 5 Stunden inkubiert. Außerdem wurde den Zellen noch das Zellgift Brefeldin A hinzu gegeben. Nach 5 stündiger Inkubation bei 37 C und 5% CO 2 wurde die 96-Loch-Platte abzentrifugiert. Anschließend wurden die Proben zweimal mit je 100 µl SB gewaschen. Anschließend wurde in alle Vertiefungen ein Blocking-Antikörper (IgG 1, BD PharMingen) gegeben, der die unspezifischen Bindungsstellen belegt. Nach einer 20- minütigen Inkubation bei 4 C wurde die CD8-Färbung mit einem PE-markierten CD8- Antikörper (BD PharMingen) durchgeführt. Die Inkubation erfolgte wie beim Blocking- Ak. Nach der CD8-Färbung wurden die Zellen abzentrifugiert, gewaschen und für die intrazelluläre Zytokinfärbung fixiert und permeabilisiert. Hierfür wurden die Zellen mit Cytofix/Cytoperm (BD PharMingen) für exakt 15 min. bei 4 C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen erneut gewaschen und mit FITC-markiertem Antikörper gegen intrazelluläres IFN-γ inkubiert. Parallel wurden bei allen Antikörper-Schritten die analogen Isotype-Kontrollfärbungen durchgeführt. Nun wurde die Platte dreimal mit 100 µl SB gewaschen und für die Messung an der FACS- Maschine mit je 100 µl CellFIX (BD PharMingen) fixiert.

24 3 Material und Methoden 24 A B PE-markierter CD8 Antikörper CD8 IFN γ IFN-γ FITC data.018 Intrazellulärer FITC-markierter IFN γ Antikörper CD8 PE CD8 PE Abbildung 3.5 Intrazelluläre Zytokin-Färbung (A) Schema einer Interferon-γ produzierenden, Antikörper-markierten CD8 + T-Zelle (B) FACS-Analyse einer CD8 + IFN-γ + T-Zell- Population (rechter oberer Quadrant) CFSE-Färbung Das Proliferationsverhalten von Zellen in einer Kultur lässt sich mit der CFSE-Färbung untersuchen. Die Zellen werden zu Beginn der Kultur mit CFSE (5-(und-6)- Carboxyfluorescein diacetat succinimidyl Ester, Molecular Probes, USA) beladen, die jede Zelle bei der Zellteilung gleichmäßig an beide Tochterzellen weitergibt. Da diese Substanz fluoreszierende Eigenschaften hat, kann mittels Durchflusszytometrie über die Farbintensität indirekt darauf geschlossen werden, wie viele Zellteilungen eine Zelle in einer Kultur hinter sich hat. Abbildung 3.6 zeigt schematisch das Prinzip der CFSE- Färbung. Je 10 7 CD4 depletierte PBMC wurden in 1 ml PBS resuspendiert und mit 1 µmol/l CFSE für 10 min. bei 37 C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen dreimal in 10 ml RPMI Zellmedium gewaschen und in unterschiedlichen Verhältnissen mit unmarkierten CD4 + CD25 + T reg -Zellen oder mit CD4 + CD25 - Zellen kultiviert. Stimulation und Kultur erfolgte wie in Kapitel beschrieben. Für die Auswertung der Kultur wurde eine Tetramer-Färbung durchgeführt.

25 3 Material und Methoden 25 A B CFSE 1. Zellteilung CD8 Cy7 PE CFSE 2. Zellteilung Abbildung 3.6 CFSE-Färbung (A) Schema der Weitergabe von absorbiertem CFSE bei Zellteilungen (B) FACS-Analyse nach Kultur zeigt CD8 + T-Zellen, die proliferiert haben (linker oberer Quadrant) und CD8 + T-Zellen, die nicht proliferiert haben (rechter oberer Quadrant) 3.4 Durchflusszytometrie Die einzelnen Proben wurden nach den Antikörperfärbungen in spezielle FACS- Röhrchen überführt. Die Messungen wurden an einem FACSCalibur-Gerät (BD Biosciences) mithilfe von Cell Quest Software (BD Biosciences) durchgeführt. Bei den Auswertungen wurden ausschließlich Zellen im Lymphozyten-Gate berücksichtigt. 3.5 Statistik Die statistische Signifikanz der Ergebnisse aus den Kapiteln 4.8 und 4.9 wurde mit dem Mann-Whitney U-Test geprüft, wobei p<0,05 als Signifikanzschwelle festgelegt wurde.

26 4 Ergebnisse 26 4 Ergebnisse 4.1 Die Depletion von CD4 + Zellen führt zu einer gesteigerten in vitro Expansion von HCV-spezifischen CD8 + T-Zellen bei Patienten mit einer chronischen HCV-Infektion CD4 + Zellen werden einerseits für das Priming und die Expansion HCV-spezifischer CD8 + T-Zellen benötigt um das Virus zu eliminieren [Kalams et al., 1998], andererseits gibt es eine Subpopulation von CD4 + Zellen, der in verschiedenen Modellen ein inhibitorisches Potenzial bezüglich der Proliferation und Funktion antigenspezifischer CD8 + T-Zellen zugeschrieben wird [Shevach, 2002]. Zuerst sollte untersucht werden, ob CD4 + Zellen bei der chronischen HCV-Infektion die Expansion von HCVspezifischen CD8 + T-Zellen unterstützen oder eine inhibitorische Funktion aufweisen. Hierzu wurden sowohl PBMC als auch CD4 depletierte PBMC mit HCV-Peptid stimuliert und für 7 Tage kultiviert. Anschließend wurde die Expansion HCVspezifischer T-Zellen durch eine Tetramer-Färbung bestimmt. Interessanterweise führte die Depletion von CD4 + Zellen zu einer deutlich stärkeren Expansion von virusspezifischen CD8 + T-Zellen (Abbildung 4.1). Dieser Effekt konnte bei allen Patienten mit chronischer Hepatitis C Virusinfektion nachgewiesen werden, bei denen eine CD8 + T-Zell-Antwort gegen eines der immundominanten Epitope mittels Tetramer-Technologie nachweisbar war. Bei einer Patientin (C1) konnten wir diesen Effekt sogar für zwei unterschiedliche Epitope zeigen. Diese Ergebnisse deuten somit darauf hin, dass bei der chronischen HCV-Infektion eine inhibitorische Funktion innerhalb der CD4 + Zellen überwiegt.

27 4 Ergebnisse % tetramer + / CD Patient/ Peptid 0 C1/2 C1/3 C2/3 C3/2 C4/1 C5/2 C6/2 C7/3 C8/1 Abbildung 4.1 Depletion von CD4 + Zellen steigert die Expansion der HCV-spezifischen CD8 + T- Zellen. PBMC (weiße Balken) und PBMC nach Depletion der CD4 + Zellen (schwarze Balken) wurden mit HCV-Peptid stimuliert und 7 Tage kultiviert. Bei allen untersuchten Patienten war die HCV-spezifische CD8 + T-Zell-Expansion nach Depletion der CD4 + Zellen verstärkt. 4.2 CD4 + CD25 + T reg -Zellen hemmen die in vitro Expansion HCV-spezifischer CD8 + T-Zellen Um der Frage nachzugehen, ob T reg -Zellen für den inhibitorischen Effekt innerhalb der CD4 + Zellpopulation verantwortlich sind, wurde die CD4 + Zellpopulation von der CD4 - Zellpopulation getrennt. Die CD4 + Zellen wurden in CD4 + CD25 - Zellen und in CD4 + CD25 + (T reg -Zellen) Zellen aufgetrennt. Nach diesen Selektionsschritten resultieren nun drei Zellpopulationen: CD4 depletierte PBMC, CD4 + CD25 - Zellen und T reg -Zellen. CD4 depletierte PBMC wurden alleine, in Anwesenheit von CD4 + CD25 - Zellen (Verhältnis 3:1) oder T reg -Zellen (Verhältnis 3:1) in Kultur genommen und mit HCV-spezifischen Peptiden sowie anti-cd28 Antikörpern stimuliert (Abbildung 3.3). Nach 7 Tagen Kultur erfolgte die Auswertung durch Tetramer-Färbungen. Interessanterweise führte die Kokultivierung von CD4 depletierten PBMC mit autologen CD4 + CD25 - Zellen zu einer deutlichen Steigerung der Expansion von HCVspezifischen CD8 + T-Zellen verglichen mit der Kultur ohne CD4 + Zellen. Im Gegensatz

28 4 Ergebnisse 28 dazu zeigte sich in Gegenwart von T reg -Zellen eine deutliche Inhibition der HCVspezifischen Expansion (Abbildung 4.2). Diese Ergebnisse zeigen, dass ein Teil der CD4 + Zellpopulation, nämlich die CD4 + CD25 + T reg -Zellen, einen inhibitorischen Effekt auf die Proliferation von CD8 + T- Zellen hat, wohingegen die CD4 + CD25 - Zellen die HCV-spezifische Expansion der CD8 + T-Zellen unterstützen. 1, % tetramer + / CD ,5 5 0 Patient C1 / Peptid 2 1,8 Patient C1 / Peptid Patient C2 / Peptid 3 0 Patient C3 / Peptid 2 Abbildung 4.2 T reg -Zellen inhibieren die Expansion HCV-spezifischer CD8 + T-Zellen. CD4 depletierte PBMC wurden allein (graue Balken), in Anwesenheit von CD4 + CD25 - Zellen (schwarze Balken) oder T reg -Zellen (weiße Balken) nach HCV-Peptid- Stimulation für 7 Tage kultiviert. Die Zugabe von CD4 + CD25 - Zellen steigert die HCVspezifische Expansion von CD8 + T-Zellen, die Zugabe von T reg -Zellen inhibiert die Expansion im Vergleich zu allein wachsenden CD4 depletierten PBMC. 4.3 T reg -Zellen hemmen die IFN-γ Produktion von HCV-spezifischen CD8 + T- Zellen Als nächstes untersuchten wir, ob T reg -Zellen auch die intrazelluläre IFN-γ Produktion der CD8 + T-Zellen inhibieren. Dazu wurde der gleiche Versuchsansatz wie in Kapitel 4.2 beschrieben verwendet. Nach der Kultur erfolgte die Auswertung jedoch durch eine intrazelluläre IFN-γ-Färbung.

29 4 Ergebnisse 29 Es zeigte sich, dass die durch HCV-Peptid-Stimulation induzierte Produktion von IFN-γ in vergleichbarer Weise durch die Wirkung von T reg -Zellen beeinflusst wird wie die Proliferation. Die intrazelluläre Produktion dieses Zytokins durch CD8 + T-Zellen wird hingegen in der Anwesenheit von CD4 + CD25 - Zellen verstärkt. Der immunmodulatorische Effekt von T reg -Zellen auf HCV-spezifische Effektorzellen konnte also sowohl für die Proliferationskapazität als auch für die Zytokinproduktion nachgewiesen werden (Abbildung 4.3). CD4 depletierte PBMC plus IFN-γ data CD8 PE CD4 + CD25 - CD4 + CD25 + data CD8 PE data % 26% 4,5% CD8 PE CD8 Patient C1 / Peptid 3 Abbildung 4.3 T reg -Zellen inhibieren die IFN-γ Produktion von HCV-spezifischen CD8 + T-Zellen. CD4 depletierte PBMC wurden allein (graue Balken), in Anwesenheit von CD4 + CD25 - Zellen (schwarze Balken) oder T reg -Zellen (weiße Balken) nach HCV-Peptid Stimulation für 7 Tage kultiviert. Die Zugabe von CD4 + CD25 - Zellen steigert die HCVspezifische IFN-γ Produktion von CD8 + T-Zellen, die Zugabe von T reg -Zellen inhibiert die IFN-γ Produktion im Vergleich zu allein wachsenden CD4 depletierten PBMC. 4.4 T reg -Zellen vermitteln ihre Wirkung dosisabhängig Um der Frage nachzugehen, ob der prozentuale Anteil von T reg -Zellen in einer Kultur entscheidend für das Ausmaß der suppressiven Wirkung ist, wurden CD4 depletierte PBMC in Anwesenheit unterschiedlicher Konzentrationen von T reg -Zellen peptidspezifisch kultiviert. Die CD4 depletierten PBMC wurden zunächst mit dem Proliferationsmarker CFSE beladen. Anschließend wurden T reg -Zellen in unterschiedlichen Verhältnissen zu der CD4 - Effektorpopulation hinzugegeben. Da bereits mit einem Verhältnis von 3:1 (CD4 depletierte PBMC: T reg -Zellen) eine nahezu komplette Inhibition der HCV-spezifischen T-Zell-Proliferation beobachtet wurde

30 4 Ergebnisse 30 (Kapitel 4.2), wurden für diesen Versuch Verhältnisse von 10:1 (9% T reg ), 15:1 (6,25%), 30:1 (3,2%) und 100:1 (0,99%) gewählt. Nach 7 Tagen in vitro Kultur wurde die Expansion der HCV-spezifischen CD8 + T-Zellen mithilfe einer Tetramer-Färbung ermittelt. Eine nahezu maximale Inhibition zeigte sich bei einem Verhältnis von 3:1 und bei einem Verhältnis von 10:1 (CD4 depletierte PBMC: CD4 + CD25 + T reg -Zellen). Weiterhin zeigte sich, dass ein geringer werdender Anteil von T reg -Zellen in der Kultur zu einer stärkeren peptidspezifischen CD8 + T-Zell-Expansion führte. Mit der CFSE- Färbung konnte gezeigt werden, dass bei Verhältnissen von 3:1 und 10:1 (CD4 depletierte PBMC: CD4 + CD25 + T reg -Zellen) nur ein geringer Anteil Tetramer + CD8 + T- Zellen proliferiert hat. Ab einem Verhältnis von 15:1 kam es zu einer Zunahme der HCV-spezifischen CD8 + T-Zell-Proliferation (Abbildung 4.4). Dieser Versuch konnte also auf der Einzel-Zell-Ebene zeigen, dass T reg -Zellen die Proliferation HCVspezifischer CD8 + T-Zellen dosisabhängig inhibieren.

31 4 Ergebnisse 31 5 % tetramer + /CD8 + 2,5 0 3:1 10:1 15:1 30:1 100:1 counts counts data.020 data.008 data.012 data.016 data.020 M CFSE counts M CFSE counts % 17 % 54 % 71 % 85 % M CFSE counts M CFSE counts M CFSE CFSE Patient C1 / Peptid 3 Abbildung 4.4 T reg -Zellen hemmen die Proliferation HCV-spezifischer CD8 + T-Zellen dosisabhängig. Bei nachlassender Anzahl von T reg -Zellen kommt es zu einer Zunahme der Proliferation HCV-spezifischer CD8 + T-Zellen. Die abgebildeten Plots zeigen ausschließlich CD8 + Tetramer + T-Zellen. 4.5 Die Suppression durch T reg -Zellen ist Zell-Zell-Kontakt abhängig Als nächstes untersuchten wir, ob ein direkter Zell-Zell-Kontakt für die inhibitorische Wirkung von T reg -Zellen notwendig ist. Wie bereits in Kapitel beschrieben, ist es mit einer Transwell -Membran möglich, zwei Zellpopulationen im gleichen Medium zu kultivieren, ohne dass ein direkter Zell-Zell-Kontakt besteht; ein Austausch von Zytokinen wird hierdurch nicht verhindert. CD4 depletierte PBMC wurden als Effektorpopulation alleine und in der Anwesenheit von T reg -Zellen kultiviert. Zusätzlich wurde noch eine Kokultur angelegt, in der beide Zellpopulationen durch eine Membran getrennt wurden. Die Kulturen wurden anschließend mit HCV-Peptiden stimuliert und für eine Woche kultiviert, bevor eine Tetramer-Färbung durchgeführt wurde.

32 tetramer 4 Ergebnisse 32 Dieser Versuch zeigte, dass T reg -Zellen, die aufgrund der Membran keinen Zell-Zell- Kontakt mit CD8 + T-Zellen eingehen können, nicht in der Lage sind, die Expansion der Effektorzellen zu inhibieren. Wenn beide Zellpopulationen aber ohne Membran gemeinsam kultiviert wurden, war wiederum eine deutliche Reduktion der CD8 + T-Zell- Expansion zu beobachten (Abbildung 4.5). Diese Ergebnisse zeigten somit, dass ein direkter Zell-Zell-Kontakt für die von T reg -Zellen vermittelte Suppression der Expansion HCV-spezifischer T-Zellen notwendig ist. CD4 depletierte PBMC plus - CD4 + CD25 + (3:1) kein Zell-Zell-Kontakt CD4 + CD25 + (3:1) Zell-Zell-Kontakt data CD8 Cy7-PE data CD8 Cy7-PE CD8 data % 9.80% 1.67% Patient C1 / Peptid CD8 Cy7-PE Abbildung 4.5 Inhibition durch T reg -Zellen ist Zell-Zell-Kontakt abhängig. CD4 depletierte PBMC wurden allein (links), in Anwesenheit von T reg -Zellen aber durch eine Membran getrennt (Mitte) und in Anwesenheit von T reg -Zellen mit direktem Zell-Zell-Kontakt kultiviert (rechts). 4.6 Die Inhibition durch T reg -Zellen ist unabhängig von IL-10 und TGF-β Verschiedene Arbeiten haben auf eine mögliche Rolle von Zytokinen wie Interleukin 10 und TGF-β in der Inhibition von Effektorzellen durch T reg -Zellen hingewiesen. Um den Einfluss dieser Zytokine auf die T reg -Zell-vermittelte Inhibition zu untersuchen, wurden den Kokulturen von CD4 depletierten PBMC und T reg -Zellen neutralisierende Antikörper gegen IL-10 und TGF-β hinzu gegeben, bevor sie mit HCV-Peptiden stimuliert und für eine Woche kultiviert wurden. Anschließend wurde eine Tetramer- Färbung durchgeführt.

33 4 Ergebnisse 33 Diese Versuche zeigten, dass die Zugabe neutralisierender Antikörper nur einen sehr geringen Einfluss auf die Inhibition der HCV-spezifischen CD8 + T-Zell-Expansion durch T reg -Zellen hat (Abbildung 4.6). Dies deutet daraufhin, dass die Inhibition von HCV-spezifischen CD8 + T-Zellen durch T reg -Zellen unabhängig von Interleukin-10 und TGF-β ist. 100 % Inhibition 50 anti IL-10 anti TGF-β keine Antikörper 0 Patient C1 / Peptid 3 Abbildung 4.6 Inhibition durch T reg -Zellen ist unabhängig von IL-10 und TGF-β. Kokulturen von T reg -Zellen und CD4 depletierten PBMC wurden neutralisierende Antikörper gegen IL- 10 und TGF-β hinzugegeben. Hierdurch wurde die inhibitorische Kapazität der T reg - Zellen nicht aufgehoben. 4.7 Einfluss von IL-2 auf die Wirkung von T reg -Zellen T reg -Zellen exprimieren konstitutiv die α-kette des Interleukin-2 Rezeptors CD25 auf ihrer Oberfläche. Somit stellt sich die Frage nach der Rolle von Interleukin-2 bei der T reg -Zell-vermittelten Suppression. Einige Arbeiten haben beschrieben, dass die Zugabe von exogenem IL-2 die inhibitorische Wirkung von T reg -Zellen aufhebt, andere Arbeiten haben dies aber nicht bestätigen können. Um den möglichen Einfluss von IL-2 auf die Wirkung von T reg -Zellen in unserem System zu untersuchen, wurden CD4 depletierte Zellen mit T reg -Zellen, wie in Kapitel 4.2 beschrieben, kultiviert und zusätzlich mit 2 U/ml, 20 U/ml oder 200 U/ml

34 4 Ergebnisse 34 Interleukin-2 stimuliert. Die Zugabe von steigenden Mengen exogenem IL-2 hatte jedoch nahezu keinen Einfluss auf die T reg -Zell-vermittelte Inhibition der virusspezifischen CD8 + T-Zell-Expansion. Anschließend sollte das Proliferationsverhalten von T reg -Zellen untersucht werden. Dazu wurden CD25 + T-Zellen mit CFSE beladen und in Kultur gebracht. Die Stimulation erfolgte entweder nur mit anti-cd28 oder mit anti-cd28 und rekombinantem IL-2. An den Tagen 2, 4, 5 und 7 wurde über eine CD4-Färbung untersucht, wie viel Prozent der CD4 + CD25 + T reg -Zellen proliferiert haben. Nur in den Kulturen, die mit IL-2 stimuliert wurden, proliferierten T reg -Zellen, aber nur zu einem geringen Anteil von 14%. In den Kulturen, die nur mit anti-cd28 stimuliert wurden, zeigte sich keine Proliferation von T reg -Zellen (Abbildung 4.7). Diese Versuche zeigen somit, dass T reg -Zellen Interleukin-2 zum Wachstum benötigen, doch trotz massiver Zugabe von Interleukin-2 (200 U/ ml an Tag 0 und Tag 4) proliferierten nur 14% der T reg -Zellen. A B anti-cd28 + IL-2 14% data.004 % Proliferation der CD4 + CD25 + T-Zellen anti-cd28 + IL-2 anti-cd28 CD CFSE FITC <1% anti-cd28 data Tage in Kultur CFSE FITC CFSE Abbildung 4.7 T reg -Zellen sind nur nach Zugabe hoher Dosen von Interleukin-2 in der Lage zu proliferieren. (A) CD25 + Zellen wurden mit CFSE beladen und in Kultur gebracht. Stimulation erfolgte entweder nur mit gelöstem anti-cd28 oder zusätzlich mit rekombinantem IL-2. Nach 7 Tagen zeigte sich, dass T reg -Zellen nur nach Zugabe von IL-2 proliferieren. (B) Dot plots beider Kulturen nach 7 Tagen.

35 4 Ergebnisse 35 Weiterhin untersuchten wir, ob in den Kokulturen eine Proliferation von T reg -Zellen notwendig ist, um suppressiv auf CD8 + T-Zellen zu wirken. Hierfür wurden T reg -Zellen nach der Selektion mit 30 Gy bestrahlt. Dadurch wird den Zellen die Proliferationsfähigkeit genommen. Anschließend wurden die bestrahlten T reg -Zellen gemeinsam mit CD4 depletierten PBMC in Kultur gebracht. Interessanterweise hatte die Bestrahlung aber keinen Einfluss auf die suppressive Kapazität von T reg -Zellen (Abbildung 4.8). Somit scheint die Proliferation von T reg -Zellen für die Inhibition der CD8 + Effektorzellen nicht notwendig zu sein. % tetramer + / CD , ,5 0 Patient G1 / Peptid 4 Patient G2 / Peptid 4 Abbildung 4.8 Bestrahlte T reg -Zellen verlieren nicht ihre inhibitorische Kapazität. CD4 depletierte PBMC wurden alleine (schwarze Balken), mit T reg -Zellen (weiße Balken) und mit bestrahlten T reg -Zellen (schraffierte Balken) kultiviert. Bestrahlte Treg-Zellen behalten ihre suppressive Wirkung. 4.8 Stärkere Inhibition virusspezifischer T-Zell-Antworten bei Patienten mit chronischer HCV-Infektion im Vergleich zu gesunden Probanden und Personen, die das Virus eliminiert haben Mit den folgenden Experimenten sollte untersucht werden, ob die Suppression von virusspezifischen T-Zellen spezifisch für die chronische Hepatitis C Virusinfektion ist. Hierfür wurden neben Patienten mit chronischer HCV-Infektion auch Personen untersucht, die HCV entweder spontan oder therapieinduziert eliminiert haben. Weiterhin sollte untersucht werden, ob die T reg -Zell-vermittelte Inhibition spezifisch für das persistierende Antigen ist, oder ob sich auch eine Hemmung anderer virusspezifischer T-Zellen nachweisen lässt. Als Kontrollantigen wurde hierfür ein immundominantes Peptid des Influenza Virus verwendet.

36 4 Ergebnisse 36 CD4 depletierte PBMC wurden in Anwesenheit von CD4 + CD25 - Zellen (Verhältnis 3:1) oder CD4 + CD25 + T reg -Zellen (Verhältnis 3:1) in Kultur gebracht und mit HCVspezifischen und Influenza-spezifischen Peptiden sowie anti-cd28 Antikörpern stimuliert. Nach 7 Tagen Kultur erfolgte die Auswertung durch Tetramer-Färbungen. Um die Stärke der jeweils beobachteten Inhibition vergleichen zu können, wurde die prozentuale Inhibition berechnet. Es zeigte sich, dass die Proliferation von Influenza-spezifischen CD8 + T-Zellen bei chronisch HCV-infizierten Personen nahezu gleich stark inhibiert wurde wie die von HCV-spezifischen CD8 + T-Zellen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass sich die Wirkung von T reg -Zellen nicht auf das persistierende Antigen beschränkt. Auch bei Personen mit ausgeheilter HCV-Infektion zeigte sich eine gleich starke Hemmung von HCV-spezifischen und Influenza-spezifischen T-Zellen. Interessanterweise war die Inhibition der CD8 + T-Zellen bei Personen mit ausgeheilter HCV-Infektion und gesunden Probanden aber deutlich schwächer als bei Patienten mit chronischer HCV- Infektion (Abbildung 4.9). Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Wirkung von T reg -Zellen bei der chronischen HCV-Infektion verstärkt, aber nicht spezifisch für das persistierende Antigen ist.

37 4 Ergebnisse chron. HCV HCV eliminiert gesund p= % 87.4% % Inhibition % 52.6% 50.8% 20 p= HCV Peptid Flu Peptid p=0.018 HCV Peptid Flu Peptid Flu Peptid Abbildung 4.9 Stärkere Inhibition durch T reg -Zellen bei Patienten mit chronischer HCV-Infektion als bei Personen mit ausgeheilter HCV-Infektion und gesunden Kontrollpersonen. Für die Berechnung der prozentualen Inhibition wurde folgende Formel angewandt: 100 (Prozentzahl Tetramer + CD8 + T-Zellen in Gegenwart von T reg -Zellen geteilt durch die Prozentzahl Tetramer + CD8 + T-Zellen in Gegenwart von CD4 + CD25 - T-Zellen) x 100. Chronische HCV: HCV-Peptid (C1[2 Epitope], C2, C3 und C4), Flu-Peptid (C1, C2, C3, C4 und C5); HCV eliminiert: HCV-Peptid (R1, R2[2 Epitope], R3, R7 und R8[2 Epitope]), Flu-Peptid (R2, R3, R4, R5 und R6) und 6 gesunde Probanden. 4.9 Erhöhte Frequenz von T reg -Zellen bei Patienten mit chronischer HCV- Infektion Um die biologische Relevanz von T reg -Zellen bei der chronischen Hepatitis C Virusinfektion weiter zu charakterisieren, sollte die Frequenz der zirkulierenden T reg - Zellen im peripheren Blut untersucht werden. Mithilfe von FACS-Färbungen wurde der Anteil CD4 + CD25 + T reg -Zellen an den Lymphozyten von Patienten mit chronischer HCV-Infektion ermittelt. Als Kontrollgruppen dienten erneut Personen, die das Hepatitis C Virus eliminiert haben und gesunde Kontrollpersonen. Wie in Abbildung 4.10 dargestellt zeigte sich, dass T reg -Zellen bei Patienten mit chronischer Infektion in

38 4 Ergebnisse 38 signifikant höherer Prozentzahl im peripheren Blut zirkulieren als bei den beiden Kontrollgruppen. 6 p= % CD4 + CD25 + Lymphozyten p= chron. HCV n=10 HCV eliminiert n=9 Gesunde Spender n=10 chron. HCV HCV eliminiert gesund 4,1% 2,8% 2,5% CD CD25 PE CD25 PE CD25 PE CD25 Abbildung 4.10 Erhöhte Frequenz von Treg-Zellen im Blut von Patienten mit chronischer HCV- Infektion verglichen mit Personen, die das Virus eliminiert haben und gesunden Kontrollpersonen T reg -Zellen im Blut von Patienten mit chronischer HCV-Infektion, Personen mit ausgeheilter HCV-Infektion und gesunden Probanden (oben); Repräsentative density plots aus jeder Population (unten)