Nichtlineare Photoperturbation an lebenden Zellen mit Mehrfarben-Femtosekunden-Faserlasern

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1 Nichtlineare Photoperturbation an lebenden Zellen mit Mehrfarben-Femtosekunden-Faserlasern Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Doctor rerum naturalium) vorgelegt von Martin Tomas an der Mathematisch-Naturwissenschaftliche Sektion Fachbereich Physik Tag der mündlichen Prüfung: 23. Juli Referent: Prof. Dr. Alfred Leitenstorfer 2. Referentin: Prof. Dr. Elisa May Konstanzer Online-Publikations-System (KOPS) URL:

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3 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Fluoreszenzmikroskopie und Photoperturbation Konfokale Fluoreszenzmikroskopie Multiphotonenmikroskopie Fluoreszenz-Photoperturbation zur Erforschung von Proteindynamiken DNA-Schäden und ihre Reparaturmechanismen Kompaktierung der DNA zum Chromatin DNA-Schäden Induktion von DNA-Schäden durch Laser Experimenteller Aufbau zur Fluoreszenzmikroskopie und Photoperturbation Femtosekunden-Faserlaser Einkopplung eines Femtosekunden-Faserlasers in ein LSM Einkopplung eines Zwei-Arm-Femtosekunden-Faserlasers in ein LSM über eine externe Scaneinheit Bestrahlungsbedingungen Lokale Induktion von DNA-Schäden zur Analyse von DNA-Reparaturmechanismen Charakterisierung des laserinduzierten Schadens Rekrutierungsstudien von DNA-Reparaturproteinen Die Schadenserkennung des Reparaturproteins XPC Die Rekrutierung von GFP-XPC in der Zelllinie DT Der Einfluss der Methylierung des Proteins PARP1 auf dessen enzymatische Aktivität Die Rekrutierung des Proteins XRCC1 unter Inhibition der PARP iii

4 Inhaltsverzeichnis 5.7 Die Rekrutierung der Werner-Proteins unter Inhibition der PARP Messung der Mobilität von Kernproteinen in Anwesenheit eines DNA- Schadens Messung der Leistungsabhängigkeit von Photoaktivierung und DNA-Schadensinduktion Kombination von nichtlinearer DNA-Schädigung und Photoaktivierung Vergleich mit anderen Messmethoden Charakterisierung des induzierten Schadens Das Linker-Histon H Die schadensinduzierte Zunahme der Mobilität von H Ortsabhängigkeit der schadensinduzierten Mobilitätszunahme von H Einfluss des Enzyms PARP Die Mobilität von H1.2 unter Inhibition der Histon-Deacetylase Diskussion der Ergebnisse Messung von Austauschraten rekrutierender Proteine am Beispiel von XRCC Akkumulation von GFP-XRCC1 an der Schadensstelle Mobilitätsmessungen von PAGFP-XRCC1 in zuvor geschädigtem Chromatin 99 9 Modellierung von Proteinkinetiken als Reaktions-Diffusions-Prozess Modellierung der schadensinduzierten Mobilitätszunahme des Linker-Histons H Abschätzung der mittleren Zeitdauer bei der Bindung von XRCC1 an DNA-Schäden Zusammenfassung und Ausblick 113 Literaturverzeichnis I iv

5 1 Einleitung Fortschritte in der Mikroskopie sind in vielen Fällen die Grundlage neuer Erkenntnisse in der Biologie. Schon die Entdeckung der Zelle als kleinste Einheit von lebenden Organismen geht auf die Entwicklung des ersten Lichtmikroskops zurück (Hoo65). In der modernen Biologie zählt insbesondere die Fluoreszenzmikroskopie zu den wichtigsten Analysemethoden, da sie die Visualisierung von subzellulären Strukturen ermöglicht. Große Fortschritte werden aktuell vor allem auf dem Gebiet der hochauflösenden Mikroskopie erreicht, die es ermöglicht Strukturen mit einer Größe unterhalb von 100 nm sichtbar zu machen (Wil06; Bet06; Gus05). Neben ihrer Funktion zur Abbildung werden optische Technologien in der Biologie und Medizin immer häufiger auch zur gezielten Manipulation von lebenden Zellen oder Gewebe eingesetzt. Beispiele hierfür sind optische Pinzetten, die das kontrollierte Bewegen von Zellen oder Zellbestandteilen erlauben (Ash10), der Forschungsbereich der Optogenetik, bei dem biologische Systeme durch Licht manipuliert werden (Dei10), oder auch der Einsatz von Lasern in der Chirurgie (Bou86). Im Forschungsgebiet der Zellbiologie ist in diesem Zusammenhang die Photoperturbation von Bedeutung. Der regulär vorherrschende Zustand einer Zelle wird dabei durch Licht bewusst gestört, um anschließend die durch den Eingriff hervorgerufenen Prozesse zu beobachten. Die Methode erlaubt so die Analyse dynamischer Vorgänge in lebenden Zellen. Ein Beispiel hierfür ist die lokale Induktion von DNA-Schäden, die zu der Aktivierung einer komplexen zellulären Schadensantwort führt. Techniken der Photoperturbation werden zudem in der Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt, um ein Ungleichgewicht in der räumlichen Verteilung von fluoreszenzmarkierten Proteinen zu erzeugen. Die anschließende Beobachtung der Rückkehr zum Gleichgewichtszustand lässt Rückschlüsse auf die Dynamik und das Bindungsverhalten von Proteinen zu (Ban10). Eine wichtige Voraussetzung für Fortschritte auf den Gebieten der Mikroskopie und der optischen Manipulation ist die technische Weiterentwicklung von Laserquellen mit immer höherer Leistungsstärke, Flexibilität und Bedienerfreundlichkeit. So hat die Nutzung von Lasern mit Impulsdauern in der Größenordnung von 100 fs zahlreiche neue Techniken 1

6 1 Einleitung ermöglicht, von denen die Multiphotonenmikroskopie die bekannteste ist (Zip03). Zur Erzeugung von ultrakurzen Laserimpulsen werden üblicherweise Titan:Saphir-Laser verwendet. In den letzten Jahren haben sich jedoch auch Femtosekunden-Faserlaser zu einer etablierten Technik auf diesem Gebiet entwickelt. Diese auf dotierten Glasfasern basierenden Lasersysteme zeichnen sich vor allem durch ihre hohe Stabilität, Flexibilität und die einfache Bedienbarkeit aus. Durch die gezielte Nutzung von hochnichtlinearen Effekten in Germanosilikat-Glasfasern und die Frequenzkonversion in nichtlinearen Kristallen haben Faserlaser einen weiten Wellenlängenbereich erschlossen, der sich über das gesamte sichtbare und nahinfrarote Spektrum erstreckt (Trä08). Im Forschungsgebiet der DNA-Reparatur hat sich die lokale Schädigung von lebenden Zellen durch Femtosekunden-Laser zu einer beliebten Technik entwickelt, da das betroffene Volumen auf einen Bereich innerhalb des Zellkerns beschränkt ist. Die Kombination von Laserschädigung mit der Fluoreszenzmikroskopie bietet die Möglichkeit der unmittelbaren Beobachtung der sich an die Photoperturbation anschließenden Prozesse. Bei der Bestrahlung mit Femtosekunden-Impulsen entstehen DNA-Schäden durch nichtlineare Prozesse. Aus diesem Grund unterscheidet sich die bei verschiedenen Wellenlängen hervorgerufene Art der Schäden deutlich von der bei der lineare Absorption. So können beispielsweise bei Wellenlängen im Bereich von 800 nm über eine Drei-Photonen-Absorption sogenannte UV-Photoprodukte induziert werden (Mel03). Diese Art von Schaden entsteht bei linearer Absorption nur in einem Wellenlängenbereich von etwa 260 nm (Voe63). Zusätzlich zur Induktion von UV-Photoprodukten führt die Bestrahlung mit Femtosekunden-Impulsen durch Prozesse höherer Ordnung zur Ionisation und freien Elektronen. Die auf diese Weise induzierten Schäden sind vergleichbar mit denen von ionisierender Strahlung, sie führen im Wesentlichen zu DNA-Strangbrüchen. Die Vielseitigkeit von Faserlasern erweist sich auch im Forschungsgebiet der DNA-Reparatur als großer Vorteil. So konnte gezeigt werden, dass bei einer Wellenlänge von 1050 nm in einem bestimmten Leistungsbereich selektiv DNA-Strangbrüche induziert werden können, wohingegen eine Wellenlänge von 775 nm zu Strangbrüchen und UV-Photoprodukten führt (Trä10). Selektivität in der Schadensinduktion ist von großer Bedeutung bei der Erforschung der vielfältigen und komplexen Reparaturmechanismen der DNA. 2

7 Diese Arbeit befasst sich mit Techniken der nichtlinearen Photoperturbation zur Untersuchung von DNA-Reparaturmechanismen in lebenden Zellen. Dazu wird ein Femtosekunden-Faserlaser in ein konfokales Fluoreszenzmikroskop eingekoppelt. Die Ausgangswellenlänge von 1550 nm des Erbium:Faserlasersystems kann durch eine Frequenzverdopplung zu einer Wellenlänge von 775 nm konvertiert werden. Zudem liefert eine Kombination aus einer hoch nichtlinearen Germanosilikat-Glasfaser und einem Ytterbium:Faserverstärker Femtosekunden-Impulse bei der Wellenlänge 1050 nm. Die durch die Photoperturbation hervorgerufenen Prozesse werden durch die Fluoreszenzmikroskopie mit linearer Anregung beobachtet. Nach einer lokalen DNA-Schädigung an lebenden Zellen kann auf diese Weise die Akkumulation von fluoreszenzmakierten Reparaturproteinen untersucht werden. Diese Technik findet Anwendung in unterschiedlichsten Bereichen im Forschungsgebiet der DNA-Reparatur. In der vorliegenden Arbeit werden Ergebnisse von Studien zum Bindungsverhalten des Reparaturproteins XPC, zum Einfluss der Methylierung des Enzyms PARP auf dessen Aktivität und zur Bindung der Proteine XRCC1 und WRN an DNA- Schäden unter Inhibition der PARP vorgestellt. Des Weiteren wird in dieser Arbeit ein Messverfahren vorgestellt, das die Untersuchung der Mobilität von Kernproteinen in zuvor geschädigten Zellen erlaubt. Es besteht aus einer DNA-Schädigung durch Femtosekunden-Impulse und einer Zwei-Photonen-Photoaktivierung bei unterschiedlichen Laserwellenlängen. Die Kombination dieser beiden Techniken der nichtlinearen Photoperturbation ermöglicht erstmals die direkte Beobachtung des Einflusses von DNA-Schäden auf die Mobilität von Kernproteinen. Insbesondere für den Zeitraum innerhalb der ersten Minuten nach der Schadensinduktion ist dies mit anderen Ansätzen bisher nicht möglich. Das entwickelte Messverfahren wird in dieser Arbeit dazu genutzt, den Einfluss von DNA- Schäden auf die Mobilität des Linker-Histons H1.2 zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigen erstmals, dass es zu einer Zunahme der Mobilität von H1.2 in Anwesenheit von DNA- Schäden kommt. Die Mobilitätsänderung weist eine zeitliche Abhängigkeit auf und ist lokal auf den geschädigten Bereich begrenzt. Als weitere Anwendung wird die Bindung des Reparaturproteins XRCC1 an die DNA- Schadensstelle untersucht. Durch das entwickelte Messverfahren und eine mathematische Modellierung der Ergebnisse kann erstmals ein Wert für die mittlere Bindungsdauer an der Schadensstelle angegeben werden. 3

8 1 Einleitung Die vorliegende Arbeit beginnt mit einer Vorstellung der Techniken der Fluoreszenz-Photoperturbation, mit denen Proteindynamiken in lebenden Zellen beobachtet werden. Um aus den Messdaten Rückschlüsse auf die Bindung von Proteinen ziehen zu können, werden die Prozesse durch ein Reaktions-Diffusions-Modell beschrieben und mit den gemessenen Ergebnissen verglichen. In Kapitel 2 wird diese Vorgehensweise genauer beschrieben und eine Zusammenfassung der wichtigsten Veröffentlichungen auf diesem Themengebiet gegeben. Kapitel 3 gibt einen Überblick über die unterschiedlichen Arten von DNA-Schäden, deren Entstehung, sowie die zellulären Reparaturmechanismen. Da im Forschungsgebiet der DNA-Reparatur häufig Laser zur Induktion von Schäden genutzt werden, wird in diesem Kapitel ein Überblick über diese Technik gegeben, wobei der Schwerpunkt auf den Entstehungsmechanismen von DNA-Schäden bei der Bestrahlung mit ultrakurzen Laserimpulsen liegt. Nach einer Beschreibung des in dieser Arbeit verwendeten Versuchsaufbaus in Kapitel 4 zeigt Kapitel 5 die Ergebnisse von Messungen, bei denen die Akkumulation von Reparaturproteinen an der Schadensstelle untersucht wird. Kapitel 6, 7 und 8 widmen sich schließlich der neu entwickelten Messmethode und den dadurch erzielten Ergebnissen. Es handelt sich hierbei um Untersuchungen zum Linker- Histon H1.2 (Kapitel 7) und zum Reparaturprotein XRCC1 (Kapitel 8). Kapitel 9 beschreibt einen Ansatz zur mathematischen Modellierung von Proteinbewegungen in zuvor geschädigtem Chromatin. Die Arbeit endet mit einer Zusammenfassung (Kapitel 10). 4

9 2 Fluoreszenzmikroskopie und Photoperturbation Die Fluoreszenzmikroskopie stellt eine der wichtigsten Analysemethoden in der modernen Biologie dar. Durch fluoreszierende Farbstoffe lassen sich Strukturen in Zellen oder Gewebe sichtbar machen, die mit anderen lichtmikroskopischen Techniken aufgrund des geringen Kontrastes nicht beobachtet werden können. Der Einsatz von fluoreszierenden Proteinen ermöglicht auch die Mikroskopie von lebenden Zellen. Dynamische Prozesse und Mobilitäten von Proteinen lassen sich durch die Fluoreszenz-Photoperturbation beobachten. Bei diesen Techniken werden die Fluoreszenzeigenschaften der Markerproteine durch Licht manipuliert. Die Anregung und Manipulation von fluoreszierenden Proteinen kann auch durch die gleichzeitige Absorption von mehreren Photonen geringerer Energie erfolgen. Das Anregungsvolumen ist in diesem Fall kleiner als bei einer Ein-Photonen-Anregung. In der Multiphotonenmikroskopie erreicht man durch dieses Prinzip eine erhöhte Auflösung, bei der Photoperturbation ist eine präzise Manipulation im Sub-µm-Bereich möglich. Dieses Kapitel gibt, nach einer Einführung in die konfokale Fluoreszenzmikroskopie und die Multiphotonenanregung, einen Überblick über die wichtigsten Techniken der Fluoreszenz-Photoperturbation und die Auswertung und Interpretation der Messergebnisse durch Modellierung. 2.1 Konfokale Fluoreszenzmikroskopie Bei der Fluoreszenz geht ein Atom oder Molekül von einem angeregten Zustand unter Emission eines Photons in einen energetisch tiefer liegenden Zustand über. Die mittlere Lebensdauer des angeregten Zustandes liegt dabei im Bereich von einigen Nanosekunden. Im Gegensatz zu Atomen gibt es bei Molekülen neben den elektronischen Energieniveaus noch eine Vielzahl von Schwingungs- und Rotationszuständen, die zu einer Verbreiterung der Energieniveaus führen. In komplexen Molekülen führt dies zu kontinuierlichen Absorptions- und Emissionsspektren, deren Maxima wegen der Stokesverschiebung bei 5

10 Energy 2 Fluoreszenzmikroskopie und Photoperturbation Sample Objective S 1 Laser Scanner Dichroic mirror S 0 Pinhole Photomultiplier Abbildung 2.1: Funktionsweise der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie. Links: Aufgrund der Stokes-Verschiebung hat die von einem Fluorophor emittierte Strahlung eine höhere Wellenlänge als das Anregungslicht. Rechts: Die Fluoreszenzmikroskopie nutzt dieses Prinzip, um Anregungs- und Emissionslicht durch einen dichroitischen Strahlteiler zu trennen. Durch eine Blende vor dem Detektor gelangt nur Licht aus der Fokusebene zum Detektor. unterschiedlichen Wellenlängen liegen. Die Fluoreszenzmikroskopie nutzt dieses Prinzip, um Anregungslicht und das vom Fluorophor emittierte Licht durch einen dichroitischen Strahlteiler spektral voneinander zu trennen. Die optischen Eigenschaften dieses Strahlteilers sind dabei so gewählt, dass er ein stark unterschiedliches Reflexionsvermögen für die Anregungswellenlänge und die ins Langwellige verschobene Fluoreszenz besitzt. Erfolgt die Anregung der Fluorophore zu einem bestimmten Zeitpunkt nur an einem Punkt des Präparats, so spricht man von konfokaler Fluoreszenzmikroskopie. Konfokal bedeutet in diesem Fall, dass der Beleuchtungs- und der Abbildungsstrahlengang den gleichen Fokus haben. Durch punktweises Abrastern des gesamten Präparats lässt sich eine Abbildung der räumlichen Fluoreszenzintensitätsverteilung erstellen. Man spricht bei diesem Verfahren von einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (LSM). Abbildung 2.1 zeigt schematisch die Funktionsweise. Die optische Auflösung eines LSMs wird charakterisiert durch die Punktabbildungsfunktion (point spread function, PSF). Die PSF gibt an, wie ein als punktförmig angenommenes 6

11 2.2 Multiphotonenmikroskopie Objekt durch das optische System abgebildet wird. Ein mit einem LSM aufgenommenes Bild ist immer ein Faltung des realen Bildes mit der PSF. Die Gesamt-PSF setzt sich zusammen aus dem Produkt der Beleuchtungs-PSF und der Detektions-PSF. Die Beleuchtungs-PFS entspricht dem Anregungsvolumen des durch das Objektiv fokussierten Laserstrahls. Die minimale Größe dieses Volumens ist gegeben durch die Beugung des Anregungslichtes am Objektiv des Mikroskops. Die Detektions- PSF lässt sich durch eine Lochblende (pinhole) vor dem Detektor weiter verkleinern. Diese Anordnung führt dazu, dass nur Fluoreszenzlicht aus der Fokusebene zum Detektor gelangen kann, was die Auflösung erhöht. Die Fluoreszenzmikroskopie ist von großer Bedeutung in der Biologie. Ein Grund hierfür ist, dass es durch die Immun- oder Antikörperfärbung möglich ist, bestimmte Strukturen in Zellen anzufärben. Die Immunfärbung beruht auf dem Einsatz von Antikörpern, die spezifisch an bestimmte Proteine binden. Durch eine Kombination dieser Antikörper mit Farbstoffen ist es möglich Zellbestandteile oder Proteinverteilungen sichtbar zu machen. Für eine Antikörperfärbung von subzellulären Strukturen muss das Gewebe jedoch fixiert sein, eine Mikroskopie an lebenden Zellen ist mit dieser Technik nicht möglich. Durch den Einsatz von fluoreszierenden Proteinen, wie beispielsweise dem grün fluoreszierenden Protein (GFP), ist es auch möglich, die Funktionsweise von Proteinen in lebenden Zellen zu untersuchen. Dazu wird die DNA von GFP mit der DNA von anderen Proteinen fusioniert und in lebende Zellen eingebracht. Auf diese Weise bringt man die Zelle dazu, selbständig dieses Protein herzustellen. Durch die Fluoreszenzmikroskopie lassen sich somit Informationen über die räumliche und zeitliche Verteilung des Proteins gewinnen. 2.2 Multiphotonenmikroskopie In der Fluoreszenzmikroskopie erfolgt die Anregung eines Farbstoffmoleküls üblicherweise durch die Absorption eines Photons. Es ist aber auch möglich, dass zwei Photonen mit geringerer Energie gleichzeitig absorbiert werden und den Übergang anregen. Dieser Prozess wurde im Jahre 1931 von Maria Göppert-Mayer theoretisch beschrieben (GM31). Da für eine Zwei-Photonen-Anregung sehr hohe Photonendichten nötig sind, konnte der experimentelle Nachweis jedoch erst 1961 nach der Erfindung des Lasers erbracht werden (Kai61). Im Jahre 1990 wurde die Zwei-Photonen-Anregung erstmals für die Mikroskopie genutzt (Den90) und hat sich seitdem zu einer weit verbreiteten Technik entwickelt (Zip03; Hel05). 7

12 2 Fluoreszenzmikroskopie und Photoperturbation Ein wichtiger Grund für den Erfolg der Multiphotonenmikroskopie ist die Enwicklung von immer leistungsstärkeren und bedienerfreundlicheren Ultrakurzpulslasern mit Impulsdauern in der Größenordnung von 100 fs. Da sich die Energie auf die einzelnen Lichtimpulse konzentriert, erreichen Femtosekunden-Laser die für die Zwei-Photonen-Anregung benötigten sehr hohen Spitzenintensitäten (GW/cm 2 ) schon bei moderaten mittleren Leistungen (einige mw). Dies ermöglicht die Mikroskopie von lebenden Zellen, Gewebe und ganzen Organismen (Svo97; Hel05). Mathematisch lässt sich die Zwei-Photonen-Absorption durch die zeitabhängige Störungsrechnung zweiter Ordnung beschreiben. Der Übergang wird als Zwei-Niveau-System betrachtet, dass durch die Absorption von zwei Photonen vom Grundzustand in den angeregten Zustand übergehen kann. Das erste Photon hebt das System dabei in einen virtuellen Zwischenzustand mit sehr kurzer Lebensdauer (fs) an. Durch die Absorption eines weiteren Photons während dieser Zeit kann der Übergang in den angeregten Zustand erfolgen. Bei einem Ein-Photonen-Absorptionsprozess ist die Wahrscheinlichkeit für einen Übergang propotional zur Intensität der einfallenden Strahlung. In der Fluoreszenzmikroskopie besteht also ein linearer Zusammenhang zwischen der Intensität des Anregungslichtes und der Anzahl der angeregten Moleküle und somit der Fluoreszenzintensität. Bei der Zwei-Photonen-Anregung sind sowohl die Wahrscheinlichkeit für den Übergang ins Zwischenniveau als auch die Wahrscheinlichkeit für den Übergang vom Zwischenniveau in den angeregten Zustand propotional zur Intensität der einfallenden Strahlung. Die Gesamtwahrscheinlichkeit für die Anregung vom Grundzustand in den energetisch höher liegenden Zustand ist somit proportional zum Quadrat der Intensität. Man spricht deshalb auch von einem nichtlinearen Prozess zweiter Ordnung. Für die Anzahl N der durch einen Zwei-Photonen-Prozess angeregten Moleküle gilt (Den90): N P 2 0 σ τf 2 ( ) NA 2 2 (2.1) 2 cλ P 0 ist dabei die mittlere Leistung, τ die Impulsdauer, f die Wiederholrate des Lasers, NA die numerische Apertur des Objektivs, λ die Wellenlänge und σ der Wirkungsquerschnitt für die Zwei-Photonen-Absorption. Neben der Absorption von zwei Photonen ist auch die gleichzeitige Absorption von drei oder mehr Photonen möglich. Allgemein gilt für die 8

13 2.2 Multiphotonenmikroskopie z (µm) n=1 x (µm) n=2 n=3 > < 0.05 Abbildung 2.2: Berechnete Verteilung des effektiven Anregungsvolumens für eine Ein-, Zweiund Drei-Photonen-Anregung mit einer Wellenlänge von 775 nm und einer NA von 1,3. Mit zunehmender Ordnung des Prozesses verringert sich das Anregungsvolumen. Anzahl der durch einen n-photonen-prozess angeregten Moleküle N (Xu96): N σ n I n peak τ P n 0 τ n 1 (2.2) Hierbei ist σ n der Wirkungsquerschnitt für eine n-photonen-absorption. Die Spitzenintensität I peak berechnet sich zu (Trä10): I peak = P 0 fτa (2.3) A ist hierbei die bestrahlte Fläche. Da sich durch eine längere Wechselwirkungsdauer auch die Wahrscheinlichkeit für einen Übergang erhöht, ist die Ordnung der Impulsdauer τ in Gleichung 2.2 um eins geringer als die der mittleren Leistung P 0. Abbildung 2.2 zeigt die berechnete räumliche Intensitätsverteilung einer Ein-, Zwei- und Drei-Photonen-Anregung für Licht der Wellenlänge 775 nm, das durch ein Objektiv mit einer NA von 1,3 fokussiert wird 1. Da die Wahrscheinlichkeit für eine Anregung von der n-ten Potenz der Intensität abhängt, verringert sich das angeregte Volumen mit zunehmender Ordnung n des Prozesses. Die nichtlineare Abhängigkeit des Fluoreszenzsignals von der Intensität stellt sich als großer Vorteil für die Mikroskopie heraus, da sie zu einer Erhöhung der Auflösung führt. Eine Blende vor dem Detektor, wie bei der linearen Anregung zur Erhöhung des Auflösungsvermögens verwendet wird, ist bei der Multiphotonen-Mikroskopie nicht mehr nötig. Zudem verringert sich durch das geringere Anregungsvolumen der Effekt des Ausbleichens 1 Die Darstellung orientiert sich an einer Abbildung aus Meldrum et al. (Mel03). Den Berechnungen liegt die gaußsche Strahlenoptik zugrunde. 9

14 2 Fluoreszenzmikroskopie und Photoperturbation der Farbstoffe. Um Fluorophore im sichtbaren Spektralbereich anzuregen wird in der Multiphotonen- Mikroskopie typischerweise infrarote Strahlung im Wellenlängenbereich zwischen 700 nm und 1000 nm verwendet, was dem Durchstimmbarkeitsbereich eines Titan:Saphir-Lasers entspricht. Infrarote Strahlung bietet gegenüber sichtbarem Licht den Vorteil, dass die Eindringtiefe in biologische Medien deutlich höher ist. Die Gründe hierfür sind zum einen starke Frequenzabhängigkeit der hier dominierenden Rayleigh-Streuung ( ω 4 ) und zum anderen die geringere Absorption von zellulären Bestandteilen (Kön01). Bei einer Wellenlänge von 1300 nm liegt die Eindringtiefe bei über einem Millimeter (Kob09). Für höhere Wellenlängen überwiegt jedoch die stärker werdende Wasserabsorption gegenüber der geringeren Streuung. Bei den Zwei-Photonen-Absorptionsspektren von Fluorophoren fällt auf, dass sie nicht exakt der doppelten Photonenenergie der linearen Absorption entsprechen. Typischerweise sind sie leicht ins Kurzwellige verschoben. Zudem lassen sich viele Moleküle gar nicht oder nur sehr ineffizient anregen. Der Grund hierfür ist, dass für die Zwei-Photonen-Absorption andere Auswahlregeln gelten als für die lineare Absorption. In Atomen oder Molekülen mit Inversionszentrum kann ein durch die Absorption eines Photons induzierter Dipol- Übergang nur zwischen zwei Zuständen mit unterschiedlicher Parität stattfinden, also von gerader zu ungerader Parität oder umgekehrt. Bei einem Zwei-Photonen-Übergang ändert sich die Parität bei der Absorption des ersten Photons und noch ein weiteres Mal bei der Absorption des zweiten Photons. Insgesamt bleibt die Parität also erhalten. Die Auswahlregeln gelten jedoch schon in größeren Atomen nicht mehr streng. Bei einer Spin-Bahn-Kopplung ist nur noch der Gesamtdrehimpuls eine Erhaltungsgröße und es kommt zu einer Überlagerung von verschiedenen Zuständen. Zudem führt eine Abweichung von der Zentralsymmetrie, wie es in mehratomigen Molekülen der Fall ist, ebenfalls zu einer Aufhebung der Drehimpuls-Auswahlregel. Wie effizient sich ein elektronischer Übergang eines Moleküls durch eine Zwei-Photonen-Absorption anregen lässt, hängt von der chemischen Struktur des Fluorophors ab. 10

15 2.3 Fluoreszenz-Photoperturbation zur Erforschung von Proteindynamiken 2.3 Fluoreszenz-Photoperturbation zur Erforschung von Proteindynamiken Die Techniken der Fluoreszenz-Photoperturbation bieten eine Möglichkeit, die Mobilität von Proteinen in lebenden Zellen zu untersuchen. Die Idee bei dieser Art von Experimenten ist es, durch eine optische Manipulation ein räumliches Ungleichgewicht in der Verteilung der fluoreszent markierten Proteine herzustellen um danach die Wiederherstellung des Gleichgewichtszustandes zu beobachten. Die bekanntesten Methoden hierfür sind FRAP (fluorescence recovery after photobleaching), FLIP (fluorescence loss in photobleaching), Photoaktivierung und Photokonvertierung. Diese Messmethoden werden im ersten Teil dieses Abschnitts erklärt. Aus den gemessenen Daten lassen sich Rückschlüsse auf biochemische Bindungseigenschaften ziehen. Dazu werden die Proteindynamiken durch ein Reaktions-Diffusions-Modell beschrieben und mit den experimentellen Daten verglichen. Im zweiten Teil dieses Abschnitts werden die Grundlagen und die wichtigsten analytischen sowie numerischen Lösungen der Modelle vorgestellt Techniken der Fluoreszenz-Photoperturbation Mit der Fluoreszenzmikroskopie ist es möglich die räumliche und zeitliche Verteilung eines Proteins in lebenden Zellen zu beobachten. Die gemessene Intensitätsverteilung ist jedoch üblicherweise ein Gleichgewichtszustand und liefert somit keine Informationen darüber, ob ein Austausch der Proteine stattfindet und mit welcher Geschwindigkeit dieser erfolgt. Die Techniken der Fluoreszenz-Photoperturbation bieten eine Möglichkeit, diese dynamischen Prozesse zu untersuchen. Die am weitesten verbreitete Methode in diesem Zusammenhang ist FRAP. Bei dieser Technik wird die Fähigkeit der Fluoreszenz des Markerproteins lokal durch einen Bleichprozess zerstört. Dies geschieht durch die kurzzeitige Bestrahlung einer definierten Stelle mit Licht hoher Intensität. Dadurch ändert sich zwar die räumliche Verteilung der Fluoreszenz, nicht aber die des zu untersuchenden Proteins. Bei einer Umverteilung kommt es zu einer Vermischung zwischen Proteinen mit fluoreszierenden und geblichenen Markern und somit zu einer Rückkehr der Fluoreszenz innerhalb der geblichenen Region. Die Zeit der Wiederherstellung der Fluoreszenz (fluorescence recovery) hängt von den Bindungseigenschaften des Proteins ab. Aus dem zeitlichen Intensitätsverlauf lassen sich durch Vergleich mit Modellen Rückschlüsse auf Bindungskonstanten ziehen. In Abbildung

16 2 Fluoreszenzmikroskopie und Photoperturbation ist die Funktionsweise der Messmethode schematisch gezeigt. Der zeitliche Verlauf der Intensität kann auch in einem Bereich beobachtet werden, in dem das fluoreszierende Protein nicht geblichen wurde. In diesem Fall kommt es bei der Umverteilung des Proteins zu einer Abnahme der Fluoreszenzintensität innerhalb dieser Region. Diese Technik wird als FLIP bezeichnet und liefert eine zu FRAP komplementäre Information, was eine unabhängige Bestätigung der Ergebnisse liefert. Neuere Methoden der Fluoreszenz-Photoperturbation beruhen auf dem Einsatz von photoaktivierbaren und photokonvertierbaren Proteinen. Diese Proteine ändern durch die Bestrahlung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge ihre Fluoreszenzeigenschaften. Bei photoaktivierbaren Proteinen erhöht sich die Effizienz der Fluoreszenzanregung um mehrere Größenordnungen, bei photokonvertierbaren Proteinen ändert sich das Anregungsund Emissionsspektrum. Es ist also möglich, die Fluoreszenzeigenschaft dieser Proteine durch einen Lichtblitz gewissermaßen anzuschalten. Das bekannteste Beispiel in diesem Zusammenhang ist das photoaktivierbare grün fluoreszierende Protein (photoactivatable green fluorescent protein, PAGFP) (Pat02). Durch eine Bestrahlung bei einer Wellenlänge von 400 nm erhöht sich bei diesem Protein die Intensität der emittierten Strahlung um den Faktor 100 (Anregung bei 504 nm, Emission bei 517 nm) (Ban10). Photoaktivierbare Proteine eignen sich sehr gut zur Analyse von Proteinmobilitäten, da die Bestrahlung mit einem fokussierten Laser die Fluoreszenzeigenschaft lokal anschalten kann. Dies ermöglicht Experimente, die zu FRAP-Messungen analog sind. Abbildung 2.4 zeigt schematisch den Ablauf eines solchen Experimentes. Gegenüber dem Ausbleichen von Proteinen bietet die Photoaktivierung folgende Vorteile (Ban10): Bei Photoaktivierungsexperimenten wird ein helles Signals über einem dunklen Hintergrund gemessen. Dies führt zu einem besseren Signal-zu-Rausch-Verhältnis im Vergleich zu FRAP Messungen, bei denen eine dunkle Region vor einem hellen Hintergrund gemessen wird. Beim Ausbleichen wird das Markerprotein teilweise in einen Triplett-Zustand angeregt. Diese sogenannten dunklen Zustände (dark states) haben eine relativ lange Lebensdauer im Bereich von einigen Millisekunden und tragen währenddessen nicht zur Fluoreszenz bei. Nach dem Zerfall in den Grundzustand ist eine Anregung der Fluoreszenz jedoch wieder möglich. Diese Eigenschaft kann die Ergebnisse von FRAP-Messungen verfälschen, da dieser Prozess bei der Auswertung und Interpretation der Daten nicht berücksichtigt wird. 12

17 2.3 Fluoreszenz-Photoperturbation zur Erforschung von Proteindynamiken irradiation time fluorescence intensity time Abbildung 2.3: Schematische Darstellung eines FRAP-Experimentes. Nach dem Ausbleichen einer definierten Region im Zellkern führt die Umverteilung der Proteine zu einer Rückkehr der Fluoreszenz innerhalb der geblichenen Region. irradiation time fluorescence intensity time Abbildung 2.4: Schematische Darstellung zur Messung der Proteinmobilität durch Photoaktivierung. Die Intensität nimmt innerhalb des aktivierten Bereiches nach der Fluoreszenz- Photoperturbation ab. 13

18 2 Fluoreszenzmikroskopie und Photoperturbation Der Prozess der Photoaktivierung ist deutlich effizienter als der des Ausbleichens. Das bedeutet, dass die Bestrahlungszeit für die Aktivierung kürzer gewählt werden kann als die Zeitdauer, die bei FRAP-Experimenten für das Bleichen benötigt wird. Dies ist wichtig bei hohen Proteinmobilitäten, da bereits während des Ausbleichens/Photoaktivierens Diffusion stattfindet. Aufgrund der höheren Effizienz des Prozesses ist die benötigte Laserleistung geringer. Bei der Mikroskopie von lebenden Zellen ist es wichtig, die Intensität der Laserstrahlung so gering wie möglich zu halten, da durch Licht auch DNA-Schäden entstehen können (Dob07; SK12). Bei einigen Proteinen führt ein DNA Schaden zu einer veränderten Mobilität (Ayo08; Tom12) Modellierung der Proteindynamik als Reaktions-Diffusionsprozess FRAP- und Photoaktivierungsexperimente liefern Informationen über die Diffusion und das Bindungsverhalten von Proteinen in lebenden Zellen. Aus den Messdaten lassen sich direkt qualitative Informationen über die Geschwindigkeit der Proteinumverteilung gewinnen. Der Kurvenverlauf und die Halbwertszeit enthalten Informationen über mobiles oder immobiles Verhalten des Proteins. Durch Vergleichsstudien können Änderungen in der Mobilität, die beispielsweise durch DNA-Schäden oder die Inhibition eines bestimmten Enzyms verursacht werden, untersucht werden. Die quantitative Bestimmung von Bindungs-Reaktionskonstanten ist deutlich schwieriger und fehleranfälliger, da sie lediglich indirekt durch Kurvenanpassung erfolgt (Pha01). Dazu wird anhand eines mathematischen Modells der zeitliche Intensitätsverlauf nach der Photoperturbation berechnet und mit den Messdaten verglichen, wobei Diffusionsund Bindungskonstanten als Parameter eingehen. Durch eine Variation dieser Parameter ergibt sich deren Wert über die minimale Abweichung zwischen gemessener und berechneter Kurve. Die mathematische Beschreibung der Proteinkinetiken erfolgt durch eine Reaktions- Diffusionsgleichung in drei Raumdimensionen. In früheren Studien wurde angenommen, dass die Diffusion eines Proteins vernachlässigbar ist, da sie im Gegensatz zur Bindung die Bewegung des Proteins nicht limitiert (Bul01; Dun02; Rab04; Pha04a; Pha04b). Die Arbeiten von Sprague et al. (Spr04) und Beaudouin et al. (Bea06) zeigen jedoch, dass auch bei Proteinen mit geringer Mobilität die Diffusion die Bewegung des Proteins beeinflussen kann. 14

19 2.3 Fluoreszenz-Photoperturbation zur Erforschung von Proteindynamiken Die Beschreibung von Proteindynamiken durch eine Reaktions-Diffusionsgleichung geht von der Annahme aus, dass ein Protein stochastisch in drei Dimensionen diffundiert bis es auf eine freie Bindungsstelle trifft. Dort geht es eine Bindung ein, die für eine gewisse Zeit besteht. Das mathematische Modell zur Beschreibung der Kinetik von Proteinen beruht somit auf folgender Reaktionsgleichung (Spr04; Bea06; Car04) 1 : F + S kon C (2.4) koff F steht für ungebundenes Protein (free protein), S für freie Bindungsstellen (vacant binding sites) und C für gebundene Komplexe (bound complexes). Die Reaktionsgeschwindigkeit ist bestimmt durch die Raten für die Hin- und die Rück-Reaktion k on und k off. Die inversen Werte von k on und k off entsprechen der mittleren Zeit zwischen zwei Reaktionen und der mittleren Dauer der Bindung. Für die Konzentrationen f = [F ], s = [S] und c = [C] gilt unter Berücksichtigung der Diffusion: f t = D f 2 f k on f s + k off c s t = D s 2 s k on f s + k off c c t = D c 2 c + k on f s k off c (2.5) In diesem allgemeinen Ansatz einer Reaktions-Diffusionsgleichung in drei Dimensionen ist 2 der Laplace-Operator und D die Diffusionskonstante der einzelnen Komponenten. Das Gleichungssytem kann durch zwei Annahmen vereinfacht werden, die üblicherweise in biologischen Systemen gewährleistet sind: 1. Vor dem Photobleichen/-aktivieren befindet sich das System im Gleichgewicht. Für die Anzahl von Proteinen, Bindungsstellen und Komplexen gilt: F = F eq S = S eq C = C eq Durch das Bleichen ändert sich die Anzahl der fluoreszierenden freien Proteine und 1 Die Darstellung orientiert sich an der aus Sprague et al. (Spr04), ist aber analog zu Beaudouin et al. (Bea06) und Carrero et al. (Car04). 15

20 2 Fluoreszenzmikroskopie und Photoperturbation der fluoreszierenden gebundenen Komplexe (F und C), nicht aber die Anzahl der freien Bindungsstellen S eq, da diese ja keinen Fluoreszenzmarker tragen. Da sowohl k on als auch S eq konstant sind, werden sie zusammengefasst zur sogenannten Pseudo-Hin-Reaktionsrate: k on = k on S eq (2.6) In biologischen Systemen ist diese Vereinfachung üblicherweise eine gute Näherung. Auf Zeitskalen von mehreren Stunden kann sich zwar das Expressionslevel und somit die Gesamtmenge des Proteins in der Zelle ändern, jedoch liegt die Beobachtungsdauer einer einzelnen Messung typischerweise im Bereich von Sekunden bis Minuten. 2. Freie Bindungsstellen und gebundene Komplexe bewegen sich nicht. Es gilt somit: D s = 0 D c = 0 (2.7) Typischerweise wird bei Mobilitätsmessungen die Bindung von beweglichen Proteinen an eine unbewegliche Struktur betrachtet. Bei Kernproteinen ist dies die Bindung an das Chromatin, dessen Bewegung und Umorganisation auf einer Zeitskala von einigen Stunden stattfindet. Mit diesen Annahmen vereinfacht sich Gleichung 2.5 zu: f t = D f 2 f k on f + k off c c t = k on f k off c (2.8) Das Verhältnis zwischen freien und gebundenen Proteinen ist durch den Quotient aus k off und k on gegeben. Da sich das System vor dem Bleichen im Gleichgewicht befindet, 16

21 2.3 Fluoreszenz-Photoperturbation zur Erforschung von Proteindynamiken gilt: df dt = dc dt = 0 = k on F eq = k off C eq F eq C eq = k off k on (2.9) Lösungen der Reaktions-Diffusionsgleichung Die Bewegung von Proteinen ist durch die Reaktions-Diffusionsgleichung 2.8 gegeben. Diese Gleichung kann für bestimmte Anfangs- und Randbedingungen gelöst und mit den gemessenen Daten verglichen werden. Für einige Verteilungen der Anfangsintensität mit einfacher Geometrie (z.b. Kreis (Spr04; Maz08), Rechteck (Car04) oder gaußförmige Intensitätsverteilung (Kan08)) existieren analytische Lösungen. Dazu müssen jedoch folgende Vereinfachungen angenommen werden: 1. Die räumliche Verteilung der Bindungsstellen wird als homogen angenommen. Die Näherung ist in vielen Fällen nicht gerechtfertigt, da das Chromatin keine einheitliche Dichte besitzt (z.b. Eu-/Heterochromatin) und es zudem abgetrennte Bereiche gibt (z.b. Nukleoli). Bereiche mit unterschiedlichen Chromatindichten können nur separat gemessen werden, wenn die Größe der geblichenen/aktivierten Fläche kleiner ist als die der betrachteten Struktur (z.b. Mistelli et al. (Mis01)), andernfalls wird ein Mittelwert gemessen. In Sprague et al. (Spr06) wird eine analytische Lösung von Gleichung 2.8 vorgestellt, die unterschiedliche Bindungskonstanten in axialer Richtung berücksichtigt. 2. Die endliche Ausdehnung des Zellkerns wird vernachlässigt. Bei FRAP-Messungen stellt dies üblicherweise kein Problem dar, da bei der Auswertung auf die Intensität des gesamten Zellkerns normiert wird. Ohne Normierung ist die Näherung gerechtfertigt, wenn das geblichene bzw. aktivierte Volumen deutlich kleiner ist als das Volumen des Zellkerns. Die Näherung ist für frühe Zeitpunkte nach der Photoperturbation besser geeignet als für späte, da die mittlere quadratische Verschiebung δr 2 eines Moleküls linear mit der Zeit t ansteigt: δr 2 (t) = 2nDt (2.10) 17

22 2 Fluoreszenzmikroskopie und Photoperturbation Dabei ist n die Anzahl der Dimensionen, in denen die Diffusion stattfindet. 3. Der geblichene/photoaktivierte Bereich hat die gleiche Größe entlang der axialen Richtung. Die Intensitätsverteilung ist somit in allen Ebenen in dieser Richtung gleich und das System kann als zweidimensional betrachtet werden. Bei FRAP- Experimenten an Kernproteinen ist diese Näherung üblicherweise erfüllt, da die meisten adherenten Zelllinien sehr dünn sind (ca. 5 µm Dicke bei ca. 20 µm axialer Ausdehnung) 2 und der fokussierte Laserstrahl eine gewisse Ausdehnung in axialer Richtung besitzt (die axiale Ausdehnung der PSF ist ca. um den Faktor drei größer als die laterale). Die Näherung als zweidimensionales System ist gerechtfertigt, wenn die axiale Ausdehnung des geblichenen/aktivierten Bereiches in etwa die gleiche Größe hat wie die Dicke der Zelle (Ban10). In einer Arbeit von Mazza et al. (Maz08) wird eine analytische Lösung der Diffusionsgleichung angegeben, die auch eine Intensitätsverteilung in axialer Richtung berücksichtigt, wie sie bei Multiphotonenanregung auftritt. Reaktions-Diffusionsprozesse lassen sich hiermit jedoch nicht beschreiben. Können diese Vereinfachungen nicht gemacht werden, so muss Gleichung 2.8 numerisch gelöst werden. Numerische Lösungen sind deutlich rechenintensiver und aufwendiger in der Umsetzung als analytische. In Tabelle 2.1 sind die wichtigsten analytischen und numerischen Lösungsansätze für FRAP- und Photoaktivierungsexperimente von Kernproteinen zusammengefasst. Eines der am häufigsten verwendeten Modelle ist die von Sprague et al. (Spr04) vorgestellte Lösung der Reaktions-Diffusionsgleichung für einen geblichenen Kreis. Die mittlere Intensität innerhalb eines geblichenen Kreises in Abhängigkeit der Zeit ist demnach gegeben durch die Laplace-Transformation des folgenden Ausdrucks: frap(p) = 1 p F eq p ( 1 2 K 1 (qw) I 1 (qw) ) ( 1 + k on p + k off ) C eq p + k off (2.11) Dabei ist w ist der Radius des geblichenen Bereichs, I 1 und K 1 sind die Bessel-Funktionen erster und zweiter Ordnung und p die der Zeit t entsprechende Laplace-Variable. q ist 2 Die Größen variieren sowohl für unterschiedliche Zelllinien als auch für die einzelnen Zellen einer Zelllinie. 18

23 2.3 Fluoreszenz-Photoperturbation zur Erforschung von Proteindynamiken Publikation Modell Art der Lösung/ Dimension Sprague et al. (Spr04) Carrero et al. (Car04) Phair et al. (Pha04a) Sprague et al. (Spr06) Mazza et al. (Maz08) Kang et al. (Kan08) Beaudouin et al. (Bea06) Calvert et al. (Cal07) Stasevich et al. (Sta10) Anfangsintensitätsverteilung Reaktions- Diffusions- Modell Reaktions- Diffusions- Modell nur Reaktion, Diffusion wird vernachlässigt Reaktions- Diffusions- Modell reine Diffusion, immobile Fraktion Reaktions- Diffusions- Modell Reaktions- Diffusions- Modell Diffusion Reaktions- Diffusions- Modell analytisch, 2D analytisch, 1D/2D analytisch analytisch 2D/3D analytisch 2D/3D analytisch 2D numerisch, 2D/3D numerisch, 3D numerisch, 2D Kreis Linie, Rechteck Halber Zellkern (Bleichen) Bemerkungen Liefert vereinfachte Lösungen für bestimmte Wertebereiche der Hin- und Rück-Reaktionsraten. Ein Vergleich zw. (Car04) und (Spr04) liefert unterschiedliche Ergebnisse (Mue08; Mue10). Diffusion kann in vielen Fällen nicht vernachlässigt werden (Bea06). gaußverteilte Intensität, Kreis Halber Zellkern (Photoaktivieren) gaußverteilte Intensität Kreis Kreis Berücksichtigt subzelluläre Bereiche in axialer Richtung mit unterschiedlichen Bindungskonstanten. Kreis Das Modell ist für multiphotonen FRAP/PA geeignet, da auch axiale Intensitätsverteilung berücksichtigt wird. Explizite Lösung von Gleichung 2.8, nicht wie in (Spr04) die Laplace-Transformation der Lösung. Zudem gaußförmige Anfangsintenität möglich, was besser einer Laseranregung entspricht. Das Modell berücksichtigt die Geometrie der Zelle und eine inhomogene Verteilung der Bindungsstellen Multiphotonen-PSF als Anfangsbedingung, sphärische Randbedingungen (Zellkern), Berechnete Intensität entlang einer Linie durch aktivierten/geblichener Punkt. Intensität entlang einer Linie vom geblichenen zum ungeblichenen Bereich wird berechnet. Tabelle 2.1: Zusammenfassung der wichtigsten Modelle für FRAP- und Photoaktivierungsexperimente an Kernproteinen. 19

24 2 Fluoreszenzmikroskopie und Photoperturbation lo g (k * o n ) R e a c tio n - D o m in a n t E ffe c tiv e D iffu s io n F u ll M o d e l O n ly P u re -D iffu s io n D o m in a n t lo g (k o ff ) Abbildung 2.5: Wertebereiche von k on und k off, für die die Näherungen von reiner Diffusion, effektiver Diffusion und dominierender Bindung gültig sind. Eine numerische Rechtfertigung für die Einteilung in diese Bereiche ist in Sprague et al. (Spr04) gezeigt. gegeben durch: ( p q = D f ) ( 1 + k on p + k off ) (2.12) In der Arbeit von Sprague et al. (Spr04) wird zusätzlich gezeigt, dass das Gleichungssystem 2.8 bei bestimmten Wertekombinationen von kon und k off weiter vereinfacht werden kann. Es existieren die Näherungen der reinen Diffusion (pure diffusion), der effektiven Diffusion (effective diffusion) und der dominierenden Reaktion (reaction dominant), die im folgenden beschrieben werden. Das Diagramm zeigt für welche Werte von k on und k off welche der Näherungen geeignet ist (Spr04). 3 Die Darstellung orientiert sich an einer Abbildung aus Sprague et al. (Spr04) 20

25 2.3 Fluoreszenz-Photoperturbation zur Erforschung von Proteindynamiken Reine Diffusion Diese Näherung ist gerechtfertigt, wenn der größte Anteil der fluoreszierenden Proteine ungebunden ist. Der Anteil der freien Proteine ist nach Gleichung 2.9 durch den Quotient aus k off und k on gegeben. In Abbildung 2.5 ist der Bereich gezeigt, in dem der Anteil der gebundenen Proteine kleiner als 1 % ist. Die Reaktions-Diffusions-Gleichung 2.8 vereinfacht sich in diesem Fall zu einer einfachen Diffusionsgleichung: df dt = D f 2 f (2.13) Die Diffusionskonstante kann durch die Stokes-Einstein-Relation abgeschätzt werden (Bea06): D = k BT 6πηR (2.14) Dabei ist k B die Boltzmann-Konstante, T die Temperatur, η die Viskosität und R der Radius des Proteins, das als kugelförmig angenommen wird. Da die Viskosität innerhalb eines Zellkerns näherungsweise konstant ist, wird die Diffusionsgeschwindigkeit also im Wesentlichen durch die Größe des Proteins bestimmt. Für GFP ist der Wert für D bekannt. Somit lässt sich die Diffusionskonstante eines beliebigen Proteins anhand der Masse abschätzen (Bea06): ( ) 1 mgfp 3 D protein = D GFP m protein (2.15) Für den zeitlichen Intensitätsverlauf innerhalb eines kreisförmig geblichenen Bereiches gilt: mit [ ( ) frap(t) = e τ D τd 2t I 0 2t I 0 und I 1 sind die modifizierten Besselfunktionen. ( )] τd + I 1 2t (2.16) τ D = w2 D f (2.17) 21

26 2 Fluoreszenzmikroskopie und Photoperturbation Effektive Diffusion Bei großen Werten von k on (k on > 10 3 s -1 ) finden die Reaktionen so häufig statt, dass zu jedem Zeitpunkt ein lokales Gleichgewicht vorherrscht. Obwohl sich der größte Teil der Proteine in einer Bindung befindet, hängt die Mobilität von der Diffusionskonstante D f ab (Spr04; Bea06). Unter diesen Bedingungen vereinfacht sich das Gleichungssystem 2.8 ebenfalls zu einer einfachen Diffusionsgleichung, die sich jedoch durch den Wert der Diffusionskonstante von Gleichung 2.15 unterscheidet (Cra75): mit df dt = D eff 2 f (2.18) D eff = D f 1 + k on k off (2.19) Der zeitliche Intensitätsverlauf innerhalb eines geblichenen Kreises ist ebenfalls durch Gleichung 2.16 gegeben. Dominierende Reaktion Der Grenzfall der dominierenden Reaktion ist bei einer niedrigen Hin-Reaktionsrate k on und einer gleichzeitig niedrigen Rück-Reaktionsrate k off erfüllt. Die Reaktionen finden dann selten statt (kon < 1 s -1 ) und eine Bindung besteht relativ lang ( k off k on > 0,01). Freie Proteine befinden sich sehr schnell in einem Gleichgewichtszustand und es gilt: f = F eq = const. (2.20) Damit verschwindet die erste Gleichung von 2.8 und der Ausdruck vereinfacht sich zu: dc dt = k on F eq k off c (2.21) Für die mittlere Intensität in einem kreisförmig geblichenen Kreis gilt: frap(t) = 1 C eq e k off t (2.22) 22

27 2.3 Fluoreszenz-Photoperturbation zur Erforschung von Proteindynamiken Neben dem vorgestellten Modell von Sprague et al. wird das Modell von Carrero et al. (Car04) sehr häufig für die Interpretation von FRAP-Daten verwendet. Es liefert eine analytische Lösung der Reaktions-Diffusionsgleichung für ein geblichenes Rechteck. Die Modelle von Sprague et al. und Carrero et al. können jedoch unterschiedliche Ergebnisse liefern (Mue08; Mue10). Die Arbeit von Mazza et al. stellt eine analytische Lösung für eine kreisförmig geblichene/photoaktivierte Fläche vor. Die Besonderheit dabei ist, dass auch die axiale Intensitätsverteilung berücksichtigt wird, was es besonders geeignet für Multiphotonenanregungen macht, bei denen die zweidimensionale Näherung nicht immer gültig ist. Das Modell betrachtet jedoch nur reine Diffusion (Gleichung 2.13) und eine vollständig immobile Fraktion. Die Bindungsraten k on und k off können mit diesem Modell nicht bestimmt werden. Für Kernproteine ist jedoch ein Reaktions-Diffusionsmodell (Spr04; Bea06) besser geeignet. Kang et al. (Kan08) stellen ebenso wie Sprague et al. (Spr04) eine analytische Lösung der Reaktions-Diffusionsgleichung in zwei Raumdimensionen vor. Im Gegensatz zu Sprague et al. handelt es sich um eine explizite Form und nicht um die Laplace-Transformation. Neben der kreisförmigen Anfangsbedingung liefert das Modell auch eine Lösung für eine gaußförmige Verteilung der Anfangsintensität in lateraler Richtung, was besser mit der Intensitätsverteilung eines Laserstrahls übereinstimmt. Durch numerische Modelle ist eine genauere Bestimmung der Bindungs-Reaktionsraten möglich. Beaudouin et al. (Bea06) stellen ein Modell vor, in dem die Reaktions-Diffusionsgleichung numerisch in zwei Dimensionen gelöst wird. Das Modell berücksichtigt die Geometrie der Zelle und eine inhomogene Verteilung der Bindungsstellen. Bei den Messungen wird bei jeder Zelle die Hälfte des Zellkerns photoaktiviert. Calvert et al. (Cal07) stellen eine numerische Lösung der Diffusionsgleichung 2.13 in drei Raumdimensionen für ein photoaktiviertes Volumen mit gaußförmiger Intensitätsverteilung vor. In diesem Modell wird auch die Dauer der Aktivierung berücksichtigt, was bei schnellen Prozessen von Bedeutung ist. Für einige Proteine wird auch eine eindimensionale Diffusion entlang des DNA-Stranges diskutiert (vr11; Gor08). Der Kontakt zwischen Protein und DNA-Strang erfolgt in diesen Modellen durch zahlreiche, kurze Bindungsereignisse. Eine Beschreibung der Mobilität dieser Proteine durch die Reaktions-Diffusionsgleichungen in drei Dimensionen ist auch 23

28 2 Fluoreszenzmikroskopie und Photoperturbation in diesem Fall korrekt, da dieses Modell ebenfalls von zahlreichen, kurzlebigen Bindungen ausgeht (Bea06). Im Zusammenhang mit FRAP-Messungen taucht in der Literatur häufig der Begriff der immobilen Fraktionen auf (Hem11). Dies bedeutet in diesem Zusammenhang, dass es eine Subpopulation des Proteins gibt, die auf der Zeitskala eines FRAP-Experiments vollständig unbeweglich ist. Bei der Beschreibung durch ein Reaktions-Diffusionsmodell entspricht dies einem reaktionsdominierten Prozess mit sehr kleinen Werten von k off. Bei Modellen mit immobiler Fraktion (z.b. Mazza et al. (Maz08)) wird die geringe Austauschrate vollständig vernachlässigt. 24

29 3 DNA-Schäden und ihre Reparaturmechanismen Die Desoxyribonukleinsäure (deoxyribonucleic acid, DNA) ist ein biologisches Makromolekül und Träger der Erbinformation. Sie besteht aus zwei Strängen, die durch Wasserstoffbrücken miteinander verbunden sind und eine Doppelhelixstruktur bilden. Der chemische Aufbau ist eine Abfolge von Nukleotiden, bestehend aus Zucker (Desoxyribose), einem Phosphatrest und einer der vier Basen Adenin, Thymin, Guanin oder Cytosin. Die Wasserstoffbrückenbindung erfolgt jeweils zwischen den zueinander komplementären Basen Adenin und Thymin, sowie Guanin und Cytosin (Abbildung 3.1). Die Erbinformation ist in der Abfolge der Nukleotide kodiert. Bei der Transkription wird diese Abfolge in einen Abschnitt aus Ribonukleinsäure (RNA) übersetzt, die Boten-RNA (messenger RNA, mrna) genannt wird. Diese wird bei der Translation in Proteine übersetzt. Schäden am DNA-Molekül können zu einer fehlerhaften Synthese von Proteinen und somit zu zellulären Fehlfunktionen führen (Mun70). Im Laufe der Evolution haben sich jedoch sehr effiziente Reparaturmechanismen entwickelt. Diese reduzieren die Anzahl der mit der Zeit auftretenden Mutationen und das damit verbundene Risiko von Krebs deutlich (Mit03). Um das komplexe Zusammenspiel der an der DNA-Reparatur beteiligten Proteine zu verstehen ist es wichtig, die aus biochemischen Analysen gewonnenen Erkenntnisse über die Funktion von Proteinen durch Experimente an lebenden Zellen zu ergänzen. Um die DNA-Reparaturmechanismen an lebenden Zellen studieren zu können, müssen künstlich DNA-Schäden induziert werden. Üblicherweise erfolgt dies durch ionisierende Strahlung, genotoxische Substanzen oder UV-Licht. Um DNA-Schäden mit hoher räumlicher Genauigkeit zu induzieren werden häufig fokussierte Laserstrahlen verwendet. Auf diese Weise ist es möglich, an einer definierten Stelle des Zellkerns eine sehr hohe Schadensdichte zu erzeugen, während gleichzeitig die Gesamtschadensmenge gering bleibt. Mit dieser Technik kann besonders gut die Bindung von Proteinen an der Schadensstelle untersucht werden. Die Bestrahlung mit ultrakurzen Laserimpulsen stellt sich als eine weitere Verbesserung 25

30 3 DNA-Schäden und ihre Reparaturmechanismen Abbildung 3.1: Chemische Struktur der DNA-Doppelhelix (WIK13a)1 auf diesem Gebiet heraus, da sich die Schadensinduktion auf einen Bereich innerhalb des Zellkerns beschränkt. Dieses Kapitel gibt eine kurze Einführung in die Kompaktierung der DNA zum Chromatin und beschreibt im Anschluss die Entstehung von verschiedenen DNA-Schadensarten und die mit ihnen verbundenen Reparaturmechanismen. Darauf folgt eine Zusammenfassung der unterschiedlichen Ansätze für die Induktion von DNA-Läsionen durch Laser, wobei in besonderem Maße auf Femtosekunden-Impulslaser eingegangen wird. 1 Dieses Bild wurde vom Wikipedia-Autor Zephyris unter der Lizenz Creative Commons AttributionShare Alike 3.0 Unported (CC BY-SA 3.0) veröffentlicht. 26

31 3.1 Kompaktierung der DNA zum Chromatin Abbildung 3.2: Schematischer Aufbau eines Nukleosoms. Die DNA ist um ein Oktamer aus 8 Core-Histonen gewickelt. Das Linker-Histon H1 bindet an die DNA-Abschnitte zwischen den Nukleosomen (WIK13b) Kompaktierung der DNA zum Chromatin Im Zellkern ist die DNA durch mehrfache Faltung zu einem dichten Komplex verpackt, dem sogenannten Chromatin. Die Kompaktierung erfolgt durch spezielle Architekturproteine wie Histone, wobei zwischen den Core-Histonen und den Linker-Histonen unterschieden wird. Die Proteine H2A, H2B, H3 und H4 bilden die Core-Histone, das Protein H1 bezeichnet man als Linker-Histon. Die DNA-Doppelhelix ist um ein Oktamer aus Core-Histonen gewickelt, wodurch die Nukleosomen gebildet werden. Das Linker-Histon H1 bindet an die DNA-Abschnitte zwischen den Nukleosomen, die sogenannte Linker-DNA, und ermöglicht dadurch eine weitere Kompaktierung des Chromatins. Je nach Dichte wird zwischen zwei Formen von Chromatin unterschieden. Das dichter gepackte Heterochromatin enthält inaktive DNA, das weniger dicht gepackte Euchromatin enthält transkriptionsaktive DNA. Durch die dichtere Packung ist DNA im Heterochromatin weniger anfällig gegenüber DNA-Schäden (Cow07; Fal08; Kim07). Abbildung 3.2 zeigt schematisch den Aufbau eines Nukleosoms, Abbildung 3.3 die Kompaktierung des Chromatins. Neuere Experimente stellen die gezeigte Verpackung der Nukleosomen zu der 30-nm Faser jedoch in Frage und schlagen stattdessen eine fraktale Struktur des Chromatins vor (Ban12). Diese Sichtweise wird durch Neutronen-Streuexperimente (Leb05) und Diffusionsmessungen (Ban09) gestützt. 2 Dieses Bild wurde vom Wikipedia-Autor Darekk2 unter der Lizenz Creative Commons Attribution- Share Alike 3.0 Unported (CC BY-SA 3.0) veröffentlicht. 27

32 3 DNA-Schäden und ihre Reparaturmechanismen Abbildung 3.3: Die Kompaktierungsstufen des Chromatins (Fel03). 28

33 3.2 DNA-Schäden 3.2 DNA-Schäden Die chemische Struktur der DNA kann durch Umwelteinflüsse, wie beispielsweise ultraviolettes (UV) Licht, ionisierende Strahlung oder bestimmte chemische Substanzen zerstört werden. Neben exogenen Einflüssen führen auch endogene Stoffwechselprodukte zu einer Schädigung des DNA-Moleküls. Es existiert eine Vielzahl von unterschiedlichen Schadenstypen, wie UV-Photoprodukte, Strangbrüche und chemische Modifikationen der Basen. Die Schädigung kann direkt, durch die Absorption eines Photons hervorgerufen werden, oder durch indirekte Prozesse, wie Radikale, angeregte Moleküle oder solvatisierte Elektronen. Zwei wichtige exogene Ursachen für DNA-Schäden sind UV-Licht und ionisierende Strahlung. Im Folgenden wird beschrieben, welche physikalischen und chemischen Prozesse bei der Wechselwirkung dieser beiden Strahlungsarten mit lebenden Zellen und Gewebe auftreten, zu welchen DNA-Schäden sie führen und welche DNA-Reparaturmechanismen für die auftretenden Schäden existieren UV-Strahlung UV-Strahlung ist Licht im Wellenlängenbereich von 200 nm bis 380 nm, also kurzwelliger als sichtbares Licht. Man unterscheidet zwischen UVA- (380 nm nm), UVB- (315 nm nm) und UVC-Licht (280 nm nm). Elektromagnetische Strahlung mit Wellenlängen unterhalb von 200 nm zählt im biologischen und medizinischen Kontext üblicherweise zur ionisierenden Strahlung, wobei es hierfür keine einheitliche Definition gibt. Photonen im UVB- und UVC-Bereich können direkt von der DNA absorbiert werden. Das Absorptionsmaximum der DNA-Basen liegt bei einer Wellenlänge von 260 nm (Voe63). Dabei entsteht eine kovalente Bindung zwischen zwei benachbarten Basen eines DNA- Stranges. Die zwei häufigsten Formen für diese Art von DNA-Läsionen sind Cyclobutan- Pyrimidin-Dimere (CPDs) und Pyrimidin-6-4-Pyrimidon-Photoprodukte (6-4-PP). Auch bei höheren Wellenlängen im Bereich der UVB- und UVA-Strahlung entstehen UV-Photoprodukte, jedoch in geringerer Menge. Die Induktion erfolgt indirekt über endogene Sensibilisatoren (Her08). Bei UVA-Strahlung entstehen im Verhältnis mehr CPDs als 6-4-PP (Mou06). UV-Photoprodukte führen zu einer Verbiegung des DNA-Stranges (bulky lesions). Die 29

34 3 DNA-Schäden und ihre Reparaturmechanismen Änderung in der Struktur der DNA spielt eine wichtige Rolle bei der Erkennung des Schadens durch Reparaturenzyme. Es existiert ein eigener Reparaturweg für UV-Photoprodukte, bei dem die kovalent gebundenen Nukleotide herausgeschnitten werden (nucleotide excision repair, NER). Bei den Erbkrankheiten Xeroderma Pigmentosum (auch Mondscheinkrankheit genannt) und Cockayne-Syndrom ist dieser Reparaturweg nicht voll funktionsfähig. Patienten mit Xeroderma Pigmentosum sind sehr empfindlich gegen Sonnenlicht und bekommen durchschnittlich im Alter von 9 Jahren Hautkrebs (Bra11). Die an der NER beteiligten Proteine sind zum großen Teil nach dieser Krankheit benannt (XPA bis XPG; wobei XP für Xeroderma Pigmentosum steht). Für die Reparatur wird der verbogene Teil des DNA-Stranges herausgeschnitten und danach durch DNA-Polymerasen wieder aufgefüllt, wobei der gegenüberliegende Strang als Vorlage dient. Die künstliche Induktion von UV-Photoprodukten zur Erforschung der NER erfolgt durch die Bestrahlung mit UVC-Licht. Dies kann entweder großflächig oder lokal begrenzt sein. Eine weit verbreitete Technik zur lokalen Induktion von UV-Läsionen beruht auf dem Einsatz eines Polycarbonatfilters mit etwa 8 µm großen Poren (Mon01). Auf diese Weise ist es möglich subnukleare Bereiche zu schädigen. Der Nachweis von CPDs und 6-4-PP erfolgt durch Färbungen mit Antikörpern, die an diese chemische Strukturen binden Ionisierende Strahlung Unter dem Begriff der ionisierenden Strahlung werden alle Strahlungsarten zusammengefasst, die biologische Moleküle ionisieren können. Bei elektromagnetischer Strahlung ist dies für Photonenenergien oberhalb von etwa 6,5 ev (190 nm) der Fall, Partikelstrahlung wie Elektronen, α-teilchen oder Ionen wird ebenfalls hierzu gezählt. Beim Auftreffen auf Materie kommt es durch Photo- oder Comptoneffekt zu einer Ionisierung. Die dadurch entstehenden Sekundärelektronen können, je nach kinetischer Energie, weitere Ionisationen verursachen. Auf diese Art entstehen zahlreiche Elektronen mit kinetischen Energien im Bereich von einigen ev. Ein einfallendes Teichchen mit einer Energie von einem MeV erzeugt 10 5 Elektronen mit Energien unterhalb von 30 ev (San05). Die Schädigung der DNA erfolgt im Wesentlichen durch folgende Mechanismen: Zum einen kann das DNA-Molekül durch das Primärteilchen oder Sekundärelektronen direkt ionisiert werden. Des Weiteren können andere Moleküle in der Zelle ionisiert werden, wodurch Radikale entstehen, die mit der DNA reagieren können. In diesem Zusammen- 30

35 3.2 DNA-Schäden hang ist die Radiolyse von Wasser von besonderer Bedeutung, bei der eine Vielzahl von reaktiven Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) entsteht (Gar05). Die durch Sekundärionisationen entstehenden Elektronen mit geringer kinetischer Energie können durch resonante Streuung an Molekülen ebenfalls das Aufbrechen einer chemischen Bindung verursachen. Bei diesem Prozess besetzt das Elektron ein energetisch höher liegendes Energieniveau, wodurch sich das Molekül häufig in einem antibindenden Zustand befindet, was eine Dissoziation zur Folge hat (San05). Durch diesen Prozess können ebenfalls direkt DNA-Moleküle gespalten werden, oder reaktive Spezies entstehen, die auf indirektem Wege zu einer Schädigung der DNA führen. Durch ionisierende Strahlung entstehen vor allem Einzel- und Doppelstrangbrüche und chemische Modifikationen der Basen. Chemische Modifikationen einzelner Basen werden durch die Basenexzisionsreparatur (base excision repair, BER) repariert. Diese Modifikationen können z.b. Oxidationen, Alkylierungen oder Desaminierungen sein. Durch die Modifikation kommt es zu einer Basenfehlanpassung und somit zu einer Verbiegung des DNA-Strangs. Die modifizierte Base wird durch eine DNA-Glykosylase entfernt und es entsteht eine AP-Stelle 1. Eine AP-Endonuklease schneidet diese anschließend heraus. Die fehlende Base wird nun durch eine DNA-Polymerase ergänzt. Als Vorlage dient dabei der komplementäre DNA-Strang. Eine DNA-Ligase verbindet anschließend die Enden des Rückgrates (Wil07). Die Reparatur von Einzelstrangbrüchen (single strand breaks, SSB) überlappt größtenteils mit der BER. Auch hier dient der komplementäre DNA-Strang als Vorlage. Bei der Reparatur von Doppelstrangbrüchen (double strand breaks, DSB) ist dies nicht möglich, da in diesem Fall die entsprechende Vorlage fehlt. Die Reparatur erfolgt entweder durch die nichthomologe End-zu-End-Verknüpfung (nonhomologous end joining, NHEJ) oder durch die Homologe Rekombination (homologous recombination, HR). Bei der NHEJ werden die einzelsträngigen, überhängenden Enden an der Bruchstelle mit Nukleotiden aufgefüllt und anschließend verbunden. Dieser Reparaturweg ist jedoch fehleranfällig, da es zu einer Veränderung der DNA-Sequenz oder zu einer Verbindung von nicht kompatiblen DNA-Abschnitten kommen kann. Weniger fehleranfällig ist der Reparaturweg der HR. In den Phasen des Zellzyklus nach der Replikation des Genoms und vor der Zellteilung (späte S- und G2-Phase) liegt ein doppelter Chromosomensatz vor. Die HR nutzt 1 Eine AP-Stelle (apurinic/apyrimidinic site) auf einem DNA-Strang enthält weder Purine noch Pyrimidine. 31

36 3 DNA-Schäden und ihre Reparaturmechanismen dies aus, um den Schaden mit Hilfe der Information des homologen Schwesterchromatids zu reparieren. Als Indikator für Doppelstrangbrüche wird häufig die phosphorylierte Form des Histons H2AX (γh2ax) verwendet. Das Anhängen einer Phosphatgruppe an dieses Histon bewirkt eine Auflockerung des Chromatins und ist Teil der zellulären Schadensantwort bei Doppelstrangbrüchen. Durch einen mit einem Fluorophor kombinierten Antikörper, der an γh2ax bindet, können Doppelstrangbrüche in der Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden. Es handelt sich jedoch nur um eine indirekte Nachweismethode. 3.3 Induktion von DNA-Schäden durch Laser Eine weit verbreitete Technik zur Induktion von DNA-Schäden beruht auf dem Einsatz von fokussierten Laserstrahlen. Gegenüber ionisierender Strahlung oder einer Behandlung mit genotoxischen Stoffen hat dies, neben der hohen räumlichen Genauigkeit, vor allem den Vorteil einer einfachen Kombination mit der Fluoreszenzmikroskopie. Im Zuge der zellulären Schadensantwort kommt es zu einer verstärkten Anlagerung von Reparaturproteinen an der Schadensstelle. Mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie kann dies direkt durch eine lokale Zunahme der Intensität beobachtet werden. Ein Nachteil von Lasern ist, dass sie nicht genau den gleichen Schaden induzieren wie UV-Licht oder ionisierende Strahlung, da die DNA-Läsionen in diesem Fall durch andere Effekte hervorgerufen werden. Um bei Experimenten vergleichbare und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten ist eine genaue Kenntnis der Laserparameter sowie eine Charakterisierung des dadurch verursachten DNA-Schadens wichtig. Im Wesentlichen haben sich drei unterschiedliche Ansätze für die Induktion von DNA-Schäden durch Laser etabliert: Die Nutzung der linearen Absorption von UV- und sichtbaren Lasern im Dauerstrich- Betrieb oder mit Impulsdauern von einigen Nanosekunden, die Kombination von Lasern mit Sensibilisatoren und die Nutzung von nichtlinearen Effekten gepulster Laser mit Impulsdauern im Piko- und Femtosekundenbereich. In diesem Abschnitt werden diese unterschiedlichen Ansätze vorgestellt und die damit verbundenen Schadensmechanismen diskutiert. Eine Zusammenfassung von in der Literatur verwendeten Lasersystemen und den damit erzeugten Schadensarten ist in den Tabellen 3.1, 3.2 und 3.3 gezeigt. 32

37 3.3 Induktion von DNA-Schäden durch Laser Publikation Wellenlänge Laser nachgewiesene Schäden Dinant et al. 266 nm diodengepumpter CPD (Din07) Festkörperlaser 6-4-PP (7,8 khz) keine DSB (γh2ax, TUNEL) Kong et al. 337 nm N 2 -Laser CPD (Kon09) (4 ns; 6 Hz) 6-4-PP 8-oxoG (Antikörper) DSB (Ku70) Lan et al. 365 nm keine Angabe DSB (γh2ax) (Lan04) 8-oxoG (OGG1) Solarcyk et al. 488 nm Ar + -Ionen-Laser DSB (γh2ax) (SK12) Tabelle 3.1: Zusammenfassung unterschiedlicher Lasersysteme mit der linearen Absorption als dominierendem Schadensmechanismus DNA-Schadensinduktion durch lineare Absorption Laser im Dauerstrich-Betrieb werden vor allem für die Erzeugung von UV-Photoprodukten verwendet. Mit einem diodengepumpten Festkörperlaser bei einer Wellenlänge von 266 nm ist es möglich, selektiv UV-Photoprodukte (CPDs, 6-4-PP) zu erzeugen (Din07). Der Nachteil bei dieser Wellenlänge ist, dass die verwendete Optik, insbesondere das Objektiv auf UVC-Licht optimiert sein muss. Die direkte Anregung der Basen bei Wellenlängen unterhalb von 315 nm (Voe63) führt zusätzlich zu der in Abschnitt beschriebenen Induktion von UV-Photoprodukten auch zu anderen chemischen Modifikationen der Basen, wie beispielsweise 8-Oxoguanin (8-oxoG). In einer Arbeit von Kielbassa et al. (Kie97) wurde die Generation von CPDs und 8-oxoG nach Bestrahlung mit Licht im Wellenlängenbereich zwischen 290 nm und 500 nm untersucht. Als Nachweis für 8-oxoG wurde die Rekrutierung der DNA-Glykosylase Fpg verwendet. Während die Anzahl der induzierten CPDs mit zunehmender Wellenlänge (bei konstanter Intensität) abnimmt, ergibt sich für die Menge an 8-oxoG ein weiteres Maximum im Bereich zwischen 400 und 450 nm. Die Entstehung erfolgt durch endogene Photosensibilisatoren, die zu Hydroxylradikalen ( OH) und in den Singlett-Zustand an- 33

38 3 DNA-Schäden und ihre Reparaturmechanismen geregten Sauerstoff-Molekülen ( 1 O 2 ) führen. Diese reagieren mit den Basen und führen zu oxidativen Modifikationen. Oberhalb von 470 nm nehmen die induzierten Basenmodifikationen stark ab (Kie97). In einer Arbeit von Solarzyk et al. (SK12) wird gezeigt, dass auch bei einer Wellenlänge von 488 nm DNA-Schäden entstehen. Der Nachweis erfolgte über eine immunozytochemische Anfärbung von γh2ax. Als mögliche Mechanismen für die Schadensentstehung werden endogene Sensibilisatoren (Pfl94) und die Photolyse von Wasser diskutiert. Bei gepulsten Lasern im UV-Bereich führt die durch lineare Absorption verursachte Temperaturerhöhung zusätzlich zu DNA-Schäden. Da sich die Gesamtenergie auf die einzelnen Impulse konzentriert, kann die durch einen einzelnen Impuls deponierte Energiemenge sehr hoch sein. Dies führt kurzzeitig (ns) zu einer starken Temperaturerhöhung, die das Aufbrechen von chemischen Bindungen zur Folge hat. In einer Arbeit von Kong et al. (Kon09) wird diskutiert, dass bei einer Bestrahlung mit einem N 2 -Laser (337 nm, 4 ns, 6 Hz) die Temperaturerhöhung der dominierende Schadensmechanismus ist. Es wird berechnet, dass ein Impuls mit einer Energie von 40 nj zu einer Temperaturerhöhung von über K führt. Da die Absorption aller Biomoleküle im sichtbaren und infraroten Spektralbereich sehr gering ist, sind thermische Effekte nur bei UV-Lasern von Bedeutung. Ein Nachteil bei der Schadenserzeugung durch lineare Absorption ist, dass der betroffene Bereich nicht nur auf den Laserfokus beschränkt ist. Durch die starke Bündelung des Lichts hinter dem Objektiv entstehen DNA-Schäden innerhalb eines kegelförmigen Volumens. Bei dünnen Zellen kann es leicht zu einer ungewollten Beschädigung der Kernmembran kommen. Des Weiteren ist eine Schadensspezifität nur für CPDs bei UVC-Licht gegeben. Höhere Wellenlängen führen durch endogene Sensibilisatoren zu reaktiven Spezies, wodurch auch Strangbrüche entstehen können Kombination von Lasern mit Sensibilisatoren Die am häufigsten verwendete Methode um durch Laserbestrahlung DNA-Strangbrüche mit hoher Spezifität zu erzeugen, beruht auf einer Kombination von UVA-Strahlung mit Photosensibilisatoren (photosensitizer). Hierunter versteht man Substanzen, die in die DNA interkalieren und eine erhöhte Absorption im UVA-Bereich aufweisen. Bei der Be- 34

39 3.3 Induktion von DNA-Schäden durch Laser Publikation Wellenlänge Sensibilisator/ nachgewiesene Laser Schäden Lukas et al. 337 nm BrdU DSB (γh2ax) (Luk03) N 2 Laser (30 Hz) Kong et al. 337 nm BrdU DSB (γh2ax) (Kon09) N 2 -Laser (4 ns; 6 Hz) Rogakou et al. 390 nm Hoechst DSB (γh2ax) (Rog99) Paull et al. 390 nm Hoechst DSB (γh2ax) (Pau00) Farbstofflaser 8-oxoG (OGG1) (Dauerstrich) Kong et al. 405 nm BrdU DSB (γh2ax) (Kon09) Diodenlaser (Dauerstrich) Dinant et al. 405 nm Hoechst DSB (γh2ax) (Din07) Diodenlaser TUNEL (Dauerstrich) CPD Lan et al. 405 nm Hoechst DSB (γh2ax) (Lan05) Diodenlaser 8-oxoG (OGG1) (Dauerstrich) Tabelle 3.2: Zusammenfassung unterschiedlicher Lasersysteme in Kombination mit Photosensibilisatoren. 35

40 3 DNA-Schäden und ihre Reparaturmechanismen strahlung führt dies zu DNA-Strangbrüchen (Lim93). Die wichtigsten Substanzen in diesem Zusammenhang sind Bromdesoxyuridin (BrdU) (Luk03; BJ06; Mai07) und der Farbstoff Hoechst (Cel03; Rog99; Bra05; Wal03). Bromdesoxyuridin (BrdU) ist ein chemisches Analogon des Nukleosids Thymidin bzw. Desoxyuridin. In phosphorylierter Form kann es anstelle des Nukleotids Desoxythymidintriphosphat (dttp) in die DNA eingebaut werden. Hoechst und Hoechst binden an die DNA-Doppelhelix und werden daher üblicherweise als DNA-Farbstoffe verwendet. Die Anregung erfolgt durch UVA-Licht, dabei ist ein strahlungsloser Energieübertag an die DNA möglich, wodurch Strangbrüche entstehen können. Ein Nachteil beim Einsatz von Sensibilisatoren ist, dass durch unerwünschte Nebeneffekte die Funktion der Zelle beeinträchtigt werden kann DNA-Schadensinduktion durch Femtosekunden-Laserimpulse Bei der Bestrahlung von lebenden Zellen mit Femtosekunden-Laserimpulsen entstehen in einem Wellenlängenbereich zwischen 750 und 800 nm UV-Photoprodukte (CPDs, 6-4-PP) (Mel03; Din07; Kon09; Trä10) und Strangbrüche (Mar06; Din07; Kon09; Trä10). Bei einer Wellenlänge von 1050 nm ist es in einem bestimmten Leistungsbereich möglich, spezifisch Strangbrüche zu erzeugen (Trä10). Im sichtbaren Spektralbereich können mit Pikosekundenimpulsen bei 532 nm (Kon09) und Femtosekunden-Impulsen im Bereich von nm (Dad11) ebenfalls CPDs induziert werden. Eine Zusammenfassung der in den zitierten Arbeiten verwendeten Laserparameter und der nachgewiesenen Schäden ist in Tabelle 3.3 gezeigt. Als Ursachen für die Schädigung kommen im Wesentlichen drei Mechanismen in Frage: direkte Absorption durch Multiphotonenprozesse, die Ausbildung von Plasmen geringer Dichte, sowie Temperaturerhöhungen. Multiphotonenabsorptionen Die Induktion von UV-Photoprodukten mit Femto- und Pikosekundenimpulsen erfolgt durch eine Multiphotonenabsorption. Bei hohen Photonendichten, wie sie bei ultrakurzen Laserimpulsen vorliegen, ist die simultane Absorption mehrerer Photonen möglich. Das Absorptionsmaximum der DNA-Basen liegt bei einer Wellenlänge von 260 nm, was gerade der dreifachen Photonenenergie bei einer Wellenlänge von 780 nm entspricht. Die 36

41 3.3 Induktion von DNA-Schäden durch Laser Publikation Wellenlänge Laser nachgewiesene Schäden Roukos et al. 355 nm frequenz- DSB (γh2ax) (Rou11) verdreifachter Nd:YAG Laser (470 ps; 500 Hz) Daddysman et al. 400 nm frequenz- CPD (Dad11) nm verdoppelter Titan-Saphir (210 fs; 80 MHz) Kong et al. 532 nm frequenz- CPD (Kon09) verdoppelter 6-4-PP Nd:YVO4 Laser DSB (KU70,53BP1) (12 ps; 76 Hz) kein 8-oxoG (Antikörper) Meldrum et al. 750 nm Titan-Saphir CPD (Mel03) (120 fs; 82 MHz) Träutlein et al. 775 nm Faserlaser CPD (Trä10) (230 fs; 107 MHz) 6-4-PP DSB (γh2ax) Mari et al. 800 nm Titan-Saphir DSB (γh2ax) (Mar06) (200 fs; 76 MHz) Kong et al. 800 nm Titan-Saphir DSB (Kon09) (200 fs; 76 MHz) CPD 6-4-PP kein 8-oxoG (Antikörper) Dinant et al. 800 nm Titan-Saphir DSB (γh2ax) (Din07) (200 fs; 76 MHz) CDP 6-4-PP Träutlein et al nm Faserlaser DSB (γh2ax) (Trä10) (77 fs; 107 MHz) (wenig) CPD (wenig) 6-4-PP Tabelle 3.3: Zusammenfassung unterschiedlicher Lasersysteme mit der nichtlinearen Absorption als dominierenden Schadensmechanismus. 37

42 3 DNA-Schäden und ihre Reparaturmechanismen Induktion von CPDs bei Wellenlängen zwischen 750 und 800 nm ist also durch eine Drei- Photonen-Absorption zu erklären. Die Induktion von CPDs im sichtbaren Spektralbereich hingegen beruht auf einer Zwei-Photonen-Absorption (Kon09; Dad11). Neben der Zwei- oder Drei-Photonen-Absorption sind auch Prozesse höherer Ordnung möglich. Eine Vier-Photonen-Absorption bei einer Wellenlänge von 800 nm entspricht beispielsweise einer linearen Anregung bei 200 nm. In diesem Wellenlängenbereich absorbieren die meisten Biomoleküle sehr gut. Die dadurch erreichten angeregten Molekülzustände führen in vielen Fällen zu einem Aufbrechen chemischer Bindungen. Ausbildung von Plasmen Durch eine Bestrahlung mit ultrakurzen Laserimpulsen können Atome ionisiert werden. Die hierfür verantwortlichen Mechanismen sind die Tunnelionisation und die Multiphotonenionisation. Bei der Tunnelionisation ist das (oszillierende) elektrische Feld des Lasers so stark, dass es das Coulomb-Potential der Atome beeinflusst. Auf ein gebundenes Elektron wirkt nun die Summe aus den beiden Potentialen. Dadurch entsteht eine Energiebarriere, die von den Elektronen mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit durch einen Tunnelprozess überwunden werden kann. Dieser Ionisationsmechanismus ist jedoch erst bei sehr hohen Spitzenintensitäten von Bedeutung. Bei den für die DNA-Schädigung verwendeten Leistungen ist der Prozess der Multiphotonenionisation dominierend (Vog05). Hierbei handelt es sich um die simultane Absorption mehrerer Photonen, die zu einer Ionisation des Atoms führt. Um den Einfluss dieser Prozesse auf lebende Zellen zu verstehen, ist es hilfreich, den Einfluss von ultrakurzen Laserimpulsen auf Wasser zu untersuchen. Die optischen Eigenschaften von biologischen Medien sind sehr ähnlich zu denen von Wasser, sodass sich die Ergebnisse gut übertragen lassen. Der Grund hierfür ist, dass Zellen zu einem großen Teil aus Wasser bestehen. Zudem liegen die Übergangsenergien für elektronische Anregungen vieler Biomoleküle in einem vergleichbaren Energiebereich. Beim Wassermolekül liegt der niedrigste elektronisch angeregte Zustand bei einer Energie 6,5 ev oberhalb des Grundniveaus. Bei der Bestrahlung mit einer Wellenlänge von 770 nm (1,62 ev) kann dieses Energieniveau durch eine Vier-Photonen-Absorption erreicht werden. Die Anregung ist mit einer Dissoziation des Moleküls verbunden, wobei ROS und solvatisierte Elektronen entstehen. Man spricht deshalb von der Ausbildung von Plasmen. Die anschließenden Reaktionsprozesse mit der DNA sind vergleichbar mit denen bei ioni- 38

43 3.3 Induktion von DNA-Schäden durch Laser sierender Strahlung. Auf diese Weise entstehen hauptsächlich Strangbrüche und oxidative Basenmodifikationen. Bei sehr hohen Photonendichten werden die Elektronen durch den Prozess der inversen Bremsstrahlung (Vog05; Rea71) beschleunigt. Oberhalb einer gewissen kinetischen Energie können sie durch Stöße weitere Moleküle ionisieren. Auf diese Weise kommt es zu einer lawinenartigen Ionisation, die die Absorptionseigenschaften vollständig ändert. Man spricht hierbei von einem optischen Zusammenbruch. Dieser Leistungsbereich wird für die Laserablation und die Nanochirurgie genutzt. In einer Arbeit von Vogel et al. (Vog05) wird der Einfluss von ultrakurzen Laserimpulsen auf Wasser berechnet. Der optische Zusammenbruch tritt demnach bei einer Wellenlänge von 800 nm (NA = 1,3; 100 fs; 80 MHz) bei einer Spitzenintensität von 6540 GW/cm 2 auf. In Abbildung 3.4 sind die in Vogel et al. berechneten Werte für die Anzahl der erzeugten Elektronen pro Laserimpuls, sowie die damit verbundenen Elektronendichten gegenüber der Spitzenintensität aufgetragen. In dem für die DNA-Schädigung genutzten Leistungsbereich werden typischerweise einige wenige freie Elektronen pro Impuls erzeugt. Die berechneten Werte für die Spitzenintensität lassen sich jedoch nicht ohne Weiteres auf andere Wellenlängen übertragen, da die Photonenenergie bei der Multiphotonenionisation einen großen Einfluss hat. Temperaturerhöhung Aufgrund der verstärkten Wasserabsorption bei infraroten Wellenlängen wird häufig auch der Einfluss einer Temperaturerhöhung als möglicher Schadensmechanismus diskutiert. Nach Berechnungen von Schönle et al. ist der Einfluss einer linearen Absorption von Wasser jedoch vernachlässigbar (Sch98). Nach einer Bestrahlungszeit von 10 s mit einer Laserleistung von 100 mw ergibt sich bei den Wellenlängen 850 nm und 1050 nm eine Temperaturerhöhung von 0,23 C bzw. 1,94 C. Für eine Denaturierung der DNA wäre mindestens eine Temperatur von 50 C notwendig. In dieser Rechnung wird jedoch nicht berücksichtigt, dass die Energie eines Impulses in einem kurzen Zeitintervall zu größeren Temperaturerhöhungen führen kann. In der Arbeit von Vogel et al. wird die Temperaturerhöhung berechnet, die durch Stöße zwischen freien Elektronen und Atomen hervorgerufen wird. Bei fokussierten Femtosekunden-Impulsen mit einer Wellenlänge von 800 nm (NA = 1,3; 100 fs, 80 MHz) tritt eine Temperaturerhöhung von 100 C bei einer Elektronendichte von 2, cm 3 auf, was 39

44 3 DNA-Schäden und ihre Reparaturmechanismen NormalizedNpeakNintensityNTI B I th = bhw w ElectronNdensityNTcm M3 = wb 2w wb w9 wb w7 wb w5 BubbleNformationNbyNwNpulse TN=NwbbN CNreachedNafterNpulseNseriesNT8bNMHz= OpticalNbreakdown wb 7 wb 5 wb 3 wb w FreeNelectronsNperNpulse wb w3 OneNfreeNelectronNperNpulseN wbb wbbb wbbbb PeakNintensityNTGWBcm 2 = Abbildung 3.4: Freie Elektronendichte in Abhängigkeit von der Spitzenintensität. Die Werte wurden von Vogel et al. für die Wellenlänge 800 nm für Wasser berechnet (NA = 1,3; 100 fs; 80 MHz) (Vog05). Auf der y-achse sind zusätzlich die Werte für die entsprechende Anzahl der erzeugten freien Elektronen pro Laserimpuls eingetragen (ausgehend von der Annahme, dass die Dichte von 2, cm 3 einem freien Elektron pro Impuls entspricht). Auf der x-achse sind zusätzlich die Werte der Spitzenintensität I normiert auf den Schwellwert für den optischen Zusammenbruch I th eingetragen. 51 % der Dichte des optischen Zusammenbruchs entspricht. Aus den Rechnungen folgt also, dass es einen Intensitätsbereich unterhalb des optischen Zusammenbruch gibt, in dem thermische Effekte in Wasser dominieren. In biologischen Medien ist jedoch zu berücksichtigen, dass auch die hohe Elektronendichte zu einer Denaturierung von Biomolekülen führt, sodass thermische Effekte im Vergleich dazu eher eine untergeordnete Rolle spielen (Vog05). Des Weiteren wird bei den Berechnungen der Einfluss der Repetitionsrate auf kumulative thermische Effekte untersucht. Dazu wird die Temperaturerhöhung nach einem einzigen Puls mit der Erhöhung nach einer Bestrahlungszeit von einigen Mikrosekunden (einige 100 Pulse) verglichen. Es zeigt sich, dass letztere um einen Faktor von 6,8 höher ist, jedoch in Sättigung geht. Bei einer Repetitionsrate unterhalb von einem MHz verschwin- 40

45 3.3 Induktion von DNA-Schäden durch Laser den diese kumulativen thermischen Effekte vollständig. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass eine Temperaturerhöhung durch lineare Absorption vermutlich keinen Einfluss hat. Zusätzlich zu der Erhöhung durch lineare Absorption tritt eine Temperaturerhöhung durch die Ausbildung von Plasmen auf. Die dadurch verursachten DNA-Schäden sind jedoch vernachlässigbar im Vergleich zu den durch ROS und solvatisierte Elektronen verursachten Schäden. Kumulative thermische Effekte können durch eine Verringerung der Repetitionsrate vermieden werden. 41

46 3 DNA-Schäden und ihre Reparaturmechanismen 42

47 4 Experimenteller Aufbau zur Fluoreszenzmikroskopie und Photoperturbation In dieser Arbeit wurden nichtlineare Prozesse genutzt, um DNA-Schäden in lebenden Zellen zu induzieren und um über eine Photoaktivierung die Mobilitäten von Kernproteinen zu untersuchen. In beiden Fällen erfolgte die optische Manipulation durch einen Femtosekunden-Faserlaser. Die durch die Photoperturbation hervorgerufenen Proteinumverteilungen wurden mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie beobachtet. Dieses Kapitel gibt eine kurze Einführung in die Funktionsweise von Femtosekunden- Faserlasern und beschreibt den in dieser Arbeit verwendeten experimentellen Aufbau, bei dem mehrere Wellenlängen durch Faserlaser erzeugt und in ein konfokales Fluoreszenzmikroskop eingekoppelt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zudem ein neues System aufgebaut, das eine einfachere Bedienung und neue Anwendungen für Experimente der nichtlinearen Photoperturbation ermöglicht. 4.1 Femtosekunden-Faserlaser Glasfasern bestehen aus einem Kern, üblicherweise aus SiO 2, der von einem Material mit geringerem Brechungsindex umgeben ist. Durch die Totalreflexion am optisch dünneren Medium kann das Licht entlang des Kerns geführt werden. Die gesamte Glasfaser ist umgeben von einer Schutzschicht aus Kunststoff. Eine mit einem Element der Seltenen Erden dotierte Glasfaser kann als aktives Medium für einen Laser genutzt werden. Bei Faserlasern werden für die Dotierung häufig die Elemente Erbium, Ytterbium, Thulium oder Neodym verwendet. Das optische Pumpen geschieht durch eine fasergekoppelte Laserdiode. Das am häufigsten verwendete Element zur Dotierung ist Erbium. Das Energietermschema von Er 3+ -Ionen in Glas unterscheidet sich stark von dem von freien Ionen. Die Gründe hierfür sind die Kopplung an Phononen des Gitters und eine Aufspaltung durch den Stark-Effekt, verursacht durch lokale elektrische Felder. Dies führt zum einen zu ei- 43

48 4 Experimenteller Aufbau zur Fluoreszenzmikroskopie und Photoperturbation ner Verschiebung der Niveaus und zum anderen zu einer homogenen Verbreiterung. Die amorphe Stuktur von SiO 2 verursacht zudem eine inhomogene Verbreiterung. Die energetisch breiten Niveaus ermöglichen eine Verstärkung über einen weiten Spektralbereich, was für die Erzeugung von ultrakurzen Laserimpulsen notwendig ist. Mit modengekoppelten Faserlasern wurden bereits Impulsdauern von nur 8 fs realisiert (Sel09) und sogar einzelne Lichtschwingungen synthetisiert (Kra09). Für die Erzeugung dieser Pulse werden passive Modenkopplungsmechanismen verwendet. Beispiele hierfür sind die nichtlineare Polarisationsdrehung und die intensitätsabhängige Reflexion an sättigbaren Absorberspiegeln. Der Modenkopplungsmechanismus der nichtlinearen Polarisationsdrehung nutzt die Veränderung des Polarisationszustandes in nichtpolarisationserhaltenden Glasfasern. Dazu wird durch eine mechanische Verspannung eine Doppelbrechung induziert, die eine Veränderung der Lichtpolarisation zur Folge hat. Aufgrund des Kerr-Effekts führt diese Doppelbrechung dazu, dass der gepulste Betriebsmodus mit hoher Spitzenintensität einen anderen Polarisationszustand hat als das Dauerstrichlicht. Durch eine Kombination aus Wellenplättchen und Polarisationsstrahlteiler kann der modengekoppelte Betriebsmodus bevorzugt werden. Eine modernere Technik um den Betriebsmodus der Modenkopplung zu erreichen, beruht auf der Reflexion an sättigbaren Absorberspiegeln (saturable absorber mirror, SAM). Diese weisen bei geringeren Intensitäten eine stärkere Absorption auf als bei hohen. Ist die Kopplung der Moden mit konstanter Phasenbeziehung einmal erreicht, so ist dieser Prozess selbsstabilisierend. Ein Strahlteiler ermöglicht die Auskopplung eines Teils des Laserlichtes aus dem Oszillator, welches dann in eine weitere Verstärkerfaser eingespeist wird (seed). Dieses Konzept erlaubt auch das gleichzeitige Seeden von mehreren Verstärkern. Auf diese Weise können mit einem Oszillator unterschiedliche Zweige des Lasers realisiert werden. Die kurzen Impulse von Femtosekunden-Faserlasern ermöglichen durch nichtlineare Prozesse die Erzeugung neuer Wellenlängen. Beispiele hierfür sind die Frequenzverdopplung oder die Superkontinuumserzeugung mit Hilfe einer hoch nichtlinearen Germanosilikat- Glasfaser (highly nonlinear fiber, HNF). Bei der Lichtpropagation in einer HNF führt die Selbstphasenmodulation zu einer intensitätsabhängigen Phasenverschiebung. Es entstehen neue spektrale Anteile am langwelligen und kurzwelligen Ende des Spektrums. Die HNF hat bei der Ausgangswellenlänge einen Nulldurchgang der Dispersion zweiter Ordnung. Somit propagiert der langwellige Anteil mit anormaler Dispersion, der kurzwellige mit normaler Dispersion. Für den langwelligen Anteil wirken Dispersion und Selbspha- 44

49 4.2 Einkopplung eines Femtosekunden-Faserlasers in ein LSM senmodulation in gegensätzlicher Weise auf die zeitliche Form des Impulses, sodass eine stabile Impulsform (Soliton) entstehen kann. Solange ein zeitlicher Überlapp zwischen den beiden spektralen Anteilen besteht, können diese durch Wellenmischprozesse miteinander wechselwirken. Dadurch wird der solitonische ins Langwellige, der dispersive Anteil ins Kurzwellige verschoben. Da der Einfluss der Selbstphasenmodulation von der Spitzenintensität abhängt, kann das Ausgangsspektrum der HNF innerhalb eines bestimmten Bereiches durchgestimmt werden. Dies geschieht üblicherweise durch das Anpassen der Dispersion mit Hilfe eines Prismenkompressors. 4.2 Einkopplung eines Femtosekunden-Faserlasers in ein LSM Für die in dieser Arbeit beschriebenen Experimente der nichtlinearen Photoperturbation wurde ein Versuchsaufbau verwendet, bei dem ein Femtosekunden-Faserlaser in ein konfokales Fluoreszenzmikroskop eingekoppelt wird. Die Kernkomponente des Lasers ist ein Er:Oszillator, der als Modenkopplungsmechanismus die nichtlineare Polarisationsdrehung verwendet. Die hieraus gewonnenen Laserimpulse durchlaufen anschließend einen Er:Verstärker. Danach erfolgt der Übergang in die Freistrahlstrecke. Die Ausgangsleistung beträgt an dieser Stelle 300 mw bei einer Zentralwellenlänge von 1550 nm und einer Wiederholrate von 107 MHz. Durch einen Silizium-Prismenkompressor lassen sich die Impulse auf eine Dauer von weniger als 60 fs komprimieren (Trä08; Trä09). Zur anschließenden Frequenzkonversion steht eine HNF und ein Yb:Verstärker zur Verfügung. Auf diese Weise wird eine Wellenlänge von 1050 nm erreicht. Zudem wird ein periodisch gepolter MgO:LiNbO 3 -Kristall (Mou06) zur Frequenzverdopplung (second harmonic generation, SHG) genutzt, was zu einer Wellenlänge von 775 nm führt. Mit Hilfe eines verschiebbaren Spiegels kann ohne aufwendige Nachjustage zwischen diesen beiden Varianten umgeschaltet werden. Die HNF wird im Wesentlichen dazu verwendet, eine Wellenlänge von 1050 nm zu erreichen, um diese als Seed für einen Ytterbiumverstärker zu nutzen. Als Verstärkerfaser dient hierbei eine Yb-dotierte Singlemode-Faser, die bidirektional durch fasergekoppelte Laserdioden mit einer Wellenlänge von 974 nm gepumpt wird. Durch eine Sequenz von zwei Reflexionsgittern lassen sich die Impulse komprimieren (grating compressor, GC). Die an dieser Stelle erreichte Durchschnittsleistung beträgt 200 mw, das Emissionsmaximum liegt bei 1050 nm. 45

50 4 Experimenteller Aufbau zur Fluoreszenzmikroskopie und Photoperturbation objective Er:fiber laser = 1550 nm Er:oscillator Er:amplifier frequency conversion HNF Yb:amplifier GC SHG = 1050 nm = 775 nm dichroic mirror scan mirrors fluorescence excitation HeNe laser = 543 nm LSM + Ar ion laser = 488 nm Abbildung 4.1: Schematische Darstellung des experimentellen Aufbaus, der für die in dieser Arbeit vorgestellten Messungen verwendet wurde. Ein Er:Oszillator/Verstärkersystem liefert eine Ausgangswellenlänge von 1550 nm. Durch Frequenzverdopplung (SHG) oder eine Kombination aus hoch nichtlinearer Faser (HNF) und Yb:Verstärker werden die Wellenlängen 775 nm und 1050 nm erzeugt. Die zeitliche Kompression der Impulse bei 1050 nm erfolgt durch einen Gitterkompressor (GC). Beide Wellenlängen können in ein konfokales Fluoreszenzmikroskop (LSM Pascal, Carl Zeiss AG) eingekoppelt werden. Zur Fluoreszenzanregung stehen die Wellenlängen 488 nm und 543 nm zur Verfügung. Eine alternative Methode zur Einkopplung der infraroten Laser verwendet einen dichroitischen Spiegel unter dem Objektiv (hier gestrichelt eingezeichnet). Sowohl für die optische Manipulation von lebenden Zellen als auch die Beobachtung der nachfolgenden Prozesse wird ein konfokales Fluoreszenzmikroskop verwendet (LSM Pascal, Carl Zeiss AG). Das Mikroskop mit inversem Stativ bietet die Möglichkeit, einen infraroten Freistrahllaser einzukoppeln und über die Scan-Spiegel zu bewegen. Für die Fluoreszenzanregung stehen ein Ar + -Ionen- und ein HeNe-Laser zur Verfügung. Diese liefern die Wellenlängen 488 nm und 543 nm. Abbildung 4.1 zeigt schematisch den Aufbau des Lasers und die Einkopplung in das Mikroskop. Eine genauere Beschreibung des Er:Oszillators und -Verstärkers findet sich in (Adl07), der Yb:Verstärker ist in (Trä09) beschrieben. Für weitere Informationen zum gesamten Aufbau sei auf (Trä08; Trä06; Trä09) verwiesen. Ein Nachteil der beschriebenen Einkopplung in das Mikroskop ist, dass die Zeitdauer für das Umschalten zwischen Photoperturbation und Fluoreszenzanregung etwa eine Sekunde dauert. Für viele Experimente ist diese Zeit deutlich zu lang. Eine gleichzeitige 46

51 4.2 Einkopplung eines Femtosekunden-Faserlasers in ein LSM Manipulation und Beobachtung ist zudem überhaupt nicht möglich. Aus diesem Grund wurde im Rahmen dieser Arbeit eine alternative Einkopplung in das Mikroskop entwickelt, die dieses Problem umgeht. Sie basiert auf einem dichroitischen Strahlteiler, der direkt unterhalb des Objektivs angebracht ist. Dazu wurde der automatisch verschiebbare Schlitten, in dem sich die Filter und Strahlteiler für die Weitfeld- Fluoreszenzmikroskopie befinden, umgebaut und als Halterung für einen dichroitischen Strahlteiler verwendet. Dieser weist eine hohe Reflexion für infrarote Wellenlängen und eine hohe Transmission für sichtbares Licht auf. Aufgrund der automatischen Ansteuerung des Schlittens kann er einfach und reproduzierbar in den Strahlengang geführt werden. Durch die Wahl der Reflexionseigenschaften ist eine gleichzeitige Nutzung von infraroten Wellenlängen zur Photoperturbation und sichtbarem Licht für die Anregung und Detektion der Fluoreszenz möglich. Vor der Einkopplung wird der Strahldurchmesser durch ein Teleskop vergrößert, sodass die Rückapertur des Objektivs vollständig ausgeleuchtet werden kann. Eine mechanische Vorrichtung zum Blocken und Freigeben des Strahls regelt die Bestrahlungsdauer. Eine Bewegung des Strahls ist bei dieser Art der Einkopplung nicht möglich. Diese wird jedoch für viele Experimente, insbesondere zur Photoaktivierung, auch nicht benötigt. Abbildung 4.1 zeigt das Grundprinzip dieser Einkopplung als gestrichelte Linien. Das beschriebene Lasersystem basiert auf einem Ein-Arm-Er:Verstärker. Durch einen verschiebbaren Spiegel kann entweder durch Frequenzverdopplung die Wellenlänge 775 nm oder durch eine HNF und einen Yb:Verstärker die Wellenlänge 1050 nm erreicht werden. Eine gleichzeitige Nutzung beider Wellenlängen ist auf diese Weise nicht möglich. Um dieses Problem zu umgehen, wurde der verschiebbare Spiegel zum Umschalten zwischen den Wellenlängen durch einen Strahlteiler (Pellicle) ersetzt, der die Intensität wellenlängenunabhängig zu gleichen Anteilen reflektiert und transmittiert. Dieser befindet sich im Strahlengang des 1550 nm Lasers hinter dem Silizium-Prismenkompressor. Durch einen geeigneten Apexabstand der Prismen ist es möglich, ein Ausgangsspektrum der HNF mit einer Zentralwellenlänge von 1050 nm zu erreichen, das als Seed für den Yb:Verstärker dient. Die Leistung nach der Frequenzverdopplung zur Wellenlänge 775 nm beträgt dann 20 mw. Nach Einkopplung in das Mikroskop über die im vorherigen Abschnitt beschriebene Methode entspricht dies einem Wert von 7 mw. Diese Leistung ist ausreichend, um eine Zwei-Photonen-Photoaktivierung von PA-GFP hervorzurufen. Die in dieser Arbeit beschriebenen Experimente der Mobilitätsmessung wurden auf diese Weise durchgeführt 47

52 4 Experimenteller Aufbau zur Fluoreszenzmikroskopie und Photoperturbation (Kapitel 6, 7 und 8). 4.3 Einkopplung eines Zwei-Arm-Femtosekunden-Faserlasers in ein LSM über eine externe Scaneinheit Der im vorhergehenden Abschnitt beschriebene experimentelle Aufbau wurde im Rahmen dieser Arbeit durch ein neues System ergänzt. Dieses besteht aus einem kommerziellen Faserlaser, der durch einen Yb:Verstärker erweitert wurde, einem konfokalen Fluorszenzmikroskop und einer externen Einheit zum Einkoppeln und Bewegen des Laserstrahls. Abbildung 4.2 zeigt schematisch den experimentellen Aufbau. Das verwendete Lasersytem FemtoFiber pro der Firma Toptica Photonics setzt sich aus einem Er:Oszillator, zwei Er:Verstärkern und einer Frequenzverdopplung zusammen. Die Modenkopplung des Oszillators wird durch die Reflexion an einem SAM erreicht. Die Wellenlänge des Systems liegt bei 1550 nm, die Repetitionsrate beträgt 40 MHz. Einer der Verstärkerarme bietet zusätzlich die Möglichkeit einer Frequenzverdopplung durch einen periodisch gepolten MgO:LiNbO 3 -Kristall, sodass eine Wellenlänge von 775 nm erreicht wird. Das Umschalten zwischen der fundamentalen und der frequenzverdoppelten Wellenlänge geschieht durch einen verschiebbaren Spiegel. Um auch an diesem System eine Wellenlänge von 1050 nm zu erreichen, wird ein selbsgebauter Yb:Verstärker verwendet. Die Seedimpulse werden, wie auch beim im vorhergehenden Abschnitt beschrieben Aufbau, durch eine HNF generiert, die in diesem Fall direkt an den Yb:Verstärker angespleißt ist. Durch einen periodisch gepolten MgO:LiNbO 3 -Kristall kann die Ausgangswellenlänge des Yb:Verstärkers frequenzverdoppelt werden, sodass eine Wellenlänge von 525 nm erreicht wird. Eine detailliertere Beschreibung des aufgebauten Lasersystems findet sich in (Blu12). Das konfokale Fluoreszenzmikroskop ist ein LSM 700 der Firma Carl Zeiss AG. Für die Fluoreszenzanregung stehen Festkörperlaser mit den Wellenlängen 488 nm und 555 nm zur Verfügung. Im Vergleich zu dem bisher verwendeten LSM Pascal zeichnet sich das LSM 700 vor allem durch die deutlich empfindlicheren Detektoren aus. Zudem erlaubt die neuere Version der Ansteuerungssoftware den Einatz von Makros, die eine weitere Automatisierung des Messprozesses ermöglichen 1. Die Einkopplung der unterschiedlichen Laserwellenlängen erfolgt bei diesem Aufbau über 1 Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit der Inbetriebnahme des LIC-Makros aus der Arbeitsgruppe von Dr. Roland Nitschke (Universität Freiburg) begonnen. 48

53 4.4 Bestrahlungsbedingungen Er:fiber laser = 1550 nm frequency conversion objective Er:oscillator Er:amplifier HNF Yb:amplifier GC SHG = 525 nm scan mirrors = 1050 nm dichroic mirror Er:amplifier SHG = 775 nm fluorescence excitation diode laser diode laser = 555 nm = 488 nm LSM Abbildung 4.2: Schematische Darstellung des experimentellen Aufbaus, der im Rahmen dieser Arbeit aufgebaut wurde. Ein Zwei-Arm-Er:Oszillator/Verstärkersystem (FemtoFiber pro, Toptica Photonics) liefert eine Ausgangswellenlänge von 1550 nm. Durch Frequenzverdopplung (SHG) oder eine Kombination aus hoch nichtlinearer Faser (HNF) und Yb:Verstärker werden die Wellenlängen 775 nm und 1050 nm erreicht, die Frequenzverdopplung von 1050 nm liefert die Wellenlänge 525 nm. Die Einkopplung in das Mikroskop erfolgt durch einen externen Scanner (UGA 40, Rapp OptoElectronic). Das konfokale Fluoreszenzmikroskop (LSM 700, Carl Zeiss AG) bietet durch Festkörperlaser die Möglichkeit zur Fluoreszenzanregung bei 488 nm und 555 nm. das Scansystem UGA 40 der Firma Rapp OptoElectronic. Hierbei handelt es sich um ein externe Einheit, bestehend aus zwei galvanometrischen Spiegeln zum Bewegen des Strahls, und einer integrierten Optik zur Aufweitung des Strahldurchmessers. Das System wird an der Anschlussstelle der Fluoreszenzlampe am Stativ des Mikroskops angebracht. Ein dichroitischer Strahlteiler ermöglicht die gleichzeitige Nutzung von eingekoppelten Lasern und Fluoreszenzlicht für die Weitfeldmikroskopie. Ähnlich wie bei der im vorhergehenden Abschnitt beschriebenen Einkopplung werden die Halterungen der Fluoreszenzstrahlteiler und -filter genutzt, um dort einen dichroitischen Strahlteiler zu befestigen, der die infraroten Wellenlängen reflektiert und in das Objektiv leitet. Diese Art der Lasereinkopplung ermöglicht das Bewegen der infraroten Laser während gleichzeitig eine Fluoreszenzanregung durch die Festkörperlaser erfolgt. Ein Zeitversatz zwischen optischer Manipulation und Bildaufnahme existiert somit nicht. 49

54 4 Experimenteller Aufbau zur Fluoreszenzmikroskopie und Photoperturbation 8 8 A m p litu d e (a.u.) A m p litu d e (a.u.) D e la y tim e (fs ) D e la y tim e (s ) Abbildung 4.3: Interferometrische Autokorrelation (schwarz) von Impulsen bei den Wellenlängen 775 nm (links) und 1050 nm (rechts). Die Intensitätsautokorrelation ist in rot gezeigt. Unter Annahme einer sech 2 -Impulsform betragen die Impulsdauern 380 fs (775 nm) und 85 fs (1050 nm). 4.4 Bestrahlungsbedingungen Die Wahrscheinlichkeit für eine n-photonen-absorption ist proportional zu der n-ten Potenz der Spitzenintensität. Diese hängt von der mittleren Leistung, der Impulsdauer, der Wiederholrate und der bestrahlten Fläche ab (Kapitel 2.2). Eine Schädigung von DNA durch nichtlineare Prozesse hängt somit ebenfalls in nichtlinearer Weise von den genannten Parametern ab. Um die Bedingungen bei den Experimenten so definiert wie möglich zu halten, wurde immer nur die mittlere Leistung variiert; Repetitionsrate, bestrahlte Fläche und Impulsdauer waren konstant. Die Repetitionsrate ist durch den Aufbau des Laseroszillator festgelegt und somit unveränderlich, ebenso ist die bestrahlte Fläche bei vollständiger Ausleuchtung der Rückapertur des Objektivs konstant. Um auch die Impulsdauer so konstant wie möglich zu halten, ist jedoch eine regelmäßige Messung zur Kontrolle notwendig. In dieser Arbeit wurde hierfür eine interferometrische Autokorrelation mit einem Michelson-Interferometer verwendet, die auch eine Messung hinter dem Mikroskopobjektiv erlaubt. Eine genauere Beschreibung des verwendeten Aufbaus findet sich in (Trä06). Abbildung 4.3 zeigt die Autokorrelationen von Femtosekunden-Impulsen bei den Wellenlängen 775 nm und 1050 nm. Die Messungen erfolgten hinter dem Mikroskopobjektiv. Die Impulse wurden von dem in Abschnitt 4.2 beschriebenen Lasersystem erzeugt. Unter 50

55 4.4 Bestrahlungsbedingungen Faserlaser aus (Adl07; Trä09) FemtoFiber pro Repetitionsrate 107 MHz 40 MHz Wellenlänge 775 nm 1050 nm 775 nm Impulsdauer 380 fs 85 fs 250 fs (hinter Objektiv) PSF (lateral) 270 nm (Trä09) 377 nm (Trä09) 270 nm (FWHM, 2-Photonen) Tabelle 4.1: Zusammenfassung der Laserparameter bei der Einkopplung des in Abschnitt 4.2 beschriebenen Faserlasers und des FemtoFiber pro in das LSM Pascal. Annahme einer sech 2 -Impulsform betragen die Impulslängen 380 fs bei 775 nm bzw. 85 fs bei 1050 nm. Um auch an dem in Abschnitt 4.3 beschriebenen Versuchsaufbau eine regelmäßige Messung der Impulsdauer vornehmen zu können, wurde ein weiterer Michelson-Autokorrelator aufgebaut und in Betrieb genommen (Kro12). Bei allen in dieser Arbeit gezeigten Messungen wurde die Photoperturbation am LSM Pascal durchgeführt. Hierfür wurde entweder der in Abschnitt 4.2 beschriebene Faserlaser oder der FemtoFiber pro (Toptica Photonics) verwendet. Diese wurden beide in das LSM Pascal eingekoppelt. In Tabelle 4.1 sind die bei den Bestrahlungen verwendeten Parameter zusammengefasst. Die Umrechnung von der mittleren Leistung im Fokus des Objektivs auf die Spitzenintensität erfolgte mit Hilfe von Gleichung 2.3. Die bestrahlte Fläche A wurde mit Hilfe der PSF der Zwei-Photonen-Anregung bestimmt (Trä09): A = π ( 2 d P SF 2 ) 2 (4.1) Der Faktor 2 ergibt sich durch die Umrechnung der Zwei-Photonen-PSF auf die lineare PSF. 51

56 4 Experimenteller Aufbau zur Fluoreszenzmikroskopie und Photoperturbation 52

57 5 Lokale Induktion von DNA-Schäden zur Analyse von DNA-Reparaturmechanismen Die Bestrahlung von lebenden Zellen mit Femtosekunden-Impulsen bietet die Möglichkeit, DNA-Schäden durch eine Multiphotonenabsorption zu erzeugen. Der Vorteil der Schadensinduktion durch nichtlineare Prozesse ist, dass das betroffene Volumen im Vergleich zu einer linearen Schädigung deutlich kleiner ist. Zudem werden infrarote Wellenlängen von Biomolekülen kaum absorbiert, wodurch fast keine Kollateralschäden, insbesondere an der Kernmembran, entstehen. Die Kombination von lokaler DNA-Schädigung und Fluoreszenzmikroskopie bietet die Möglichkeit, eine Anreicherung von fluoreszenzmarkierten Reparaturproteinen an der Schadensstelle zu beobachten. Die Messungen erlauben eine Analyse der zeitlichen Abhängigkeit dieser Akkumulation. Ein Vergleich von Rekrutierungskurven für unterschiedliche Proteine bzw. verschiedene Varianten des gleichen Proteins ermöglicht Rückschlüsse auf die Bindung an der Schadensstelle. Um die Schadensmenge nach der Bestrahlung mit Femtosekunden-Impulsen der Wellenlänge 775 nm und 1050 nm zu untersuchen, wurde bei unterschiedlichen Laserleistungen die Anzahl der induzierten Strangbrüche untersucht. Dies geschah mit Hilfe einer immunozytochemischen Färbung gegen die phosphorylierte Form des Histons H2AX. Da es sich bei der Schadensinduktion um einen nichtlinearen Prozess handelt, kann auf dessen Ordnung geschlossen werden, indem die Leistungsabhängigkeit der Schadensmenge betrachtet wird. Im ersten Abschnitt dieses Kapitels werden die Ergebnisse dieser Messungen vorgestellt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Kombination aus lokaler Schädigung und anschließender Fluoreszenzmessung für die Beantwortung sehr vielfältiger Fragestellungen genutzt. Nach einer kurzen Einführung in die verwendete Methode der Datenanalyse werden in diesem Kapitel einige der erzielten Ergebnisse vorgestellt. Es handelt sich um Studien zur Schadensbindung des Proteins XPC, zum Einfluss der Methylierung auf die Aktivität des Proteins PARP1 und zum Einfluss der PARP-Aktivität auf die Schadensbindung der 53

58 5 Lokale Induktion von DNA-Schäden zur Analyse von DNA-Reparaturmechanismen Proteine XRCC1 und WRN. 5.1 Charakterisierung des laserinduzierten Schadens In der Arbeit von Träutlein et al. (Trä09) wurde untersucht, welche Schadensarten bei der Bestrahlung mit Femtosekunden-Impulsen der Wellenlängen 775 nm und 1050 nm entstehen. Dazu wurden Zellen der Linie HeLa 229 bei unterschiedlichen Leistungen bestrahlt, fixiert und immunozytochemisch mit Antikörpern spezifisch für γh2ax, CPDs und 6-4- PP angefärbt. Die Fixierung erfolgte direkt nach der Bestrahlung (Trä09; Trä10). In Abbildung 5.1 ist die Fluoreszenzintensität der unterschiedlichen Färbungen gegenüber der Spitzenleistung der Laserimpulse für beide Wellenlängen aufgetragen. Durch die Bestrahlung mit einer Wellenlänge von 775 nm entstehen sowohl CPDs (grün) und 4-6-PP (rot), als auch Strangbrüche. Das Signal des γh2ax-antikörpers (schwarz) hat bereits eine Sättigung erreicht. Bei 1050 nm existiert hingegen ein Leistungsbereich, in dem das Signal für γh2ax ebenfalls in Sättigung liegt, die UV-Photoprodukte (CPDs und 6-4- PP) jedoch unterhalb der Nachweisgrenze. Es ist also möglich, spezifisch Strangbrüche zu erzeugen. UV-Photoprodukte werden durch eine direkte Mehrphotonenabsorption der Basen erzeugt. Bei 775 nm ist dies durch eine Dreiphotonenabsorption möglich. Bei 1050 nm ist hierfür eine Vier-Photonen-Absorption notwendig. Diese ist deutlich unwahrscheinlicher und erfordert somit eine höhere Spitzenintensität. Die Generation von Strangbrüchen beruht auf der Ausbildung von Plasmen geringer Dichte und der damit verbundenen Erzeugung von solvatisierten Elektronen und Radikalen. Diese Effekte hängen ebenfalls von der Photonenenergie ab, treten aber bei beiden Wellenlängen auf. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Ergebnisse von Träutlein et al. durch Messungen in einem niedrigeren Leistungsbereich ergänzt, in dem das Signal der γh2ax-spezifischen Färbung noch nicht in Sättigung ist. Für die Messungen wurden HeLa Kyoto Zellen verwendet. Die Bestrahlung mit Femtosekunden-Impulsen erfolgte entlang zweier sich kreuzender Linien mit der Länge von 10 µm. Für beide Wellenlängen wurden bei jeweils vier unterschiedlichen Leistungen mindestens 10 Zellen pro Leistung geschädigt. Nach einer Inkubationszeit von 10 min folgte die Fixierung und Färbung der Zellen. Dieses Zeitintervall wurde gewählt, da sich die Phosphorylierung von H2AX erst innerhalb einiger Minuten nach der Schadensinduktion ausbildet und etwa zu diesem Zeitpunkt eine Sät- 54

59 5.1 Charakterisierung des laserinduzierten Schadens Abbildung 5.1: Fluoreszenzintensität der immunozytochemischen Färbung gegen γh2ax (schwarz), CDPs (grün) und 6-4-PP (rot) nach Bestrahlung von Zellkernen mit Femtosekunden- Impulsen. Es wurden die Wellenlängen 775 nm und 1050 nm bei unterschiedlichen Laserleistungen verwendet. Die Fixierung der Zellen erfolgte direkt nach der Bestrahlung. Die gezeigten Datenpunkte sind die Mittelwerte aus mindestens 8 Zellen, die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung, die Skalierung beider Achsen ist logarithmisch. Mit Femtosekunden-Impulsen der Wellenlänge 1050 nm ist es möglich, in einem bestimmten Leistungsbereich spezifisch Strangbrüche zu induzieren. Die Abbildung ist übernommen aus (Trä09). fluorescence intensity (a. u.) γh2ax γh2ax fluorescence intensity (a. u.) Abbildung 5.2: Fluoreszenzintensität der immunozytochemischen Färbung gegen γh2ax nach Bestrahlung von Zellkernen mit Femtosekunden-Impulsen bei den Wellenlängen 775 nm und 1050 nm mit unterschiedlichen Laserleistungen. Die Fixierung erfolgte 10 min nach der Bestrahlung. Die gezeigten Datenpunkte sind die Mittelwerte aus mindestens 8 Zellen, die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler, die Skalierung beider Achsen ist logarithmisch. Die blauen Kreise geben die Fluoreszenzintenistät unbestrahlter Zellen an. Die Steigungen der angepassten Geraden betragen 3,1 ± 0,9 bei 775 nm und 5,8 ± 2,1 bei 1050 nm. 55

60 5 Lokale Induktion von DNA-Schäden zur Analyse von DNA-Reparaturmechanismen tigung erreicht. Zur Messung der Fluoreszenzintensität des mit dem γh2ax-antikörper kombinierten Farbstoffs wurde ein Epifluoreszenzmikroskop (Axio Observer Z1, Carl Zeiss AG) verwendet, wobei die Belichtungszeiten und Detektoreinstellungen für alle Messungen konstant waren. Bei der Auswertung der aufgenommenen Bilder wurde die mittlere Intensität innerhalb des geschädigten Bereichs für jede bestrahlte Zelle gemessen. Die gemittelten Werte dieser Messungen sind in Abbildung 5.2 in einer doppelt-logarithmischen Auftragung gezeigt. Die verwendeten Leistungspunkte liegen oberhalb der Nachweisgrenze und unterhalb der in Träutlein et al. gemessenen Sättigung (Trä10). Die Fluoreszenzintensität von unbestrahlten Zellen ist zum Vergleich ebenfalls ins Diagramm eingezeichnet (blaue Kreise). Die Steigung der angepassten Geraden beträgt 3,1 ± 0,9 bei 775 nm und 5,8 ± 2,1 bei 1050 nm. Da es sich bei der Schadensinduktion um eine Mehrphotonenabsorption handelt, enthält die Steigung dieser Geraden die Information über die Ordnung des zugrundeliegenden Prozesses. Es fällt auf, dass die für ein γh2ax-signal benötigten Spitzenintensitäten bei 1050 nm deutlich höher sind als bei 775 nm. Die Erzeugung von Strangbrüchen ist vermutlich auf eine elektronische Anregung des Wassermoleküls zurückzuführen, wofür eine Energie von 6,5 ev notwendig ist. Dies entspricht einer Vier-Photonen-Absorption bei 775 nm und einer Sechs-Photonen-Absorption bei 1050 nm. Da die Wirkungsquerschnitte mit zunehmender Ordnung des Prozesses kleiner werden, ist für einen Sechs-Photonen-Absorption eine höhere Spitzenintensität nötig als für einen Vier-Photonen-Prozess. Die Steigung von 5,8 ± 2,1 bei 1050 nm kann über die Sechs-Photonen-Absorption des Wassermoleküls erklärt werden (6 1,18 ev = 7,1 ev). Bei 775 nm deutet die gemessene Steigung der Leistungskurve auf einen Drei-Photonen-Prozess hin. Für ein Radiolyse des Wassermoleküls wäre ein Vier-Photonen-Prozess notwendig. Für die Erzeugung von Strangbrüchen ist also in diesem Fall ein anderer Prozess verantwortlich. Eine mögliche Erklärung könnte die indirekt Aktivierung über die Erzeugung von UV-Photoprodukten sein. Es ist bekannt, dass γh2ax bei Einzelstrangbrüchen auftreten kann. Bei der Reparatur von UV-Photoprodukten durch die NER entstehen als Zwischenprodukt offene Einzelstrangenden, die zu einer Phosphorylierung von H2AX führen können. Durch ein kürzeres Zeitintervall als die verwendeten 10 min zwischen Schädigung und Fixierung ließe sich der Einfluss eines solchen Reaktionsmechanismus ausschließen, jedoch wäre in diesem Fall das Signal des γh2ax-antikörpers auch deutlich schwächer. Ein Nachweis geringer Schadensmengen ist somit schlechter möglich. 56

61 5.2 Rekrutierungsstudien von DNA-Reparaturproteinen irradiation time fluorescence intensity time Abbildung 5.3: Die lokale Induktion von DNA-Schäden führt zu einer Akkumulation von fluoreszenzmarkierten Reparaturproteinen. Die schematische Darstellung zeigt die Zunahme der Intensität in der bestrahlten Region des Zellkerns. 5.2 Rekrutierungsstudien von DNA-Reparaturproteinen Die lokale Schädigung der DNA führt zu einer Anreicherung von Reparaturproteinen an der Schadensstelle. Sind diese Proteine mit einem fluoreszierenden Protein markiert, so kann diese Umverteilung an Hand einer Erhöhung der Intensität in einer fluoreszenzmikroskopischen Bildaufnahme gemessen werden. Auf diese Weise ist eine Beobachtung der zeitlichen Dynamik dieser Prozesse an lebenden Zellen möglich. Abbildung 5.3 zeigt diese Messmethode schematisch. Um aus den Mikroskopiebildern eine quantitative Intensitätszunahme zu bestimmen, wird von jedem aufgenommenen Bild die mittlere Intensität an der Schadensstelle I Schaden (t) und die mittlere Intensität des gesamten Zellkerns I Kern (t) bestimmt. Die prozentuale Intensitätszunahme I Zunahme berechnet sich folgendermaßen: I Zunahme (t) = ( ISchaden (t) I Kern (t) ) IKern(vor Bestrahlung) I Schaden (vor Bestrahlung) (5.1) Das Verhältnis aus I Schaden (t) zu I Kern (t) beschreibt die Zunahme der Intensität. In vielen Fällen ist jedoch die Verteilung des Proteins im Zellkern bereits vor der Schädigung nicht homogen. Da dies nicht als Zu- oder Abnahme der Intensität an der Schadensstelle fehlinterpretiert werden soll, wird mit dem Verhältnis aus I Kern (t) zu I Schaden (t) für einen 57

62 5 Lokale Induktion von DNA-Schäden zur Analyse von DNA-Reparaturmechanismen Zeitpunkt vor der Laserbestrahlung multipliziert. Die Subtraktion des Wertes 1 und die Multiplikation mit 100 liefern die prozentuale Zunahme. Ein Ausbleichen der fluoreszierenden Proteine während der Bildaufnahme ist bei dieser Auswertung bereits berücksichtigt, da auf den gesamten Zellkern normiert wird. Verringert sich die Gesamtzahl der fluoreszierenden Proteine, so wird dies rechnerisch durch die Normierung auf I Kern (t) korrigiert. Diese Art der Auswertung wurde für alle in dieser Arbeit gezeigten Proteinrekrutierungen verwendet. Ein Nachteil dieser Auswertemethode ist, dass I Zunahme (t) abhängig ist von der Gesamtmenge der fluoreszierenden Proteine im Zellkern und somit vom Expressionsniveau. Dieses ist jedoch immer einer gewissen Schwankung unterworfen. Deshalb muss bei der Auswahl der Zellen darauf geachtet werden, dass die Anfangsintensität möglichst gleich ist. Um eine starke Zunahme zu beobachten, empfiehlt es sich, ein schwaches Expressionslevel auszuwählen, da hier die prozentuale Zunahme größer ist. 5.3 Die Schadenserkennung des Reparaturproteins XPC 1 UV-Photoprodukte sind Querverbindungen von benachbarten Basen eines DNA-Stranges. Diese Art von Schäden, die zu einer Verbiegung der Doppelhelixstruktur führen, wird durch die NER repariert (Kapitel 3.2.1). Von zentraler Bedeutung für die Erkennung der Schadensstelle ist dabei das Reparaturprotein XPC. Die Bindung von XPC erfolgt nicht an der Schadensstelle selbst, sondern an der einzelsträngigen DNA des gegenüberliegenden Stranges, die durch die Verbiegung der Doppelhelixstruktur entsteht. Der genaue Mechanismus ist jedoch noch nicht vollständig verstanden. Das zu humanem XPC homologe Protein der Hefe wird als Rad4 bezeichnet. Durch Röntgenstrukturanalysen dieses Proteins konnten Seitenketten identifiziert werden, die für die Bindung wichtig sind, da sie in engem Kontakt mit den ungepaarten Basen des gegenüberliegenden DNA Stranges stehen. In humanem XPC sind die entsprechenden Aminosäuren evolutionär hoch konserviert. Aufgrund der Struktur von Rad4 kann daher angenommen werden, dass in XPC die Aminosäuren N754, F756, F799 und F797 für die Bindung an die ungepaarten, aus der DNA-Helix nach außen herausragenden Basen verantwortlich sind. Um diese Hypothese zu stützen, wurde die Rekrutierung von XPC-Mutanten untersucht, 1 Die in diesem Abschnitt vorgestellten Ergebnisse entstanden in Zusammenarbeit mit der Gruppe von Prof. Dr. Hanspeter Nägeli, Universität Zürich. Eine genauere Beschreibung findet sich in (Cle10). 58

63 5.3 Die Schadenserkennung des Reparaturproteins XPC 2 5 In c re a s e in F lu o re s c e n c e [% ] T im e [s ] w ild ty p e F A F A F A N A Abbildung 5.4: Akkumulation unterschiedlicher Varianten des Proteins XPC-EGFP nach der Bestrahlung mit Femtosekunden-Impulsen der Wellenlänge 775 nm. Der Wildtyp weist eine stärkere Bindung an der Schadensstelle auf als die untersuchten Mutanten des Proteins (N754A, F756A, F799A und F797A) (Cle10). bei denen diese Aminosäuren jeweils durch ein Alanin ersetzt wurden, und mit dem Wildtyp verglichen. Diese Mutationen sollten zu einer schlechteren Erkennung des Schadens und somit zu einer schwächeren Rekrutierung führen. Für die Messungen wurden Zellen der Linie CHO (chinese hamster ovary) verwendet, die das Protein XPC-EGFP exprimieren. Die Bestrahlung mit Femtosekunden-Impulsen der Wellenlänge 775 nm erfolgte entlang einer Linie der Länge 10 µm. Die mittlere Laserleistung betrug 13 mw, was einer Spitzenintensität von 365 GW/cm 2 entsprach (290 fs, 107 MHz). Nach der Bestrahlung erfolgte die Messung der Intensitätszunahme an der Schadensstelle durch Fluoreszenzanregung bei der Wellenlänge 488 nm. Es wurden Bilder im Abstand von 6,5 s über einen Zeitraum von insgesamt 320 s aufgenommen. Die Berechnung der Zunahme der Fluoreszenzintensität an der Schadensstelle anhand der Zeitserien erfolgte durch Gleichung 5.1. Die Daten zeigen eine Akkumulation des Wildtyps und aller Mutanten von XPC. Die Rekrutierung des Wildtyps ist signifikant stärker als die aller untersuchten Mutanten. 59

64 5 Lokale Induktion von DNA-Schäden zur Analyse von DNA-Reparaturmechanismen Diese Varianten von XPC weisen also eine schlechtere Schadenserkennung auf, wobei der Austausch der Aminosäuresequenz N754 gegen Alanin den größten Einfluss hat. 5.4 Die Rekrutierung von GFP-XPC in der Zelllinie DT40 2 Eine häufig verwendete Technik, um die Funktion einzelner Proteine zu studieren, besteht darin, die Expression der für sie codierenden Gene gezielt auszuschalten (knockout) und den Einfluss des Fehlens des entsprechenden Proteins in Zellen oder ganzen Organismen zu beobachten. In der Zelllinie DT40 ist diese Technik besonders gut möglich, da diese Zellen eine sehr hohe Rekombinationsaktivität aufweisen. Bei dieser aus B-Lymphozyten von Hühnern hervorgegangenen Zelllinie handelt es sich um Suspensionszellen mit einem Durchmesser von nur etwa 5 µm. Im Forschungsgebiet der NER führt die geringe Größe der Zellen zu dem Problem, dass es mit den gängigen Methoden zur lokalen Erzeugung von UV-Photoprodukten (Polycarbonat-Filter, Kapitel 3.2.1) nicht möglich ist subnukleare Bereiche zu bestrahlen. Im Rahmen dieser Arbeit ist es erstmals gelungen, lokal innerhalb des Kerns von DT40- Zellen UV-Photoprodukte zu erzeugen und diese durch Antikörperfärbungen und die Rekrutierung des Proteins XPC nachzuweisen. Diese Technik wurde verwendet, um den Einfluss von Centrin2 auf die NER zu untersuchen. Dieses Protein ist vornehmlich in den Zentrosomen lokalisiert, es bindet jedoch auch an XPC. Die genaue Funktion dieser Bindung bei der NER ist bisher nicht bekannt. Bei den Messungen wurde die Akkumulation von GFP-XPC in DT40-Zellen beobachtet und mit einer DT40-Variante verglichen, bei der die für die Proteine Centrin2, Centrin3 und Centrin4 codierenden Gene ausgeschaltet waren. Für eine weitere Messung wurde in solchen Zellen das Protein Centrin2 exogen zur Reexpression gebracht gebracht. Dazu wurde für Centrin2 codierende DNA zusätzlich durch eine transiente Transfektion in die Zellen eingebracht. Auf diese Weise konnte untersucht werden, ob ein möglicher Unterschied in der Rekrutierung von XPC in den Centrin-negativen Zellen reversibel war. Die Bestrahlung der Zellen erfolgte entlang einer Linie der Länge 6 µm mit Femtosekunden- Impulsen der Wellenlänge 775 nm (520 GW/cm 2 ; 6 mw; 250 fs; 40 MHz). Anschließend wurden für eine Zeitspanne von 3 min Fluoreszenzbilder in Zeitintervallen von 5 s aufge- 2 Die in diesem Abschnitt vorgestellten Ergebnisse entstanden in Zusammenarbeit mit der Gruppe von Prof. Dr. Ciaran Morrison, NUI Galway. Eine genauere Beschreibung findet sich in (Dan13). 60

65 5.4 Die Rekrutierung von GFP-XPC in der Zelllinie DT40 DNA GFP-XPC CPD Abbildung 5.5: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme einer Beispiel-Zelle der Linie DT40, die das Protein GFP-XPC exprimiert, nach der Bestrahlung mit Femtosekunden-Impulsen der Wellenlänge 775 nm. CPDs wurden immunozytochemisch detektiert. Die Bestrahlung führte zu einer Induktion von CPDs, an denen das Protein XPC akkumuliert. Die Länge des eingezeichneten Maßstabs beträgt 5 µm (Dan13). RelativeWGFP-cXPCWenrichmentWatWlaserWstripeW(%) Wild-type Cetn4 -/- /2 -/- /3 - Cetn4 -/- /2 -/- /3 - + myc Cetn TimeWafterWlaserWeventW(s) Abbildung 5.6: Quantitative Auswertung der Rekrutierung von GFP-XPC in Centrin2-, Centrin3- und Centrin4-positiven (schwarze Quadrate) und negativen (orangene Kreise) DT40- Zellen. Die Centrin-negativen Zellen zeigen eine geringfügig schwächere Akkumulation von XPC. Die Varianz der Messungen ist jedoch so groß, dass keine statistisch signifikante Aussage möglich ist. Bringt man die Centrin-negitiven Zellen durch eine transiente Transfektion zur Expression von Centrin2 (violette Dreiecke), so ist die Rekrutierung vergleichbar mit der des Wildtyps (Dan13). 61

66 5 Lokale Induktion von DNA-Schäden zur Analyse von DNA-Reparaturmechanismen nommen. Aufgrund der starken Bewegung und Drehung der Zellen erfolgte die Auswertung der Daten durch ein anwenderspezifisches Makro 3 des Bildbearbeitungsprogramms ImageJ. Das Auswählen der Schadensbereiche geschah durch eine automatische Erkennung von hellen Bereichen mit einer definierten Minimalgröße. Als zusätzliche Bedingung für die Erkennung wurde angenommen, dass diese Bereiche in einer größeren Fläche mit elliptischer Geometrie, die der vom Laser bestrahlten Fläche entspricht, enthalten sind. Zur Berechnung der relativen Intensitätszunahme wurde die mittlere Intensität im geschädigten Bereich durch die mittlere Intensität des ganzen Zellkerns geteilt. Abbildung 5.5 zeigt die Mikroskopieaufnahme (Axio Observer Z1 mit Spinning Disk, Carl Zeiss AG) einer GFP-XPC exprimierenden DT40-Zelle, bei der CPDs immunozytochemisch detektiert wurden. Man sieht eine Kolokalisation von CPDs und XPC. Die Ergebnisse der quantitativen Auswertung sind in Abbildung 5.6 zu sehen. Die Messungen stellen einen Mittelwert aus mindestens 30 gemessenen Zellen dar, die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler. Die Varianz der Messungen ist so groß, dass keine statistisch signifikante Aussage über ein unterschiedliches Verhalten der untersuchten Gruppen möglich ist. Als leichte Tendenz lässt sich dennoch erkennen, dass XPC schwächer in Centrinnegativen als in Wildtypzellen an die Schadensstelle rekrutiert. Bringt man diese Zellen durch eine transiente Transfektion zur Expression von Centrin2, so ist die Rekrutierung vergleichbar mit der des Wildtyps. 5.5 Der Einfluss der Methylierung der Proteins PARP1 auf dessen enzymatische Aktivität 4 Posttranslationale Modifikationen sind Veränderungen von Proteinen, die nach der Übersetzung der mrna in die Aminosäuresequenz stattfinden. Bekannte Beispiele hierfür sind die Phosphorylierung, die Acetylierung oder die Methylierung. Durch diese Modifizierungen ändern sich die Eigenschaften des Proteins. Bei der posttranslationalen Modifikation der Poly-ADP-Ribosylierung werden Ketten aus Adenosindiphosphat (ADP) -Ribose Resten (Poly-ADP-ribose, PAR) an bestimmte Aminosäuren des Proteins angehängt. Dies ge- 3 Programmiert von Felix Schönenberger; frei verfügbar auf 4 Die in diesem Abschnitt vorgestellten Ergebnisse entstanden in Zusammenarbeit mit der Gruppe von Prof. Dr. Michael Hottiger, Universität Zürich. Eine genauere Beschreibung findet sich in (Kas13). 62

67 5.5 Der Einfluss der Methylierung des Proteins PARP1 auf dessen enzymatische Aktivität schieht zum größten Teil durch das Enzym Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase-1 (PARP1 5 ), das diese Ketten synthetisiert. PARP1 rekrutiert an DNA-Schäden. Bei der Bindung an den Schaden wird es aktiv und synthetisiert PAR-Ketten. Viele Reparaturproteine binden an diese Ketten und werden auf diese Weise an die Schadensstelle rekrutiert. Auch PARP1 selbst bindet an PAR, wodurch die Akkumulation von PARP1 an der Schadensstelle verstärkt wird. In einer Arbeit von Mortusewicz et al. (Mor07a) wurde die Anreicherung von PARP1 nach der lokalen Induktion von DNA-Schäden durch einen Laser bereits untersucht. Die Intensität erreicht nach etwa einer Minute ein Maximum und nimmt danach wieder ab. Das Maximum ist auf die erhöhte PARP-Aktivität direkt nach der Schadensinduktion zurückzuführen. Eine posttranslationale Modifikation von PARP1 ist die Methylierung der Aminosäure K508. Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, welchen Einfluss diese Modifikation auf die Aktivität von PARP1 hat. Dazu wurde die Akkumulation von GFP-PARP1 in Zellen der Linie U2OS nach der Induktion eines DNA-Schadens beobachtet und mit einer Mutante von PARP1 verglichen, bei der in der Aminosäuresequenz das Lysin an der Stelle K508 durch Arginin ersetzt wurde (K508R). Die Schädigung erfolgte entlang einer Linie mit den Wellenlängen 1050 nm (1200 GW/cm 2 ) oder 775 nm (312 GW/cm 2 ). Abbildung 5.7 zeigt die Ergebnisse dieser Messungen. Der qualitative Verlauf der Rekrutierung ist vergleichbar mit der in Mortusewicz et al.. Nach der Schadensinduktion kommt es zu einer Akkumulation von PARP1 mit einem Maximum nach etwa einer Minute, danach fällt die Intensität an der Schadensstelle auf einen geringeren Wert ab. Nach Bestrahlung mit 1050 nm ist kein Unterschied im Rekrutierungsverlauf zwischen Wildtyp (wt) und Mutante (K508R) zu sehen. Die Schädigung mit 775 nm führt jedoch zu einer stärkeren Anreicherung des Wildtyps. Dies könnte durch eine geringere PARP-Aktivität der methylierungsdefizienten Mutante erklärt werden. Die Schadensdichte bei den verwendeten Laserparametern ist bei 775 nm deutlich höher als bei 1050 nm. Da es sich bei dem Unterschied zwischen Wildtyp und Mutante um einen sehr geringen Effekt handelt, ist dieser vermutlich nur bei dieser hohen Schadensdichte sichtbar. Eine Möglichkeit, PARP-Aktivität an der DNA-Schadensstelle direkt nachzuweisen, bietet sich über die Rekrutierung der Makrodomäne (macro domain) des Histons macroh2a PARP1 ist in der Literatur auch unter dem Begriff ARDT1 (ADP-ribosyltransferase diphtheria toxinlike 1) bekannt. 63

68 5 Lokale Induktion von DNA-Schäden zur Analyse von DNA-Reparaturmechanismen IncreasePinPfluorescenceP(%) GFP-PARP1 l =P1050Pnm wt K508R TimeP(s) IncreasePinPfluorescenceP(%) GFP-PARP1 l =P775Pnm wt K508R TimeP(s) Abbildung 5.7: Akkumulation der Wildtyp-GFP-PARP1 (schwarz) und der methylierungsdefizienten Mutante K508R (grün) nach Bestrahlung mit Femtosekunden-Impulsen bei den Wellenlängen 1050 nm (links) und 775 nm (rechts). Die Datenpunkte sind der Mittelwert aus mindestens 20 Zellen, die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler. Das höhere Schadensniveau nach der Bestrahlung bei 775 nm führt zu einer stärkeren Rekrutierung von PARP1. Bei 775 nm ist die Rekrutierung beim Wildtyp stärker (Kas13). IncreaseHinHfluorescenceH(%) GFP-macroH2A l =H1050Hnm wt K508R TimeH(s) Increaseuinufluorescenceu(%) GFP-macroH2A l = 1050unm siset7/9 scrambled Timeu(s) Abbildung 5.8: Akkumulation von GFP-macroH2A nach Schadensinduktion mit Femtosekunden-Impulsen der Wellenlänge 1050 nm. Die Wildtyp-PARP1 (schwarz) oder deren Mutante K508R (grün) wurden transient exprimiert (links). In einem weiteren Experiment unter identischen Bestrahlungsbedingungen (rechts) wurde die Expression des Enzyms SET7/9 durch RNA-Interferenz herunterreguliert (rot). Als Kontrolle diente eine sogenannte scrambled sir- NA (blau). Die schwächere Anreicherung von GFP-macroH2A in Abwesenheit von SET7/9 (rot) zeigt den positiven Einfluss des Enzyms auf die PARP-Aktivität. 64

69 5.6 Die Rekrutierung des Proteins XRCC1 unter Inhibition der PARP Dieser Bereich bindet an PAR-Polymere. Ein Fusionsprotein, das aus dieser Domäne und einem fluoreszierenden Protein besteht, kann also als Sensor für PAR-Ketten dienen, weil es dort lokalisiert ist, wo diese in der Zelle entstehen (Tim09). Abbildung 5.8 zeigt links die Rekrutierung der mit GFP fusionierten Makrodomäne von macroh2a1.1 (GFPmacroH2A) nach der Schadensinduktion durch Femtosekunden-Impulse bei der Wellenlänge 1050 nm (1200 GW/cm 2 ). Den Zellen der Linie U2OS fehlte das endogen PARP1, zusätzlich wurde durch eine transiente Transfektion sowohl GFP-macroH2A, also auch PARP1 (wt oder K508R) eingebracht. Auf diese Weise konnte der Einfluss der Methylierung an der Stelle K508 von PARP1 auf dessen enzymatische Aktivität untersucht werden. In den Messungen war kein signifikanter Unterschied erkennbar. Das Enzym, das für die Methylierung von PARP1 zuständig ist, ist die Methyltransferase SET7/9. Abbildung 5.8 zeigt rechts den Einfluss von SET7/9 auf die PARP-Aktivität. Verglichen wurden Zellen mit normaler und unterdrückter Expression des SET7/9 Gens. Die Herunterregulation der Expression erfolgte durch sogenannte RNA-Interferenz. Mit Hilfe dieser Technik kann die Translation von bestimmten Genen gezielt unterdrückt werden. Dafür werden kurze, der RNA des zu unterdrückenden Gens komplementäre RNAs, sogenannte sirnas in die Zellen mittels Transfektion eingebracht. Durch das Ausschalten von SET7/9 ist die Akkumulation von GFP-macroH2A signifikant kleiner. Daraus kann gefolgert werden, dass SET7/9 eine verstärkende Wirkung auf die PARP1 Aktivität hat. 5.6 Die Rekrutierung des Proteins XRCC1 unter Inhibition der PARP Das DNA-Reparaturprotein XRCC1 (X-ray repair cross-complementing protein 1) ist an der Reparatur von Einzelstrangbrüchen beteiligt und zeichnet sich durch eine sehr starke Akkumulation an laserinduzierten Schädigungen aus. XRCC1 ist ein bekanntes PAR-Bindeprotein. Die starke Akkumulation an der Schadensstelle zu frühen Zeitpunkten nach der Schadensinduktion ist somit auf die Bindung an PAR zurückzuführen. Als Nachweis hierfür dient die vollständige Hemmung der XRCC1 Rekrutierung durch Zugabe eines chemischen Inhibitors der PARP1 (Gag12). Diese Ergebnisse wurden in dieser Arbeit bestätigt. Dazu wurden Zellen der Linie He- 65

70 5 Lokale Induktion von DNA-Schäden zur Analyse von DNA-Reparaturmechanismen In c re a s e in flu o re s c e n c e (% ) G F P -X R C C n m T im e (s ) Abbildung 5.9: Akkumulation von GFP-XRCC1 nach Bestrahlung mit Femtosekundenimpulsen der Wellenlänge 1050 nm (1200 GW/cm 2 ) in An- bzw. Abwesenheit des PARP-Inhibitors ABT 888 (blaue Kreise bzw. schwarze Quadrate). Wenn die PARP-Aktivität gehemmt ist, verschwindet die Rekrutierung von XRCC1 nahezu vollständig (Tom12). La Kyoto, die das Protein GFP-XRCC1 exprimieren mit Femtosekundenimpulsen bei der Wellenlänge 1050 nm entlang einer Linie bestrahlt (1500 GW/cm 2 ). Die Messungen wurden mit und ohne die Zugabe des PARP-Inhibitors ABT 888 (1 µm) durchgeführt. Abbildung 5.9 zeigt die gemessene Zunahme der Fluoreszenzintensität an der Schadensstelle nach der Bestrahlung. Die Daten sind die Mittelwerte aus 8 Einzelmessungen, die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler. Die Rekrutierung wird durch die Inhibition der PARP fast vollständig unterdrückt. 5.7 Die Rekrutierung der Werner-Proteins unter Inhibition der PARP 6 Das Werner-Protein (Werner protein, WRN) ist eine DNA-Helikase, also ein Enzym, das die Struktur von doppelsträngiger DNA ändern kann. Benannt ist es nach der Erbkrank- 6 Die in diesem Abschnitt vorgestellten Ergebnisse entstanden in Zusammenarbeit mit der Gruppe von Prof. Dr. Alexander Bürkle, Universität Konstanz. 66

71 5.7 Die Rekrutierung der Werner-Proteins unter Inhibition der PARP increase in fluorescence (%) time (s) control ABT888 Abbildung 5.10: Akkumulation von GFP-WRN nach Bestrahlung mit Femtosekunden-Impulsen der Wellenlänge 775 nm mit (rot) und ohne Zugabe des PARP-Inhibitors ABT888. Die Inhibition der PARP erhöht die Rektutierung von WRN. heit Werner-Syndrom, bei der dieses Protein einen Defekt aufweist. Bei Patienten mit Werner-Syndrom kommt es zu einer frühzeitigen Alterung. WRN ist auch an der DNA- Reparatur beteiligt. Es rekrutiert an Doppelstrangbrüchen (Lan05). In dieser Arbeit wurde untersucht, welchen Einfluss die PARP-Aktivität bei der Bindung von WRN an laserinduzierte Schäden hat. Aus biochemischen in vitro Experimenten ist bekannt, dass PAR die Bindung von WRN an DNA hemmt (Pop12). Um diesen Befund an lebenden Zellen Zellen zu überprüfen, wurde untersucht, ob GFP-WRN eine veränderte Akkumulation an einem DNA-Schaden aufweist, wenn die PARP-Aktivität durch einen Inhibitor unterdrückt wird. Für die Messungen wurden Zellen der Linie HeLa S3, die das Protein GFP-WRN exprimieren, mit Laserimpulsen der Wellenlänge 775 nm und einer Spitzenintensität von 610 GW/cm 2 bestrahlt (7 mw, 40 MHz, 250 fs). Anschließend wurde für eine Zeitspanne von 10 min die Zunahme der Fluoreszenzintensität an der Schadensstelle beobachtet. Die Experimente wurden in An- bzw. Abwesenheit des PARP-Inhibitors ABT 888 (5 µm) durchgeführt. Die Ergebnisse der Messungen sind in Abbildung 5.10 gezeigt. Die Inhibition der PARP führt zu einer erhöhten Anreicherung von WRN an der Schadensstelle. Dieser Effekt kann 67

72 5 Lokale Induktion von DNA-Schäden zur Analyse von DNA-Reparaturmechanismen durch die geringere Menge an PAR an der Schadensstelle nach der Inhibition der PARP erklärt werden, wodurch die Bindung von WRN weniger stark geschwächt wird (Pop12). 68

73 6 Messung der Mobilität von Kernproteinen in Anwesenheit eines DNA-Schadens Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, die eine Mobilitätsmessung von Kernproteinen nach vorhergehender DNA-Schädigung ermöglicht. Sie beruht auf einer Zwei-Photonen-Photoaktivierung des Markerproteins PAGFP bei einer Wellenlänge von 775 nm. Nach der Aktivierung innerhalb eines kleinen Volumens kommt es zu einer Umverteilung der Proteine und somit zu einer Abnahme der Fluoreszenzintensität innerhalb des aktivierten Bereiches. Die Geschwindigkeit der Intensitätsabnahme ist ein Maß für die Mobilität des Proteins. Eine Besonderheit bei dem Schaltprozess von photoaktivierbaren Proteinen ist die Wellenlängenabhängigkeit der Effizienz dieses Vorgangs. Das Maximum für die lineare Aktivierung von PAGFP liegt bei 400 nm. Bei 440 nm ist die Anzahl der aktivierten Proteine bei gleicher Lichtleistung um 80 % geringer (Pat02). Die Effizienz der Zwei-Photonen- Aktivierung von PAGFP wurde in einer Arbeit von Schneider et al. bestimmt. In einem Wellenlängenbereich zwischen 750 nm und 800 nm zeigte der Prozess eine hohe Effizienz, oberhalb von 900 nm war keine Photoaktivierung messbar (Sch05). Eine Wellenlänge von 1050 nm ist demnach ungeeignet für eine effiziente Zwei-Photonen-Photoaktivierung. Auf der anderen Seite lassen sich durch eine Bestrahlung mit Femtosekunden-Impulsen bei 1050 nm spezifisch DNA-Strangbrüche induzieren (Trä10). In der vorliegenden Arbeit wurden die Zwei-Photonen-Photoaktivierung bei 775 nm und die nichtlineare DNA-Schädigung bei 1050 nm kombiniert, um die Mobilität von Kernproteinen in einem zuvor geschädigten Bereich des Zellkerns zu messen. Dies ist möglich, da sich die Methoden gegenseitig nicht beeinflussen. Zum einen kann durch die effiziente Photoaktivierung bei 775 nm eine Laserleistung gewählt werden, bei der kein nachweisbarer DNA-Schaden entsteht. Andererseits ist die Effizienz der Photoaktivierung bei 1050 nm deutlich geringer als bei 775 nm. Somit lassen sich bei dieser Wellenlänge DNA-Schäden erzeugen, ohne dabei eine merkliche Photoaktivierung hervorzurufen. Um die experimentellen Bedingungen genau zu charakterisieren, wurde die Leistungs- 69

74 6 Messung der Mobilität von Kernproteinen in Anwesenheit eines DNA-Schadens abhängigkeit der Photoaktivierung und der Induktion von Strangbrüchen bei beiden Wellenlängen im Detail untersucht. Die Ergebnisse dieser Messungen sind im ersten Abschnitt dieses Kapitels gezeigt. Im darauffolgenden Abschnitt wird die Messmethode selbst vorgestellt, gefolgt von einem Abschnitt mit einer Diskussion über die Vor- und Nachteile gegenüber bisher verwendeten Techniken. Die Art und vor allem die Anzahl der induzierten DNA-Läsionen hängt stark von der verwendeten Laserleistung ab. Um sicherzustellen, dass der verwendete Leistungsbereich zwar Schäden induziert, jedoch nicht zu einer Ablation des Chromatins führt, wurden Kontrollexperimente durchgeführt, die im letzten Abschnitt dieses Kapitels vorgestellt sind. 6.1 Messung der Leistungsabhängigkeit von Photoaktivierung und DNA-Schadensinduktion Grundlage der in diesem Teil der Arbeit durchgeführten Experimente ist die Annahme, dass bei einer Wellenlänge von 775 nm eine effiziente Photoaktivierung möglich ist, ohne dass bei der verwendeten Laserleistung DNA-Schäden entstehen. Auf der anderen Seite sollen bei einer Wellenlänge von 1050 nm DNA-Schäden erzeugt werden, ohne dabei eine Photoaktivierung hervorzurufen. Sowohl die Anzahl der induzierten DNA-Läsionen als auch die der photoaktivierten PAGFP-Proteine hängen von der verwendeten Laserleistung ab. Daher wurde untersucht, inwieweit eine Trennung von Photoaktivierung und DNA-Schädigung bei den verwendeten Wellenlängen möglich ist. Dieser Abschnitt zeigt die Ergebnisse dieser Messungen. Die Mobilitätsmessungen beruhen auf einer Zwei-Photonen-Photoaktivierung eines PAGFP-Fusionsproteins. Dazu wurde eine definierte Stelle innerhalb des Kerns einer PAGFP exprimierenden Zelle drei Mal hintereinander für ein Zeitintervall von 200 ms mit Femtosekunden-Impulsen der Wellenlänge 775 nm bestrahlt. Der Nachweis, dass die verwendeten Bestrahlungsbedingungen keine DNA-Schäden induzieren, geschah anhand der Rekrutierung des Reparaturproteins XRCC1. Dazu wurden GFP-XRCC1 exprimierende Zellen der Linie HeLa Kyoto unter den gleichen Bedingungen bestrahlt. Da keine Rekrutierung des Proteins nachgewiesen werden konnte, ist davon auszugehen, dass bei den für die Mobilitätsmessungen verwendeten Bedingungen kein DNA-Schaden erzeugt wurde. 70

75 6.1 Messung der Leistungsabhängigkeit von Photoaktivierung und DNA-Schadensinduktion PA-GFP-H2B H2AX DNA = 775 nm P = 64 GW/cm² = 1050 nm P = 1500 GW/cm² Abbildung 6.1: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von PAGFP-H2B exprimierenden HeLa Kyoto Zellen, die mit Femtosekunden-Impulsen der Wellenlängen 775 nm (64 GW/cm 2 ) und 1050 nm (1500 GW/cm 2 ) bestrahlt wurden. Anschließend wurde γh2ax immunozytochemisch nachgewiesen. Die Wahl des immobilen Core-Histons war durch das Zeitintervall von 10 min zwischen Bestrahlung und Fixierung vorgegeben. Zur Sichtbarmachung der DNA wurde der Farbstoff Hoechst verwendet. Die Länge des eingezeichneten Maßstabs beträgt 5 µm. Die unterschiedlichen Wellenlängen ermöglichen die Trennung von Photoaktivierung und Schädigung ohne gegenseitige Beeinträchtigung (Tom12).) Die Ergebnisse zur Leistungsabhängigkeit von DNA-Strangbrüchen bei beiden Wellenlängen wurden bereits in Kapitel 5.1 vorgestellt. Der Schadensmarker hierfür waren Antikörper spezifisch für γh2ax. Die Bestrahlung der Zellen erfolgte dabei entlang zweier sich kreuzender Linien. Abbildung 5.2 (Kapitel 5.1) ist zu entnehmen, dass bei 775 nm bei der Spitzenintensität von 64 GW/cm 2 keine Strangbrüche nachweisbar waren, bei 1050 nm führte eine Bestrahlung mit 1500 GW/cm 2 zu einem deutlichen Signal in der immunozytochemischen Anfärbung von γh2ax. Um die Photoaktivierung bei diesen Leistungspunkten zu vergleichen, wurden PAGFP- H2B exprimierende Zellen der Linie HeLa Kyoto unter den gleichen Bedingungen bestrahlt. Die Verwendung eines immobilen Core-Histons war durch das Zeitintervall von 10 min zwischen Bestrahlung und Fixierung vorgegeben, da während dieser Zeitspanne bei diesem Protein keine Umverteilung auftritt. Die Messungen ermöglichten einen direkten Vergleich der Effizienz von Photoaktivierung und DNA-Schädigung bei den gewählten Bedingungen. In Abbildung 6.1 sind die mit einem Fluoreszenzmikroskop (LSM 510 Meta, Carl Zeiss 71

76 6 Messung der Mobilität von Kernproteinen in Anwesenheit eines DNA-Schadens F l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y ( a. u. ) n m n m P e a k i r r a d i a n c e ( G W / c m ² ) Abbildung 6.2: Fluoreszenzintensität von PAGFP nach Aktivierung mit den Wellenlängen 775 nm und 1050 nm bei unterschiedlichen Laserleistungen. Für die Messungen wurden fixierte Zellen, die das Protein PAGFP-H1.2 exprimieren, innerhalb eines definierten Bereichs bestrahlt. Die anschließende Anregung der Fluoreszenz erfolgte bei der Wellenlänge 488 nm. Da die Effizienz der Aktivierung bei 775 nm höher ist, sind die benötigten Laserleistungen deutlich geringer (Tom12). AG) aufgenommenen Bilder exemplarisch für zwei Zellen gezeigt. Für die gleichen Farbkanäle wurden jeweils gleiche Belichtungs- und Detektoreinstellungen verwendet. Nach Bestrahlung mit 775 nm war eine deutliche Photoaktivierung sichtbar, es konnte aber kein DNA-Schaden nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu führte die Bestrahlung von 1050 nm nicht zu einer messbaren Photoaktivierung, jedoch zu einem γh2ax-spezifischen Signal. Durch die Verwendung von empfindlicheren Detektoreinstellungen für die Messung der Fluoreszenzintensität nach der Photoaktivierung konnte jedoch gezeigt werden, dass auch die Bestrahlung mit 1050 nm zu einer geringen Photoaktivierung führt. Um die Effizienz der Photoaktivierung bei beiden Wellenlängen besser vergleichen zu können, wurde die Fluoreszenzintensität nach der Photoaktivierung in fixierten, PAGFP-H1.2 exprimierenden Zellen der Linie HeLa Kyoto mit unterschiedlichen Laserleistungen gemessen. Die vorhergehende Fixierung verhinderte eine Bewegung des Proteins nach der Photoaktivierung. Ein Bereich der Größe 6 6 µm innerhalb des Zellkerns wurde bei beiden Wellenlängen mit vier unterschiedlichen Leistungen bestrahlt und anschließend die Fluoreszenzintensität des 72

77 6.1 Messung der Leistungsabhängigkeit von Photoaktivierung und DNA-Schadensinduktion erzeugten Signals gemessen. Die Anregung des aktivierten PAGFPs erfolgte durch einen Ar + -Ionen Laser mit einer Wellenlänge von 488 nm, dessen Leistung bei allen Messungen konstant war. Die Detektoreinstellungen wurden so gewählt, dass sie einen möglichst großen dynamischen Bereich bei der Intensitätmessung abdeckten. Diese Einstellungen waren ebenfalls für alle Messungen konstant. Für jeden Leistungswert wurde die mittlere Intensität innerhalb des bestrahlten Bereichs gemessen. Abbildung 6.2 zeigt die Ergebnisse dieser Messungen. Aufgetragen ist die Fluoreszenzintensität gegenüber der Spitzenintensität der Femtosekunden-Impulse in doppelt-logarithmischer Darstellung. Die Punkte sind Mittelwerte aus mindestens 10 bestrahlten Zellen, die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler. Die angepassten Geraden haben eine Steigung von 1,8 ± 0,4 bei 775 nm und 1,9 ± 0,8 bei 1050 nm. Es handelt sich also in beiden Fällen um eine Zwei-Photonen-Aktivierung. Da für die Messungen der Fluoreszenzintensität nach der Photoaktivierung mit beiden Wellenlängen die gleichen Aufnahmeparameter verwendet wurden, ist ein direkter Vergleich der Effizienz der beiden Aktivierungswellenlängen möglich. Die Messungen zeigen, dass es auch bei 1050 nm möglich ist, über eine Zwei-Photonen-Anregung PAGFP zu aktivieren. Die verwendeten Spitzenintensitäten liegen jedoch um mehr als drei Größenordnung über den Werten, die bei 775 nm für eine vergleichbare Fluoreszenzintensität benötigt werden. Bei der Leistungsabhängigkeit der Photoaktivierung bei 1050 nm fällt auf, dass die Fluoreszenzintensität des höchsten verwendeten Leistungswertes deutlich vom Verlauf der anderen Messpunkte abweicht. Der Kurvenverlauf suggeriert eine Art Sättigungseffekt. Dies wurde in einer weiteren Messung genauer untersucht. Das Experiment verlief analog zu den bereits beschriebenen, jedoch wurde in diesem Fall der dynamische Bereich des Detektors nicht für beide Wellenlängen optimiert, sondern für die viel niedrigeren Intensitäten angepasst, die nach einer Photoaktivierung mit 1050 nm auftreten. In Abbildung 6.3 sind die Ergebnisse dieser Messung ebenfalls in doppelt-logarithmischer Darstellung gezeigt. An die niedrigsten drei Messwerte ist eine Gerade mit der Steigung 2,5±1,2 angepasst. Die eingezeichneten Fehlerbalken zeigen den Standardfehler. Es ist zu sehen, dass oberhalb einer Bestrahlungsleistung von etwa 1000 GW/cm 2 die Intensität nach der Photoaktivierung mit steigender Laserleistung nicht weiter zunimmt. Ein Vergleich mit der in Abbildung 5.2 gezeigten Leistungsabhängigkeit der Strangbrüche zeigt, dass hier auch ein γ-h2ax-signal auftritt. Es ist anzunehmen, dass bei diesen Leistungen 73

78 6 Messung der Mobilität von Kernproteinen in Anwesenheit eines DNA-Schadens F l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y ( a. u. ) P e a k i r r a d i a n c e ( G W / c m ² ) Abbildung 6.3: Fluoreszenzintensität von PAGFP nach Aktivierung mit der Wellenlänge 1050 nm bei unterschiedlichen Laserleistungen. Für die Messungen wurden fixierte Zellen, die das Protein PAGFP-H1.2 exprimieren, innerhalb eines definierten Bereichs bestrahlt. Die anschließende Anregung der Fluoreszenz erfolgte bei der Wellenlänge 488 nm. Oberhalb von etwa 1000 GW/cm 2 steigt die Intensität nach der Aktivierung nicht weiter an. Ein Vergleich mit Abbildung 5.2 zeigt, dass in diesem Leistungsbereich auch DNA-Schäden induziert werden. nicht nur DNA geschädigt wird, sondern auch PAGFP-Moleküle zerstört werden. Diese können dann nicht mehr aktiviert werden, wodurch sich der beobachtete Sättigungseffekt erklären ließe. 6.2 Kombination von nichtlinearer DNA-Schädigung und Photoaktivierung Bei der Reparatur von DNA-Schäden kommt es sowohl zu einer Akkumulation unterschiedlicher Proteine an der Schadensstelle, als auch zu einer Auflockerung der Struktur des Chromatins. Erkenntnisse über den Zusammenhang zwischen der Aktivität von Reparaturproteinen und der Chromatinumorganisation sind von zentraler Bedeutung für das Verständnis der DNA-Reparaturmechanismen. Ein Ansatz, die Funktion einzelner Proteine bei der Reparatur zu untersuchen, beruht in der Messung von Änderungen im Bindungsverhalten. DNA-Reparaturproteine sollten eine erhöhte Verweildauer an der Schadensstelle haben, Chromatinarchitekturproteine können eine veränderte Bindung aufweisen. Eine Messung der Mobilität der Proteine in 74

79 6.2 Kombination von nichtlinearer DNA-Schädigung und Photoaktivierung 1050 nm DNA damage t 775 nm photoactivation 488 nm fluorescence imaging time x=0 2 x 0 2 H2AX PA-GFP-H1.2 0 s 10 s 20 s Abbildung 6.4: Schematische Darstellung des Messverfahrens zur Analyse von Proteinmobilitäten in Anwesenheit von DNA-Schäden. Nach der Schädigung in einem definierten Bereich des Zellkerns mit Femtosekunden-Impulsen der Wellenlänge 1050 nm erfolgt die Mobilitätsmessung durch Zwei-Photonen-Photoaktivierung von PAGFP-Fusionsproteinen bei 775 nm. Die anschließende Intensitätsabnahme durch die Umverteilung des Proteins wird durch Fluoreszenzanregung bei der Wellenlänge 488 nm beobachtet. Da das Zeitintervall t zwischen Schädigung und Photoaktivierung beliebig gewählt werden kann, ist eine Messung der Zeitabhängigkeit von schadensinduzierten Mobilitätsänderungen möglich. Zudem kann die Photoaktivierung innerhalb oder außerhalb des Schadensbereiches gesetzt werden ( x). Für das Linker-Histon H1.2 sind exemplarisch fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Photoaktivierung gezeigt. Die Länge des eingezeichneten Maßstabs beträgt 5 µm (Tom12). Anwesenheit von DNA-Schäden ermöglicht Rückschlüsse auf das Bindungsverhalten und liefert somit Informationen über die Funktion dieser Proteine. Mit der in dieser Arbeit entwickelten Messmethode ist es möglich, den Einfluss eines DNA-Schadens auf die Mobilität von Proteinen zu untersuchen. Das Grundprinzip des Verfahrens ist in Abbildung 6.4 gezeigt. In einem ersten Schritt wird die Zelle in einem subnukleären Bereich mit Femtosekunden- Impulsen der Wellenlänge 1050 nm geschädigt. Bei den in den folgenden Kapiteln vor- 75