Praktikum Spezielle Bakteriologie

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1 Studiengang Biologie Praktikum Spezielle Bakteriologie Dresden, April 2013 Sandro Wolf

2 INHALT Kursinhalte... 1 Ziel und Ablauf des Kurses... 1 Inhalt erste kurswoche... 2 Inhalt zweite kurswoche... 3 Arbeitsanleitungen... 3 Aufgabe A - Identifizierung von auf Agarplatten wachsenden Bakterien Fraktionierter Ausstrich Auswertung der fraktionierten Ausstriche, Durchführung biochemischer Tests Differenzierung gram-negativer Stäbchen mit Hilfe von api-systemen... 5 Aufgabe B - Differenzierung von Bakterien aus einer Suspension Quantitative Analyse Qualitative Analyse... 6 Aufgabe S - Identifizierung einer Bakterienart auf Schrägagar... 7 Kauffmann - White - Schema... 8 zur serologischen Differenzierung von Salmonellen (Auszug)... 8 Aufgabe L - Differenzierung von Keimen aus der Luft Erfassung der Keime in der Luft mit Hilfe des Sedimentationsverfahrens Differenzierung von Bakterien aus der Luft von Sedimentationsplatten... 9 Aufgabe PCR A- Nachweis von Sulfatreduzierern mittels spezifischer PCR DNA-Extraktion Herstellung des Mastermixes PCR Gelektrophorese und Visualisierung B - Genetische Identifizierung ausgesuchter Isolate mittels Sequenzierung von PCR-Fragmenten. 13 DNA-Extraktion Herstellung des Mastermixes PCR Gelektrophorese und Visualisierung Aufreinigen des PCR-Produktes Nachweis und Quantifizierung von E. coli/coliformen Begriffsbestimmung: Quantifizierung von E. coli nach dem MPN-Verfahren... 15

3 Aufgabenstellung Vorgehensweise Auswertung Aufgabe H - Identifizierung von Mikroorganismen mittels CARD-FISH Theoretischer Teil Aufgabenstellungen... Fehler! Textmarke nicht definiert. Durchführung... Fehler! Textmarke nicht definiert. Verwendete Reagenzien/Geräte:... Fehler! Textmarke nicht definiert. Probenvorbereitung (bereits durchgeführt):... Fehler! Textmarke nicht definiert. Hybridisierung und CARD Signalamplifikation (von den Kursteilnehmern durchzuführen):. Fehler! Textmarke nicht definiert. Anhang: Tabellen zur bakterienidetifizierung Tabelle 1 - Koloniemorphologie Tabelle 2 - Überblick Bakteriendifferenzierung Tabelle 3 - Differenzierung gramnegativer Stäbchen Tabelle 4 - Differenzierung grampositiver Kokken Tabelle 5 - Differenzierung grampositiver Stäbchen Tabelle 6a - Übersicht zum Wachstum ausgewählter Gram-Negativer Keime auf Nährmedien Tabelle 6b - Wachstum ausgewählter Gram-Positiver Keime auf den verwendeten Nährmedien.. 34 ii Praktikum Spezielle Bakteriologie / Mikrobentaxonomie 2013

4 KURSINHALTE Identifizierung von 3 Bakterienarten auf einer Agarplatte (A) Identifizierung von 2 Bakterienarten in einer Bouillon (B) Identifizierung einer Bakterienart auf Schrägagar (S) Differenzierung von Keimen aus der Luft (L) Identifizierung von Isolaten mittels PCR/Sequenzierung (PCR A/B) Identifizierung von Mikroorganismen mittels in situ Hybridisierung mit rrna-gerichteten Oligonukleotidsonden (CARD-FISH-Technik) (H) Demonstration ausgewählter Mikroorganismengruppen: Mycoplasmen ZIEL UND ABLAUF DES KURSES Im Kurs werden Bakterien von verschiedenen Medien bzw. aus verschiedenen Umweltproben isoliert, differenziert und identifiziert. Dabei werden von den Kursteilnehmern grundlegende Arbeitstechniken, die aus dem Grundkurs Mikrobiologie bekannt sind, selbstständig angewendet sowie verschiedene Testverfahren zur Identifizierung von Bakterien kennen gelernt. Weiterhin wird die in situ Hybridisierung mit rrna-gerichteten Oligonukleotidsonden als kultivierungsunabhängiges Verfahren der Analyse von mikrobiellen Gemeinschaften in Umweltproben durchgeführt. Ergänzend werden einige ausgewählte Mikroorganismengruppen von Mitarbeitern des Instituts für Medizinische Mikrobiologie vorgestellt. Neben dem Anfertigen eines Protokolls wird von jedem Kursteilnehmer ein Kurzvortrag zu kursrelevanten Keimen (Themen werden ausgegeben) und das Bestehen eines kurzen Abschlusstestats (ca. 30 Minuten, schriftlich) erwartet. In der folgenden Tabelle ist der zeitliche Ablauf des Kurses charakterisiert, wobei dieser in großem Maße von der erfolgreichen Kultivierung abhängt und demzufolge entsprechend der Testergebnisse variieren kann. 1 Praktikum Spezielle Bakteriologie / Mikrobentaxonomie 2011

5 INHALT ERSTE KURSWOCHE Tag Aufgabe A Aufgabe B Aufgabe S Aufgabe L Aufgabe PCR Sonstiges Agarplatte Bouillon Schrägagar Luftplatte Mo Kolonien 4 DS Gramtest, fraktioniert Quantifiz. (KbE), makroskop. mikrosk. PCR A: Nukleins.- überimpfen Ausstrich charakteris., extraktion abimpfen Di 2 DS Kontrolle auf Reinkultur, Auswertung KbE, Differenz. wie Aufg. A Kontrolle sonst weiter am Mittwoch PCR A: Ansatz PCR (läuft über Nacht) Mi 3 DS Biochem. Tests, api-system Gramtest, fraktioniert überimpfen Kontrolle auf Reink., Biochem. Tests Biochem. Tests, api- System Gelektrophorese und Detektion Do 2 DS auswerten od. fortsetzen auswerten od. fortsetzen Biochem. Tests, api-system Biochem. Tests, ggf. api- System PCR B: Ansatz PCR (läuft über Nacht) Quantifizierung von E.coli und Coliformen mittels Colilert Fr PCR B: 4 DS Auswertung Protokoll Auswertung Protokoll Auswertung Serologie testen Auswertung oder fortsetzen Gelelektrophorese und Aufreinigung. Abschicken der Proben an GATC Auswertung Colilert; Demonstration Mycoplasmen 2 Praktikum Spezielle Bakteriologie / Mikrobentaxonomie 2011

6 INHALT ZWEITE KURSWOCHE Mo 4 DS Di 2 DS Einführung und Durchführung der in situ Hybridisierung mit rrna-gerichteten Oligonukleotidsonden (CARD-FISH) 13:00-16:20 Uhr CARD-FISH-Auswertung (3 Gruppen) Biochem. Test, ggf. api-system Auswertung zur Aufgabe A, B, S, L Mi 3 DS Do 2 DS Fr 11:10 Uhr-16:20 Uhr Gemeinsame Auswertung Aufgabe PCR B (bis Mittag) CARD-FISH-Auswertung (3 Gruppen) 13:00-16:20 Uhr CARD-FISH-Auswertung (2 Gruppen) Vorträge; Testat 4 DS ARBEITSANLEITUNGEN Im Folgenden wird die Vorgehensweise bei der Bearbeitung der verschiedenen Aufgaben beschrieben. Hinsichtlich der Zusammensetzung und Wirkungsweise der verschiedenen Nährmedien sowie der zu erwartenden Koloniemorphologie sei auf den Grundkurs bzw. ausliegende Nährmedien-Handbücher verwiesen! Auch die Anleitungen zur Durchführung verschiedener biochemischer Tests ist dem Arbeitsmaterial zum Grundkurs zu entnehmen. Differenzierungsschemata bzw. Anleitungen für das Arbeiten mit den api-systemen sind im Anhang aufgeführt. 3 Praktikum Spezielle Bakteriologie / Mikrobentaxonomie 2011

7 AUFGABE A - IDENTIFIZIERUNG VON AUF AGARPLATTEN WACHSENDEN BAKTERIEN Auf einer Agarplatte liegt eine Mischkultur von drei Bakterienarten vor. Voraussetzung für deren Identifizierung ist die Erzielung von Reinkulturen. Dafür müssen einzeln liegende Kolonien, je nach mikroskopischem Erscheinungsbild, auf verschiedene Selektiv-Nährböden abgeimpft werden. Überprüfen Sie das GRAM-Verhalten neben der GRAM-Färbung noch zusätzlich mit alternativen Schnelltests, wie z.b. KOH-Test und/oder L-Aminopeptidase-Test. 1. FRAKTIONIERTER AUSSTRICH Kokken: Gram-positive Stäbchen: Blut-Agar, Äsculin-Agar, TTC-Azid-Agar, Baird-Parker Agar Nähragar und MOSSEL-Agar Gram-negative Stäbchen: Nähragar, ENDO-Agar, MACCONKEY-Agar, LEIFSON-Agar und Cetrimid-Agar Bebrütung 24h bei 30 C (Kokken bei 37 C) 2. A USWERTUNG DER FRAKTIONIERTEN A USSTRICHE, DURCHFÜHRUNG BIOCHEMISCHER T ESTS Zur Kontrolle der Reinheit Tests zur Gram-Differenzierung durchführen (Mikroskopieren!) Mischkulturen: nochmals gezielt fraktioniert auf (Selektiv-) Nährmedien abimpfen Reinkulturen: biochemische Leistung prüfen, z.b. Oxidase-Test, IMVoC- Reaktionen, Harnstoffspaltung, OF-Test nach Hugh-Leifson, Wachstum auf Kligler-Schrägagar, Katalase-Test, Plasmakoagulase, Wachstum bei ph 9,6 und 6,5% NaCl (i.d.r. bei 37 C bebrüten!) Siehe Differenzierungstabellen im Anhang! für Pseudomonas-verdächtige Kolonien (Wachstum auf Cetrimid-Agar) Farbstoffnachweis durchführen: Platte unter UV-Licht betrachten Fluoreszenz weist auf den Farbstoff Fluorescein hin. Chloroformausschüttellung zur Pigmenttrennung 4 Praktikum Spezielle Bakteriologie / Mikrobentaxonomie 2013

8 Beimpfen des Teststammes in Nährbouillon; Bebrütung bei Raumtemperatur im Licht (Fensterbrett) Bei Trübung und sichtbarer Grünfärbung (nach mind. 1 Tag) 2 ml Chloroform zugeben (unter dem Abzug arbeiten) Testansatz wiederholt gut vortexen und nachfolgend ca. 3 h stehen lassen (Fensterbrett) Trennung der Farbpigmente: Pyocyanin: bläulich; löslich in Chloroform und Wasser Fluorescein: gelblich fluoreszierend; wasserlöslich Selten treten auch noch der braunschwarze Farbstoff Pyomelanin und der rote Farbsstoff Pyrubin auf. Beide Farbstoffe sind ebenfalls wasserlöslich. 3. DIFFERENZIERUNG GRAM-NEGATIVER STÄBCHEN MIT HILFE VON API-SYSTEMEN Standardisierte Testsysteme wie die api-systeme der Firma api biomerieux basieren auf physiologischen Tests, die in miniaturisierten Reaktionsgefäßen (hier: Streifen mit Kunststoffbechern) durchgeführt werden. Die Teststreifen werden mit der Suspension einer (von einem Selektivnährboden stammenden) Einzelkolonie entsprechend der jeweiligen Gebrauchsanleitung beimpft. Wichtigste Voraussetzung dafür ist das Vorliegen einer Reinkultur. Durch gleichzeitiges Ausstreichen auf einem Selektivnährboden wird die Reinheit der Kolonie überprüft und dafür Sorge getragen, dass das Untersuchungsmaterial aufbewahrt bleibt. Folgende Teststreifen zur Differenzierung Gram-negativer Stäbchen stehen zur Verfügung: api-20-e für Enterobacteriaceae, Anwendung wenn Oxidase-Test negativ und Glucose fermentativ verwertet wird (Ausschluss von Acinetobacter sp.) api-20-ne für sog. Nonfermenter, Anwendung wenn Oxidase-Test positiv und/ oder Glucose nicht fermentativ verwertet werden kann Die Teststreifen werden 24h (48h) inkubiert und danach die Reaktionen entsprechend dem beiliegenden Schema ausgewertet. Mit Hilfe des dabei erhaltenen numerischen Codes erfolgt die Identifizierung mit Hilfe des Profilindex. 5 Praktikum Spezielle Bakteriologie / Mikrobentaxonomie 2013

9 AUFGABE B - DIFFERENZIERUNG VON BAKTERIEN AUS EINER SUSPENSION In einer Nährbouillon liegt ein Gemisch von zwei Bakterienarten vor. Der Bakteriengehalt dieser Suspension ist quantitativ (Koloniebildende Einheiten-KbE pro ml) zu bestimmen und die darin enthaltenen Bakterienspezies zu differenzieren (qualitative Analyse). Für die Differenzierung ist wiederum das Vorliegen von Reinkulturen Voraussetzung. 1. QUANTITATIVE ANALYSE Die Bouillon (B) wird mit PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) von 10-1 bis 10-6 verdünnt [0,5 ml Bouillon (B) 4,5 ml PBS = 1 : 10 = 10-1 ; weiter verdünnen durch Überpipettieren]. Von 10-4, 10-5 und 10-6 werden je 0,1 ml auf eine Nähragarplatte ausgespatelt. Bebrütung 24h bei 37 C Auszählung einer geeigneten Verdünnungsstufe (Koloniezahlen zwischen 20 und 300) und Berechnung der KbE je ml Bouillon 2. QUALITATIVE ANALYSE Zur Differenzierung der in der unverdünnten Bouillon enthaltenen Bakterien wird diese auf folgenden (Selektiv-)Nährböden fraktioniert ausgestrichen: Nähragar / Blut-Agar / ENDO-Agar / MacConkey-Agar / LEIFSON-Agar / TTC-Azid-Agar / Äsculin-Agar / Baird Parker-Agar Bebrütung 24h bei 37 C Zur Kontrolle der Reinheit und zur Planung der weiteren Vorgehensweise werden von den fraktionierten Ausstrichen Gram-Präparate angefertigt (bzw. weitere Tests zur Gram- Differenzierung durchgeführt). Die weitere Vorgehensweise entspricht der für die Probe A dargelegten, siehe daher Aufgabe A-2 und A-3. 6 Praktikum Spezielle Bakteriologie / Mikrobentaxonomie 2013

10 AUFGABE S - IDENTIFIZIERUNG EINER BAKTERIENART AUF SCHRÄGAGAR Es ist eine auf Schrägagar gewachsene Reinkultur zu identifizieren. Nach Durchführung der Tests zur Gram-Differenzierung werden folgende Nährmedien fraktioniert beimpft: Gram-negative Stäbchen auf Nähragar, ENDO-Agar und LEIFSON-Agar abimpfen Sollten die Gram-Tests zu anderen Ergebnissen führen, siehe Aufgabe A bzw. Kursassistenten konsultieren! Bebrütung 24h bei 37 C, weitere biochemischen Differenzierung (inkl. Oxidase-Test), ggf. api-20e-streifen beimpfen (wenn Oxidase neagtiv) Bebrütung 24 h bei 37 C, Auswertung siehe A-3 bzw. Anhang bei Salmonella verdächtigen Stämmen serologische Differenzierung entsprechend dem Kauffmann-White-Schema durchführen: angewendet werden zwei polyspezifische Antiseren (Antisalmonella I und II), auf einem Objektträger nebeneinander einen Tropfen Antiserum und einen Tropfen physiol. Kochsalzlösung (Negativkontrolle) geben, den nachzuweisende Stamm in beiden Tropfen suspendieren bis eine homogene, leicht milchig trübe Suspension entstanden ist, den Objektträger nachfolgende mehrfach leicht schwenken, Die Reaktion muss positiv gewertet werden, wenn innerhalb von ca. 2 min eine sichtbare Agglutination (Flockenbildung) im Ansatz mit dem Testreagenz sichtbar wird (gegen einen dunklen Hintergrund prüfen). Im negativen Fall bleibt die Suspension gleichmäßig trüb. Im Zweifelsfall muss das Ergebnis bei schwacher Vergrößerung mit dem Mikroskop ausgewertet werden. Antisalmonella I agglutiniert Salmonellen der Gruppe A-E, Antisalmonella II agglutiniert Salmonellen der Gruppe F-67 Hinweis: Bei einer positiven Reaktion der Kolonien könnte eine weitergehende Typisierung mit gruppen- und monospezifischen Testseren entsprechend dem Kauffmann-White-Schema durchgeführt werden. Dies ist im Kurs jedoch nicht vorgesehen. 7 Praktikum Spezielle Bakteriologie / Mikrobentaxonomie 2013

11 KAUFFMANN - WHITE - SCHEMA ZUR SEROLOGISCHEN DIFFERENZIERUNG VON SALMONELLEN (AUSZUG) Serogruppe Serotyp O-Antigene H-Antigene (Serovar) Phase 1 Phase 2 A S. paratyphi A 1, 2, 12 a - B S. paratyphi B S. typhimurium 1, 4, 5, 12 1, 4, 5, 12 b i 1, 2 1, 2 C S. paratyphi C 6, 7 c 1, 5 D S. typhi S. enteritidis 9, 12 1, 9, 12 d g m - - E S. anatum 3, 10 e h 1, 6 Nähere Informationen zur serologischen Differenzierung der Salmonellen werden in der Praktikumseinführung vermittelt. 8 Praktikum Spezielle Bakteriologie / Mikrobentaxonomie 2013

12 AUFGABE L - DIFFERENZIERUNG VON KEIMEN AUS DER LUFT 1. ERFASSUNG DER KEIME IN DER LUFT MIT HILFE DES SEDIMENTATIONSVERFAHRENS Im Vorfeld des Praktikums wurden an unterschiedlichen Standorten (Liste liegt aus) jeweils zwei Nähragarplatten mit geöffnetem Deckel 60 Minuten exponiert. Nach Schließen des Deckels wurden die Petrischalen zwei Tage bei 22 C bzw. 37 C bebrütet. Die nach zwei Tagen angewachsenen Bakterienkolonien sollen gezählt (quantitative Analyse) und charakterisiert werden (s. nächsten Abschnitt). 2. DIFFERENZIERUNG VON BAKTERIEN AUS DER LUFT VON SEDIMENTATIONSPLATTEN Jeder Kursteilnehmer sollte von einer der beiden Sedimentationsplatten ca. 5 verschiedene (Bakterien-)Kolonien charakterisieren und auf eine Nähragarplatte abimpfen (Bebrütung bei der Temperatur, bei der die jeweilige Kolonie gewachsen war). Charakterisierung der Bakterienkolonien nach folgenden Merkmalen: Koloniefarbe Kolonierand Kolonieprofil Kolonieoberfläche Konsistenz Größe Geruch Siehe dazu die Hinweise zur Beschreibung der Makromorphologie von Bakterienkolonien im Anhang. 1. Von den ausgewählten Kolonien Gram-Eigenschaften feststellen und die Mikromorphologie der Bakterien beschreiben (z.b. Form, Größe, Sporen, Säurefestigkeit) 2. Nach ein- bis zweitägiger Inkubation der von den Sedimentationsplatten abgeimpften Bakterien: Tests zur Gramdifferenzierung durchführen (Reinheit überprüfen) Überimpfung auf Selektivnährmedien (entsprechend Aufgabe A-1) 9 Praktikum Spezielle Bakteriologie / Mikrobentaxonomie 2013

13 Von den Reinkulturen einige biochemische Eigenschaften prüfen, z.b. - Oxidase, Katalase - IMVOC-Reaktionen - Urease-Test (Harnstoffabbau) - O/F-Test Eine weitere Differenzierung kann entsprechend der bei der Aufgabe A-2 und A-3 dargelegten Vorgehensweise versucht werden. Weiterhin können ein Isolate durch PCR/Sequenzierung näher charakterisiert werden (siehe Aufgabe PCR B) 10 Praktikum Spezielle Bakteriologie / Mikrobentaxonomie 2013

14 AUFGABE PCR A- NACHWEIS VON SULFATREDUZIERERN MITTELS SPEZIFISCHER PCR Die Reduktion oxidierter Schwefelverbindungen (Sulfat, Sulfid, Schwefelwasserstoff) durch sogenannte Desulfurizierer stellt ein wichtiges Element im Schwefelkreislauf dar. Bakterien die zu dieser biochemischen Leistung befähigt sind nutzen verschiedene organische Stoffe und Wasserstoff (meist organische Stoffe die im fermentativen Abbau von organischen Stoffen durch fermentative Bakterien entstehen und von diesen ausgeschieden werden) als Reduktionsmittel und übertragen die Elektronen verschiedene oxidierte Schwefelverbindungen. Diese Redoxreaktionen sind exergon und dienen diesen Mikroorgansimen als Energiequelle. Zu Ökologie und Bedeutung von Desulfurikanten sei auf die Vorlesung Mikrobentaxonomie verwiesen. Eine kurze Einführung wird zusätzlich im Kurs gegeben. Die PCR ist eine molekularbiologische Methode zur Amplifikation spezifischer Genabschnitte. Das PCR-Produkt kann anschließend elektrophoretisch aufgetrennt und mittels verschiedener DNA-Farbstoffe (z.b. Ethidiumbromid oder SYBR-Safe) unter UV-Licht (oder anderen spezifischen Wellenlängen) visualisiert werden. Zum Nachweis von Desulfurikanten mittels PCR existieren verschiedene Primersysteme. Im Kurs wird ein Primersystem verwendet, das spezifisch an hochkonservierte Bereiche des dsra-gens, welches die dissimilatorische Sulfatreduktase (das Schlüsselenzym der Dissimilatorischen Sulfatreduktion) kodiert, bindet. Die Primer amplifizieren ein 514 bp langes Fragment. Für den Kurs stehen Ihnen pro Gruppe (je 2 Studenten) 2 Sedimentproben zur Verfügung (Probe A und Probe B). Eine der Proben wurde im Vorfeld mit PCR positiv auf Sulfatreduzierer getestet. Ihre Aufgabe ist es diese Probe zu identifizieren. Probe C (Wasser) wird als Negativkontrolle genutzt. Weiterhin ist es ratsam, Verdünnungsstufen (z.b. 1:10) der extrahierten Proben-DNA in der PCR mit zu untersuchen, um mögliche inhibitorische Effekte der Probenmatrix auf die PCR zu überprüfen und das Risiko falsch-negativer Befunde zu minimieren. 11 Praktikum Spezielle Bakteriologie / Mikrobentaxonomie 2013

15 DNA-EXTRAKTION Die DNA Isolierung erfolgt mittels des PowerSoil DNA Isolation Kit (Mo BIO Laboratories, Inc). Kopien des Nutzerhandbuches werden für jede Gruppe bereitgestellt. HERSTELLUNG DES MASTERMIXES Nutzen Sie folgendes Schema für die Herstellung Ihres Mastermixes für jeweils 2xProben- DNA, 2xProben-DNA 1:10, 1xPositivkontrolle, 1xNegativkontrollen 1 extra für Pipettierfehler: Reagens Endkonzentration Vol. / 25 µl PCR-Reaktion [µl] Gesamt Vol. Mastermix [µl] GoTaq Green Mix (2.5x) 1x 12.5 SH1 vorwärts Primer (10 µm) 0.4 µm 1 SH2 rückwärts Primer (10 µm) 0.4 µm 1 RNase freies Wasser 9.5 Gesamt Mastermix Volumen 24 NB : 1 µl DNA (oder Wasser) zu 24 µl aliquotiertem Mastermix PCR PCR Aktivierung/Template Denaturierung: 95 C, 3 min PCR: 40 x (94 C - 30s, 62 C - 30s, 72 C - 45s ), 72 C, 3 min GELEKTROPHORESE UND VISUALISIERUNG Legen Sie auf einem Stück Parafilm 1-2 µl 6xLadepuffer pro Probe, sowie für die DNA Leiter vor. Geben Sie auf den Ladepuffer 8 µl PCR Produkt bzw. 1,5 µl DNA Leiter und mischen Sie Ladepuffer und PCR Produkt (bzw. DNA Leiter) mit der Pipette. Geben Sie diese Mischung jeweils in eine Tasche eines bereitgestellten Agarosegels (2% Agarose wt/vol) in einer Elektrophoresekammer mit TAE-Puffer. Lassen Sie das Gel für 45 min bei 110 V laufen. Visualisieren Sie das Gel entsprechend den Anweisungen des Kursbetreuers. Die Sulfatreduzierer-spezifische PCR amplifiziert ein ~510 bp langes Fragment. 12 Praktikum Spezielle Bakteriologie / Mikrobentaxonomie 2013

16 B - GENETISCHE IDENTIFIZIERUNG AUSGESUCHTER ISOLATE MITTELS SEQUENZIERUNG VON PCR-FRAGMENTEN Neben der biochemischen Identifizierung ist der Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen mittels PCR eine alternative/ergänzende Nachweismethode. Zusätzlichen können die gewonnen PCR-Fragmente kloniert und sequenziert (bei erwarteten Mischsequenzen) oder direkt sequenziert werden. Die dadurch gewonnene Nukleinsäuresequenz kann mit entsprechenden Datenbanken abgeglichen werden. Pro Student soll ein vom Studenten ausgesuchtes Isolat mittels PCR/Sequenzierung näher charakterisiert werden. Die verwendeten Primer binden spezifisch an alle Bacteria (früher Eubakterien ) und generieren ein ca. 1,5 kb langes Amplikon. Die PCR-Produkte werden aufgereinigt und an die Firma GATC (Konstanz) zum Sequenzieren (Sanger-Sequenzierung) gesandt. DNA-EXTRAKTION Eine Alternative zu relativ teuren und zeitaufwändigen Extraktionskits wird in diesem Fall die schnelle (jedoch weniger effiziente) Methode des heat-release verwendet. Dazu wird eine kleine Menge Bakterienmaterial bei 95 C für 3-5 min inkubiert. Die Bakterienzellen platzen und ihre Nukleinsäure wird freigesetzt. HERSTELLUNG DES MASTERMIXES Nutzen Sie analog zu den Sulfatreduzierern folgendes Schema für die Herstellung Ihres Mastermixes (jeweils für eine Probe und eine Negativkontrolle 1 extra für Pipettierfehler): Reagens Endkonzentration Vol. / 25 µl PCR-Reaktion [µl] Gesamt Vol. Mastermix [µl] GoTaq Green Mix (2.5x) 1x F Vorwärtsprimer (10 µm) 0.4 µm 1 5 -AGAGTTTGATCCTGGCTGAG 1492r Rückwärtsprimer (10 µm) 0.4 µm 1 5' TACGGYTACCTTGTTACGACTT RNase freies Wasser 10.5 Gesamt Mastermix Volumen 25 NB : Bakterienmaterial (sehr wenig!) 25 µl aliquotiertem Mastermix 13 Praktikum Spezielle Bakteriologie / Mikrobentaxonomie 2013

17 PCR Heat Release/Aktivierung/Template Denaturierung: 95 C, 3 min, gefolgt von (95 C - 30s, 66 C - 45s, 72 C - 1 min, 30s) x 35, finale Extension bei 72 C, 5 min GELEKTROPHORESE UND VISUALISIERUNG Erfolgt analog zur Sulfatreduzierer PCR. Das PCR Produkt ist ca. 1,5 kb groß. A UFREINIGEN UND SEQUENZIERUNG DES PCR-PRODUKTES Es besteht die Möglichkeit ausgwählte PCR-Produkte von interessanten Umweltkeimen sequenzieren zu lassen. Dies erfolgt in Absprache mit dem Kursbetreuer. Die Aufreinigung erfolgt mittels Hi-Yield PCR Clean-up kit entsprechend den Angaben des Herstellers (wird ausgegeben). Aufgereinigte PCR-Produkte werden zusammen mit einem oder mehreren Sequenzierprimern an die Firma GATC zum Sequenzieren gesendet. Die von GATC zugesandten Sequenzdaten stehen in aller Regel am übernächsten Werktag zur Verfügung und werden gemeinsam im Kurs analysiert/editiert und mit den anderen Kursteilnehmern mit Sequenzen aus entsprechenden Datenbanken (NCBI) abgeglichen. 14 Praktikum Spezielle Bakteriologie / Mikrobentaxonomie 2013

18 NACHWEIS UND QUANTIFIZIERUNG VON E. COLI/COLIFORMEN BEGRIFFSBESTIMMUNG: E. coli und coliforme Bakterien gehören zur Familie der Enterobacteriaceae. Es sind gramnegative stäbchenförmige Bakterien, die keine Sporen bilden. Es gibt sowohl bewegliche als auch unbewegliche Vertreter. Physiologisch zeichnen sie sich durch einen aeroben und anaeroben Laktose-Abbau aus. Sie sind Cytochromoxidase-negativ. Mit der nachfolgenden Methode werden sowohl E. coli (direkt) als auch viele unterschiedliche Vertreter der Enterobacteriaceae (Coliforme), z.b. Vertreter der Gattungen Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter u.v.a., nachgewiesen. E.coli/Coliforme werden als Indikatorkeime für das Vorliegen von Verunreinigungen mit Warmblüterfäkalien gewertet. Nach Trinkwasserverordnung dürfen E.coli/Coliforme in 100 ml Trinkwasser nicht nachweisbar sein. QUANTIFIZIERUNG VON E. COLI NACH DEM MPN-VERFAHREN Das Colilert-System basiert auf der Defined Substrate Technology (DST ) zum Nachweis von E.coli und Coliformen in Wasser. Die Nachweis-Reaktionen beruhen auf der Aktivität der Enzyme β-glucuronidase (E.coli) und β-galactosidase (Coliforme). Während der Inkubationszeit verstoffwechseln die coliformen Bakterien mit Hilfe des Enyzms β-galactosidase den im Colilert-Test enthaltenen spezifischen Indikatornährstoff ONPG und bewirken so eine Farbänderung von farblos nach gelb. Bei Anwesenheit von E.coli wird zusätzlich durch die Aktivitität der β-glucuronidase aus dem Substrat Methylumbelliferyl-β-D-glucuronid (MUG) das fluoreszierende 4- Methylumbelliferon freigesetzt. Die Fluoreszenz wird mittels einer UV-Lampe sichtbar gemacht. Die Quantifizierung erfolgt nach dem MPN-Verfahren. AUFGABENSTELLUNG Quantifizieren Sie E. coli/coliforme in einer bereit gestellten Oberflächenwasserprobe mittels Colilert. Setzen Sie hierfür eine Originalprobe und eine 10-1 verdünnte Probe ein. 15 Praktikum Spezielle Bakteriologie / Mikrobentaxonomie 2013

19 VORGEHENSWEISE 100 ml der zu analysierenden Wasserprobe (bzw. Verdünnung) in einen Messzylinder abfüllen Die Wasserprobe in eine sterile 100 oder 250 ml Schott-Flasche geben und den Inhalt des Colilert-Testkits hinzugeben und lösen ( 2 Tropfen Antifoam-Lösung) Die aus Probe und Reagenz bestehende Mischung in ein Quanti Tray 2000 gießen. Dabei ist folgendes zu beachten: - Den oberen Teil des Quanti Trays etwas zusammendrücken - Die Frontlasche von der Seite mit den Vertiefungen abziehen. Dabei darf die Innenseite der Folie oder des Trays nicht berührt werden. - Eingießen der Mischung; Berührung mit Folienlasche vermeiden. - Seitlich 2-3mal an die kleinen Vertiefungen klopfen, um evl. Luftblasen zu entfernen. Den mit Probe gefüllten Quanti Tray auf die Gummi-Trägerunterlage des Versiegelungsgerätes legen. Die Seite mit den Vertiefungen muss dabei nach unten zeigen Verschweißen des Trays/Beschriften Inkubation der Ansätze bei 35 C für 24h AUSWERTUNG Die Ergebnisse anhand der nachstehenden Ergebnisauswerte-Tabelle ablesen Die Anzahl der positiven Vertiefungen zählen (Gelbfärbung und Fluoreszenz): - Prüfung auf Fluoreszenz mit einer 6-Watt, 365 nm UV-Lampe aus einem Abstand von 13 cm in einer dunklen Umgebung - Colilert18 Ergebnisse sind nach 18 Stunden definitiv. die wahrscheinlichste Zahl (MPN; Most Probable Number) anhand der MPN-Tabelle bzw. des MPN Calculators ermitteln. 16 Praktikum Spezielle Bakteriologie / Mikrobentaxonomie 2013

20 TABELLE 1: ERGEBNISAUSWERTUNG DES COLILERT-VERFAHRENS. Erscheinungsbild der Probe keine Gelbfärbung Ergebnis Negativ für Gesamtcoliforme und E. coli Gelbfärbung Gelbfärbung und Fluoreszenz Positiv für Gesamtcoliforme Positiv für E. coli 17 Praktikum Spezielle Bakteriologie / Mikrobentaxonomie 2013

21 AUFGABE H - IDENTIFIZIERUNG VON MIKROORGANISMEN MITTELS CARD-FISH THEORETISCHER TEIL Bei der Untersuchung von Mikroben in der Umwelt bestand lange Zeit das Problem, dass die Bakterien auf Grund fehlender morphologischer Diversität nicht in situ identifiziert werden konnten. Deshalb mussten die Bakterien kultiviert, isoliert (Erzielen von Reinkulturen) und an Hand von physiologischen und biochemischen Tests identifiziert werden. Durch Kultivierung kann das Vorhandensein verschiedener Mikroorganismen in verschiedenen Habitaten nachgewiesen werden, doch die meisten freilebenden Bakterien sind nicht kultivierbar (<1-15%). Weiterhin ist mit einer erheblichen Populationsverschiebung mit selektiver Begünstigung leicht kultivierbarer Arten zu rechnen. Um die wirkliche Populationsstruktur zu erfassen, empfiehlt sich eine direkte Erkennung und Identifizierung in situ. Dafür können markierte Antikörper oder Oligonukleotidsonden eingesetzt werden. Voraussetzung für den Einsatz phylogenetischer Oligonukleotidsonden ist die Kenntnis der Sequenz der ribosomalen RNA (16S bzw. 23S). Die rrna stellt aus den folgenden Gründen ein ideales Zielmolekül für die in situ Identifizierung dar: die rrna ist ubiquitär in lebenden Zellen verbreitet (Proteinsynthese!) Die Sequenzen der 16S und 23S rrna bilden die Grundlage zur phylogenetischen Taxonomie Es gibt sowohl hoch konservative als auch sehr variable Regionen in den Sequenzen der 16S und der 23S rrna. Somit lässt sich die Spezifität der Oligonukleotidsonden variieren. Die rrna liegt in hoher Kopienzahl in den Zellen vor (zwischen und Kopien), wodurch eine ausreichende Signalstärke der Fluoreszenz erreichbar ist. Die rrna ist als Zielmolekül für die Oligonukleotidsonden gut zugänglich. Um die Zellwand der Mikroorganismen für die Oligonukleotidsonden durchlässig zu machen, werden die Zellen abhängig von ihren Gram-Verhalten fixiert (siehe auch Versuchsablauf). 18 Praktikum Spezielle Bakteriologie / Mikrobentaxonomie 2013

22 Durch die Fixierung der Zellen wird die Tertiärstruktur der Ribosomen nicht vollständig denaturiert. Deshalb müssen Zielregionen auf der rrna, die bei isolierter rrna (vgl. Dot-Blot) gut zugänglich sind, sich nicht auch zwingend für die in situ Hybridisierung eignen. Durch Vorversuche können geeignete die Regionen, die durch Oligonukleotidsonden hybridisiert werden können, identifiziert werden. BACTERIA EUKARYA Proteo - bakterien Cyanobakterien Flavobakterien Gram-positive Bakterien grüne Schwefelfreie- Bakterien Ciliaten Pilze Tiere Pflanzen Flagellaten Thermotoga Microsporidia extrem halophile Methanogene extrem thermophile ARCHAEA ABBILDUNG 1: PHYLOGENETISCHER STAMMBAUM DER DREI DOMÄNEN DES LEBENS AUF GRUNDLAGE DER RIBOSOMALEN RNA. 19 Praktikum Spezielle Bakteriologie / Mikrobentaxonomie 2013

23 ABBILDUNG 2: PHYLOGENETISCHER STAMMBAUM DER BACTERIA AUF GRUNDLAGE DER RIBOSOMALEN RNA Als Gensonden werden Oligonukleotide bezeichnet, mit deren Hilfe bestimmte genetische Informationen detektiert werden können. Taxonomische Sonden werden auf der Grundlage von rrna-sequenzen, die die Basis der taxonomischen Einordnung von Bakterien unter phylogenetischen Gesichtspunkten darstellen (siehe Abbildung 1 und 2), konstruiert. Dafür werden zunächst alle verfügbaren Sequenzen einer Organismengruppe im Hinblick auf identische Sequenzabschnitte und mögliche Unterschiede zwischen nahe verwandten Arten untersucht. Im nächsten Schritt muss die mögliche Zielsequenz mit den homologen Sequenzen aller verfügbaren rrna-sequenzen verglichen werden (Datenbanken). Die Sequenz der Zielregion muss bei allen Mitgliedern der spezifischen Gruppe gleich und verschieden von allen anderen Organismen sein. 20 Praktikum Spezielle Bakteriologie / Mikrobentaxonomie 2013

24 Die Gensonden können an ihren Enden unterschiedlich markiert werden, z.b. mit: Radioaktiv markierten Elementen: 32 P, 3 H, 35 S, 125 I Fluoreszenzfarbstoffe: Fluorescein und Tetramethylrhodamin, Nitrobenzofuran, Cy3, Cy5 Enzymen: alkalische Phosphatase, Mikroperoxidase mit Nachweis durch Chemilumineszenz. Als Hybridisierung wird die Reassoziation von DNA- oder RNA-Einzelsträngen zu DNA-DNAoder DNA-RNA Doppelsträngen bezeichnet. Eine bedeutende Größe für die Stabilität der Doppelstränge ist der Schmelzpunkt T m. Er ist definiert als der Punkt, bei dem die Hälfte der Doppelstrang-Struktur als Einzelstränge vorliegt. T m ist abhängig von: der Ionenstärke; Tm [in C] steigt linear mit dem Logarithmus der Ionenstärke dem GC-Gehalt der Sondenlänge der Formamid-Konzentration; 1% Anstieg der Formamidkonzentration reduziert T m um 0,6 C. Dadurch wird eine Hybridisierung bei niedrigeren Temperaturen möglich und eine Degeneration oder Lösung von Nukleinsäure bei hohen Temperaturen vermieden. Die Stringenz beschreibt die Bedingungen bei der Hybridisierung und beim folgenden Waschschritt. Je stringenter die Bedingungen, desto weniger Sonden mit Fehlbindungen (mismatches) zur Zielsequenz verbleiben als Hybrid. Für eine korrekte Auswertung müssen die Bedingungen bei der Hybridisierung so gewählt werden, dass nur perfekte Basenpaarungen stabil bleiben. Die Stabilität der Hybride ist von der Stringenz und von der Anzahl und der Lage der Fehlpaarungen abhängig. Durch den Einsatz von Formamid und NaCl werden die Hybridisierungsbedingungen der verschiedenen Gensonden auf eine Hybridisierungstemperatur von 46 C bzw. einer Waschtemperatur von 48 C eingestellt. Die Permeabilisierung der Zellen für die Sonde erfolgt durch einen Fixierungsschritt. Dieser erfolgt bei Reinkulturen in Abhängigkeit von den Gram-Eigenschaften: bei Gram-negativen Bakterien mit Paraformaldehyd und bei Gram-positiven mit Ethanol. Bei Umweltproben werden beide Fixierungsverfahren angewendet, um beide Bakteriengruppen erfassen zu 21 Praktikum Spezielle Bakteriologie / Mikrobentaxonomie 2013

25 können. Zur weiteren Untersuchung werden die fixierten Zellen zuerst auf Glasobjektträgern immobilisiert und einer Dehydratisierung unterworfen. Anschließend wird die Probe mit der Hybridisierungslösung, welche die markierten Sonden enthält, überschichtet. Zur Hybridisierung werden die Objektträger dann in einer feuchten Kammer für 2-3 Stunden bei der für die Sonden empfohlenen Temperatur inkubiert. Durch mehrere Waschschritte werden nicht oder falsch gebundene Sonden wieder von den Proben entfernt. Nach einer Gegenfärbung aller Zellen mit dem DNA-Farbstoff DAPI wäscht man die Objektträger mit dest. Wasser und trocknet sie an der Luft. Zum Schluss bettet man die Proben in Citifluor ein. Die Auswertung erfolgt an einem Epifluoreszenzmikroskop durch die parallele Zählung der Sonden- und der DAPI-Signale. Als Ergebnis erhält man die prozentualen Anteile der hybridisierten Zellen an der Gesamtzellzahl. Vorteile der in situ Hybridisierung: es wird keine Kultivierung und Isolierung der Mikroorganismen benötigt, d.h. auch nicht kultivierbare Organismen können nachgewiesen werden die in situ Identifikation erfolgt auf phylogenetischer Ebene die Relevanz der isolierten Stämme kann in situ kontrolliert werden die räumliche Verteilung der Bakterien im System, d.h. in situ, kann untersucht werden pathogene Keime in Umweltproben können sehr schnell und spezifisch quantifiziert werden bakterielle Endosymbionten können untersucht werden Nachteile der in situ Hybridisierung: die in situ Identifizierung lässt keine Aussagen über das physiologische Potential und die Aktivität der nachgewiesenen Organismen zu. Es stehen nur eine beschränkte Anzahl an getesteten Gensonden zur Analyse bereit (Abhängigkeit von vorhandenen Sequenzdaten) Gruppen oder Arten, die weniger als ca. 2-3% der Gesamtpopulation ausmachen, können nicht mehr sicher quantifiziert werden. Probleme mit der Probenmatrix, insbesondere bei Boden- und Sedimentproben Als Fluoreszenz wird die Emission von Licht durch ein Atom oder Molekül nach einer erfolgten Anregung bezeichnet. Nach Beendigung der Anregung klingt die Fluoreszenz sehr 22 Praktikum Spezielle Bakteriologie / Mikrobentaxonomie 2013

26 schnell ab. Dabei hat das emittierte Licht eine größere Wellenlänge als das absorbierte Licht (Stokes sche Regel). ABBILDUNG 3: SCHEMATISCHE DARSTELLUNG DES STRAHLENGANGS UND DER FILTERANORDNUNG IM FLUORESZENZMIKROSKOP AM BEISPIEL DES FARBSTOFFES DAPI Bei der Epifluoreszenzmikroskopie wird das Präparat in Abhängigkeit vom verwendeten Farbstoff mit Licht einer geeigneten Wellenlänge angeregt und das emittierte Licht als Signal beobachtet. Die Abbildung zeigt das Prinzip des Strahlengangs und der Filteranordnung im Fluoreszenzmikroskop am Beispiel von DAPI. 23 Praktikum Spezielle Bakteriologie / Mikrobentaxonomie 2013

27 AUFGABENSTELLUNGEN Quantifizieren Sie ausgewählte Bakteriengruppen (EUB, NONEUB, Archaea, alpha-, beta- Proteobakterien, CF, SRB, GNSB) in Sedimentproben aus der Trinkwassertalsperre Saidenbach. Ihnen werden zum Kurs mit Agarose beschichten Objektträger, auf denen die zu untersuchenden Proben bereits aufgetragen sind zur Verfügung gestellt. Weiterhin sind die Proben bereits mit Lysozym und Acromopeptidase behandelt. DURCHFÜHRUNG VERWENDETE REAGENZIEN/GERÄTE: Objektträger mit Proben (je 1 Objektträger pro Gruppe) Sonden Hybridisierungspuffer Waschpuffer Amplifikationspuffer FITC-Substrat Ethanol 96%ig PBS H 2 O 2 Propidiumiodid P ROBENVORBEREITUNG (BEREITS DURCHGEFÜHRT): Homogenisieren der Proben mittels Ultraschallsonde Proben auf den beschichteten Objektträger (OT) auftragen Probe bei Raumtemperatur trocknen lassen Dehydrieren der Probe in einer aufsteigenden Alkoholreihe (je 1 min in 50, 80 und 96%igem Ethanol) Probe lufttrocknen Lysozymbehandlung: Inkubation mit 10mg/mL Lysozym für 1 h bei 37 C 24 Praktikum Spezielle Bakteriologie / Mikrobentaxonomie 2013

28 OT waschen mit Aqua dest. Acromopeptidasebehandlung: Inkubation für 30 min bei 37 C mit Acromopetidase- Lsg. (60 U/ml) OT waschen mit Aqua dest. Inaktivierung der endogenen Peroxidasen: Inkubation für 30 min in Methanol mit 0,15% H 2 O 2 In viel Aqua dest. Waschen in 96% Ethanol dehydrieren (1 min) Lufttrocknen, (OT können bei 20 C gelagert werden) HYBRIDISIERUNG UND CARD SIGNALAMPLIFIKATION (VON DEN KURSTEILNEHMERN DURCHZUFÜHREN): Je Probenfeld 1 µl Sonde zu 10 µl Hybridisierungspuffer der richtigen Formamid Konzentration (siehe Tabelle) geben und vorsichtig mischen Hybridisierung für mind. 2h bei 46 C Achtung: Nach der Hybridisierung darf die Probe nicht mehr trocken werden. 10 min mit Waschpuffer (der entsprechenden Konzentration, siehe Tabelle) bei 48 C waschen Inkubation in 1 x PBS (10 ml, RT, 15 min) Substratreaktion: Herstellung: 1. 1 µl H 2 O 2 (30%) und 200 µl 1xPBS mischen (End-konz.: % H 2 O 2) 2. davon 5 µl mit 500 µl Amplifikationspuffer mischen 3. 1 µl Substrat (FITC markiert) mit 500 µl vorbereitetem Amplifikationspuffer mischen Inkubation für 30 min, 46 C, DUNKEL waschen in 1x PBS (10 min, RT) 2x in 50 ml of Aqua dest. waschen (RT, im dunkeln) in 50 ml 96% Ethanol (RT, im dunkeln) Lufttrocknen 25 Praktikum Spezielle Bakteriologie / Mikrobentaxonomie 2013

29 Gegenfärbung mit Propidiumjodid (15min im Dunkeln bei RT) TABELLE 2: VERWENDETE SONDEN UND FORMAMIDKONZENTRATIONEN ZUR HYBRIDISIERUNG Sonde Spezifität Formamidkonzentration im Hybridisierungspuffer EUB Bacteria 0-40% NONEUB Negativkontrolle 0-40% Alpha Alphaproteobacteria 20% Beta Btaproteobacteria 35% Gamma Gammaproteobacteria 35% CF most Flavobacteria, some 20% Bacteroidetes, some Sphingobacteria HGC Actinobacteria 20% GNSB Chloroflexi 35% TABELLE 3: PROBENVERTEILUNG (SEDIMENTPROBEN E1/ E3 AUS DER TALSPERRE SAIDENBACH) UND SONDEN FÜR DIE CARD-FISH Gruppe Probe Hybridisierung mit Sonde Formamidkonzentration OT 1 E1 EUB, NONEUB,Arch 0% OT 2 E1 Beta, Gamma, CF, 35% GNSB OT 3 E3 EUB, NONEUB,Arch 0% OT 4 E3 Beta, Gamma, CF, 35% GNSB 26 Praktikum Spezielle Bakteriologie / Mikrobentaxonomie 2013

30 ANHANG: TABELLEN ZUR BAKTERIENIDETIFIZIERUNG TABELLE 1 - KOLONIEMORPHOLOGIE 1. Farbe: Insbesondere auf den Luftplatten treten häufig pigmentierte Kolonien auf. Die Farbstoffe (gelb bis rosarot) sind Carotinoide; Sie haben eine Schutzfunktion gegenüber sichtbarem und ultraviolettem Licht 2. Geruch: falls ein spezifischer Geruch vorhanden ist (z.b. nach Erde Streptomyceten; nach Milchsäure Lactobacillus) 3. Form (Umriss): 4. Profil (Erhebung über dem Nährboden): 27 Praktikum Spezielle Bakteriologie / Mikrobentaxonomie 2013

31 5. Rand (Betrachtung mit dem Mikroskop (10fache Vergrößerung) 6. Oberfläche: glänzend oder stumpf faltig filamentös unregelmäßig krümelig 7. Konsistenz (mit der Impföse prüfen) butterartig / bröckelig / schleimig / knorpelig 8. Größe klein /mittel /groß (besser gemessenen Durchmesser angeben) 28 Praktikum Spezielle Bakteriologie / Mikrobentaxonomie 2013

32 TABELLE 2 - ÜBERBLICK BAKTERIENDIFFERENZIERUNG Gram negativ Gram positiv Oxidase-Test - - Stäbchen Kokken Anaerobe Glukosereaktion Anaerobe Glukosereaktion aerob Fakultativ / obligat anaerob Tab.: 3 Tab.: sporulierend Nicht sporulierend sporulierend Nicht sporulierend Nonfermenter Enterobakterien Nonfermenter z.b. Aeromonas Vibrio z.b. Pseudomonas Alcaligenes Flavobacterium z.b. Escherichia Klebsiella Proteus Salmonella Shigella Serratia z.b. Pseudomonas Acinetobacter z.b. Bacillus Tab.: 4 z.b. Cellulomonas Arthrobacter Corynebacterium Nocardia Mycobacterium z.b. Clostridium z.t. Bacillus Tab.: 5 Tab.: 5 Tab.: 4 z.b. Lactobacillus Eubacterium Tab.: 3 Tab.: 2 API 20-NE API 20-NE API 20-E API 20-NE 29

33 TABELLE 3 - DIFFERENZIERUNG GRAMNEGATIVER STÄBCHEN E.coli Klebsiella oxytoca Proteus vulgaris Morganella morganii Salmonella havana Citrobacter freundii Serratia marcescens Pseudom. aeruginosa Pseudom. fluorescens Pseudom. stutzeri Aeromonas hydrophila Acinetobacter junii Oxidase Lactose variabel Glucose (OF) F F F F F F F O O O F O Kligler: Schrägfläche Stich Gas gelb gelb rot/gelb gelb rot gelb rot gelb () rot gelb meist rot/gelb gelb H 2 S I Indol M Methylrot Vo Voges- Proskauer C Citrat Urease Nitratreduktion (bis NO 2 ) (bis NO 2 ) (bis NO 2 ) (bis NO 2 ) (bis NO 2 ) (bis NO 2 ) (bis NO 2 ) (bis N 2 ) (bis N 2 ) (bis N 2 ) (bis NO 2 ) Proteolyse Äsculinspaltung Beweglichkeit Wachst. auf Cetrimidagar Legende: kein Wachstum / negative Reaktion, lediglich im Anstrich Wachstum / variable Reaktion, sehr zartes Wachstum über den Anstrich hinaus / pos. Reaktion, gutes Wachstum, üppiges Wachstum 30 Praktikum Spezielle Bakteriologie / Mikrobentaxonomie 2013 rot gelb ( ) rot rot rot rot rot rot rot rot rot rot ()

34 TABELLE 4 - DIFFERENZIERUNG GRAMPOSITIVER KOKKEN Paketkokken Haufenkokken Kettenkokken Micrococcus Staphylococcus Streptococcus Enterococcus luteus aureus epider -midis saprophyticus pyogenes agalactiae faecalis Katalase Katalase Hämolyse (Blutagar) Hämolyse (Blutagar) ± Plasma-koagulase (clumping factor) CAMP-Test - - Koloniefarbe (Fleischagar) Baird-Parker: Tellurit-Red. Proteolyse Glucose-Abbau zitronengelb goldgelb weiß weiß Äsculin- Spaltung - - ± ± ± Wachstum b. ± ± C u. 45 C obligat aerob 37 C (oxidativ) anaerob (fermentativ) Mannit 6,5% NaCl - - Lysostaphin Wachstum kein Wachstum ph 9,6 - - Auf TTC-Azid- ± ± ± Auf TTC-Azid- - - Agar: dunkelrote Kolonien farblos dunkelrote Kolonien Agar: dunkelrote Kolonien Legende: kein Wachstum / negative Reaktion, lediglich im Anstrich Wachstum / variable Reaktion, sehr zartes Wachstum über den Anstrich hinaus / pos. Reaktion, gutes Wachstum, üppiges Wachstum 31 Praktikum Spezielle Bakteriologie / Mikrobentaxonomie 2013

35 TABELLE 5 - DIFFERENZIERUNG GRAMPOSITIVER STÄBCHEN Zelldurch-messer [µm] Spore* Glucoseverwertung** Anaerobes Wachstum Wachstum bei 7% NaCl Voges-Proskauer Mannit Lecithinase Citratverwertung Indolbildung Urease Stärkeabbau B. cereus 1 Z S ± ± B. mycoides 1 Z S ± ± ± B. thuringiensis 1 Z S ± ± ± B. anthracis 1 Z S ± B. megaterium 1 Z S ± ± ± ± B. subtilis < 1 Z S B. pumilus < 1 Z S ± B. licheniformis < 1 Z S ± B. polymyxa < 1 Z(T)/ S S/G B. macerans < 1 T/S S/G ± B. alvei < 1 Z(T)/ S S B. circulans < 1 T/S S ± ± ± B. laterosporus < 1 Z/L/ S B. brevis < 1 Z(T)/ S S ± (±S) ± ± B. firmus < 1 Z (±S) ± B. lentus < 1 Z (±S) ± ± ± B. sphaericus < 1 T/R ± ± ± Legende: * Z zentrale Spore ** S Säurebildung T terminale Spore G Gasbildung R runde Spore S Zelle durch Spore aufgetrieben Anmerkung: Alle aufgeführten Bacillus-Arten sind Katalase-positiv. 32 Praktikum Spezielle Bakteriologie / Mikrobentaxonomie 2013

36 TABELLE 6A - ÜBERSICHT ZUM WACHSTUM AUSGEWÄHLTER GRAM-NEGATIVER KEIME AUF NÄHRMEDIEN Laktose Nähr- (Fleisch)-Agar Blutagar Hämolyse TTC-Acid Agar Äsculin Agar ENDO Agar Leifson Agar Mac Conkey-Agar Cetrimid Agar Mossel Agar Baird Parker-Agar E. coli gelb Klebsiella oxytoca Citrobacter freundii feucht, schleimig rote Kolonie große schwarze ; Hof farblose rote Kolonien rote Kolonien rote Kolonien gelb gelb, Hof schwarze Proteus vulgaris Morganella morganii Salmonella havana Serratia marcescens Pseudomonas stutzeri P. aeruginosa P. fluorescens Acinetobacter junii rötliche braun-grüne gelbliche gelbliche ß rote Kolonie rote Kolonie rote Kolonie rote Kolonie rote Kolonie rote Kolonie rote Kolonie rote Kolonie farblose K. braune, Hof farblose K. farblose farblose farblose farblose Kolonien farblose farblose schwarze farblose Kol gelb, Hof farblose farblose Kolonien farblose blaugrüne blaugrüne farblose rote Kolonie gelb, fluoresz. schwarze schwarze braunschwarze schwarze Kol 33 Praktikum Spezielle Bakteriologie / Mikrobentaxonomie 2013

37 TABELLE 6B - WACHSTUM AUSGEWÄHLTER GRAM-POSITIVER KEIME AUF DEN VERWENDETEN NÄHRMEDIEN Nähr- (Fleisch-) Agar Grampositive Stäbchen Bacillus. cereus matte Kolonien Blut Agar Hämolyse TTC-Acid Agar ß rote Äsculin Agar farblose Kolonien ENDO Agar farblose Bacillus. mycoides farblose Bacillus subtilis matte Kolonien Grampositive Kokken Staphylococcus aureus goldgelbe/beige Staphylococcus epidermidis Micrococcus luteus zitronengelbe Streptococcus agalactiae Enterococcus faecalis farblose ß rote weiße rote weiße rosa Leifso n Agar Mac Conkey Agar Cetrimid Agar Mossel Agar Hof Baird Parker Agar gelbe orang e-rote rosa rosa gelb, Hof schwarze Kolonien schwarze Aufklarun g schwarzgraue Klein, schwarz leicht ß farblose α; rote schwarze ; scwarzer Hof rosa rosa rosa gelb, Hof schwarze 34 Praktikum Spezielle Bakteriologie / Mikrobentaxonomie 2013