Analyse der freien flüchtigen Carbonsäuren als Instrument der Qualitätskontrolle

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1 Eidgenössisches Volkswirtschaftsdepartement EVD Forschungsanstalt Agroscope Liebefeld-Posieux ALP Analyse der freien flüchtigen Carbonsäuren als Instrument der Qualitätskontrolle René Badertscher Interlab-Fachkongress, 4. Juni 2008

2 Flüchtige Carbonsäuren bis i-c4 O O OH OH Ameisensäure C1 Methansäure O Essigsäure C2 Ethansäure O OH OH Propionsäure C3 Propansäure iso-buttersäure i-c4 2-Methylpropansäure 2

3 Flüchtige Carbonsäuren C4 bis C6 O O Buttersäure C4 Butansäure O OH iso-valeriansäure i-c5 3-Methylbutansäure O OH OH OH Capronsäure C6 Hexansäure iso-capronsäure i-c6 4-Methylpentansäure 3

4 Physikalische Stoffeigenschaften der CS Molmasse Smp Temperatur in C resp. rel. Molmasse in g/mol Sdp. Dampfdruck Dampfdruck in Pa bei 20 C C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 i-c4 i-c5 i-c6 Carbonsäure Kurzbezeichnung 4

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7 FlCS aus der Proteolyse Proteolyten Bacillus subtilis Clostridium sporogenes Pseudonomas fluorescens Sc liquefaciens Proteasen Proteine primäre Proteolyse (Peptone, Polypeptide, Oligopeptide) sekundäre Proteolyse (Di- und Tripeptide, Aminosäuren) Abbau der Aminosäuren Biogene Amine, Ammoniak Carbonsäuren Hydroxicarbonsäuren Ketosäuren CO 2, H 2 S 7

8 FlCS aus dem Lipidgemisch Stoffklasse Fettanteil Wichtigste Vertreter Triacylglyceride % Bei 14 Säuren sind 1470 verschiedene Triglyceride möglich Diacylgyceride % Bei 14 Säuren sind 301 verschiedene Diglyceride möglich Monoacylglyceride % Bei 14 Säuren sind 28 verschiedene Monoglyceride möglich Ketosäureglyceride % Carbonylgruppe an den Positionen Hydroxysäureglyceride % 4- bzw. 5-Hydroxycarbonsäuren (C 8...C 16 ) Phospholipide % Lezithin, Kephalin, Sphingomyelin Freie Fettsäuren % 14 Säuren mit einem Anteil > 1% der freien Fettsäuren Fettbegleitstoffe % Sterine, Squalen, fettlösliche Vitamine (A, D3, E, F, K), Karotinoide 8

9 Wichtigste Stoffwechselprodukte von käseschädlichen Keimen (Ernst Jakob, 2008) Keimgruppe Obligat heterofermentative Laktobazillen Faktulativ heterofermentative Laktobazillen Propionsäurebakterien Coliforme Keime Clostridium butyricum Clostridium tyrobutyricum Clostridium sporogenes Clostridium beijerinckii Hefen Produkte Lactat Acetat, CO 2 Ethanol Acetoin / Diacetyl Biogene Amine Lactat, Formiat, Acetat, CO 2 Propionat, Acetat, CO 2, ev. Succinat Lactat, Formiat, Acetat, H 2, CO 2 Acetat, Butyrat, H 2, CO 2 Acetat, Butyrat, H 2, CO 2 Acetat, Propionat, Butyrat, iso-valeriat, iso-butyrat, iso-caproat, H 2, CO 2 Acetat, Butyrat, H 2, CO 2 Acetat, Ethanol, H 2 Unerwünschte Einflüsse auf Käsequalität Gasbildung, Frühblähung unsaubere Lochung Off Flavour ev. unerwünschte Lochbildung und Nachgärung (Gläs) ev. unerwünschte Lochbildung und Nachgärung (Gläs) braune Tupfen, süsslicher Geschmack unerwünschte Lochbildung, Frühblähung frühe Buttersäuregärung Spätblähung Putrifikus (Weissfäule) atypische Buttersäuregärung (wenig Gas und Buttersäure) unerwünschte Lochbildung, Frühblähung 9

10 Teilübersicht der FlCS-Prüfmethoden Probenvorbereitung Auftrennung Detektion Wasserdampfdestillation Headspace (dyn. / stat.) Solidphase-Extraktion Extraktion / Filtration Dialyse Gaschromatographie HPLC / IC Kapillarelektrophorese WLD / FID MS / MS-MS UV / RI / Leitfähigkeit FT-IR 10

11 Wasserdampfdestillation und Titration 20.0 g Käse 5 ml Schwefelsäure 10 % Wasserdampfdestillation ca. 250mL Destillat Titration mit Natronlauge (c = 0.1 mol/l; Phenolphthalein) 11

12 GC-WLD nach Flüssiginjektion S i g n a l [ * 2 5 µ V ] i - C 4 C 3 C 4 C 2 C 1 i - C 5 i - C 6 C 6 Säule: DB-FFAP (Polyethylenglycol) Dimensionen: 30 m * 0.32 mm * 0.25 µm Trägergas: Helium Splitverhältnis: 1:15 Strömungsgeschwindigkeit: 25 cm/s Volumenstrom: 1.2 ml/min Injektortemperatur: 180 C Detektortemperatur: 220 C Temperaturprogramm: C/min C min Injektion 50 0 Stufe Stufe P e a k s a u s D i e t h y l e t h e r R e t e n t i o n s z e i t [ m i n ] 12

13 Headspace-Veresterung C 2 H 5 OH R-COOC 2 H 5 H 2 O Headspace Plattentemperatur: 75 C Heliumvolumenstrom: 7 ml/min Veresterungszeit: 60 min Loop füllen: 0.3 min Vialvolumen: 20 ml Loop equilibrieren: 0.2 min Druckaufbau: 0.5 min Ventiltemperatur: 140 C Druck halten: 0.5 min Leitungstemperatur: 140 C Loopgrösse: 0.25 ml R-COOH Destillat 13

14 WD + Headspace + GC-FID S i g n a l [ p A ] i - C 4 i - C 6 P e a k s a u s V e r e s t e r u n g s - r e a g e n z C 1 C 2 C 3 C 4 i - C 5 C 6 Säule: Ultra2 (5 % Phenyl-Methylsilikon) Dimensionen: 50 m * 0.32 mm * 0.52 µm Trägergas: Helium Splitverhältnis: 1:6 Strömungsgeschwindigkeit: 25 cm/s Volumenstrom: 1.2 ml/min Injektortemperatur: 140 C Detektortemperatur: 270 C Temperaturprogramm: C/min C min Injektion 45 5 Stufe Stufe R e t e n t i o n s z e it [ m i n ] 14

15 FlCS-Gehalte ausgewählter Käse (~ Taxationsalter) 100 Appenzeller Emmentaler Gruyère Sbrinz FlCS in mmol/kg Total FlCS C1 C2 C3 i-c4 C4 i-c5 C6 15

16 Emmentaler mit Buttersäuregärung Parameter Normal 2.5 Monate Buttersäure gärung 3 Monate ranzig 3 Monate Normalbereich für 3 Monate Total flüchtige Carbonsäuren mmol/kg Ameisensäure C1 mol% Essigsäure C2 mol% Propionsäure C3 mol% iso-buttersäure i-c4 mol% Buttersäure n-c4 mol% < 1 Capronsäure n-c6 mol% <

17 Direktheadspace + GC-FID in div. MP Milch Joghurt Milchpulver Rahm Käse Publikation Ende

18 120 Lieferantenmilchproben KG xy (Mischprobe Woche 29) 100 Lipase-Aktivität [IU/Liter] Lieferant 18

19 Lieferantenmilchproben Käserei xy (Mischprobe Woche 29) freie Buttersäure in µmol/l n-c4 sofort n-c4 nach 24 h Zunahme Lieferant Nr. 19

20 Ausblick mit direkt Headspace-Methode Abschluss der Validierungsarbeiten Ermitteln der Grenzwerte für keimbelastete Milch Testen des Einsatzes als Prognosemethode in Käse Ausweitung des Anwendungsbereiches für weitere MP Identifizierung von Keimen mit Hilfe chemometrischer Verfahren 20

21 Zusammenfassung Bei der Käsereifung werden freie flüchtige Carbonsäuren aus erwünschten und aus unerwünschten Abbaureaktionen gebildet. ALP verfügt und entwickelt Prüfmethoden für die Bestimmung der flüchtigen Carbonsäuren in Milch und MP. Einsatz dieser Prüfmethoden als Instrument der Qualitätskontrolle in der milchwirtschaftlichen Praxis. 21

22 Danke für Ihre Aufmerksamkeit! 22

23 Fragen? 23