Hämoglobin A. Haem. Fe 2+
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- Lukas Fuhrmann
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Transkript
1 Hämoglobin
2 Hämoglobin A β-ketten Haem Fe 2+ α-ketten
3 Schema der drei postembryonalen humanen Hämoglobine Hb A Hb F Hb A 2 β α γ α δ α α α β α γ α δ Anteil am Gesamthämoglobin beim Erwachsenen (%): > ,2-3,5
4 Was ist Hb A1c?
5 Glykierungsreaktion Saure Aminogruppe Saure Aminogruppe Louis Camille Maillard ( ) Zucker Zucker
6 Prot -H 2 O H 2 O Prot Prot (Ketoamin) (Ketoamin)
7 Brief note An abnormal hemoglobin in red cells of diabetics Clinica Chimica Acta, Volume 22, Issue 2, October 1968, Pages Samuel Rahbar Abnormal Hemoglobin Research Laboratory, Department of Immunology, Faculty of Medicine, University of Tehran, Iran Received 11 June 1968.
8 + A1c -
9 1 VHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALGRLLVVYPWTQRF FESFGDLSTPDAVMGNPKVKAHGKKVLGAFSDGLAHLDNLK GTFATLSELHCDKLHVDPENFRLLGNVLVCVLAHHFGKEFT PPVQAAYQKVVAGVANALAHKYH 1 beta-globinkette alpha-globinkette VLSPADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGAEALERMFLSFPTTKT YFPHFDLSHGSAQVKGHGKKVADALTNAVAHVDDMPNALSA LSDLHAHKLRVDPVNFKLLSHCLLVTLAAHLPAEFTPAVHA SLDKFLASVSTVLTSKYR
10 Hb A 1c Glu Glu Glu α - β β Val1 Glu Glu Glu The IFCC working group has defined HbA1c as Hb that is irreversibly glycated at one or both N-terminal valines of the beta chains. This does not exclude hemoglobin that is additionally glycated at other sites on the alpha or beta chains.
11 Faktoren, die die Hb A1c-Bestimmung klinisch oder methodisch verfälschen können 1. Veränderung der Ery-Halbwertszeit oder der Glykierungs-Kinetik 2. Postsynthetische Hb-Modifikationen 3. Hämoglobinopathien
12 Veränderung der Halbwertszeit oder der Glykierungs- Kinetik klinisch irreführend niedrige Hb A1c - Werte Verkürzte Erythrozyten-Überlebenszeit Blutverlust ev. Erythrozyten-Transfusion Hemmung der Glykierung (Vit C, Vit E)? Schwangerschaft? klinisch irreführend hohe Hb A1c - Werte Verlängerte Erythrozyten-Überlebenszeit (Splenektomie?) Chron. Eisenmangel, späte Schwangerschaft
13 Postsynthetische Hb-Modifikationen u. U. falsch hohe Hb A1c - Werte Carbamylierung Acetylierung Alkoholismus Niereninsuffizienz/Urämie. Anstieg bis auf 3 % des Gesamt-Hb bei Einnahme von > 500 mg/d ASS über mehrere Wochen. Anstieg bis auf 5 % des Gesamt-Hb. Niedrig dosierte Dauertherapie oder mg/d für 1 Woche scheinen die Bestimmung nicht zu stören bei g/d Alkohol. Normalisierung nach Absetzen mit einer HWZ von 11 d β-laktam-penicillin Phenobarbital Hydroxyurea Chron. Bleivergiftung Galaktosämie im Vergleich zu Glucose gesteigerte Glykierungsreaktion
14 Carbamyliertes Hämoglobin Urea O NH 2 C NH 2 NH4+ Cyanat + - HCO H O Hb NH 2 + HN C O Hb N C NH 2 Isocyanidsr. Carbamyliertes Hb Carb-Hb O = C-NH2 O = C-NH2 Val 1 Val 1 α - β
15 Routinemethoden zur Bestimmung von Hb A1c 1. enzymatisch 2. immunologisch 3. aufgrund von Unterschieden der elektrischen Ladung 4. affinitäts-chromatographisch (glykiertes Gesamt-Hb)
16 Prinzip der enzymatischen Messung von Hb A1c Hb A1c β-ketten proteolytische Spaltung Fructosyl- Valin- Oxidase + H2O2
17 Verfahren der enzymatischen Messung von Hb A1c J Diabetes Sci Technol May; 3(3):
18 Prinzip der immunologischen Messung von Hb A1c Hb A1c β-ketten Antibody recognition site Endopeptidase Glu - C
19 Prinzip der ladungsabhängigen Messung von Hb A1c Hb A0 Hb A1c Hb A1c ist schwächer positiv geladen als Hb A0 Daher ist eine Trennung mit Ionenaustauscher oder elektrophoretisch möglich
20 Wie wird bei der HPLC der Hb A1c-Wert ermittelt? Man definiert die Zeitfenster für die Elution von Hb Ao und von Hb A1c und berechnet - unter Berücksichtigung des ermittelten Kalibrationsfaktors - das Verhältnis der Flächen unter den Kurven für Hb A1c / (Hb total) Voraussetzung für die Hb A1c-Ermittlung ist somit ein eindeutiger peak für Hb A1c
21 Hämoglobinopathien Hämoglobinvarianten Thalassämien homozygote und zusammengesetzt heterozygote Formen sind in jeder beliebigen Kombination möglich
22 Hämoglobinvarianten Zur Zeit sind an die 1000 Varianten beschrieben. Sie betreffen sämtliche Globinketten häufigste Formen Varianten der beta-kette α β β α Hb S Hb C Hb E Hb D
23 Geografische Verteilung häufiger Hämoglobinvarianten Hb S Hb C Hb D Hb E
24 Geografische Verteilung von Hb S und Thalassämien in Europe sowie dem Nahen und Mittleren Osten Hb S Thallassaemias
25 Westeuropa Träger Träger von von Hämoglobinopthien Hämoglobinopathien Bevölkerung AS beta-thal andere gesamt % Niederlande ,10 Belgien ,52 Luxenburg ,71 Frankreich ,33 Deutschland ,36 Österreich ,26 Schweiz ,60 gesamt ,75 Nordeuropa gesamt ,98 Südeuropa gesamt ,57 Modell B. et al. Scand J Clin Lab Invest 2007; 67: 39-70; modif.
26 ... glykieren alle Hbe, also auch Hb-Varianten? Ja, selbstverständlich. Hb S Hb S1c Hb D Hb D1c Hb F Hb F1c...
27 Ist es klinisch vertretbar, glykierte Varianten wie Hb A1c zu betrachten? Es gibt dazu kaum Untersuchungen und keine Empfehlung! Einige Hämoglobine dürften sich sehr ähnlich wie Hb A bzw. wie Hb A1c verhalten, andere sind in glykierter Form weniger stabil als Hb A (Hb C, Hb E, Hb F)*, wieder andere können die Erythrozyten-Lebensdauer verkürzen, daher ist es zur Beurteilung eines Hb A1c-Wertes wünschenswert zu wissen, ob in der Probe eine Hb-Variante vorliegt! *) Lee B-S et al: J Biomolecular Techniques 22:90-94,2011
28 Kann man mit den Routinemethoden der Hb A1c- Bestimmung erkennen, ob eine Hb-Variante vorliegt? enzymatisch Lys Glu Glu Pro Thr Leu His Val-Glucose immunologisch Lys Glu Glu Pro Thr Leu His Val-Glucose nein, (nur bei Mutation in Pos. 1-2) nein, (nur bei Mutation in Pos. 1-4) [AK-abhängig] ladungsabhängig meistens, da die Mehrzahl der beschriebenen klinisch relevanten Varianten sich in ihrer Ladung von Hb A unterscheiden* *) Kleinert P et al: Clin Chem 54:1,69-76 (2008)
29 eine Anmerkung... zur Definition von Hb A1c
30 International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (IFCC) Scientific Division Working Group on HbA1c Standardisation and Network of Reference Laboratories for HbA1c IFCC 2002/1 HbA1c is the stable glucose adduct to the N-terminal group of the β-chain of HbA0. Clin Chem Lab Med 2002; 40(1):78 89 IFCC Reference System for Measurement of Hemoglobin A1c in Human Blood and the National Standardization Schemes in the United States, Japan, and Sweden: A Method-Comparison Study Each sample was prepared from 10 donations. Before mixing, each donation was checked for... abnormal Hb variants such as S, C, E, and F (... criterion, HbF <1% and other variants absent); and abnormal amounts of urea to exclude increased concentrations of carbamylated Hb. Clin Chem 2004: 50(1):
31 The IFCC working group has defined HbA1c as Hb that is irreversibly glycated at one or both N-terminal valines of the beta chains. This does not exclude hemoglobin that is additionally glycated at other sites on the alpha or beta chains. Glycated hemoglobin A1c is a hemoglobin molecule in which the N-terminal valine residue of the β subunit has been modified by blood glucose J Diabetes Sci Technol 2009 May; 3(3):
32 Methode AC AS AE AD F Abbott Architect/Aeroset Arkray ADAMS A1c HA-8180V (Menarini) Axis-Shield Afinion Bayer A1c Now Beckman AU system Beckman Synchron System Bio-Rad D-10 (extended program) >10 % Bio-Rad Variant II NU - - >10 Bio-Rad Variant II Turbo Bio-Rad Variant II Turbo 2.0 Bio-Rad in2it Ortho-Clinical Vitros Roche Cobas Integra Gen 2 Roche/Hitachi (Tina Quant II) >10% >10% >5 >5% >25 >25% Methode AC AS AE AD F Sebia Capillarys 2 Flex Piercing - Siemens Advia HbA1c (orig. vers.) Siemens Advia A1c (new version Siemens DCA 2000 >10% Siemens Dimension Tosoh G7 Tosoh G8 Trinity (Primus) HPLC (affinity) Randox Haemoglobin Ac >10% vermutlich keine Interferenz mit Hb D und Hb E, weil die Roche Substitution Cobas Integra vom N-Terminus der Hb-beta-Kette entfernt lokalisiert ist Roche Cobas Integra Gen >15% Roche vermutlich Tina-quant Interferenz II bei einem Hb F über ~ % 30% Roche Unimate Siemens Hb Advia A1c wird HbAc nicht (orig. quantifiziert vers.) Siemens Advia Ac (new version) Interferenz: nein ja ja/nein Siemens (previously Bayer) DCA Tosoh Ac. Plus Tosoh G (Variant Analysis Mode) updated August 2012, modified Tosoh G (Variant Analysis Mode)
33 Zusammenfassung 1 Nur mit ladungsabhängigen Methoden zur Hb A1c-Bestimmung kann man in der Routine das Vorliegen einer Hb-Variante erkennen und den echten Hb A1c-Wert ermitteln. Bei den anderen Methoden bleiben (von seltenen Ausnahmen abgesehen) Hb-Varianten unentdeckt, der ermittelte Hb A1c-Wert beinhaltet die glykierten Anteile der Hb-Variante(n) in der Probe.
34 Überlegungen zur Hb A1c-Bestimmung mit HPLC
35 Bedeutung von Hämoglobinvarianten für die Hb A1c-Bestimmung mittels HPLC heterozygot - homozygot Bei Personen, die heterozygot für eine Hämoglobinopathie sind (Hb AX), ist die Hb A1c-Bestimmung nur dann korrekt möglich, wenn Hb Ao und Hb A1c von Hb X und Hb X1c getrennt eluieren. Bei Personen, die homozygot (oder doppelt heterozygot) für eine Hämoglobinopathie sind (Hb XX oder HB XY), ist eine Hb A1c-Bestimmung nicht möglich, da kein Hb A1c vorhanden ist.
36 Bedeutung von Hämoglobinvarianten für die Hb A1c-Bestimmung mittels HPLC Chromatogramme bei heterozygoten Hb-Varianten
37 Hb A Hb X Hb A1c Hb X1c t Hb A + Hb X Hb A1c + Hb X1c t
38 Probenidentifikation mittels HPLC allein oder zusätzlich mittels MS N davon abnormal Kationenaustauscher- und RP-HPLC: identifiziert Massen-Spektrometrie: zusätzlich identifiziert 4 *) 4 *) Hb Zürich-Hottingen *) (α 9 Asn > Ser)? klinisch 1 Hb Zürich-Langstrasse (β 50 Thr > Ser) asymptomatisch 2 Hb Riccarton (α 51 Gly > Ser) asymptomatisch (?) Kleinert P et al: Clin Chem 54,69-76,2008
39 Hb A Hb X Hb X + Hb A1c Hb A Hb A1c Hb X1c t t Hb A Hb X Hb A + Hb X Hb A1c + Hb X1c Hb A1c Hb X1c t t
40 Anforderung an die HPLC zur Hb A1c-Bestimmung Identifikation aller Varianten und korrekte Hb A1c-Messung: nicht realistisch aber bei den häufigsten Varianten soll die Hb A1c- Bestimmung möglich sein und in allen anderen Fällen das Vorhandensein einer Variante angezeigt und kein unrichtiger Hb A1c-Wert ermittelt werden Allgemein gilt: Je kürzer die Laufzeit desto schlechter die Trennung!
41 Hb A1c Messung mittels HPLC in Gegenwart von Hb-Varianten Zusammenfassung 2 Hb A1c kann in Anwesenheit einiger häufiger Varianten gemessen werden, andere Varianten werden oft angezeigt ohne dass ein Hb A1c-Wert bestimmt wird. Die Trennzeit ist ein maßgeblicher Parameter für das Erkennen von Varianten. Deshalb sind ultrakurze Läufe nur bei (bekannten) Proben mit normaler Hb-Zusammensetzung vertretbar. Auch wenn bei Vorliegen einer unbekannten Variante ein Hb A1c-Wert ermittelt wurde, sollte die Variante identifiziert werden, weil der formal korrekt ermittelte Hb A1c-Wert klinisch irreführend sein kann.
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