BIOCHEMIE des Stoffwechsels ( )

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1 Glycolyse 6. Reaktion: Glycerinaldehyd-3- phosphat-dehydrogenase BIEMIE des Stoffwechsels ( ) 5. Einheit Glycerinaldehyd-3- + NAD + + i 1,3-Bisphosphoglycerat + NAD + + Enzym: xidoreductase Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (E ) Tetramer 4 37 kda (Kaninchenmuskel) Glycerinaldehyd-3-1,3-Bisphosphoglycerat Glycolyse (2) 3 + NAD + + i + NAD Glycerinaldehyd-3-- Dehydrogenase (Mensch): Tetramer Aldehydoxidation: stark exergonisch Bildung von NAD und Bisphosphoglycerat (Acylphosphat = gemischtes Anhydrid): endergonisch G = + 6,3 kj/mol (K eq = 0,078) G = -1,29 kj/mol NAD + Mechanistische Untersuchungen: A. Glycerinaldehyd-3--D wird durch Alkylierung mit stöchiometrischen Mengen IDAETAT inaktiviert. Akkumulierung von Fructose-1,6-bisphosphat im ytosol ( ystein im aktiven Zentrum). Enzym- 2 -S + I 2 - Enzym- 2 -S- 2 - I roteinhydrolyse B aus 1-3 -GA wird durch Glycerinaldehyd-3-D auf NAD + übertragen ( Reaktion verläuft über direkte ydrid-übertragung) NAD + + i + NAD N 3 2 S arboxymethylcystein + andere Aminosäuren 1

2 Mechanistische Untersuchungen:. Die GA-D katalysiert (reversible) Isotopenaustauschreaktion von 32 zwischen [ 32 ]- i und Acetylphosphat (Analogon des rodukts). Dies weist auf Acyl-Enzym-Zwischenprodukt hin (reversible kovalente Knüpfung der gemischten Anhydridbindung). GA-D Reaktionsmechanismus 1. Binden von Glycerinaldehyd-3-hosphat an das Enzym 2. Nucleophiler Angriff der Sulfhydrylgruppe am arbonyl--atom des Aldehyds. Bildung eines Thiohalbacetals. B: S 2 3 B + S 2 3 Bildung eines Thiohalbacetals: kovalente Katalyse Reaktionsmechanismus 3. xidation des Thiohalbacetals zu einem Acylthioester (wurde als Zwischenprodukt isoliert) durch direkte Übertragung eines ydrid-ions auf NAD + N 2 B + S N R N 2 S B Acylthioester N R Im Acylthioester wird der Großteil der bei der xidationsreaktion freigesetzten Freien Enthalpie gespeichert (letztendlich für die Kopplung an o-hosphat und Ausbildung des gemischten Anhydrids) 4. NAD + verdrängt NAD 5. Nucleophiler Angriff von i an das Thioester- Zwischenprodukt 6. Knüpfung der gemischten Anhydridbindung S - B ,3-Bisphosphoglycerat Veränderung der Freien Enthalpie bei der xidation von Glycerinaldehyd mit anschließender Bildung von Acylphosphat. Acylthioester (A) ypothetischer Fall ohne Kopplung beider rozesse. Der zweite Schritt benötigt eine große Aktivierungsenergie, was die Reaktion sehr verlangsamt. (B) Der tatsächliche Verlauf. Die beiden Reaktionen sind über ein Thioester- Zwischenprodukt miteinander gekoppelt. 2

3 Arsenat entkoppelt die xidationsreaktion von der hosphorylierungsreaktion: Arsenat (As 3-4 ) ist anionisches Analogon zu hosphat. Es reagiert mit GA-D unter Bildung von 1-Arseno-3- hosphoglycerat: As Glycerinaldehyd-3--Dehydrogenase (Mensch): Tetramer ier ist die Struktur eines Monomers dargestellt. Acylarsenate sind jedoch ydrolyse-labil und zerfallen unter Bildung von 3-hosphoglycerat. Glycolyse geht weiter, jedoch ist AT-Bildung über Substratkettenphosphorylierung durch nachfolgende Kinase-Reaktion nicht mehr möglich. NAD+ Blick von außen auf NAD + -Bindungsstelle NAD + NAD + NAD Markierungsversuche mit Deuterium: GA-D überträgt ydrid-ion stets auf die si-seite des Nicotinamidringes von NAD +. Das übertragene -Atom wird zum pro-s-substituenten am (4) des NAD. Die ydrid- Ionenübertragung ist absolut stereospezifisch. re-seite R N N2 si-seite :D D -- si-seite R N R D s N2 Lactat-D, Alkohol-D katalysieren die Übertragung des pro-r- Wasserstoffs von NAD 3

4 Glycolyse 7. Reaktion: hosphoglycerat-kinase 1,3-Bisphosphoglycerat + AD 3-hosphoglycerat + AT Enzym: hosphotransferase hosphoglycerat-kinase (E ) Monomer 64 kda (Kaninchenmuskel) ofactor: Mg 2+ 1,3-Bisphosphoglycerat 3-hosphoglycerat AD GK, Mg G = -18,9 kj/mol (K eq = 2060), G = 0,1 kj/mol Reaktion 6 und 7 der Glycolyse sind gekoppelt (1,3- Bisphosphoglycerat als Intermediat): Glycerinaldehyd-3- + AD + i + NAD + 3-hosphoglycerat + AT + NAD + + G 6+7 = -12,6 kj/mol SUBSTRATKETTENSRYLIERUNG + AT hosphoglycerat-kinase aus efe GK-Komplex mit AT und 1,3-BG AT AT Domäne 1: Bindungsstelle für Mg 2+- AD Domäne 2: Bindungsstelle für 1,3-BG Typische (zweilappige) Domänenstruktur (vgl. exokinase) Bindungsstellen der beiden Substrate: 10 Å entfernt; Kinase: Substratinduzierte Konformationsänderung Sequentieller kinetischer Mechanismus: Angriff des terminalen hosphoryl-sauerstoffs des AD auf das (1)-hosphoratom von 1,3-BG: - Mg Adenosin Mg 2+ Adenosin Nebenweg der Glykolyse: Synthese von 2,3-Bisphosphoglycerat in Erythrocyten Glycerinaldehyd-3-hosphat GA-D 1,3-Bisphosphoglycerat GK 3-hosphoglycerat GM hosphoglycerat Bisphospho- glycerat- Mutase i 2,3- Bisphospho glycerat- hosphatase ,3- Bisphosphoglycerat 4

5 Bisphosphoglycerat-Mutase ,3-Bisphosphoglycerat-hosphatase 2,3- BG ,3- BG 2 i Intermolekularer hosphoryltransfer vom (1) des 1,3-BG zum (2) des 3-G Konzentration von 2,3 BG in Erythrocyten: 3 mm; in Spuren in allen anderen Zellen ,3 BG ist wichtigster allosterischer Effektor des ämoglobins; Bindung an Desoxyhämoglobin: Erniedrigung der Sauerstoffaffinität Kopplung Glycolyse und Sauerstoffmetabolismus. * exosekinasemangel Sinken des 2,3-BG- Spiegels gesteigerte Sauerstoffaffinität des ämoglobins * yruvatkinase- Mangel Steigen des 2,3-BG-Spiegels verringerte Sauerstoffaffinität des ämoglobins exokinase-mangel p 2 in Torr Normale Erythrocythen yruvat yruvat-kinase-mangel Glycolyse 8. Reaktion: hosphoglycerat-mutase hosphoglycerat-mutase 3-hosphoglycerat hosphoglycerat Enzym: Isomerase hosphoglycerat-mutase (E ) Dimer: 2 27 kda (Kaninchenmuskel) ofactor: 2,3 -BG hosphoglycerat hosphoglycerat Mutase: Formal intramolekulare Übertragung einer funktionellen Gruppe (formal, da dies nicht immer mit dem Mechanismus vereinbar sein muss) G = + 4,4 kj/mol (K eq = 0,169); G = 0,83 kj/mol 5

6 Typ 1 Mutasen: efe, Säugetiere 2,3-Bisphosphoglycerat als ofaktor nötig Experimentelle Daten: 1. Für die Enzymaktivitäten sind katalytische Mengen von 2,3-Bisphosphoglycerat (2,3-BG) erforderlich 2. Inkubation des Enzyms mit katalytischen Mengen von 32 -markiertem 2,3-BG ergibt ein 32 -markiertes Enzym 3. hosphoryliert wird ein im aktiven Zentrum sitzendes istidin (8) Aktives Zentrum von efe- hosphoglycerat- Mutase Aktives Enzym: istidin 8 ist phosphoryliert Enzym 2 N hospho-is-rest N 3 Schritt 1: 3-G wird an das hosphoenzym gebunden, in dem is 8 phosphoryliert ist Schritt 2: Die hosphorylgruppe wird auf das Substrat übertragen, wodurch 2,3-Bisphosphoglycerat im Komplex mit dem Enzym entsteht Typ 2 Mutasen: flanzen (z.b. Weizen) 2,3-Bisphosphoglycerat ist kein ofaktor Schritt 3: Zersetzung des Komplexes unter Bildung des roduktes G, wobei das Enzym regeneriert wird. Die ursprüngliche hosphorylgruppe des 3-G landet also am (2) des nächsten 3-G, das diese Reaktion eingeht! Geringer rozentsatz des 2,3-BG dissoziiert ständig ab, daher muss 2,3-BG in Spuren vorhanden sein Intramolekularer hosphorylgruppentransfer von (3) auf (2) 6

7 hosphoglycerat- Mutase aus efe (Tetramer) is 8 hosphoglycerat- Mutase aus efe (Tetramer) Glycolyse 9. Reaktion: Enolase hosphoglycerat hosphoenolpyruvat + 2 Enzym: Lyase Enolase (E ) Dimer: 2 41 kda (Kaninchenmuskel) ofaktor: Mg 2+ hosphoglycerat hosphoenolpyruvat, E Dehydratation (Eliminierung eines Wassermoleküls) G = + 1,8 kj/mol (K eq = 0,5); G = +1,1 kj/mol Innere Logik der Glykolyse : Durch ydrolyse von E kann viel mehr Energie freigesetzt (-61,9 kj/mol) werden als durch ydrolyse von G (-17,6 kj/mol). Inhibierung der Enolase durch Fluorid: Anwendung in der Kariesprophylaxe. Durch emmung der bakterieller Enolase durch Fluorid wird der Abbau von Zucker in organische Säuren durch Bakterien in den laques verhindert. Säuren würden den Zahnschmelz [ydroxyapatit (a 10 ( 4 ) 6 () 2 )] auflösen. emmung der Enolase. Konsequenz: Akkumulation von G und (durch G- Mutase Aktivität) von 3-G. [F - wird aber auch in den Apatit des Zahnschmelzes eingebaut; der Ersatz von - durch F - im Apatit macht das Mineral resistenter gegen seine Auflösung]. - -B: 3 -B Reaktionsmechanismus der Enolase: Bestimmung des geschwindigkeitsbestimmenden Schritts im Enzym- Turnover. Austausch des (2) rotons von G mit dem Lösungsmittel viel schneller als die E-Bildung ( arbanion-bildung durch die Gegenwart einer basischen Gruppe erfolgt sehr rasch). Dagegen tauscht der (3)-Sauerstoff des G mit dem Lösungsmittel mit einer Geschwindigkeit aus, die jener der E-Bildung entspricht. arbanion-bildung an (2) durch Base (schnelle Reaktion). Abstrahiertes roton tauscht rasch mit Lösungsmittel (bulk phase) aus. Beweis durch Isotopenaustauschuntersuchungen, dass der Austausch des (2)-rotons mit dem Lösungsmittel 12 schneller als die E-Bildung abläuft. 7

8 Enolase -B B: - 3 E omodimer Eliminierung der (3)--Gruppe (langsamer = geschwindigkeitsbestimmender Schritt). Glycolyse 10 Reaktion: yruvat-kinase hosphoenolpyruvat + AD + + yruvat + AT Enzym: hosphotransferase yruvat-kinase (E ) Tetramer: 4 57 kda (Kaninchenmuskel) ofactor: Mg 2+, K + G (kj/mol) hosphoenolpyruvat + 2 yruvat ,2 AD AT ,5 hosphoenolpyruvat + AD yruvat - + AT ,7 K eq = ; G (Erythrocyten) = -23 kj/mol hosphoenolpyruvat yruvat Dritte stark exergonische Reaktion: Dritter Regulationspunkt der Glycolyse. yruvat-kinase wird allosterisch reguliert. Warum ist hosphoenolpyruvat so energiereich : Die hosphatgruppe fixiert quasi das Molekül in seiner instabilen Enolform! Mechanismus: 1. Das -hosphorylsauerstoffatom des AD greift das E- hosphoratom nucleophil an. Unter Verdrängung von Enolpyruvat wird AT gebildet E - - Mg AD Adenosin 2. Enolpyruvat geht in yruvat über. Stark exergonische Keto-Enol-Tautomerisierung (treibt AT-Synthese an). - - Enolpyruvat + - yruvat 8

9 Instabile Enolform des yruvats Tautomerisierung - G = -28,3 kj/mol Stabile Ketoform des yruvats - 3 G = -33,6 kj/mol yruvat-kinase-reaktion: hosphorylgruppen-transfer von E auf AD 4 Stufen: (a) Koordinativ zu AD gebundenes Wasser wird durch die hosphorylgruppe des E ersetzt (b) Mg 2+ dissoziiert vom - des AD ab (c) Transfer der hosphorylgruppe (d) rotonierung der Enolatform des yruvats yruvat-kinase Glucose + 2 AD + 2 i + 2 NAD + 2 yruvat + 2 AT + 2 NAD Evolution der Glycolyse? Zufälliges Auftreten der Enzymaktivität mit anschließender Feinabstimmung? UNWARSEINLI! WARSEINLIER: Gen-DULIKATINEN und divergente Evolution des Enzyms des vorhergehenden Schritts. Beispiel: Enolase und yruvat-kinase besitzen beide - terminale E-bindende -Barrels mit fast deckungsgleichem Rückgrat Inhaltsverzeichnis Glycolyse 1. Glucosetransport 2. Abfolge der chemischen Umwandlungen der Glucose in yruvat (10 Reaktionen) 3. Mechanismen der einzelnen Reaktionen 4. Thermodynamik und Regulation Reaktionen und Thermodynamik der Glycolyse Reaktion Enzym G K eq G kj/mol 25 kj/mol -D-Glucose + AT 4- Glucose-6-hosphat + AD exokinase -16, ,9 Glucose-6-hosphat Glucosephosphat Fructose-6-hosphat Isomerase +1,67 0,51-2,92 Fructose-6-hosphat + AT 4- hosphofructo- Fructose-1,6-Bisphosphat + AD kinase -14, ,8 Fructose-1,6-bisphosphat Dihydroxyacetonphosphat + Glycerinaldehyd-3- Aldolase +23,9 6, ,23 9

10 Reaktion Enzym G K eq G kj/mol kj/mol Dihydroxyacetonphosphat Triosephosphat- Glycerinaldehyd-3- Isomerase 7,56 0,0472 2,41 Glycerinaldehyd-3- + i + Glycerinaldehyd-3-- NAD + 1,3- Bisphosphoglycerat Dehydrogenase + NAD ,3 0,0786-1,29 1,3-Bisphosphoglycerat + AD 3 hosphoglycerat- - 3-hosphoglycerat + AT 4- Kinase -18, ,1 3-hosphoglycerat hosphoglycerat- hosphoglycerat Mutase +4,4 0,169 +0,83 hosphoglycerat hosphoenolpyruvat + 2 Enolase +1,8 0,483 +1,1 hosphoenolpyruvat + AD yruvat- yruvat + AT 4- kinase -31,7 3, yruvat + NAD + + Lactat- Lactat + NAD + Dehydrogenase -25,2 2, ,8 Standardbedingungen G G in vivo-konzentrationen Glycolyse-Reaktionen Glycolyse-Reaktionen (1) exokinase; (3) hosphofructokinase; (10) yruvatkinase; (11) Lactat-Dehydrogenase Die Glycolyse hat zwei Funktionen: 1. roduktion von AT 2. roduktion von Bausteinen für Biosynthesen (Beispiel: Fettsäure-Biosynthese aus Acetyl-oA). Enzyme, die weitgehend irreversible Reaktionen katalysieren, sind generell in Stoffwechselwegen potentielle Kontrollpunkte. Diese Enzyme haben also neben katalytischen auch regulatorische Funktionen (Kontrollpunkte). Glycolyse: exokinase hosphofructokinase yruvatkinase exokinase Die exokinase wird durch Glucose-6-hosphat (G6) gehemmt. (feedback-emmung). In der Leber befindet sich anstelle der exokinase Glucokinase, die nicht durch G6 gehemmt wird. Glucokinase phosphoryliert Glucose nur, wenn sie in höheren Mengen vorhanden ist. Ihr hoher K M -Wert garantiert die Glucoseversorgung des Gehirns und der Muskulatur. Die Aufgabe der Glucokinase besteht darin, Glucose-6-phosphat für die Synthese von Glycogen zu liefern, einer Glucose- Speicherform. Die Expression von Glucokinase wird durch Insulinausschüttung gesteigert. Das eigentliche Schrittmacherenzym der Glycolyse ist aber die hosphofructokinase. hosphofructokinase Glucose Viel bedeutender als die exokinase hinsichtlich der Regulation ist die hosphofructokinase. Warum? Weil Glucose-6- nicht nur in der Glycolyse, sondern auch in der Glycogen-Biosynthese und dem entosephosphatweg (NAD roduktion) eine Rolle spielt. Es gibt daher Sinn, dass die erste irreversible Reaktion, die NUR in der Glycolyse stattfindet (= hosphofructokinase-reaktion) den wichtigsten Regulationspunkt darstellt (den sog. committed step ). Allgemein stellt jenes Enzym, das die Schrittmachereaktion einer Reaktionsfolge katalysiert, das wichtigste Kontrollelement dieses Stoffwechselweges dar. xidativer entose- phosphat- Weg Glucose-6-hosphat Fructose-6-hosphat Glycolyse yruvat Glycogen- Biosynthese 10

11 yruvatkinase yruvatkinase katalysiert den dritten irreversiblen Schritt der Glycolyse. Es kontrolliert die Menge der gebildeten Endprodukte AT und yruvat. yruvat kann als Baustein für Biosynthesen dienen oder weiteroxidiert werden. In Säugetieren gibt es zwei Isoformen (Isozyme, Isoenzyme) der yruvat-kinase (allosterisches Enzym: Tetramer), die von verschiedenen Genen codiert werden. Beide Isoformen werden durch Fructose-1,6-bisphosphat (FB) aktiviert (feedforward-aktivierung). L-Typ (Isoform): Leber; M-Typ (Isoform): Muskel, Gehirn. ohe Energieladung (AT) und Alanin (Aminosäure-Äquivalent des yruvats) inhibieren die yruvat-kinase. Das Leber (L)-Isoenzym, nicht jedoch das M-Isozym, wird zusätzlich durch roteinphosphorylierung in seiner Aktivität modifiziert. Niedriger Glucosespiegel im Blut ist der Auslöser einer bedeutenden Reaktions-Kaskade (cam-kaskade, siehe Einheit 10). Das ormon Glucagon wird ausgeschüttet und aktiviert (camabhängig) letztendlich eine sog. rotein-kinase, die die L-Form der yruvat-kinase phosphoryliert. In phosphorylierter Form ist yruvat- Kinase weniger aktiv und E wird eher für die Glucose-Synthese (Gluconeogenese) verwendet. Auch ein Anstieg des intrazellulären a 2+ führt zur hosphorylierung der yruvat-kinase. Die Aktivierung der yruvat-kinase durch Fructose-1,6-bisphospat wird als feedforward- Stimulierung bezeichnet hosphofructokinase Die hosphofructokinase ist das wichtigste Kontrollelement der Glycolyse. Ein hoher AT-Spiegel senkt die Affinität des Enzyms für das Substrat Fructose-6-hosphat. AM und AD heben diesen emmeffekt wieder auf. Die Aktivität des Enzyms steigt also, wenn der AT/AM-Quotient kleiner wird. Generell wird die Glycolyse angeregt, wenn die Energieladung der Zelle sinkt. hosphofructokinase wird auch beim Absenken des p- Wertes (Anstieg der + -Ionen) gehemmt. Dies verhindert eine exzessive Lactatbildung und den damit verbunden Abfall des Blut-p-Wertes (Acidose). Inhibierung der hosphofructokinase durch hohe AT- Konzentrationen. Umwandlung der hyperbolischen Bindungskurve für das Substrat F6 in eine sigmoide Kurve (typisch für allosterische Enzyme). Der emmeffekt des AT wird von AM (und itrat) vermindert. AT, AD und AM modulieren also die Aktivität des Schrittmacher-Enzyms hosphofructokinase (FK): Bei hohen AT-Konzentrationen wird die Kinetik der FK kooperativ (sigmoider Kurvenverlauf). Allerdings schwanken die zellulären AT-Konzentrationen nur um maximal 10%. Jedoch kann der Fluss durch die Glykolyse um den Faktor 100 schwanken!!! AM und AD heben die inhibitorischen Eigenschaften von AT auf. Die Schwankungsbreite der AM-Konzentrationen in der Zelle ist im Vergleich zu AT viel größer! Der Adenylat-ool jeder Zelle wird durch das ubiquitäre Enzym Adenylat-Kinase (früher Myokinase) ineinander übergeführt: AD + AD AT + AM K eq = [AT][AM]/[AD] 2 = 0,44 Rechenbeispiel: Berechnen Sie die Änderung der [AM]- Konzentration, wenn in einer Erythrocyten-Zelle plötzlich 8% des AT in AD hydrolysiert werden. Typische Konzentrationen im Erythrocyt: [AT] = 1850 µm, [AD] = 145 µm, [AM] = 5 µm. Gesamtadenylatkonzentration: 2000 µm K eq = [AT][AM]/[AD] 2 = 0,44 AT: 8% hydrolysiert: [AT] = 1850(0,92) = 1702 µm [AM] + [AD] = = 298 µm [AM] = 298 µm - [AD] K eq = (1702)(298 - [AD])/([AD] 2 ) = 0,44 [AD] = 278 µm, [AM] = 20 µm Die AM-Konzentration steigt um das Vierfache!!! 11

12 Die hosphofructokinase ist eines von vielen Schrittmacher- Enzymen, die durch den Energiezustand reguliert werden. Ein Index für den Energiezustand einer Zelle ist die Energieladung (energy charge). Sie entspricht dem Stoffmengenanteil (früher Molenbruch) des AT plus dem halben Molenbruch des AD (AT enthält zwei und AD eine energiereiche gemischte Anhydrid-Bindung) [AT] + 0,5.[AD] Energieladung = [AT] + [AD] + [AM] Relative Reaktionsgeschwindigkeit AT erzeugender Weg AT verbrauchender Weg Energieladung = 0 nur AM Energieladung = 1 nur AT Die Energieladung der meisten Zellen ist zwischen 0,80 und 0,95 gepuffert. Typisch sind folgende Konzentrationsverhältnisse: [AD] 0,1 [AT] und [AM] 0,01 [AT] Einfluß der Energieladung auf Schrittmacherenzyme von anabolen und katabolen Stoffwechselwegen omöostase 0,25 0,5 Energieladung 0,75 1 Katabole Stoffwechselwege werden durch eine hohe Energieladung gehemmt, anabole Stoffwechselwege (verbrauchen AT) werden dagegen angeregt! Die Energieladung einer Zelle ist gepuffert. Die für anaerobe körperliche Anstrengung (z.b. kurze Sprints) verwendeten Brennstoffe unterscheiden sich von denen, die für aerobe körperliche Anstrengung (Langstreckenlauf) benutzt werden. Das rotein Myosin, das unmittelbar für die Umsetzung chemischer Energie in Bewegung verantwortlich ist, wird direkt von AT angetrieben. Im Muskel steht prinzipiell nur wenig AT zur Verfügung. Die erzeugte Leistung und damit auch die erzielte Laufgeschwindigkeit hängen von der Schnelligkeit ab, mit der AT aus anderen Energiequellen bereitgestellt wird und/oder durch Stoffwechselprozesse nachgeliefert wird. In einer Muskelzelle kann AT rasch aus reatinphosphat (hosphocreatin = AT-Depot) gebildet werden. Bildung von reatinphosphat ist Umkehrreaktion. Enzym: reatin-kinase: reatinphosphat + AD + + AT + reatin K eq = 162 Typische Konzentrationen im ruhenden Muskel: [AT] = 4 mm, [AD] = 0,013 mm, [reatinphosphat] = 25 mm, [reatin] = 13 mm Für einen Sprinter ist reatinphosphat die auptquelle für energiereiches hosphat. Doch auch die Menge an reatinphosphat ist beschränkt. Die gespeicherten Mengen AT und hosphocreatin reichen für einen Sprint von maximal 5-6 Sekunden. Dann muss durch anaerobe Glycogenolyse und Glycolyse AT nachgeliefert werden. Bei längerem Lauf wird dann die oxidative hosphorylierung (siehe Einheiten 7 & 8) zunehmend wichtig. AT-Quellen während körperlicher Anstrengung Energie AT reatinphosphat Sekunden Minuten Stunden Aerober Metabolismus (Glycolyse, itrat- yclus, Atmungskette) Anaerober Metabolismus (Glycogenolyse, Glycolyse) Da die Glycolyse auch Moleküle produziert, die in Biosynthesen verwendet werden, wird hosphofructokinase auch durch andere, nicht in der Glycolyse vorkommende Metaboliten reguliert. itrat (itronensäurezyklus) inhibiert die hosphofructokinase. Ein hoher itratspiegel bedeutet, dass reichlich Biosynthesevorstufen vorhanden sind. itrat steigert den inhibitorischen Effekt des AT. -D-Fructose-2,6-bisphosphat aktiviert die hosphofructokinase. Es erhöht die Affinität zum Substrat Fructose-6-hosphat. Es ist ein allosterischer Aktivator (siehe auch Gluconeogenese). Außerdem wird die Aktivität der hosphofructokinase durch F6, Ammonium-Ionen und anorganisches hosphat stimuliert. 12

13 Fructose-2,6-bisphosphat ist ein allosterischer Aktivator der hosphofructokinase. In seiner Gegenwart (1 µm) wird die sigmoidale Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration hyperbolisch (A). Fructose- 2,6-bisphosphat hebt den emmeffekt von AT auf. AT als Substrat stimuliert vorerst die Aktivität. Steigt seine Konzentration, wirkt es als allosterischer Inhibitor. Wie kann man sich nun den Einfluss dieser Effektoren auf die Enzymaktivität auf molekularer Ebene vorstellen? Die allosterischen Eigenschaften der hophofructokinase lassen sich durch das Symmetrie-Modell der Allosterie erklären: Symmetriemodell: 1965 von Jacques Monod, Jeffrie Wyman und Jean-ierre hangeaux postuliert hosphofructokinase ist ein Tetramer, das aus untereinander symmetrischen rotomeren besteht. Die Untereinheiten sind funktionell identisch. Jedes rotomer kann in mindestens 2 Konformationszuständen vorliegen, T und R, die miteinander im Gleichgewicht stehen. Die molekulare Symmetrie des roteins bleibt während des Konformationswechsels erhalten, d.h. die Umwandlung erfolgt in einer konzertierten Reaktion. Das oloenzym liegt entweder in R oder in T vor. hosphofructokinase Die hosphofructokinase ist der wichtigste Regulationspunkt der Glykolyse. Ihre Aktivität wird daher durch eine Vielzahl niedermolekularer Verbindungen kontrolliert: Inhibitoren: AT (d.h. AT ist Substrat und Inhibitor!), itrat, + Aktivatoren: AD, AM, Fructose-2,6-bisphosphat, Fructose-6- hosphat, Ammonium-Ionen, anorganisches hosphat Das Enzym kann in 2 Konformationen, die miteinander im Gleichgewicht stehen, vorliegen: R T Wie jedes allosterische rotein (Enzym) ist hosphofructokinase ein ligomer, konkret ein Tetramer. Jede Untereinheit hat eine Substratund eine allosterische Bindungsstelle. Die allosterischen Effektoren bestimmen, ob das Enzym im R- oder T-Zustand vorliegt. Nur der R- Zustand hat eine hohe Affinität zum Substrat F6. hosphofructokinase (E. coli), Dimer Komplex mit AD und Fructose-1,6-bisphosphat (FB). Das humane Enzym der Leber ist ein 340 kda Tetramer. ro Untereinheit ist also eine Substrat- Bindungsstelle (AD, F6) und eine allosterische Bindungsstelle (AD) AD vorhanden. Bindung der Effektoren an die allosterische Bindungsstelle bewirkt charakteristische Konformationsänderung im aktiven Zentrum (Substratbindungsstelle). Fructose-1,6-bisphosphat 13

14 Fructose-6-hosphat: AT, Reaktionsprodukt AD: AM, AD (Aktivatoren): AT, itrat ohe Affinität für den R-Zustand, niedrige Affinität für den T-Zustand. Bindungsstelle: Substratbindungsstelle omotropischer Effekt: Binden von F6 erhöht die Affinität von weiteren F6 Molekülen. Substratbindungsstelle Allosterische Bindungsstelle ositiver heterotropischer Effekt: Binden von AM oder AD verschiebt Gleichgewicht Richtung R-Zustand. Allosterische Bindungsstelle; verschieben Gleichgewicht Richtung T-Zustand; negativer heterotroper Effekt Wieso hat das Substrat Fructose-6-hosphat, F6, zum Enzym im R-Zustand eine hohe und zum T-Zustand eine niedrige Affinität? Die Betrachung der jeweiligen dreidimensionalen Strukturen (Röntgenkristallographie oder NMR-Spektroskopie) zeigt dramatische Konformationsunterschiede im aktiven Zentrum: R-Zustand: T-Zustand: Arginin (positive Guanidiniumgruppe) ist Teil der Bindungsstelle für F6 (negative hosphatgruppe) Arginin um 180 gedreht. In die Bindungstasche zeigt nun die arboxylat-gruppe eines Glutamat- Restes (Abstoßung von F6) R-Zustand Glu 161 Arg 162 AD- Substrat R-Zustand F6 AD- Effektor Glu 161 Arg 162 hosphofructokinase (Dimer) aus Bacillus stearothermophilus AD- Effektor AD-Substrat R-Zustand Überlagerung R- und T-Zustand Vergleich R- und T-Zustand F6 Arg162 Glu161 allo- AD R T 14

15 Zusammenfassung: exokinase, hosphofructokinase und yruvat- Kinase sind also jene (allosterischen) Enzyme der Glycolyse, deren Reaktionsgeschwindigkeit von Effektoren beeinflußt wird. Enzym Inhibitoren Aktivatoren exokinase G6 hospho- fructo- Kinase AT, itrat, + AD, AM, F2,6, F6, N 4+, i yruvatkinase AT, niedriger FB Blutglucosespiegel, Anstieg des intrazellulären a 2+ -Spiegels ( hosphorylierung) AT-Quellen während körperlicher Anstrengung Energie Aerober Metabolismus (Glycolyse, itrat- yclus, Atmungskette) reatinphosphat AT Anaerober Metabolismus (Glycogenolyse, Glycolyse) Sekunden Minuten Stunden Inhaltsverzeichnis Glycolyse 1. Glucosetransport 2. Abfolge der chemischen Umwandlungen der Glucose in yruvat (10 Reaktionen) 3. Mechanismen der einzelnen Reaktionen 4. Thermodynamik und Regulation 5. Einschleusen von Galactose, Mannose, Fructose und Glycerin in die Glykolyse Neben der Glucose steht den Zellen eine Reihe anderer Zucker zur Verfügung, entweder aus der Nahrung oder aus dem Abbau von Kohlenhydratspeichern, Glycoproteinen oder Glycolipiden. Für jeden dieser Zucker gibt es spezielle Reaktionswege, die einen Anschluß an die Glycolyse ermöglichen. Beispiele: Saccharose (aushaltszucker): Glucose und Fructose Lactose (Milchzucker): Glucose und Galactose Neben Fructose und Galactose sind Mannose und die entosen Ribose, Ribulose und Xylose häufig. Auch Glycerin (siehe Triglyceride) kann in die Glycolyse eingeschleust werden. Einige exemplarische Beispiele seien erwähnt. 15

16 Mannose: Mannose Verdauung von Glycoproteinen, Glycolipiden und olysacchariden Mannose -D-Glucose -D-Mannose Glucose und Mannose sind Epimere (unterschiedliche Stellung der -Gruppe am -2) -D-Mannose - - Mannose-6- AT AD - exokinase (Mg 2+ ) hospho- mannose- Isomerase Mannose-6- phosphat 2 Fructose-6-hosphat Galactose -D-Glucose Glucose und Galactose sind Epimere (unterschiedliche Stellung der -Gruppe am -4) -D-Galactose Galactose: Verdauung des Milchzuckers Lactose. Einschleusen in Glycolyse umfasst vier Schritte (Leloir-Zyklus; Louis Leloir) Die Reaktion beginnt mit einer hosphorylierung der Galactose am -1, katalysiert durch die Galactokinase, einem Leberenzym: -D-Galactose AT AD Mg 2+ 3 Galactose-1-phosphat Im nachfolgenden Schritt wird Galactose dann gegen Glucose im UD-Addukt ausgetauscht (hosphohexose-uridyltransferase) hosphohexose- Uridyltransferase Galactose-1-phosphat 3 N N UD-Glucose (Uridin-diphosphat- Glucose) 16

17 UD-Galactose (Uridin-diphosphat- Galactose) Glucose-1-phosphat N N Glucose-1-phosphat - - Glycogenbiosynthese hosphogluco- Mutase Glucose-6-phosphat - - Glycolyse - - UD-Galactose UD-Glucose-Epimerase UD-Glucose N N N - - N Epimerase ändert die Stellung einer funktionellen Gruppe an einem konkreten -Atom, während Mutase eine funktionelle Gruppe innerhalb eines Moleküls transferiert! Die UD-Glucose-Epimerase benötigt NAD + in Spuren als ofaktor, obwohl der Reaktionsschritt keine Netto-Redoxreaktion darstellt. Grund: Reaktionsmechanismus. UD-Galactose UD NAD + NAD + + UD NAD + NAD + + UD UD-Glucose UD-Glucose wird bei der Umwandlung von Galactose in Glucose nicht verbraucht, weil sie durch die Epimerase aus UD-Galactose regeneriert wird. Diese Epimerase-Reaktion ist reversibel und das rodukt der umgekehrten Reaktion ist ebenfalls wichtig: Synthese von Galactoseeinheiten in komplexen olysacchariden und Glycoproteinen, wenn der Anteil der Galactose aus der Nahrung nicht ausreicht. Leloir-yclus: Galactose + AT Glucose-1-hosphat + AD + + Galactosämie Die angeborene Krankheit Galactosämie beruht in den meisten Fällen auf dem Fehlen der hosphohexose-uridyltransferase. Bei Kindern, die viel Milch trinken, kommt es zu hohen Galactose- Konzentrationen im Blut und in der Folge zu den typischen Krankheitsbildern: Entwicklungsstörungen, geistige Retardierung, Katarakte im Auge, Tod durch Leberschäden usw. Durch die Unterbleibung der Bildung von UD-Galactose aus Gal-1-- häufen sich 2 giftige Stoffwechselprodukte an. Ein Beispiel ist die Reduktion der Galactose zu Galactit(ol) in der Augenlinse (Enzym: Aldose-Reductase), die für die Linsentrübung (grauer Star) mitverantwortlich gemacht wird. Galactosämie-kranke Kinder dürfen keine Milch bzw. Galactose-hältige Lebensmittel konsumieren. 2 D-Galactitol 17

18 Viele Erwachse können das Kohlenhydrat der Milch, die Lactose, nicht abbauen. Folgeerscheinung: Darmstörungen. Diese Lactoseintoleranz (ypolactasie) wird vor allem durch einen Mangel des Enzyms Lactase hervorgerufen, das Lactose in Glucose und Galactose spaltet: Die Abnahme der Lactase-Konzentration beginnt schon bei Kleinkindern nach dem Abstillen und setzt sich im Erwachsenenalter fort. Die Abnahme kann aber je nach Bevölkerungsgruppen unterschiedlich stark ausgeprägt sein. Was ist die Ursache für die Darmprobleme bei Lactase-Mangel? Lactose ist eine wichtige Energiequelle für Mikroorganismen (z.b. Lactobacilli) im Dickdarm. Sie vergären Lactose zu Milchsäure (Lactat) und erzeugen dabei Methan, 4 (g), und 2 (g): Ursache für Blähungen. Zudem ist Milchsäure osmotisch aktiv und führt zum Einstrom von Wasser in den Darm (Durchfall). Fructose Fructose wird vor allem durch die Aufnahme und ydrolyse von Saccharose in den Stoffwechsel eingeführt. Sie kann direkt in die Glycolyse eintreten, da die Fructose, ebenso wie Glucose und Mannose, am -6 durch die exokinase phosphoryliert werden kann: 2 Fructose AT AD Mg 2+ exokinase Fructose-6-phosphat Jedoch ist die Affinität der exokinase zu Glucose 20-mal größer als zu Fructose. In der Leber ist der Glucosespiegel hoch und daher wird hier nur wenig Fructose-6-phosphat gebildet. Auch im Muskel ist Glucose der bevorzugte Brennstoff, der durch exokinase umgesetzt wird. Während Leber und Muskulatur mehr Glucose als Fructose phosphorylieren, erhält das Fettgewebe mehr Fructose als Glucose. Deshalb wird die Entstehung von Fructose-6-phosphat dort nur unwesentlich kompetitiv gehemmt. Im Fettgewebe tritt daher die meiste Fructose über Fructose-6- phosphat in den Stoffwechsel ein. In der Leber von Säugetieren gibt es einen alternativen Weg, bei dem die hosphorylierung durch das Enzym Fructokinase am -1 erfolgt. 2 AT AD Mg 2+ Fructokinase Fructose 2 Fructose-1-phosphat Fructose-1-phosphat wird in der Folge durch eine spezifische Aldolase in Dihydroxyacetonphosphat und Glycerinaldehyd gespalten. Klasse-I-Aldolasen: Typ A (Muskel): Spezifisch für Fructose-1,6-bisphosphat Typ B (Leber): Verwertet auch Fructose-1-phosphat - - Glycolyse - 2 Fructose-1-phosphat Dihydroxyacetonphosphat Aldolase B 2 Glycerinaldehyd 18

19 2 Glycerinaldehyd AT AD Mg 2+ Glycerinaldehyd- Kinase 2 3 Glycerinaldehyd-phosphat Glycolyse Es gibt mehrere Bedenken gegenüber einer Fructose-reichen Diät; vor allem seit Fructose als Ersatz-Süßstoff in vielen Lebensmitteln verwendet wird (früher sogar für intravenöse Ernährung verwendet). Der Mensch hat nämlich nur eine begrenzte Kapazität der Fructoseverwertung. Die Leber kann zwar Fructose rasch phosphorylieren, aber das rodukt Fructose-1-phosphat nur langsam umsetzen. Die Fructoseverwertung ist also schlecht reguliert, und eine extreme Fructosebelastung vermindert die Kapazität der Leberzellen zur AT-Bildung (der anorganische hosphat-ool wird geplündert!). Einige Menschen haben eine angeborene Enzymmangelkrankheit, die als Fructose-Intoleranz bezeichnet wird. Diese atienten haben einen Mangel an Leber Aldolase B. Auch hier kommt es zu einem Anstau von Fructose-1-phosphat und einem Mangel an AT und i in der Leber und einer bedrohlichen ypoglykämie durch Verdrängung der Glucose (Unterzuckerung bei der der Blutzuckerspiegel auf Werte unter 50 mg/dl absinkt). Wichtige rgane werden nicht mehr mit einer ausreichenden Menge Glucose versorgt. Kommt es bei Kindern mit dieser Störung zu einer länger dauernden Fructosebelastung, kann dies ernste Folgen haben. ftmals entwickeln diese ersonen aber Abneigung gegenüber allem Süßen. Mannose Glycerin Glycerin in ein wichtiger Lipidbaustein und entsteht beim Abbau von z.b. Triacylglycerinen. 2 2 Glycerin-Kinase Mg 2+ AT AD Glycerin Glycerin-3-phosphat Glycerinphosphat- 2 Dehydrogenase 2 NAD + NAD Glycerin-3-phosphat Dihydroxyacetonphosphat Alternativ: 2 2 Glycerin Glycolyse NAD + NAD + + Alkohol- Dehydrogenase AT AD 2 Glycerinaldehydphosphat Glycerinaldehyd- Kinase Glycerinaldehyd 19

20 Inhaltsverzeichnis Glycolyse 1. Glucosetransport 2. Abfolge der chemischen Umwandlungen der Glucose in yruvat (10 Reaktionen) 3. Mechanismen der einzelnen Reaktionen 4. Thermodynamik und Regulation 5. Einschleusen von Galactose, Mannose, Fructose und Glycerin in die Glykolyse 6. Schicksale des yruvats 20