In den Fußstapfen von Watson und Crick. Skriptum

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1 In den Fußstapfen von Watson und Crick Skriptum Gläsernes Labor, Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt Skriptversion:

2 Molekularbiologisches / Gentechnologisches Praktikum für die gymnasiale Oberstufe Meine Oma sagt immer: So was wie Gene kommen mir nicht ins Essen. Ich kaufe nur genfreie Tomaten!. Um zu zeigen, dass es ohne Gene gar keine Tomaten gäbe und das die DNA die eigentliche Basis allen Lebens ist, bietet das Gläserne Labor ein Praktikum rund um die DNA und Methoden modernen Molekularbiologie an. Die DNA trägt ihn ihrer Basensequenz den genetischen Code das ist nichts anderes als ein Bauplan der einmal die Struktur eines Lebewesens vorgibt, aber auch die grundlegende Information für die Moleküle unseres Körpers schafft. DNA, die Desoxyribonukleinsäure, selber ist dabei eigentlich nichts anderes als ein chemisches Molekül, welches nur durch eine Maschinerie von Biomolekülen, z.b. bei der Transkription und Translation zum Leben erweckt wird. Es unterliegt den Regel der Chemie die wasserlösliche DNA kann durch einfache chemische Methoden sichtbar gemacht (ausgefällt) werden. Im Praktikum gibt es die Möglichkeit DNA aus Mundschleimhautzellen zu isolieren Die chemische Greifbarkeit der Strickleiter des Lebens macht moderne DNA-Forschung erst möglich. So hat die Entwicklung der Polymerase-Ketten-Reaktion (oder PCR) die Molekularbiologie revolutioniert. Im Praktikum wollen wir diese Methode bei der Analyse ihrer eigenen DNA kennen lernen und anwenden. Auch die moderne Verbrechungsbekämpfung kommt heute nicht mehr ohne PCR aus. Der genetische Fingerabdruck ist erst möglich, wenn die geringen Mengen an DNA, die am Tatort gefunden werden, so vervielfacht sind, dass sie den Methoden der Molekularbiologie zugänglich werden. Anhand eines fiktiven Tatorts und fünf Verdächtigen wollen wir diese Methode vorstellen, die heute ein Standardwerkzeug der Kriminalisten revolutioniert hat. Experimente 1. DNA Extraktion und Präzipitation 2. Der Genetische Fingerabdruck 3. DNA-Analyse am Chromosom 16

3 1 DNA - Isolation DNA Extraktion und Präzipitation A) Allgemeines Desoxyribonukleinsäure (DNA) ist ein Molekül, das in allen Lebewesen vorkommt, einschließlich Bakterien, Pflanzen und Tieren, sowie in fast allen Zelltypen. Die DNA trägt die genetische Information und ist verantwortlich für die Farbe von Haar, Augen und Haut, Größe, Gesichtszüge, Blutgruppe einer Person und für fast alles andere, das eine Person einzigartig macht. Sie trägt auch die Informationen, die die Zellen brauchen, um alle Funktionen ausführen zu können, die allen Mitgliedern einer Spezies oder allen Lebewesen gemein sind und wird so manchmal als biologischer Plan bezeichnet. Ihr persönlicher Plan ist eine Kombination von der Hälfte der DNA der Mutter (aus der Eizelle) und der Hälfte der DNA des Vaters (aus dem Sperma), entstanden während der Empfängnis. Alle Ihre Zellen enthalten dieses komplette Set an Anweisungen. Jede DNA sieht gleich aus, wenn sie aus den Zellen extrahiert wurde, aber es ist aufregend, seine eigene DNA zu sehen und zu wissen, dass es das ist, was uns einzigartig und lebendig macht. In diesem Laborversuch werden Sie aus Ihren Wangenzellen Ihre eigene DNA extrahieren eine Substanz, die ihren eigenen Plan enthält. Sie werden dazu eine schnelle und einfache Methode anwenden, die Wissenschaftler routinemäßig einsetzen, um DNA aus verschiedenen Organismen zu extrahieren. B) Versuchsprinzip Im Folgenden sollen Sie sich selber überlegen, welche Hürden Sie überwinden um an DNA, beispielsweise Ihre eigene, heranzukommen. Die Beantwortung der folgenden Fragen (am besten sie diskutieren das mit ihrer ganzen Gruppe!) kann Ihnen vielleicht helfen eine Methode zu entwerfen um die DNA heute und jetzt aus Ihrem Körper zu isolieren! 1. In welchen Zellen befindet sich DNA? 2. Welche Zellen ihres Körpers sind einfach zugänglich? Enthalten diese Zellen DNA? 3. Wo befindet sich die DNA in den Zellen? 4. Wie kommen Sie an die DNA in der Zelle heran? Welche Hindernisse müssen Sie überwinden? 5. Kennen Sie die chemische Struktur dieser Hindernisse? Wie können Sie dort chemisch ansetzen? 6. Befindet sich NUR DNA in den Zellen? 7. Was ist einer der Hauptstrukturmoleküle unseres Körpers? 8. Wie kann ich solche Moleküle zerstören? 9. Wie ist die DNA in der Zelle gelagert? 10. DNA ist wasserlöslich! Was bedeutet das im chemischen Sinne? Machen Sie sich Notizen über die einzelnen Schritte, wie Sie eine DNA-Isolierung angehen würden. Denken Sie dabei auch noch mal an den PCR-Versuch zurück. Denken Sie daran, dass es nicht nur einen Weg zum Erfolg gibt. Hier ist kein detailliertes Versuchsprotokoll gefragt, denken Sie logisch und schrittweise über Problem nach und skizzieren Sie eventuelle Versuchsansätze. Überspringen Sie dabei auch Punkte an denen Sie nicht weiterkommen. Anschließend diskutieren Sie mit einem Kursbetreuer ihren schriftlich fixierten Lösungsansatz und lassen sich die benötigten Chemikalien aushändigen! 3

4 1 DNA - Isolation Entwurfsskizzen für den Versuchsablauf: 4

5 2 Genetischer Fingerabdruck A) Allgemeines Wer war der Täter? - Der Genetische Fingerabdruck Die Methode des DNA-Fingerprints wird heute routinemäßig bei der Aufklärung von Verbrechen eingesetzt. In den vergangenen Jahren gab es immer wieder neue Berichte, wie mit kleinsten Mengen DNA Individuen identifiziert wurden, die in kriminalistische Vorfälle verwickelt waren, die sogar Jahre zurücklagen. Auf der anderen Seite konnten genauso Unschuldige von Anschuldigungen entlastet werden. DNA-Fingerprinting wird eingesetzt, sowohl in medizinischen und forensischen Anwendungen, als auch in Vaterschaftstests, um die genetischen Beziehungen zwischen Individuen auf molekularer Ebene darzustellen. Dieser Praktikumsversuch ermöglicht es in die Rolle eines forensischen Wissenschaftlers zu schlüpfen und DNA Fragmente zu analysieren und zu vergleichen. Im Rahmen dieses Versuchs analysieren Sie sechs verschiedene aufbereitete DNA-Proben. Eine dieser Proben von einem hypothetischen Tatort eines Verbrechens und fünf Proben von Verdächtigen werden mit zwei Restriktionsenzymen verdaut. Die dabei entstandenen DNA-Fragmente werden mit einem Agarosegel aufgetrennt und mit DNA-Färbelösung sichtbar gemacht. Nach Analyse der Muster der Restriktionsverdaus vergleichen Sie Tatort mit Verdächtigen und ordnen dann die DNA eines Verdächtigen der am Tatort gefundenen DNA-Probe zu. B) Versuchsdurchführung Material: Chemikalien: Reaktionsgefäße, Styropor-Ständer, Gefäßständer, Microzentrifuge, Wasserbad (37 C), Gelelektrophorese-Ausrüstung Ladepuffer, Enzymmix (EcoRI/PstI), Agarose, TEA-Puffer (1x), DNA-Färbelösung Versuchsablauf Bemerkungen Schritt 1: Restriktionsverdau In diesem Schritt wird die vom Tatort aufbereitete DNA, sowie die aufbereitete DNA der fünf Verdächtigen mit den Restriktionsenzymen EcoRI und PstI verdaut, damit unterschiedlich lange DNA-Fragmente entstehen. 1. Zentrifugieren Sie alle Proben (5 farbige (1-5) und ein durchsichtiges Reaktionsgefäß (CS), stehen auf Eis) für 2 Minuten bei 6000 U/min (um die Flüssigkeit in der Spitze des Gefäßes zu sammeln). 2. Beschriften Sie neue, farblose Reaktionsgefäße mit einem Folienstift wie folgt: CS = Tatort S1 = Verdächtiger 1 S2 = Verdächtiger 2 S3 = Verdächtiger 3 S4 = Verdächtiger 4 S5 = Verdächtiger 5 5

6 2 Genetischer Fingerabdruck 3. Pipettieren Sie 10 µl jeder ihrer Proben (CS, 1-5) aus den farbigen Reaktionsgefäßen in das entsprechend beschriftete Reaktionsgefäß. Verwenden Sie für jede DNA-Probe eine frische Pipettenspitze. Die Proben sind auf den Boden jedes Reaktionsgefäßes zu übertragen. Auf diese Weise wird keine DNA von einem Röhrchen ins nächste verschleppt. 4. Pipettieren Sie 10 µl des Enzymgemisches (ENZ, es steht auf Eis) auf den Boden jedes Reaktionsgefäßes. Verwenden Sie für jede ENZ Probe eine frische Pipettenspitze. Die Reaktionsgefäße mit den DNA-Proben sollten jetzt folgendes enthalten: DNA-Proben EcoRI/PstI gesamtes (je 10 µl) Enzymmischung Reaktionsvolumen Tatort (CS) 10 µl 20 µl Tatverdächtiger Nr. 1 (S1) 10 µl 20 µl Tatverdächtiger Nr. 2 (S2) 10 µl 20 µl Tatverdächtiger Nr. 3 (S3) 10 µl 20 µl Tatverdächtiger Nr. 4 (S4) 10 µl 20 µl Tatverdächtiger Nr. 5 (S5) 10 µl 20 µl 5. Verschließen Sie die Reaktionsgefäße mit ihren Kappen (gut zudrücken) und mischen Sie die Komponenten mit dem Vortexer. Zentrifugieren Sie alle Proben (Impulszentrifugation, 30s bei Umdrehungen), damit sich die Flüssigkeit wieder am Boden des Gefäßes sammelt. (Die Reaktionsgefäße müssen gegeneinander austariert in den Rotor positioniert werden.) Wenn Sie noch nie mit einer Zentrifuge gearbeitet haben bitte einen Kursbetreuer zur Hilfe holen!!! 6. Setzen Sie die Reaktionsgefäße in den orangen Schwimmer, so dass die Gefäße bis zum Deckel drinstecken. Setzen Sie den Schwimmer in das 37 C Wasserbad (am Ende des Kurssaals) und inkubieren Sie 45 min. (Timer stellen!!). Merken Sie sich die Nummer Ihres Schwimmers! Die Restriktionsenzyme (EcoRI und PstI) beginnen beim Temperaturoptimum von 37 C jetzt die unterschiedlichen DNA- Moleküle an bestimmten Stellen, den Restriktionsschnittstellen, zu schneiden. Beginnen Sie in der Zwischenzeit Versuch 1! 6

7 2 Genetischer Fingerabdruck Schritt 2: Gelelektrophorese 1. Geben Sie 5 µl Ladepuffer LP (Pipette kontrollieren!!) in jedes Reaktionsgefäß, wobei Sie für jede Probe eine neue Pipettenspitze verwenden. Verschließen Sie die Reaktionsgefäße und mischen Sie den Inhalt mit dem Vortexer. 2. Stellen Sie den Ladepuffer anschließend wieder in den Eiskübel. Sie brauchen ihn nochmals Der Ladepuffer enthält einen Farbstoff, damit die Proben für die Beladung im Gel besser sichtbar werden, und Glycerin, was dazu führt, dass die Probe schwerer als Wasser ist. 3. Zentrifugieren Sie die Flüssigkeit in den Röhrchen ab, damit sich das ganze Volumen am Boden des Gefäßes befindet (Impulszentrifugation!). 4. Fragen Sie den Kursbetreuer nach einem Agarose-Gel und lassen Sie sich die Elektrophoresekammer zeigen. Füllen Sie diese mit soviel 1x TAE Puffer, bis das Gel mit mindestens 2mm Flüssigkeit bedeckt ist (falls das nicht eine Gruppe vor Ihnen schon getan hat). 5. Vergewissern Sie sich, dass die Starttaschen des Agarosegels sich in der Nähe der schwarzen (-) Elektrode und der Boden des Gels sich nahe der roten (+) Elektrode befindet. An beiden Seiten des Labors befinden sich die Gelelektrophorese- Ausrüstungen. TEA-Puffer sorgt für einen konstanten ph-wert von 8,0. Bei einem ph 8,0 ist die DNA negativ geladen und bewegt sich bei Anlegen einer Gleichspannung zur Anode (Pluspol). 6. Pipettieren Sie das jeweils angegebene Volumen von jeder Probe in der folgenden Reihenfolge in 7 Geltaschen, wobei Sie für jede Probe eine frische Spitze verwenden: Bahn 1: DNA-Größenmarker, 10 µl (beschriftet mit M, steht auf Eis) Bahn 2: CS 20 µl (ihre Proben!) Bahn 3: S1 20 µl Bahn 4: S2 20 µl Bahn 5: S3 20 µl Bahn 6: S4 20 µl Bahn 7: S5 20 µl Die Pipette hierfür möglichst flach halten und die Pipettenspitze nicht ins Gel einstechen. Die Probe langsam in die Geltasche einfließen lassen. Benutzen Sie dabei beide Hände, eine zum Pipettieren, die andere zum Abstützen! Notieren Sie sich die Nummer der Elektrophoresekammer in die Sie ihre Proben pipettiert haben (und merken Sie sich ob Sie die unteren oder oberen Taschen verwendet haben. Gelkammer: Taschen: 7

8 2 Genetischer Fingerabdruck 7. Setzen Sie den Deckel auf die Elektrophoresekammer. Der Deckel lässt sich nur in einer Orientierung auf die Kammer setzen. Die roten und schwarzen Anschlussbuchsen am Deckel müssen mit den roten und schwarzen Buchsen am Unterteil übereinstimmen. Verbinden Sie die Elektroden mit dem Netzgerät. 8. Sagen Sie dem Kursbetreuer Bescheid, dass Sie mit dem Beladen des Gels fertig sind. Die Elektrophorese läuft Minuten bei 120 V. Durch die angelegte Spannung wandern die DNA-Moleküle entsprechend ihrer Ladung zur Anode (+-Pol) und trennen sich der Größe nach auf (kleine Moleküle wandern leichter und schneller durch das Maschenwerk des Agarose-Gels). 9. Am Ende der Elektrophorese schalten Sie das Netzgerät ab und entfernen den Deckel der Kammer. Nehmen Sie vorsichtig den Gelträger mit dem Gel heraus. Achtung das Gel ist sehr rutschig! Lassen Sie das Gel in die Färbeschale gleiten. Schritt 3: Färbung der DNA Um die unsichtbare DNA, die im Gel befindet, sichtbar zu machen gibt es ein spezielles Färbeverfahren. Die Färbung führen Sie bitte auf der bezogenen Unterlage durch! 1. Gießen Sie 100x Färbelösung in die Färbeschale, bis das Gel komplett bedeckt ist. Färben Sie das Gel für genau 2 Minuten (Timer!). Gießen Sie die 100x Lösung mit einem Trichter wieder zurück in die Aufbewahrungsflasche. 2. Spülen Sie das gefärbte Gel mit warmem Leitungswasser (40-55 C) für ca. 30 Sekunden (zählen!) Nutzen Sie dazu das Waschbecken im Kurssaal. Gel festhalten, damit es nicht aus der Färbeschale flutscht! 3. Gießen Sie das Wasser ab und füllen Sie die Färbeschale wieder mit warmem Leitungswasser. Färben Sie für 5 Minuten und bewegen Sie die Gele einmal pro Minute leicht im Wasser. Machen Sie das Waschbecken währenddessen für ihre Mitschüler frei. 4. Gießen sie das Wasser erneut ab und füllen Sie die Färbeschale nochmals mit warmem Leitungswasser. Bewegen Sie die Gele wieder einmal pro Minute leicht hin und her. Machen Sie das Waschbecken währenddessen wieder für ihre Mitschüler frei. 8

9 2 Genetischer Fingerabdruck 5. Gießen Sie das Wasser ein letztes Mal ab und füllen Sie die Färbeschale wieder mit warmem Leitungswasser. Nehmen Sie die Färbeschale mit an Ihren Platz. Nachdem 2. Waschschritt können die DNA- Banden unscharf sein. Sie werden innerhalb von 5-15 Minuten schärfer, da die Farbstoff- Moleküle in dem Gel diffundieren und an die DNA binden. Um einen möglichst großen Kontrast zu bekommen, kann es nötig sein, zusätzliche Waschschritte mit warmen Wasser durchzuführen. Entfärben Sie bis zum gewünschten Ergebnis. Zur Dokumentation legen Sie das Gel auf einer Folie auf den Lichttisch. Schalten Sie den Lichttisch auf der Seite an. Messen Sie mit einem Geodreieck die Laufstrecke der Banden. Wichtig ist die genaue Lage der Banden! Kennzeichnen Sie, welche Probe zu welcher Bahn gehört! C) Auswertung: Quantitative Analyse der DNA-Fragmente Wenn Sie sich vor Gericht verantworten müssten, würden Sie einer Übereinstimmung aufgrund der groben Abschätzung eines Laboranten vertrauen, oder würden Sie auf einer genaueren Meßmethode bestehen? Für einen genauen Vergleich zwischen der DNA vom Tatort und der DNA des Tatverdächtigen kann man sich nicht nur auf eine Übereinstimmung nach Augenmaß verlassen, sondern man muss die Fragmentgröße quantitativ (oder numerisch) bestimmen. Dies ist im Folgenden beschrieben: 1. Mit einem Lineal wird die Wanderungsstrecke jeder einzelnen Bande ausgemessen. Es wird die Strecke (in Millimetern) von der Unterkante der Starttasche bis zur Mitte der entsprechenden DNA- Bande gemessen und in die Tabelle auf der folgenden Seite eingetragen. Die Daten in der Tabelle werden benutzt, um eine Standardkurve zu erstellen, und so die Größen der Restriktionsfragmente der DNA vom Tatort und der Tatverdächtigen abzuschätzen. 2. Zur genauen Abschätzung der Fragmentgröße der Tatort-DNA und der DNA der Tatverdächtigen, wird eine Standardkurve erstellt unter Verwendung der Abstands- (X-Achse) und Fragmentgrößendaten (Y-Achse) der Lambda/HindIII Größenmarker. Tragen Sie für die Banden 2-6 die Abstände in Abhängigkeit von der Größe sowohl auf Millimeterpapier als auch auf halblogarithmisches Papier auf (s. folgende Seiten!). Verbinden Sie mit Hilfe eines Lineals auf allen Diagrammen die Datenpunkte mit einer Linie. Verlängern Sie die Linie bis zur rechten Seite des Diagramms. 3. Entscheiden Sie, welches Diagramm, das lineare oder das halblogarithmische zur Abschätzung der DNA-Fragmentgrößen der Tatort-DNA und der Tatverdächtigen-DNA verwendet werden soll. 4. Zur Abschätzung der Größe eines unbekannten Tatort- oder Tatverdächtigen Fragments, bestimmen Sie die Wanderungsstrecke, die das Fragment zurückgelegt hat. Tragen Sie diesen Punkt auf der X-Achse der Standardkurve ein. Denken Sie sich von diesem Punkt auf der X-Achse eine Senkrechte bis zur Standardkurve und von da eine Waagrechte bis zur Y-Achse. Dort, wo die Waagrechte die Y-Achse schneidet, kann die ungefähre Größe des unbekannten DNA-Fragments abgelesen werden. Verfahren Sie entsprechend für alle DNA-Fragmente vom Tatort und von den Verdächtigen. 5. Vergleichen Sie die Fragmentgrößen der DNA vom Tatort mit denen der Tatverdächtigen. 6. Stimmen die Fragmentgrößen der DNA irgendeines Tatverdächtigen mit denen der DNA vom Tatort überein? 7. Wie sicher sind Sie, dass hier eine Übereinstimmung vorliegt? 9

10 2 Genetischer Fingerabdruck Verdächtiger 5 Größe ca (Bp) Abstand (mm) Größe ca (Bp) Verdächtiger 4 Abstand (mm) Größe ca (Bp) Verdächtiger 3 Abstand (mm) Größe ca (Bp) Verdächtiger 2 Abstand (mm) Größe ca (Bp) Verdächtiger 1 Abstand (mm) Größe ca (Bp) Tatort Lambda/ HindIII Größenmarker Abstand (mm) Reelle Größe (Bp) Abstand (mm) Bande DNA Standard Laufstrecken der Banden 10

11 2 Genetischer Fingerabdruck Zur Abschätzung der Größe eines Fragments, das von der unbekannten DNA am Tatort oder der eines Tatverdächtigen stammt, muss zunächst die Wanderungsstrecke dieses spezifischen Fragments bestimmt werden. Tagen Sie diese Strecke auf der X-Achse der Standardkurve ein. Nehmen wir einmal an, die Bande Nr. 2 des Tatverdächtigen Nr 5 sei 24 mm gewandert (A). Gehen Sie von der 24 mm Marke auf der X-Achse senkrecht nach oben zur Standardkurve und markieren Sie die Schnittstelle mit der Standardkurve durch einen schraffierten Kreis (B). Zeichnen Sie durch diese Schnittstelle eine Waagrechte bis zur Y-Achse, dieser Wert entspricht der ungefähren Größe des Fragments (C). Bande 2 des Tatverdächtigen 5 hat demnach ungefähr die Größe von 2000 Bp. Wiederholen Sie dieses Verfahren für alle Fragmente der DNA vom Tatort und der Tatverdächtigen. Tragen Sie die ungefähren Fragmentgrößen in die Datentabelle ein. 11

12 2 Genetischer Fingerabdruck 12

13 2 Genetischer Fingerabdruck D) Interpretation der Ergebnisse Wenn Sie möchten können Sie hier ihr Gel kurz skizzieren: Was soll hier bestimmt werden? Formulieren Sie noch einmal unsere zentrale Frage. 1. Welche der DNA-Proben sind fragmentiert worden? Wie würde das Gel aussehen, wenn keine Fragmentierung stattgefunden hätte? 2. Wodurch wurde die DNA fragmentiert? 3. Wovon hängt es ab, an welcher Stelle eine Restriktionsendonuklease ein DNA-Molekül schneidet? 4. Eine Restriktionsendonuklease schneidet zwei DNA-Moleküle an der gleichen Stelle. Was haben diese beiden Moleküle an dieser Stelle demnach gemeinsam? 13

14 2 Genetischer Fingerabdruck 5. Sieht es so aus, als hätte die DNA von irgendeinem Tatverdächtigen EcoRI oder PstI Erkennungsstellen an derselben Stelle auf dem Molekül wie die DNA vom Tatort? 6. Sieht es aufgrund der obigen DNA-Sequenznalyse so aus, als stamme die DNA von einem der Tatverdächtigen und die vom Tatort vom gleichen Individuum? Beschreiben Sie die wissenschaftliche Unterlage, auf die sich Ihre Schlußfolgerung stützt. Hintergrundwissen: Restriktionsenzyme Restriktionsenzyme sitzen auf einem DNA-Molekül und gleiten entlang der Helix, bis sie spezifische Basenpaarsequenzen erkennen, die dem Enzym signalisieren, anzuhalten. An dieser Stelle, der sogenannten Restriktionsschnittstelle, verdauen die Enzyme dann das DNA-Molekül (spalten es chemisch) - sie haben also gewissermaßen die Funktion von molekularen Scheren, die die DNA an bestimmten Basenpaarsequenzen schneiden. Tritt eine spezifische Restriktionsschnittstelle mehr als einmal in einem DNA-Molekül auf, so wird das entsprechende Restriktionsenzym an allen diesen Stellen schneiden und es entstehen mehrere Fragmente. Wenn also z.b. ein lineares Stück DNA-Molekül mit einem Restriktionsenzym verdaut wird, dessen spezifischer Erkennungscode an zwei verschiedenen Stellen auf dem DNA-Molekül vorkommt, entstehen drei Fragmente unterschiedlicher Länge. Ist die DNA ringförmig und wird sie mit einem Restriktionsenzym geschnitten, dessen spezifische Erkennungsstelle an zwei verschiedenen Stellen des DNA-Moleküls auftritt, so entstehen zwei Fragmente unterschiedlicher Länge. Die Länge der einzelnen Fragmente hängt davon ab, wo sich die Restriktionsschnittstellen auf dem DNA-Molekül befinden. Werden Restriktionsenzyme dazu benutzt, einzelstränge ringförmiger DNA zu schneiden, (wie in diesem Kit vorgesehen) so entstehen Fragmente unterschiedlicher Größe. Durch Restriktionsenzyme geschnittene DNA kann durch Agarose-Gel-Elektrophorese aufgetrennt und sichtbar gemacht werden. Der Begriff Elektrophorese steht für: Wanderung unter dem Einfluß elektrischer Spannung. Agarose- Gel-Elektrophorese Bei der Elektrophorese werden die DNA-Fragmente nach ihrer Größe getrennt. Die DNA-Fragmente werden auf ein Agarose Trenngel geladen, das in eine Kammer gestellt wird, die mit einer elektrisch leitenden Pufferlösung gefüllt ist. Zwischen zwei Drahtelektroden an den beiden Enden der Kammer fließt Gleichstrom. DNA-Fragmente sind negativ geladen und werden daher in einem elekrischen Feld vom positiven Pol angezogen. Die Matrix des Agarosegels dient dabei als molekulares Sieb, durch das kürzere DNA-Fragmente leichter hindurchwandern können als größere. In einem bestimmten Zeitabschnitt wandern kleinere Fragmente weiter als größere. Fragmente von der gleichen Größe bleiben zusammen und wandern in separaten DNA- Banden. 14

15 3 Polymerase-Kettenreaktion DNA - Analyse am Chromosom 16 A) Allgemeines Im folgenden Versuch werden Sie den Genotyp für den nicht-kodierenden Genabschnitt PV92 auf dem Chromosom 16 bei einer Auswahl ihrer Klassenkameraden bestimmen. Dies soll nicht dazu dienen Ihnen Verwandtschaftsverhältnisse aufzuzeigen, sondern die Methode der PCR und die Möglichkeiten einer DNA-Analyse vorzustellen. Dazu geht man folgendermaßen vor: Nach der Isolierung der DNA aus Körperzellen werden bestimmte Abschnitte durch die PCR (Polymerase Chain Reaction = Polymerase Kettenreaktion) vermehrt (mehrere Kopien der markierten DNA Abschnitte werden hergestellt) und anschließend durch Gelelektrophorese sichtbar gemacht. Die PCR ist eine Technik zur enzymatischen Vermehrung von DNA, um aus wenig Probenmaterial in wenigen Stunden genügend Material für eine genetische Analyse zu gewinnen. Das hitzestabile Enzym Polymerase wurde aus einem Bakterium namens Thermus aquaticus (Taq) isoliert. Kary Mullis hat dieses Verfahren 1985 entwickelt und damit die genetische Forschung revolutioniert. Die PCR-Methode wird heute vielfältig eingesetzt, wenn anhand bestimmter DNA-Sequenzen Nachweise geführt werden sollen; etwa: - in der Kriminalistik oder beim Vaterschaftstest - in der medizinischen Diagnostik - in der Evolutionsbiologie, um Verwandtschaftsbeziehungen und Abstammungslinien zu verfolgen. Für die DNA Analyse sucht man sich einen bestimmten DNA Abschnitt aus. Zum Beispiel möchte man aus dem abgebildeten DNA Doppelstrang den Abschnitt zwischen den grauen Linien vervielfältigen: Dazu muss man unbedingt die genaue Zusammensetzung der flankierenden Abschnitte kennen. Diese Abschnitte sind im folgenden Bild grün bzw. blau gekennzeichnet. Um einen PCR Nachweis führen zu können, müssen zwei kurze DNA-Stücke (Primer) vorhanden sein, die zu dem gesuchten DNA- Abschnitt passen. Die markierte Sequenz wird dann mit der Vorgehensweise die Sie im folgenden Protokoll selber erarbeiten werden, bis zu 1 Millionenfach kopiert. DEFINITIONEN: Denaturierung: Durch die hohe Temperatur wird der DNA-Doppelstrang in einen Einzelstrang aufgetrennt. Annealing: Anlagern der Primer an ausgesuchte DNA Abschnitte. Primer: Im Mastermix enthalten. Kurze DNA Stücke die sich an die zu untersuchenden Stellen der DNA binden und den Aufbau eines komplementären Stranges starten. Amplifikation: Vermehrung der vorhandenen DNA. Polymerase: Enzym das Bildung der neuen DNA Stränge unterstütz, die genau Kopien der ürsprünglichen DNA darstellen. heterozygot: zwei verschiedene Allele, z.b. bw/bw, mischerbig homozygot: zwei gleiche Allele, z.b. bw/bw oder BW/BW, reinerbig Allele: Formen eines Gens 15

16 3 Polymerase-Kettenreaktion B) Versuchsdurchführung Material: Eppendorf-Röhrchen, PCR-tubes, Schere, 56 C Wasserbad,100 C Wasserbad, Vortexer, Zentrifuge, Gelelekktrophorese- Ausrüstung Chemikalien: InstaGene Matrix, Haare, Mastermix, 1 x TAE Puffer, Positiv-Kontrollen (homozygot (+/+) und (-/), heterozygot (+/-), Agarose-Gel, DNA-Färbeläösung, Ladepuffer Versuchsablauf Bemerkungen TEIL A: DNA isolieren 1. Holen Sie sich ein Reaktionsgefäß, dass mit IGM (auf der Seite) beschriftet ist. Dies beinhaltet 200 µl InstaGeneMatrix. Beschriften Sie es auf dem Deckel mit Ihren Initialen. Identifizieren Sie die zwei Phasen (Matrix-Kügelchen und Pufferlösung). 2. Entnehmen Sie sich zwei Haare aus der Kopfhaut (Wichtig!!! Mit Wurzel!, Kontrolle mit Lupe). Geben Sie die Haare mit den Haarwurzeln nach unten in das Röhrchen mit Ihren Initialen und kürzen Sie sie mit der Schere auf die Länge des Röhrchens. Nehmen Sie eine Pinzette zu Hilfe, um das Haar in die Flüssigkeit zu bringen. 3. Den Deckel des Röhrchens gut schließen und das Röhrchen bei 56 C für 10 Minuten im Wasserbad inkubieren (=bebrüten, erwärmen). Dafür gibt es kleine weiße Schwimmer. Nach halber Zeit, also nach 5 Minuten herausnehmen, kurz im Vortexer mischen und kontrollieren, ob die Haarwurzel noch in der Flüssigkeit steckt (sonst mit der Pinzette hineinbringen). Für die restlichen 5 Minuten wieder ins Wasserbad stellen. 4. Wieder kurz vortexen (Haarwurzelkontrolle!) und anschließend das Röhrchen für 5 Minuten lang ins 100 C Wasserbad stellen. Die InstaGene Matrix ist eine Suspension, die Partikel in der Zellsuspension mit zum Boden des Tubes sinken lässt, um die PCR nicht zu stören. Es ist wichtig, dass die Haarwurzeln in der Flüssigkeit stecken, dort findet die Zell- Aufspaltung statt. Die Zellverbände lockern sich und DNAabbauende Enzyme werden gehemmt. Alle Proteine denaturieren, werden unlöslich und fallen aus. 5. Das Röhrchen kurz vortexen. 6. Anschließend bei 6000 U/min für 5 Minuten zentrifugieren (die Röhrchen genau austarieren, d.h. gleich beladene Röhrchen genau gegenüber in den Rotor stellen!) Der Überstand der flüssige Bestandteil- enthält nun die DNA. Das Pellet, also der feste, unten im Reaktionsgefäß sitzende Bestandteil, enthält die InstaGeneMatrix-Partikel und denaturiertes Protein, die wir nicht für den Versuch brauchen! 16

17 3 Polymerase-Kettenreaktion TEIL B: PCR Polymerase Chain Reaction 1. Besorgen Sie sich aus dem Eiskübel ein kleines Reaktionsgefäß mit Mastermix (unbeschriftet, enthält gelbe Flüssigkeit). Beschriften Sie es mit Ihren Initialen. Bei diesen geringen zu pipettierenden Mengen muss man darauf achten, dass nichts an der Wand des Röhrchens hängen bleibt, sondern sich alles in der Spitze sammelt. Mastermix= Polymerase, Nukleotide, Primer, Puffer, Farbstoff, Glycerin 2. Pipettieren Sie 20 µl des Überstandes Ihrer Probe zum Mastermix.. Mischen Sie, indem Sie die Suspension 2-3 mal mit der Pipette anziehen und ablassen. Die neu entstandene Mischung sollte gelb sein. 3. Achten Sie beim Pipettieren darauf, dass Sie die IGM-Kügelchen nicht aufwirbeln (nur die Flüssigkeit vorsichtig pipettieren), die Kügelchen stören bei der PCR 4. Unbedingt sofort die Mischung wieder auf Eis stellen! Dort belassen bis beide Gruppen an Ihrem Tisch die PCR-Röhrchen fertig haben. 5. Mit dem Eiskübel zum PCR-Gerät gehen. Das Reaktionsgefäß direkt vom Eis holen und zur PCR in den Thermocycler stellen. Die Reaktion besteht aus 40 Cyclen PCR Amplifikation, d.h. die nebenstehenden Schritte werden 40 mal wiederholt. Programm des Thermocyclers: - Pre-Denaturation: 2 min bei 94 C -Denaturieren: 1min. bei 94 C: DNA- Doppelstrang teilt sich in zwei Einzelstränge -Annealing: 1 min. Bei 60 C: Primer lagern sich an zu schneidende Stellen an -Extensionsphase:2 min. Bei 72 C: Polymerase baut an die Primer an. Entwerfen Sie eine einfache Skizze zur Darstellung der einzelnen PCR-Schritte! (=>nächste Seite) Was ist das Ergebnis jeden PCR-Schrittes? Warum führt man bis zu 40 Zyklen durch? Skizze für PCR-Überblick: 17

18 3 Polymerase-Kettenreaktion TEIL C: Gelelektrophorese 1. Die Proben aus dem Thermocycler holen. Die Probe bei 2000 U/min für 3 sec. zentrifugieren (Zentrifuge austarieren!). 2. Pipettieren Sie 5 µl Ladepuffer zu Ihrer Probe und mischen Sie vorsichtig. 3. Nehmen Sie ihre Proben und eine 20 µl-pipette 4. Geben Sie 20 µl Ihrer Probe in die entsprechende Geltasche (In die ersten 4 Geltaschen werden die Positiv-Kontrollen pipettiert). Dazu am Besten die Pipette leicht schräg halten und aufpassen, dass die Pipettenspitze nicht die Geltasche durchsticht. Notieren Sie die Nummer der Geltasche in die Sie pipettieren, um später bei der Auswertung Ihre Probe genau identifizieren zu können. Die Kursassistent ist Ihnen beim Anschließen der Gelkammern behilflich. 5. Setzen Sie den Deckel auf die Elektrophoresekammer. Der Deckel lässt sich nur in einer Orientierung auf die Kammer setzen. Die roten und schwarzen Anschlussbuchsen am Deckel müssen mit den roten und schwarzen Buchsen am Unterteil übereinstimmen. Verbinden Sie die Elektroden mit dem Netzgerät. Der Ladepuffer enthält einen Farbstoff, damit die Proben für die Beladung im Gel besser sichtbar werden, und Glycerin, was dazu führt, dass die Probe schwerer als Wasser ist. 6. Sagen Sie dem Kursbetreuer Bescheid, dass Sie mit dem Beladen des Gels fertig sind. Die Elektrophorese läuft ca. 30 Minuten bei 100 V. Durch die angelegte Spannung wandern die DNA-Moleküle entsprechend ihrer Ladung zur Anode (+-Pol) und trennen sich der Größe nach auf (kleine Moleküle wandern leichter und schneller durch das Maschenwerk des Agarose-Gels). 7. Am Ende der Elektrophorese schalten Sie das Netzgerät ab und entfernen den Deckel der Kammer. Nehmen Sie vorsichtig den Gelträger mit dem Gel heraus. Achtung das Gel ist sehr rutschig! Lassen Sie das Gel in die Färbeschale gleiten. 18

19 3 Polymerase-Kettenreaktion Teil D: Färbung der DNA Um die unsichtbare DNA, die im Gel befindet, sichtbar zu machen gibt es ein spezielles Färbeverfahren. 1. Lassen Sie die Gele vom Gelträger in die Färbeschale gleiten. Gießen Sie 100x Färbelösung in die Färbeschale, bis das Gel komplett bedeckt ist. Färben Sie das Gel für genau 2 Minuten. Gießen Sie die 100x Lösung mit einem Trichter wieder zurück in die Aufbewahrungsflasche. 2. Spülen Sie das gefärbte Gel mit heißem Leitungswasser (40-55 C). Bewegen sie das Gel im Wasser für ca. 10 Sekunden. Gel festhalten, damit es nicht aus der Färbeschale flutscht! 3. Gießen sie das Wasser ab und füllen Sie die Färbeschale wieder mit heißem Leitungswasser. Bewegen Sie die Gele einmal pro Minute leicht im Wasser. 4. Wiederholen Sie Schritt Gießen Sie das Wasser ab und füllen Sie die Färbeschale wieder mit heißem Leitungswasser. Nehmen Sie die Färbeschale mit an Ihren Platz.Nach dem 2. Waschschritt können die DNA- Banden unscharf sein. Sie werden innerhalb von 5-15 Minuten schärfer. Das kommt von den Farbstoff- Molekülen, die in das Gel wandern und sich fester an die DNA binden. Um einen möglichst großen Kontrast zu bekommen, kann es nötig sein, zusätzliche Waschschritte mit warmen Wasser durchzuführen. Entfärben Sie bis zum gewünschten Ergebnis. Zur Dokumentation legen Sie das Gel in einer Folientasche auf eine helle Unterlage. Skizzieren Sie die Umrisse, die Starttaschen und die Banden des Gels. Kennzeichnen Sie, welche Probe zu welcher Bahn gehört! 19

20 3 Polymerase-Kettenreaktion C) Auswertung / Fragen Werten Sie nach dem Beispiel der unten abgebildeten Bandenvordrucke Ihre DNA aus. Dazu gehen Sie folgendermaßen vor: 1. Vergleichen Sie Ihre Bande mit den Banden der Kontrollen: homozygot +/+, homozygot -/- und heterozygot +/-. 2. Beachten Sie, dass die genetische Bestimmung nur an einem unkodierten Locus (=Chromosomenabschnitt) auf Chromosom 16 erfolgt ist, d.h. dass sich keine genetische Information auf dem analysierten Genabschnitt befindet, sondern lediglich die für jeden Menschen charakteristische Länge eines DNA-Fragments bestimmt wurde. Linie 1 zeigt den DNA load molecular mass ruler mit 1.000, 700, 500, 200 und 100 Basenpaaren. Linie 2 = Positiv-Kontrolle homozygot (+/+) Linie 3 = Positiv-Kontrolle homozygot (-/-) Linie 4 = Positiv- Kontrolle heterozygot (+/-) Linien 5-20 sind Ergebnisse von Schüler-DNA. Es ist vollkommen normal, dass manche Schüler-DNA sich nicht amplifiziert hat und somit unerkannt bleibt (siehe Linien 8 und 15). 20

21 >Das Helmholtz-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit Das Helmholtz-Zentrum konzentriert die Forschungsarbeiten auf eine der wichtigsten Fragen unserer Gesellschaft, die Gesundheit des Menschen in seiner Umwelt. Ziel ist es, Risiken für die menschliche Gesundheit durch Umweltfaktoren zu erkennen, Mechanismen der Krankheitsentstehung zu entschlüsseln sowie Konzepte zu entwickeln, um die Gesundheit des Menschen und seine natürlichen Lebensgrundlagen auch für die Zukunft zu schützen. Als Forschungseinrichtung des Bundes und des Freistaats Bayern mit Sitz in Neuherberg, im Norden Münchens, sind wir Mitglied der Helmholtz-Gemeinschaft, der größten öffentlichen Forschungsorganisation Deutschlands. > Über das Gläserne Labor Das Gläserne Labor wurde speziell für Schülerinnen und Schüler eingerichtet. Hier sollen sie zu bestimmten naturwissenschaftlichen Themen möglichst eigenständig, aber natürlich nach Anleitung, experimentieren und dabei entdecken, wie faszinierend naturwissenschaftliche Phänomene sind und Spaß haben an der Experimentier- und Forschertätigkeit. Zusätzlich sollen die Schülerinnen und Schüler das Helmholtz-Zentrum als Forschungseinrichtung kennen lernen und verstehen, wie Grundlagenforschung funktioniert und warum sie wichtig bzw. nötig ist. Je nach Thema werden aktuelle Forschungsprojekte des Helmholtz-Zentrums vorgestellt. Das Helmholtz-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit übernimmt als Mitglied der Helmholtz- Gemeinschaft Verantwortung für die Qualität der naturwissenschaftlich-technischen Bildung unserer Kinder. Das Gläserne Labor dient als Institution, um dieser Anforderung durch unterrichtsergänzende Angebote gerecht zu werden. Es wurde am Helmholtz Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit mit großzügiger finanzieller Unterstützung der Helmholtz-Gemeinschaft eingerichtet. > Weitere Informationen Besuchen Sie uns im Internet. Dort finden sie aktuelle Informationen und das Anmeldeformular: Bei Fragen stehen wir telefonisch unter zur Verfügung. Auf ein baldiges Wiedersehen freut sich ihr Team vom Gläsernen Labor! Gläsernes Labor Abteilung Öffentlichkeitsarbeit Helmholtz-Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit Ingolstädter Landstrasse Neuherberg 21