Protokoll Basismodul Biologie Praxis I: Biochemie

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1 Protokoll Basismodul Biologie Praxis I: Biochemie Veranstalter: Prof. Dr. Armin Hallmann Gruppe 2B / 1. Semester: Silke Ammerschubert () Jörg Mönnich () Michael Tiefuhr ( Betreuer: Kai 1. Versuchstag: Dienstag, Versuchstag: Dienstag,

2 Inhaltsverzeichnis: Versuch 1: Zellaufschluss der Bierhefe S. 3-5 Einleitung S. 3 Material, Methoden S. 3 Ergebnisse S. 4 Diskussion S. 5 Versuch 2: Proteine: Gelfiltration des Hämoglobins S. 6-8 Einleitung S. 6 Material, Methoden S. 6 Ergebnisse S. 8 Diskussion S. 8 Versuch 3: Proteinbestimmung (nach Lowry) S Einleitung S. 9 Material, Methoden S. 9 Ergebnisse S. 10 Diskussion S. 10 Versuch 4: Trennung von Proteinen: SDS - Polyacrylamidgelelektrophorese S Einleitung S. 12 Material, Methoden S. 12 Ergebnisse S. 14 Diskussion S. 15 Versuch 5: Lactat-Dehydrogenase S Einleitung S. 16 Material, Methoden S. 17 Ergebnisse S. 18 Diskussion S. 22 Versuch 6: Fettsäuren: Dünnschichtchromatographie S Einleitung S. 25 Material, Methoden S. 25 Ergebnisse S. 26 Diskussion S. 27 Kopien, welche zu den Versuchen gehören, jedoch nicht eingescannt werden konnten, befinden sich am Ende des Protokolls

3 Versuch 1: Zellaufschluss der Bierhefe Einleitung Bierhefezellen, systematisch den Pilzen zugeordnet, gehören zu den eukaryotischen Zellen. Da sie leicht zu kultivieren sind, werden sie oft für modellhafte Versuche bezüglich der Eukaryoten verwendet. Dazu muss man an das Innere der Zelle kommen, also die Zellwand aufbrechen (Aufschluss der Zelle). Bierhefezellen haben eine recht robuste Zellwand; das folgende Experiment untersucht eine Möglichkeit, den Aufschluss dieser Zellen herbeizuführen. Material, Methoden Hefesuspension 0,1 M Phosphatpuffer (ph 7,5) Glasperlen ( 0,45-0,50 mm) Hefezellen aus dem Brauhaus Bielefeld werden vorab mikroskopiert, um das Erscheinungsbild zu ermitteln. Anschließend werden die Zellen in drei Ansätze zu je 1,5 ml aufgeteilt. Die drei Ansätze werden nun gewaschen : Dazu werden sie jeweils in ein 2 ml Reaktionsgefäß ( Eppi ) pipettiert und drei Minuten bei 5000 Umdrehungen/Minute in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert. Nach Abgießen des Überstandes werden 1,5 ml Phosphatpuffer hinzu gegeben, mittels Vortex vermischt und anschließend wieder zentrifugiert. Der Überstand wird danach ebenfalls abgegossen. Das verbleibende Hefepellet wird in 1 ml Phosphatpuffer resuspendiert. In zwei Vorbereitete Eppis mit 0,1 g und 1,1 g Glasperlen wird nun jeweils eine Hefesuspension gegeben. Der dritte Ansatz bleibt zur Kontrolle ohne Glasperlen. Die Reaktionsgefäße werden gut verschlossen sieben mal zwei Minuten gevortext, dazwischen je zwei Minuten bei Raumtemperatur gelagert

4 Beim Vortexen sollen die Glasperlen durch Ihren Aufprall, Scherkräfte und lokal erzeugten Unterdruck die Zellwände der Hefezellen aufbrechen. Nach dem letzten Schütteln auf dem Vortex werden die drei Proben etwa zwei Minuten gelagert, damit sich die Glasperlen absetzen können. Nun wird von jeder der drei Proben ein Tropfen auf einen Objektträger gebracht und mit einem Deckplättchen versehen. Unter dem Lichtmikroskop werden von jeder Probe fünf Sichtfelder ausgewählt, in denen sich idealerweise Zellen befinden (evtl. die Probe verdünnen). Man zählt diese Felder nun aus und ermittelt hierbei nun das Verhältnis intakter zu aufgebrochenen Zellen. Ergebnisse Tabelle 1.1: Auszählungsergebnisse 0,1 g Glasperlen 1,1 g Glasperlen Intakte Zellen Aufgebrochene Zellen Intakte Zellen Aufgebrochene Zellen Nach Auszählung und Umrechnung in Prozent erhält man folgende Ergebnisse: Hefesuspension mit 1,1 g Glasperlen: Etwa 9,5% der Zellen wurden aufgebrochen Hefesuspension mit 0,1 g Glasperlen: Etwa 2,1% der Zellen wurden aufgebrochen Hefesuspension ohne Glasperlen: Keine aufgebrochenen Zellen - 4 -

5 Diskussion Wie zu erwarten, wurden durch eine größere Menge Glasperlen mehr Zellen aufgebrochen und auch die Tatsache, dass in der Probe ohne Glasperlen keine Zellwände zerstört wurden, war durchaus vorhersehbar. Insofern gab es keinerlei Überraschungen. Bemerkenswert jedoch ist, dass nach der im Material und Methoden-Teil beschriebenen Behandlung nicht ein höherer Anteil aufgebrochener Zellen zu finden ist. Die Schlussfolgerung wäre, dass die Zellwände bei Hefezellen äußerst stabil sind

6 Versuch 2: Proteine: Gelfiltration des Hämoglobins Einleitung Dieses Experiment stellt die Trennmethode nach Molekülgröße vor und soll dazu dienen, dass Protein besser zu verstehen. Das Protein wird aufgetrennt und in seinen Einzelteilen dargestellt. Hierbei hilft uns die Sephadex-Säule (siehe Abb. 2.1 Sephadex-Säulenfunktionsprinzip) die wie später vorgestellt, dafür sorgt, dass durch stattfindende Farbveränderung die Bestandteile des Hämoglobins visuell erkennbar sind. Material, Methoden Citratblut vom Rind, das auf 1 L Blut mit 3,8 g Trinatriumcitrat-dihydrat gemischt wird, um eine Gerinnung des Blutes zu verhindern. Gelfiltrationssäule, die einen Durchmesser von 0,5 cm und eine Länge von 30 cm besitzt; sie ist mit Sephadex G- 50 coarse in Phosphatpuffer gefüllt. Das Gemisch ist ph-neutral und ist von den Betreuern vorbereitet worden. Phosphatpuffer (hypoten) ph 7,0 20mM Phosphatpuffer (isoton) ph 7,0 150 mm Hexacyanoferrat (Kalium-Salz) 1 M Natriumdithionit (wird in Wasser gelöst) 15 mg/ml Oxidation von Hämoglobin Es werden 2 Reaktionsansätze in Eppis zusammen pipettiert, die sich in der Konzentration des Phosphatpuffers unterscheiden: Je 0,1 ml Rinderblut mit je 1 ml Phosphatpuffer zu 20 mm und 150 mm, danach erfolgt die Zugabe von 0,01 ml Hexacyanoferrat (III)

7 Gelfiltration und Reduktion von Methämoglobin: Die Sephadex-Säule wird dazu genutzt, Proteine ihrer Größe nach aufzutrennen. Die Poren werden von oben nach unten hin größer und führen dazu, dass Moleküle ihrer Größe nach, angefangen mit den Kleinsten zu den Abb. 2.1: Funktionsprinzip der Sephadex-Säule. Die schematisch dargestellte Sephadex-Säule macht deutlich, wie in Fließrichtung die kleineren Moleküle im oberen Bereich, und die größeren Moleküle mit zunehmender Größe der Poren abgefangen werden. Größten abgefangen werden. Prinzip: Molekularsieb. Die flüssige Phase der Säule wird mit 30 ml Puffer ersetzt, danach der - 7 -

8 Flüssigkeitsspiegel bis zum Gelmaterial abgesenkt. 0,2 ml Natriumdithionit- Lösung (Reduktionsmittel) wird auf die Säule aufgetragen. Nun erfolgt die Nachwäsche mit 0,5 ml und 1,0 ml Puffer (warten, bis die gesamte Flüssigkeit in das Gel eingedrungen ist). Anschließend werden 0,5 ml Methämoglobinlösung aufgetragen und es erfolgt eine erneute Nachwäsche mit zwei Mal Puffer zu 20 mm. Zum Ende wird die Säule mit Puffer aufgefüllt, und man kann nun die Färbung beobachten. Danach wird soviel Puffer nachgefüllt, bis die Säule wieder frei von Färbung ist. Ergebnisse Bei der Oxidation des Hämoglobins ist eine rostbraune Färbung zu sehen. Bei der anschließenden Gelfiltration kann man einen Farbumschlag von eben diesem Rostbraun zum normalen Blutrot beobachten. Diskussion Durch die Zugabe des Oxidationsmittels Hexacyanoferrat (III) wird das Eisenatom im Hämoglobin, welches eigentlich als Eisen (II) vorkommt, zu Eisen (III) oxidiert. Der hypotone Puffer sorgt in Verbindung mit dem Hexacyanoferrat (III) dafür, dass das Hämoglobin aufplatzt und sich dadurch das Eisenatom, welches das Zentrum des Hämoglobins bildet, oxidiert und das Blut eine rostfarbene Färbung erhält. Während der Gelfiltration kann man eine Farbveränderung von bräunlich bis rot erkennen. Im oberen Teil ist das Natriumdithionit mit dem Methämoglobin bräunlich. Mit zunehmendem Fluss nach unten wird das Methämoglobin durch den im Puffer gelösten Sauerstoff zu Hämoglobin reduziert. Dies erklärt die rötliche Färbung. Im unteren Teil verändert sich auch die Oxidationsstufe des Eisens. Eine Oxygenierung findet statt und das Methämoglobin wird zum Hämoglobin reduziert

9 Versuch 3: Proteinbestimmung (nach Lowry) Einleitung Die Methode zur Proteinbestimmung nach Lowry ist eine einfache, also ohne großen Aufwand zu betreibende, jedoch relativ zeitaufwendige Methode, um die Proteinkonzentration einer Probe quantitativ zu bestimmen. Man kann im Laufe des Versuches einen Farbumschlag in blau erkennen, welcher intensiver wird, je mehr Protein die Probe enthält. Vergleicht man diese Färbung mit einer zuvor angelegten Eichreihe, lässt sich so die ungefähre Proteinkonzentration ablesen. Genaue Werte bekäme man durch Messung im Photometer, welches jedoch in diesem Versuch nicht zur Anwendung kommt. Möglich wird diese Art der Bestimmung durch zwei nacheinander eingeleitete Reaktionsschritte: Man erstellt zunächst durch Mischung ein alkalisches Cu 2+ - Reagenz (s. Material, Methoden), welches zur Probe gegeben wird. Die Proteine der Probe reagieren mit dem Kupfer des Reagenz. Im zweiten Schritt wird Folin-Reagenz hinzu gegeben. Dieses wird durch den im ersten Schritt entstandenen Protein-Kupfer-Komplex (genauer: Durch die Aminosäuren Tyrosin und Tryptophan) reduziert und bildet eine charakteristische blaue Färbung. Material, Methoden Für das Cu-Reagenz werden folgende Lösungen benötigt: Lösung A: Na 2 CO 3 in 0,1 N NaOH 3 % (w/v) Lösung B: K, Na-Tartrat 4 % (w/v) Lösung C: CuSO 4 x 5H 2 O 2 % (w/v) Man mischt je 0,2 ml B und C und füllt mit A auf 20 ml auf und erhält somit das Cu-Reagenz. Anschließend wird dem Pipettierschema aus Tabelle 3.1 folgend die Eichreihe mit bekannten Mengen an Proteinen, in diesem Fall Serumalbumin, erstellt. Das Kupferreagenz wird in gleicher Menge (s. Tab. 3.1) auch zu den Proben x und y gegeben, dessen Proteinkonzentration herauszufinden ist. Zu beachten ist hier, dass insgesamt das Verhältnis Cu

10 Reagenz/Probe immer gleich ist, damit man die Farbintensität vergleichen kann. Man lässt nun die Ansätze bei Raumtemperatur 10 Minuten inkubieren, gibt danach jeweils 0,2 ml Folin-Ciocalteu-Lösung hinzu und mischt das Ganze gründlich auf dem Vortex. Wichtig ist, dass man die Lösung innerhalb kürzester Zeit einmischt. Nach dem Einmischen lässt man die Ansätze weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren (Man kann die Färbungen auch schon nach 15 Minuten erkennen, doch werden diese mit zunehmender Zeit besser erkenn- und somit auch besser unterscheidbar.). Nach Ablauf der Zeit kann man nun die Farbintensität der Proben mit unbekannter Proteinkonzentration mit der Eichreihe (Proben 1-5) vergleichen. Tabelle 3.1: Pipettierschema der Eichreihe (Proben 1-5) und der Proben mit unbek. Proteinkonzentration (x, y) Probe x Y Serumalbumin- Lösung(1mg/ml) 0,00ml 0,05ml 0,075ml 0,10ml 0,20ml - - unbekannte Proben ,20ml 0,20ml Wasser 0,20ml 0,15ml 0,125ml 0,10ml 0,00ml - - Cu-Reagenz 2,50ml 2,50ml 2,50ml 2,50ml 2,50ml 2,50ml 2,50ml Ergebnisse: Beim Vergleich der Farbintensität der Proben x und y mit jener der Proben mit bekannter Menge an Serumalbumin lässt sich feststellen, dass Probe x keine Färbung aufweist und Probe y die gleiche Färbung wie Probe 3 hat. Diskussion: Aus dem Vergleich der Farbintensitäten lässt sich schließen, dass sich in Probe x kein Protein befindet, da weder Probe 1, in welcher sich kein Serumalbumin befindet, noch Probe x eine Färbung aufweist. Da Probe y die gleiche Färbung wie Probe 3 aufweist, lässt sich, da die Konzentration der Serumalbumin- Lösung in der Eichreihe 1 mg/ml beträgt, auf einen Proteingehalt von 0,075 mg schließen

11 Allerdings ist dies nur ein Schätzwert, da auf den Einsatz eines Photometers verzichtet wurde und somit keine exakten Werte ermittelt werden konnten. Weiterhin wurde die Inkubationszeit nach Zugabe der Folin-Ciocalteu-Lösung auf Empfehlung des Betreuers auf 15 Minuten reduziert, was ebenfalls eine Messungenauigkeit bedeutet

12 Versuch 4: Trennung von Proteinen: SDS - Polyacrylamidgelelektrophorese Einleitung Mit diesem Experiment erlernt man eine Möglichkeit, verschiedene Substanzen auf ihr spezifisches Molekulargewicht hin zu untersuchen. In diesem Fall wird mit Hilfe der SDS Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) das Molekulargewicht des Serumalbumins ermittelt. Viele Moleküle enthalten ionisierbare Gruppen und sind in gelöster Form positiv oder negativ geladen. Bringt man sie auf ein elektrisches Feld auf, wandern sie zum ihrer Eigenladung entgegen gesetzten Pol. Die Wanderungsgeschwindigkeit hängt dabei von Ladung, Molekülmasse/ -größe, sowie der Substanz und dem ph-wert des Trennmediums ab. Vor der SDS-PAGE wird das zu untersuchende Protein mit SDS (Natriumdodecylsulfat) gemischt und inkubiert; dabei bindet das SDS mit seinem aliphatischen Rest an die hydrophoben Bereiche des Proteins, welches dadurch negativ geladen wird. Damit wandern so behandelte Proteine zur Anode. Das spezifische Molekulargewicht lässt ein Protein dann an einer bestimmten Stelle des Gels (Erklärung folgt im Material-Teil) auflagern. Es entstehen Banden. Da für den zu benutzenden Proteinstandard (als Eichreihe) die Gewichte im Skript ausgewiesen sind, kann man nach der SDS-PAGE einen graphischen Vergleich anstellen und so das Molekulargewicht des Serumalbumins feststellen. Material, Methoden Polyacrylamidgel Elektrophoreseapparatur Spannungsgerät Eppendorfinkubator Elektrodenpuffer

13 Probenpuffer nach Lämmli Coomassie-Färbelösung Entfärber Bei der SDS-PAGE wird ein Polyacrylamidgel zwischen zwei Glasplatten (Abstand ca. 0,5 cm, mit Gummidichtungen abgedichtet) gegossen. Die unteren ca. 5 cm sind das Trenngel, ph-wert 8,8. Darauf befindet sich das Sammelgel, ph-wert 6,8, etwa 3 cm hoch. Beim Gießen des Sammelgels werden mit Hilfe eines Teflonkamms kleine Einbuchtungen (Geltaschen) ausgespart, um das saubere Aufbringen der zu testenden Substanzen zu gewährleisten. Nun wird eine Spannung angelegt, mit der Kathode am oberen und der Anode am unteren Ende. Für den Versuch wurde uns das Gel fertig gegossen und am Spannungsgerät angeschlossen zur Verfügung gestellt. Vorbereitung der Probe: 5 µl Serumalbumin (1 µg / ml) wird mit 5 µl Probenpuffer gemischt, der durch ein SH-Reagenz (β-mercaptoethanol) Disulfid-Brücken trennt. Bei der anschließenden Inkubation (3 Minuten, 95 C) vom Protein-Standard und dem Serumalbumin-Probenpuffer-Gemisch denaturieren die Proteine. Beide Proben werden 1 Minute bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert. Nun werden je 5 µl der Proben mit dem 20 µl Pipetman in je eine Geltasche injiziert. Die Elektrophorese wird gestartet: 60 Minuten bei 25 ma. Nach Beendigung der Elektrophorese wird das Gel in einer Schale mit Coomassie- Färbelösung geschwenkt, dass das Gel in Bewegung bleibt. Nach 20 Minuten wird die Färbelösung gegen Entfärber ausgetauscht, der wiederum nach Minuten erneuert wird. Abschließend wird das Gel getrocknet

14 Ergebnisse Der Protein-Standard (Abb. 4.2, rechts; zum Vergleich der Molekulargewichte s. Abb. 4.1: Protein- Standard Abb )hat sich in verschiedene, dem jeweiligen Protein- Molekulargewicht entsprechende Banden aufgeteilt; das Serumalbumin ergibt eine dicke Bande (Abb. 4.2, links). Anhand des Vergleiches der Wanderungsstrecken vom Protein- Standard mit der Wanderungsstrecke des Serumalbumins kann man nun graphisch (Diagramm 4.1 und Gerade auf dem Halb-Logarithmischen Papier im Anhang) das Molekulargewicht des Serumalbumins ermitteln. Dazu werden die Wanderungsstrecken in ein Diagramm eingezeichnet und die des Serumalbumins mit der des Protein-Standards verglichen. Das Serumalbumin hat ein Molekulargewicht von etwa 65 kda. Abb. 4.2: Scan des Gels aus dem Versuch 300 Molekulargewicht (kda) Wanderungsstrecke des Serumalbumins 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 Wanderungsstrecke (cm) 1 Skript: S. 27, Abb

15 Diskussion Auch der Vergleich mit den Gelen anderer Versuchsgruppen ergibt die gleiche Bandenaufteilung. Die SDS-PAGE ist also eine zuverlässige Methode zur Gewichtsbestimmung von Molekülen

16 Versuch 5: Enzymtest: Lactat-Dehydrogenase Einleitung Viele der in der Zelle ablaufenden chemischen Reaktionen benötigen Katalysatoren (Stoffe, die die Reaktionsrate verändern, ohne jedoch dabei selbst verbraucht zu werden), um beschleunigt oder teilweise überhaupt ablaufen zu können. Da für die Reaktionen Aktivierungsenergie normalerweise in Form von Wärme benötigt wird und diese Energie zumeist nicht in ausreichendem Maß, bedingt z.b. durch die Körpertemperatur, vorhanden ist, werden diese Katalysatoren benötigt, um die einzusetzende Aktivierungsenergie zu minimieren. Auf diese Weise werden Reaktionen beschleunigt. Die Katalysatoren in der Zelle werden Enzyme genannt. Enzyme sind eine bestimmte Art von Proteinen, welche hochspezifisch in Bezug auf die Art der Reaktion und das umzusetzende Substrat wirken. Dies beruht auf der Form des aktiven Zentrums, welches das Substrat bindet und an welchem die Umsetzung des Substrates in das Produkt (bzw. die Produkte) stattfindet. Lagert sich ein passendes Substrat an, verändert sich das aktive Zentrum, sodass es besser passt. Man spricht hier von induced fit. Ist die Umsetzung erfolgt, wird das Produkt freigesetzt und das Enzym kann das nächste Substrat aufnehmen. Dieser Vorgang kann bis zu einigen tausend Mal in der Sekunde ablaufen. Das Enzym, welches in diesem Versuch zum Einsatz kommt, ist die Lactat- Dehydrogenase (LDH). Es setzt das bei der anaeroben Erzeugung von ATP während der Glycolyse entstandene Lactat in der Leber zu Pyruvat um. Anders herum wird durch LDH Pyruvat zu Lactat reduziert, um durch gleichzeitige Oxidation von NADH NAD + für die Glycolyse bereit zu stellen. Dies bedeutet für den Organismus einen Zeitgewinn durch die sofortige Bereitstellung von Energie z.b. für die Flucht und lagert einen Teil des Stoffwechsels in die Leber aus. In diesem Experiment soll die Menge an Pyruvat in einer Probe bestimmt und die Beeinflussung der Umsatzgeschwindigkeit der durch LDH katalysierten

17 Reaktion durch die Substratkonzentration mittels Photometer gemessen werden. Man kann die Aktivität von LDH nicht direkt bestimmen, muss also den indirekten Weg über die Bestimmung der NADH-Konzentration gehen. Möglich wird dies, da bei der Reduzierung von Pyruvat NADH zu NAD + oxidiert wird und sich somit die Konzentration von NADH zwangsläufig ändert. Da der Extinktionskoeffizient von NADH bekannt ist, kann man durch das Einsetzen der im Photometer ermittelten Veränderung der Extinktion ( E) in das Lambert- Beer sche Gesetz (c= E*(d*ε) -1 ) die Ausgangskonzentration an Pyruvat errechnen. Ähnlich verhält es sich bei der Ermittlung der Umsatzgeschwindigkeit: Da die Extinktion in kurzen Zeitintervallen gemessen wird und die Reaktionsgeschwindigkeit am Anfang konstant ist, lässt sich, in ein Diagramm eingezeichnet, die Veränderung der Extinktion ablesen. Über die Gleichung n = c * V Küvette, wobei man c durch oben genanntes Äquivalent des Lambert-Beer schen Gesetzes ersetzt, kann man nun die Umsatzgeschwindigkeit errechnen. Material, Methoden Für die Experimente werden folgende Reagenzien verwendet: Imidazolpuffer 1 M, ph 7,5 NADH 12 mm Lactat-Dehydrogenase 18u/µl (1:250 verdünnt) Weiterhin werden unbekannte Mengen an Pyruvat, auf drei Proben (A, B, C) verteilt, verwendet. Tabelle 5.1: Pipettierschema Reaktionsansatz Endkonzentration Blindwert H 2 O 1750µl µl Imidazolpuffer (1 M) 100µl 50mM 100µl NADH (12 mm) 75µl 450µM - Pyruvat (Probe A bzw. B) 50µl? 50µl

18 Zuerst werden der erste Reaktionsansatz und der Blindwert, dem Pipettierschema aus Tabelle 5.1 folgend, zusammen pipettiert. Im Anschluss wird das Photometer bei 366nm auf den Blindwert kalibriert. Um die nachher zu messende Extinktion auf NADH anwenden zu können, ist es wichtig, dass sich im Blindwert kein NADH befindet. Nun wird die Extinktion der Probe A eine Minute gemessen und alle 15 Sekunden der Wert notiert. Aus diesen Werten (es dürften sich nur geringste Schwankungen zeigen) wird der Mittelwert gebildet und als Startwert genommen. Nun erfolgen die Zugabe von 25 µl LDH und die sofortige Überführung in einen freien Messplatz des Photometers, denn die enzymatische Reaktion beginnt ohne Verzögerung. Alle 15 Sekunden wird nun wieder die Extinktion abgelesen und notiert, bis sich diese nicht mehr verändert. Mit dem zweiten Reaktionsansatz wird genauso verfahren, wie mit dem Ersten, mit dem Unterschied, dass beim Pipettieren anstatt Probe A diesmal Probe B verwendet wird. Nach dem Ende der enzymatischen Reaktion und der Messungen wird zu diesem Ansatz Probe C pipettiert und die weitere Extinktionsänderung wie zuvor verfolgt. Ergebnisse Nach Abschluss der Messungen ergeben sich die in Diagramm 5.1 und Tabelle 5.2 dargestellten Kurven und Werte

19 Extinktion -> 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Zeit -> Probe A Probe B Probe C Diagramm 5.1: Graphische Darstellung der in der Versuchsreihe ermittelten Extinktionswerte; jeder Punkt bedeutet einen Zeitfortschritt von 15 Sekunden Tabelle 5.2: Ermittelte Extinktionswerte der Versuchsreihe Probe A Probe B Probe C Extinktion Ohne LDH mit LDH ohne LDH mit LDH vor Zugabe Pyruvat nach Zugabe Pyruvat 1,209 0,962 0,939 0,801 0,405 0,345 1,210 0,885 0,939 0,718 0,292 1,210 0,798 0,938 0,645 0,260 1,210 0,716 0,939 0,595 0,238 0,654 0,548 0,218 0,605 0,515 0,203 0,568 0,489 0,192 0,540 0,469 0,184 0,518 0,454 0,177 0,501 0,443 0,171 0,489 0,434 0,167 0,479 0,426 0,163 0,472 0,421 0,161 0,466 0,417 0,158 0,462 0,414 0,157 0,458 0,411 0,156 0,455 0,409 0,154 0,452 0,408 0,153 0,451 0,406 0,152 0,449 0,405 0,151 0,449 0,405 0,

20 Substratkonzentration: Um E für die Bestimmung der Ausgangskonzentration zu erhalten, wird der Endwert (E 2 ) vom Anfangswert (E 1 ) subtrahiert. Somit ergeben sich für die einzelnen Proben folgende E-Werte: Probe A E = E 1 E 2 E = 1,210 0,449 = 0,761 Probe B E = E 1 E 2 E = 0,939 0,405 = 0,534 Probe C E = E 1 E 2 E = 0,405 0,151 = 0,254 Durch Einsetzen in c(µmol/ml) = E * [d(cm) * ε(ml/(µmol * cm))] -1 können, da auch d (1cm), und ε (bei einer Wellenlänge von 366nm beträgt ε 3,4ml/(µmol * cm)) bekannt sind, nun folgende Pyruvatkonzentrationen errechnet werden: Probe A c(µmol/ml) = 0,761 * [1 cm * 3,4 ml/(µmol * cm)] -1 0,2238 µmol/ml Probe B c(µmol/ml) = 0,534 * [1 cm * 3,4 ml/(µmol * cm)] -1 0,1571 µmol/ml Probe C c(µmol/ml) = 0,254 * [1 cm * 3,4 ml/(µmol * cm)] -1 0,0747 µmol/ml Reaktionsgeschwindigkeit: Um die Reaktionsgeschwindigkeit berechnen zu können, werden die Werte in ein Diagramm eingetragen und es wird, da es bei jeder enzymatischen Reaktion ein Zeitintervall gibt, in welchem die Reaktionsgeschwindigkeit konstant ist, aus dem linearen Teil der Kurve E / t abgelesen. Wie im Einleitungsteil erwähnt, wird nun das Lambert-Beer sche Gesetz benutzt, um daraus nun die Reaktionsgeschwindigkeit zu ermitteln. Über die Formel n(µmol / min) = [ E * V Küvette (ml)] * [min * ε(ml / (µmol * cm)) * d(cm)] -1 bekommt man die Reaktionsgeschwindigkeit in µmol/min. Das Küvettenvolumen beträgt in diesem Versuch bei den Proben A und B jeweils 2 ml, bei Probe C 2,05 ml Es ergeben sich nun nach beschriebener Methode folgende Werte:

21 Probe A: 1,4 1,2 Extinktion -> 1 0,8 0,6 0,4 0, Zeit (in Zeiteinheiten à 15 Sek.) -> Probe A Diagramm 5.2: Kurve für Probe A mit eingezeichneter Gerade zur Bestimmung von E / t Die graphische Auswertung ergibt hier eine Anfangssteigung von E=0,338/min. Das ergibt folgende Reaktionsgeschwindigkeit: n (µmol / min) = [0,338 * 2 ml] * [1 min * 3,4 ml / (µmol * cm)) * 1 cm] -1 0,1998 µmol/min. Probe B: Extinktion -> 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, Zeit (in Zeiteinheiten à 15 Sek.) -> Probe B Diagramm 5.3: Kurve für Probe B mit eingezeichneter Gerade zur Bestimmung von E / t

22 Die graphische Auswertung ergibt hier eine Anfangssteigung von E=0,312/min. Das ergibt folgende Reaktionsgeschwindigkeit: n (µmol / min) = [0,312 * 2 ml] * [1 min * 3,4 ml / (µmol * cm)) * 1 cm] -1 0,1835 µmol/min. Probe C: Extinktion -> 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, Zeit (in Zeiteinheiten à 15 Sek.) -> Probe C Diagramm 5.4: Kurve für Probe C mit eingezeichneter Gerade zur Bestimmung von E / t Die graphische Auswertung ergibt hier eine Anfangssteigung von E=0,226/min. Das ergibt folgende Reaktionsgeschwindigkeit: n (µmol / min) = [0,226 * 2,05 ml] * [1 min * 3,4 ml / (µmol * cm)) * 1 cm] -1 0,1363 µmol/min. Diskussion: Es lässt sich nach der Durchführung aller nötigen Berechnungen sagen, dass die hier genannte Vorgehensweise eine recht einfache, schnell durchzuführende und wirkungsvolle Methode ist, die Substratkonzentration einer Probe zu bestimmen. Leider kann man im Fall der LDH weder das Substrat noch das Produkt selbst messen und muss somit auf die Messung von NADH ausweichen. Dies bedeutet einen zusätzlichen Störfaktor (neben z.b

23 Änderung der Temperatur oder des ph-wertes), wenn man nicht darauf achtet, genug NADH zur Verfügung zu stellen, denn dann ist die vollständige Umsetzung des Pyruvates nicht gewährleistet und man bekommt folglich falsche Ergebnisse bei der Messung und den anschließenden Berechnungen. Im hier vorliegenden Fall jedoch kann davon ausgegangen werden, dass genug NADH in der Probe vorhanden ist (s. Pipettierschema, Tab. 5.1). Schaut man sich nun die errechneten Werte an und vergleicht für die einzelnen Proben die Reaktionsgeschwindigkeit in Abhängigkeit von der Substratkonzentration (und der Vollständigkeit halber von 0 bis zum Wert von Probe C ohne Messwerte ergänzt), ergibt sich folgende Kurve: Reaktionsgeschwindigkeit (V) 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 Probe A Probe B Probe C 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 Substratkonzentration (S) Diagramm 5.5: Reaktionsgeschwindigkeit in Abhängigkeit von Substratkonzentration Man kann hier erkennen, dass mit höherer Substratkonzentration die Reaktionsgeschwindigkeit steigt, wenn auch nicht proportional. Während die Pyruvatkonzentration in Probe A gegenüber Probe C fast dreimal so hoch ist, läuft die Reaktion ungefähr 1,5-mal so schnell. Auch kann man hier sehen, dass sich die Reaktionsgeschwindigkeit einem Grenzwert nähert. Dies ähnelt sehr stark der Michaelis-Menten-Kurve, welche beschreibt, dass mit steigender Substratkonzentration auch die Reaktionsgeschwindigkeit steigt. Am Anfang recht steil, im weiteren Verlauf wird die Kurve flacher, der Anstieg der Geschwindigkeit geringer. Dies ist begründet durch die Sättigung des Enzyms mit Substrat, die Geschwindigkeit lässt sich nicht (bzw. kaum) mehr weiter

24 steigern. Es wird eine Maximalgeschwindigkeit bei Substratüberschuss erreicht. Leider kann in diesem Versuch die sog. Michaelis-Konstante, welche die Affinität des Enzyms zum Substrat beschreibt nicht ermittelt werden, da nicht genug Messungen mit geringer Substratkonzentration vorliegen, um im Anfangsbereich der Kurve eben diese Konstante ablesen zu können. Durch das Michaelis-Menten-Modell lässt sich nun auch die geringere Reaktionsgeschwindigkeit bei Probe C erklären: Da Probe C eine geringere Pyruvatkonzentration aufweist, ist die Sättigung der Enzyme nicht erreicht und folglich die Geschwindigkeit geringer. Des Weiteren könnte auch die geringere Konzentration an NADH nach Ablauf der Reaktion in Probe B Einfluss gehabt haben. Hätte man anstatt Probe C einfach LDH oder NADH zugegeben, hätte diese Zugabe natürlich keinen Effekt gehabt, da das Substrat umgesetzt wurde

25 Versuch 6: Fettsäuren: Dünnschichtchromatographie Einleitung Bei diesem Experiment wird das Olivenöl durch die Pankreaslipase in ihre Fettsäurebestandteile und Glycerin gespalten. Mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie wird dann das Reaktionsprodukt aufgetrennt. Material, Methoden Olivenölsuspension 0,5 g Olivenöl; 0,5 g Gummi Arabicum; 9,5 ml 0,89%iger NaCl-Lösung; Ölsäure gleiche Mengen und Behandlung mit Gummi Arabicum und NaCl-Lösung Natrium- 10 mm: 0,44 g pro 100 ml H 2 O Desoxycholat Triethanolaminpuffer ph 8,5; 1 M: 18,6 g Triethanolamin-Hydrochlorid in 70 ml dest. Wasser lösen, mit ca. 16 ml 5N NaOH den ph- Wert auf 8,5 einstellen und mit H 2 O auf 100 ml auffüllen. Pankreaslipase- 1 g Pankreatin-Pulver in 100 ml Wasser auflösen und Lösung etwa 10 Minuten rühren. Zentrifugieren und den klaren Überstand für den Versuch verwenden. Laufmittel Petrolether, Diethylether, Essigsäure im Verhältnis 70:30:1 Iod-Kristalle Vor dem Zusammenpipettieren der Reaktionsansätze werden vier Reaktionsgefäße mit 0,1 ml 2N HCl gefüllt. Nach dem Pipettierschema (s. Tab. 6.1) werden Olivenöl- und Ölsäuresuspension in 2 ml Reaktionsgefäße pipettiert. Diese Ansätze werden auf dem Vortex gemischt und danach 5 Minuten auf Eis gekühlt. Nach der Zugabe von 0,1 ml Pankreaslipase und

26 anschließendem Vortexen wird sofort je eine Probe von 0,1 ml entnommen (Null-Minuten-Wert) und in jeweils eines der Reaktionsgefäße mit HCl gegeben. Tabelle 6.1: Pipettierschema Olivenöl Ölsäure Olivenölsuspension 0,50 ml - Ölsäuresuspension - 0,50 ml Natrium-Desoxycholatlösung 0,05 ml 0,05 ml Triethanolaminpuffer 0,45 ml 0,45 ml Die Ansätze werden derweil weiter bei 37 C inkubiert. Nach 45 Minuten erfolgt eine weitere Probenentnahme. Liegen alle Proben vor, wird mit der Extraktion begonnen: Nach Zugabe von 0,3 ml Ether (3 mal 0,1 ml pipettieren), werden die Reaktionsgefäße zur Extraktion der Lipide kräftig geschüttelt. Die obere Phase (Ether, ca. 0,1 ml) wird abgenommen und in weitere Reaktionsgefäße pipettiert. Auf eine Kieselgelplatte wird eine Startlinie gezogen und 10 µl der Etherphasen werden mit 5 µl-kapillaren aufgetragen. Im Anschluss wird die Kieselgelplatte in eine gesättigte Chromatographiekammer (Laufmittel werden etwa vor Benutzung in die Laufkammer gegeben) gestellt. Die Chromatographie ist beendet, sobald die Laufmittelfront in etwa 2 cm niedriger ist, als die Plattenhöhe. Die Laufmittelfront wird markiert und die Lösungsmittelreste abgedampft. Anschließend werden die Platten in eine mit Iod-Dampf gesättigte Kammer gestellt, bis die Reaktionsprodukte sichtbar werden. Ergebnisse Auf der Kieselgelplatte sind deutlich Banden zu erkennen, die bei Ölsäure und Olivenöl verschieden sind (s. Beigefügte Kopien). Anhand dieser Banden kann man die Anzahl der Komponenten der Fettsäure erkennen und durch Abmessen der Wanderungsweite auf dem Dünnschichtchromatogramm den sog. Rf-Wert ( retarding factor ) ermitteln

27 Die Formel zur Ermittlung des Rf-Wertes lautet: Rf= Entfernung des Fleckenmittelpunktes vom Startmittelpunkt Entfernung der Fließmittelfront vom Startmittelpunkt Es ergeben sich dadurch folgende Werte: Ölsäure 0,465 Ölsäure 0,455 Olivenöl 0,885 Olivenöl 0,880 Diskussion Rf-Werte geben die relative Wanderungsweite der Substanzen auf dem Dünnschichtchromatogramm wider. Diese Werte sind relativ ungenau, da sie in Abhängigkeit mit den Trennmedien auf Temperaturunterschiede und anderes reagieren. In der Kopie des Dünnschichtchromatogramms aus diesem Versuch fällt auf, das im Laufmittelbereich 3 (Olivenöl Lipase 0 Minuten) ein Fehler aufgetreten ist. Vermutlich ist hier durch evtl. unsauberes Arbeiten ein Teil der Probe, die in Laufmittelbereich 4 aufgetragen wurde in Bahn 3 geraten. Abbildungsnachweis: Abb. 4.1 : Skript: S. 27, Abb