Evaluierung komplexer Datensätze aus Bisulfit-basierten Next Generation Sequencing-Analysen. Versuch 2

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1 Evaluierung komplexer Datensätze aus Bisulfit-basierten Next Generation Sequencing-Analysen Versuch 2 Aufbaupraktikum Biowissenschaften, Studiengang Bioinformatik WS 2014/2015 Sascha Tierling, Pavlo Lutsik, Jasmin Gries, Christina Lo Porto und Jörn Walter FR. 8.3 Biowissenschaften, Genetik/Epigenetik Universität des Saarlandes Tel Epigenetik und DNA-Methylierung Die Epigenetik beschäftigt sich mit meiotisch und mitotisch vererbbaren und reversiblen Veränderungen der Erbinformation, die nicht in der DNA-Sequenz selbst kodiert sind, jedoch entscheidenden Einfluss auf die Transkription und Translation der im Genom kodierten Information (proteinkodierende, aber auch nichtproteinkodierende Gene) haben. Das bereits in der Keimbahn gesetzte epigenetische Programm bestimmt im Verlauf der Differenzierung das Schicksal einer jeden Säugerzelle im Bezug auf die gewebsspezifische Entwicklung. Einmal etabliert, wird dieses Programm von Tochterzelle zu Tochterzelle weitervererbt. Alle Zellen eines Individuums verfügen über ein identisches Genom. Die im Genom kodierte Information wird zelltypspezifisch in das jeweilige Transkriptom umgesetzt, welches unter anderem abhängig ist von extrazellulären Faktoren (Wachtumsfaktoren, gewebsspezifische extrazelluläre Signale) aber auch von einer Kombination aus Transkriptionsfaktoren. Epigenetische Mechanismen sorgen für die kontrollierte Expression dieser Transkriptionsfaktoren, aber auch ihrer Zielgene selbst, und bilden in ihrer Gesamtheit für jeden Zelltyp ein individuelles, von dem zu Grunde liegenden Genom unabhängiges Epigenom. Neben der Feineinstellung der Genexpression haben epigenetische Mechanismen ebenfalls eine Aufgabe bei der Aufrechterhaltung der Stabilität und Integrität des Genoms. Dazu gehört beispielsweise die gezielte Inaktivierung retrotransposabler Elemente und endogener Retroviren, welche ca. 40% des menschlichen Genoms ausmachen. Dem epigenetischen Mechanismus der DNA-Methylierung, der Mitte der 1970-er Jahre entdeckt wurde, liegt die direkte kovalente Modifikation genomischer DNA durch Methylierung der C5-Position von Cytosinen, hauptsächlich in einem 5 -CG-3 -Kontext (CpG-Dinukleotid), seltener aber auch in einem CpA- oder CpT-Kontext, zu Grunde. Diese 1

2 Modifikation wird enzymatisch von mehreren DNAMethyltransferasen (DNMTs) durch Übertragung einer Methylgruppe (Methylgruppendonor: S-Adenosyl-Methionin, kurz SAM) vermittelt. Man unterscheidet zwei Arten von Methylierung. Die sogenannte Erhaltungs- oder Maintenance -Methylierung wird während der Replikation, aber auch im Zuge der DNAReparatur durch die DNA-Methyltransferase DNMT1 durchgeführt, wobei der jeweils nicht-methylierte, neu synthetisierte DNA Strang an den durch den Komplementärstrang vorgegebenen CpG-Positionen methyliert wird. Die DNA-Methyltransferasen DNMT3a und DNMT3b hingegen sind sogenannte de novo Methyltransferasen, die an der Reprogrammierung, also dem kompletten Löschen und neuerlichen Setzen von DNA- Methylierung in der Keimbahn beteiligt sind. Innerhalb des menschlichen Genoms sind CpG-Dinukleotide nicht statistisch verteilt, sondern kommen gehäuft in unmittelbarer Nähe des Transkriptionsstarts (kurz TSS) von nahezu 60% der proteinkodierenden Gene (5 -Promotor-Bereich, bis ca. 2 kb stromaufwärts des TSS) vor und aggregieren dort zu sogenannten CpG-Inseln. CpG-Inseln sind per Definition von Gardiner-Garden und Frommer aus 1987 Regionen von über 200 Basenpaaren Länge, einem GC-Gehalt von über 50% und einem Verhältnis CGbeobachtet/CGerwartet von über 0,6. Eine Besonderheit dieser Regionen ist außerdem ihre evolutionäre Konservierung, da hier im Vergleich zu den ansonsten relativ statistisch verteilten CpG-Positionen im Genom eine spontane Deaminierung der methylierten Cytosine seltener zu beobachten ist, diese also gleichsam vor Deaminierung geschützt werden. Funktionell leistet die Methylierung promotornaher CpG-Inseln einen wichtigen Beitrag zur transkriptionellen Genregulation. In den meisten Fällen verursacht eine (Hyper)Methylierung von CpG-Inseln im Promotorbereich eines Gens dessen Stillegung (= Silencing) durch die Bindung von Methyl-CpG-Binde-Proteinen wie MeCP2 an die methylierten CpGs, was wiederum die Bindung von Transkriptionsfaktoren blockiert. Unmethylierte CpG-Inseln hingegen erlauben die Transkription des nachgeschalteten Gens. Diese Regulationsmöglichkeit wird in Zusammenhang mit entwicklungs- und gewebsspezifischer Expression genutzt, da Gene, die im jeweiligen Gewebe nicht transkribiert werden sollen, durch Methylierung stillgelegt, unmethylierte Promotoren von Haushaltgenen oder zelltypspezifische Gene hingegen aktiv transkribiert und exprimiert werden können. Neben spezifischem Silencing von einzelnen Genen in Abhängigkeit vom Zell- oder Gewebetypus spielt Methylierung auch bei der Inaktivierung eines der beiden weiblichen X-Chromosomen eine wichtige Rolle (Dosiskompensation). Im Bezug auf die Stabilität und genomische Integrität spielt die Methylierung ein wichtige Rolle bei der Stillegung retrotransposabler 2

3 Elemente, aber auch humaner endogener Retroviren. Außerdem trägt die Methylierung repetitiver Elemente, besonders in zentromernahen Regionen, zur Stabilität bei. Mit einem Verlust von Methylierung an diesen Positionen gehen häufig chromosomale Instabilität und Chromosomenbrüche einher. DNA-Sequenzierung Die DNA-Sequenzierung dient im allgemeinen der Entschlüsselung der Basenabfolge eines bestimmten DNA-Abschnitts. Das von Sanger 1977 entwickelte Verfahren des Kettenabbruchs gilt als Meilenstein der Genomanalyse und wird auch heute noch häufig angewandt: Prinzip der Sanger-Sequenzierung: Ein PCR-Produkt wird meist als Templat der Sequenzierreaktion eingesetzt, die in Bezug auf ihren zyklischen Ablauf einer PCR-Reaktion ähnelt, jedoch nur mit einem Primer durchgeführt wird. Die Verwendung einer hitzestabilen DNA-Polymerase und die mehrfache Wiederholung von DNA-Denaturierung, Primer-Anlagerung und DNA-Synthese, dienen der Effizienz-Steigerung der Reaktion und ermöglichen es mit relativ kleinen Templat-Mengen auszukommen. Der Reaktionsmix enthält neben den konventionellen DNA-Bausteinen Didesoxynukleotide (ddntps), die mit einer bestimmten Frequenz in den neuen DNA-Strang eingebaut werden und eine weitere Verlängerung des DNA-Strangs verhindern. Dies führt dazu, dass eine Population unterschiedlich langer Synthese-Produkte entsteht. Die Auftrennung der Syntheseprodukte nach ihrer Größe erfolgt in Kapillaren, in denen eine Gel- Matrix auf Polyacrylamidbasis eingegossen ist. Die Verwendung moderner ddntps, die mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert sind, erlaubt es, die Verlängerungsprodukte mit einem Laser-Detektor zu detektieren. Die unterschiedlich langen Syntheseprodukte passieren nach Größe separiert nacheinander den Detektor: Das kürzeste Produkt zuerst, das in seiner Länge der Primerlänge plus einem ddntp entspricht, und die nachfolgenden mit jeweils einem Größenunterschied von einem dntp. Da ddatps, ddctp, ddgtp und ddttp mit unterschiedlichen Farbstoffen markiert sind, können Synthese-Produkte, an deren letzter Position ein ddatp, ddctp, ddgtp oder ddttp eingebaut wurde, unterschieden werden. Auf diese Weise kann den Syntheseprodukten ein bestimmtes Nukleotid in der Basenabfolge zugeordnet werden. 3

4 A B Abbildung 12: Prinzip der Sanger-Sequenzierung. A: Bei der Abbildung handelt es sich um die ursprüngliche Form dieser Methode, bei der radioaktiv markierte Nukleotide eingesetzt wurden und für die einzelnen ddntps separate Reaktionen angesetzt wurden. Die Synthese-Produkte wurden auf einem Gel aufgetrennt, auf dieses wurde anschließend ein Röntgenfilm gelegt; B: Die moderne Form der Sanger-Sequenzierung nutzt ddntps, die mit verschiedenen fluoreszierenden Farbstoffen markiert sind. Dies ermöglicht eine Detektion mit Hilfe eines Laser- Dektetors und die Zusammenfassung aller vier ddntps in einer Reaktion. 4

5 Die beschriebene Methode eignet sich hervorragend zur Entschlüsselung kleinerer genomischer Bereiche, ist jedoch zu arbeits- und kontenintensiv, wenn größere Bereiche des Genoms entschlüsselt werden sollen. Dazu wurden in den letzten Jahren verschiedene Technologien entwickelt, die sich unter dem Oberbegriff Next-Generation-Sequencing zusammenfassen lassen. In diesem Praktikum sollen Sie sich im besonderen mit dem GS-FLX Titanium-System von Roche und die mit dieser Technologie erzeugten Daten auseinander setzen. Prinzip des Next-Generation-Sequencing mit Hilfe der GS-FLX-Titanium-Plattform: Zunächst werden Amplikons mittels PCR erzeugt, die an ihren Enden spezielle Basenabfolgen (Kennungen) enthalten, wobei die Oligos, die für die Amplikonerzeugung verwandt werden, so entworfen wurden, dass sie diese Kennungen ins PCR-Produkt mit einbringen. Diese Kennungen bestehen aus einem Key, welcher die Basenabfolge AGCT darstellt und dazu dient, Sequenzen nach der Sequenzierung klar als GS-FLX-Titanium- Sequenzen zu identifizieren. Eine weitere Kennung stellen die Bindesequenzen für den Sequenzierprimer dar (ähnlich zur Sanger-Sequenzierung). Dazu kommt noch eine 10-Basen lange Kennung (MID), die von Probe zu Probe variieren kann, um z.b. verschiedene Gewebe oder Individuen zu kennzeichnen. Schematische Zusammensetzung der zur Amplikonerzeugung verwandten Oligos Nach der Amplifikation werden die PCR-Produkte gemessen und in gleicher molarer Menge zusammenpipettiert. Die DNA-Stücke werden erneut amplifiziert, indem die Matrizen-DNA in einzelne Fragmente aufgeteilt und an 28 µm großen sog. DNA-Capture-Beads in Tröpfchen einer Emulsion immobilisiert wird. Die PCR-Reaktionen finden in den Tröpfchen statt. Komplementäre Primer, die kovalent an die DNA-Cature-Beads gebunden sind, immobilisieren die PCR-Produkte auf der Oberfläche der Beads. Die mit Matrizen-DNA überzogenen DNA-Capture-Beads werden anschließend in einzelne Wells, die in die 5

6 Oberfläche eines Lichtleitfaser-Trägers geätzt wurden, geladen. Die nun folgende Sequenziermethode basiert auf einer sog. Pyrosequenzierung, bei der nach dem Einbau eines passenden Nukleotids durch die DNA-Polymerase über eine Enzymkaskase Licht aus anorganischem Pyrophospaht (PPi) erzeugt wird. Dabei werden die einzelnen Nukleotide sequenziell über die offenen Wells gespült. Die Anzahl der erzeugten Lichtsignale ist der Anzahl der eingebauten Nukleotide proportional. Prinzip der GS-FLX-Titanium- Sequenzierung. a: Reamplifikation an Agarosekügelchen der verdünnten und vereinigten PCR-Produkte mittels Emulsions-PCR; c: in jeder Plattenvertiefung wird mittels Pyrosequenzierung der klonalen DNA-Stücke eine Sequenz von ca bp entschlüsselt. Insgesamt werden so etwa 1 Mio Sequenzen erzeugt; d: über die Stärke des Lichtsignals nach dem Einbau des jeweiligen Nukleotids werden die Pyrogramme ermittelt und diese automatisch evaluiert. 6

7 DNA-Methylierungsanalyse mittels GS-FLX-Titanium-Sequenzierung Um die epigenetische Information auf eine genetische sequenzierbare Information zu reduzieren, wird die chromosomale DNA chemisch durch Inkubation mit Natrium-metabisulfit modifiziert. Bei der Bisulfit-Behandlung werden Cytosin-Basen in Uracile umgewandelt. Diese Reaktion wird durch HSO3 - -Ionen katalysiert, die durch Lösung von Natrium-meta-bisulfit entstehen. Die Bisulfit-Sequenzierung beruht auf folgendem Prinzip: die Behandlung der Cytosinreste einzelsträngiger DNA mit HSO3 - -Ionen hat ein sulfoniertes Intermediat zur Folge, das durch anschließende Deaminierung und Desulfonierung in ein Uracil überführt wird (siehe Abbildung). I II III Chemie der Bisulfit-Reaktion. I) Sulfonierung an der C6-Position des Cytosins, II) irreversible hydrolytische Deaminierung an der C4-Position, wodurch ein 6-Sulfonyl-Uracil entsteht, und III) Desulfonierung unter alkalischen Bedingungen. Methylierung an der C5-Position verhindert die Sulfonierung an der C6-Position in Schritt 1. Das Vorhandensein einer Methylgruppe an der C5-Position des Pyrimidinrings verhindert eine Sulfonierung, so dass Methyl-Cytosine keiner chemischen Veränderung unterzogen werden. Das Resultat der Bisulfit-Reaktion ist eine DNA, in der zuvor unmethylierte Cytosine zu Uracil-Resten umgewandelt wurden, während methylierte Cytosine diese Behandlung unbeschadet überstanden haben. Nachfolgend wird die Bisulfit-behandelte DNA als Templat für eine Gen-spezifische PCR-Amplifikation unter Verwendung der oben beschriebenen Oligos benutzt. Während dieser Amplifikation wird gegenüber von Uridinen in den neu synthetisierten Strängen Adenosin eingebaut. Durch die anschließende Synthese des 2. Stranges wird eine DNA hergestellt, in deren Sequenz an Positionen, wo vor der Bisulfit- Behandlung ein unmethyliertes Cytidin (nach der Bisulfitbehandlung ein Uridin) stand, ein Thymidin steht. 7

8 5 tgtca m cg tcccatctggtacgcatccctg m cg atgcata 3 3 acagt gc m agggtagaccatgcgtagggac gc m tacgtat 5 Denaturierung und Bisulfit-Konversion 5 tgtua m cg tuuuatutggtauguatuuutg m cg atguata 3 + Einzelstrang-DNA 3 auagt gc m agggtagauuatgugtagggau gc m taugtat 5 5 tgtua m cg tuuuatutggtauguatuuutg m cg atguata 3 3 acaat gc aaaataaaccatacttaaaaac gc tacatat 5 + Strang-spezifische Amplifikation 5 tatca cg tcccatctaatacacatcccta cg atacata 3 3 auagt gc m agggtagauuatgugtagggau gc m taugtat 5 Prinzip der Bisulfit-Konversion mit anschließender PCR Die erzeugten PCR-Produkte werden anschliessend aufgereinigt und in einem Fluorometer gemessen. Anschliessend werden die Produkte auf eine vordefinierte Konzentration eingestellt und für die folgende Emulsions-PCR vereinigt. Nach erfolgter klonaler Vervielfältigung der PCR-Produkte werden diese auf die Sequenzierplatte geladen. Zu Beginn der Reaktion bindet der Sequenzierprimer an seine Zielsequenz in den Adaptoren und wird mittels Pyrosequenzierung verlängert. Eine sensitive Kamera photographiert die Sequenzierplatte nach jedem Zyklus (Waschen Zugabe eines Nukleotids Waschen). Nach etwa Zyklen sind die Chemikalien der Sequenzierreaktion aufgebraucht und der Sequenzierlauf ist beendet. Die einzelnen Photos der Platte werden automatisch von der Instrumentsoftware ausgewertet und zur Prozessierung auf einen Computercluster transferiert. Dort werden kurze Sequenzen unter 40 bp, Doppelsequenzen (entstanden durch zwei verschiedene DNA-Stücke pro Vertiefung) und Sequenzen ohne Key ausgeschlossen. Die prozessierten Rohdaten werden auf einen weiteren externen Computercluster exportiert und stehen Ihnen dort für die Evaluierung zur Verfügung. In Zusammenarbeit mit einem Bioinformatiker wird es Ihre Aufgabe sein, Rohdaten von 2 Amplikons aus 3 verschiedenen Darmkrebstumoren und einer ihrer korrespondierenden normalen Gewebeprobe nach Amplikon-Referenzsequenzen zu sortieren. Desweiteren werden die Rohdaten nach den Amplikon-spezifischen Primersequenzen sortiert und aufgrund 8

9 ihrer Lage auf der Mikrotiterplatte in verschiedenen Ordnern abgelegt (ein Ordner entspricht dabei einer Tumorprobe). Anschliessend werden unter Verwendung des Programms BiQAnalyzer HT die Sequenzen gegen die Referenzsequenz abgeglichen ( alignt ), um die Methylierung jeder einzelnen CpG-Position und jeder Einzelsequenz zu bestimmen. Eine graphische Übersicht in Form eines DNA-Methylierungsmusters ( Pattern Map ) und eines Perlenketten ( Pearl Necklace )-Diagramms werden für jedes einzelne Amplikon in den einzelnen Tumor- bzw. Normalgeweben erstellt. Nun folgt der paarweise statistische Vergleich der Methylierungsdaten durch Exportieren der Datensätze in das Programm R. Dort wird ein Chi-Quadrat-Test durchgeführt und die Qualität der statistischen Signifikanz mittels Cramer s V evaluiert. Sie sollten am Ende eine klare qualitative Aussage zu den Methylierungsunterschieden für jedes Amplikon in den verschiedenen Geweben/Zelltypen treffen können. Schematische Darstellung der Experimentellen Vorgehensweise 9

10 Allgemeines Schema zur Bioinformatischen Auswertepipeline 10

11 Experimenteller Ablauf Sonifizierung genomischer DNA Es soll die Fragmentierung genomischer DNA mittels Ultraschall getestet werden. Dabei sollen durch unterschiedliche Anzahl bzw. Dauer der Behandlungen verschiedene Fragmentgrößen generiert werden. 1. Konzentrationsbestimmung und Qualitätskontrolle Zunächst wird die Konzentration und Reinheit der zu untersuchenden genomischen DNA bestimmt. Dazu werden die Proben im NanoDrop TM (UV-Vis Spektrophotometer, Thermo Scientific) gemessen. - Vor der ersten Messung Messfläche mit Wasser reinigen und Blank-Messung mit 2 µl 1xTE vornehmen - Zwischen den Messungen Messfläche mit einem staubfreien Tuch trocknen - 2 µl der Probe messen, Konzentration der Probe notieren und Profile kontrollieren 2. Sonifizierung Die vermessenen Proben sollen nun mit Hilfe des BioruptorNGS fragmentiert werden. - 2,4 µg DNA mit 1xTE in 0,5ml-Gefäßen auf ein Gesamtvolumen von 100 µl verdünnen - Probe vortexen, kurz abzentrifugieren und auf Eis stellen - Probe im vorgesehenen Einsatz in das vorgekühlte Wasserbad hängen Achtung: alle Positionen müssen belegt sein! - Die DNA soll bei folgenden Bedingungen geschert werden: Gruppen 1 + 2: 30 sec on, 30 sec off, 13 Zyklen Gruppen 3 + 4: 15 sec on, 90 sec off, 6 Zyklen Gruppen 5-7: 5 sec on, 90 sec off, 7 Zyklen - gescherte Probe kurz abzentrifugieren 3. Kotrollgel Die Fragmentierung der DNA soll mittels Gelelektrophorese kontrolliert und mit der ursprünglichen genomischen DNA verglichen werden. 11

12 - jeweils 150 ng der genomischen Ausgangs-DNA sowie der gescherten DNA mit jeweils 2 µl Probenpuffer mischen - auf ein 1,2 %iges Agarosegel auftragen - in eine weitere Tasche 3 µl 100 bp-dna-leiter auftragen - Gelkammer an Stromquelle mit 80 V anschließen und laufen lassen bis Bromphenolblau-Front noch ca. 2 cm von unterem Gelrand entfernt ist - Gel zum Färben in Ethithiumbromidbad legen und 20 min färben lassen - gefärbtes Agarosegel auf UV-Tisch des Geldokumentationsgerätes fotografieren 100 bp Leiter (Solis BioDyne) Verdünnen und Vereinigen (Poolen) von Sequenzierlibraries Sie sollen nach Einführung in die Software ein kleines Programm zum Verdünnen und Poolen von Sequenzierlibraries erstellen. Nach erfolgreicher Simulation wird das erstellte Programm auf dem Hamilton STARlet-Pipettierroboter zur Durchführung gebracht. Emulsion herstellen Zur Veranschaulichung der Mikroreaktoren, in welchen während der Emulsions-PCR die DNA-Fragmente vervielfältigt werden, soll eine solche Emulsion hergestellt und unter dem Mikroskop betrachtet werden. - Gefäße mit Emulsions-Öl im TissueLyser (Qiagen) 2 min bei 25 Hz schütteln (nur äußere Reihe beladen und beide Einsätze gleich einsetzen) µl Mock Amplifikations-Mix in Ölgefäß geben - Gefäß 2-3 mal invertieren - Ölgefäße im TissueLyser 5 min bei 25 Hz schütteln (nur äußere Reihe beladen und beide Einsätze gleich einsetzen) - Gefäße aus Gerät nehmen Anschließend werden 3-5 µl der Emulsion lichtmikroskopisch betrachtet. 12

13 Beladung der PicoTiter Platte 110 µl werden langsam und gleichmäßig in die dafür vorgesehene Öffnung der vorbereiteten PTP-Beladeapparatur (Roche) pipettiert. 13