Humangenetik. Unterrichtsbegleitendes Material zur Vorlesung im Sommersemester 2012

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1 Humangenetik Unterrichtsbegleitendes Material zur Vorlesung im Sommersemester 2012 Institut für Humangenetik Lübeck Universitätsklinikum Schleswig-Holstein 1

2 VORBEMERKUNGEN Sehr geehrte, liebe Studierende Im Folgenden haben wir zu den einzelnen Unterrichtseinheiten der Vorlesung Humangenetik für Studierende der Medizin kurze Texte und Notizen zusammengestellt. Diese Informationen sollen Ihnen helfen, die Vorlesung nachzubereiten und sich auf die Klausur vorzubereiten. Sie ersetzen keinesfalls den Besuch der Vorlesung und die Benutzung von Fachbüchern zur Vertiefung des Stoffes. Wir empfehlen, dass Sie sich zumindest ein Lehrbuch kaufen oder ausleihen. Die Lernziele sind in einer gesonderten Datei zusammengestellt und können von unserer Internet-Seite heruntergeladen werden. Als Lehrbücher empfehlen wir: Taschenlehrbuch Humangenetik Murken, Grimm, Holinski-Feder Thieme-Verlag, 8. Auflage (2011) Basiswissen Humangenetik Schaaf & Zschocke Springer-Verlag, 1.Auflage (2007) Angewandte Humangenetik Read & Donnai degruyter-verlag, 1. Auflage (2008) Humangenetik, Tariverdian & Buselmaier Springer-Verlag, 4. Auflage (2006) Als Nachschlagewerk ist hilfreich Taschenatlas der Genetik, Passarge Thieme-Verlag, 3. Auflage (2008) Wichtige Online-Adressen: Über die Homepage des National Center for Biotechnology Information (NCBI) haben Sie Zugriff auf PubMed, OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man) und andere relevante Datenbanken Umfangreiche Informationen zu genetisch bedingten Krankheitsbildern finden Sie unter: 2

3 1. EINFÜHRUNG IN DIE HUMANGENETIK HUMANGENETISCHE BERATUNG Die genetische Beratung ist ein Kommunikationsprozess, in dem menschliche Probleme behandelt werden, die mit dem Vorliegen oder dem möglichen Auftreten eines genetisch bedingten Krankheitsbildes in einer Familie zusammenhängen. Dieser Prozess beinhaltet das Bemühen einer oder mehrerer entsprechend ausgebildeter Personen, die einem einzelnen oder einer Familie dabei helfen o medizinische Fakten, einschließlich Diagnose, Krankheitsverlauf und Behandlungsmöglichkeiten zu verstehen o die Bedeutung von Erbfaktoren in der Ätiologie einer Erkrankung zu verstehen und Erkrankungsrisiken für Verwandte richtig einzuschätzen o die Entscheidungsmöglichkeiten bei der Verarbeitung von Erkrankungsrisiken zu verstehen o die bestmögliche Einstellung zu der Erkrankung eines betroffenen Familienmitglieds beziehungsweise zu der Möglichkeit des Wiederauftretens einer Erkrankung zu gewinnen. Zu einer genetischen Beratung gehören regelmäßig: o die Klärung der persönlichen Fragestellung und des Beratungsziels o die Erhebung der persönlichen und familiären gesundheitlichen Vorgeschichte (Anamnese), einschließlich Stammbaumerhebung über drei Generationen o die Bewertung vorliegender ärztlicher Befunde o die körperliche Untersuchung der Ratsuchenden oder deren Angehörigen, wenn dies für die Fragestellung relevant ist o die Untersuchung an Blut oder anderen Geweben, wenn für die Fragestellung erforderlich o eine möglichst genaue medizinisch-genetische Diagnose o eine ausführliche Information über die in Frage kommenden Erkrankungen beziehungsweise Behinderungen o eine Abschätzung spezieller genetischer Risiken o eine Beratung über die allgemeinen genetischen Risiken o eine ausführliche Beratung über die möglichen Bedeutungen dieser Informationen für die Lebens- und Familienplanung und ggf. die Gesundheit o ein ausführlicher individueller Beratungsbrief, der die wesentlichen Inhalte der Beratung zusammenfasst Die Nichtdirektivität - also die Beratung die keinen Einfluss auf die Entscheidung der Ratsuchenden nimmt - ist ein wesentliches Prinzip der genetischen Beratung. Eine direktive Einflussnahme des Beraters auf die Entscheidungsfindung der Ratsuchenden ist mit diesem Ziel nicht vereinbar. Die humangenetische Beratung lässt sich wesentlich von den gemeinsam erarbeiteten Beratungszielen und Bedürfnissen der Ratsuchenden leiten. Es bleibt im Ermessen des Ratsuchenden, nahe Verwandte, sofern notwendig, zu informieren. 3

4 Mögliche Anlässe einer genetischen Beratung sind o Geburt eines Kindes mit einer angeborenen Erkrankung oder Entwicklungsstörung (Diagnosestellung, Bestimmung des Wiederholungsriskos, Möglichkeiten der Pränataldiagnostik) o Erkrankungen oder Entwicklungsstörungen bei Verwandten (Ermittlung des individuellen Erkrankungsrisikos für den Ratsuchenden oder dessen Kinder, Risikoberechnung, Frage der prädiktiven Diagnostik einer spätmanifestierenden Erkrankung) o Altersbedingte Risiken (z.b. Risiko für Down-Syndrom bei erhöhtem mütterlichen Alter; Aufklärung über Aussagekraft und Risiken vorgeburtlicher Diagnostik) o Konsanguinität der Ratsuchenden (Stammbaumerhebung im Hinblick auf autosomal rezessive Erkrankungen, Heterozygotentestung bei Thalassämie) o Habituelle Aborte (elterliche Chromosomenanalysen zum Ausschluss balancierter Translokationen) o Totgeburten (ggf. Röntgendiagnostik, pathologisch anatomische Untersuchung und Chromosomenanalyse zur Diagnosestellung) o Fertilitätsstörungen (Ausschluß von Chromosomenstörungen) o Abklärung eines möglichen teratogenen oder mutagenen Risikos Neben der Diagnostik im Rahmen der Abklärung einer klinischen Symptomatik, die Gegenstand einer genetischen Beratung sein kann, sind die Ergebnisse von pränataler oder prädiktiver Diagnostik sowie der Heterozygotendiagnostik komplexere Probleme in der genetischen Beratung. o Pränatale genetische Diagnostik (Erörterung von Möglichkeiten, Grenzen und mögliche Konsequenzen vor der Durchführung der Diagnostik und ggf. bei auffälligem Befund erneute Beratung) o Heterozygotentestung (Aufklärung über Häufigkeit, Ursache, Symptomatik, Verlauf und Therapie der Erkrankung, auf deren Anlageträgerschaft hin untersucht werden soll) o Prädiktive Diagnostik (Die Untersuchung eines gesunden Menschen in Hinblick auf eine erbliche Disposition. Bei behandelbaren Erkrankungen können sich individuelle präventive oder therapeutische Maßnahmen ergeben. Bei nicht behandelbaren Erkrankungen können sich wichtige Entscheidungsoptionen hinsichtlich der Lebens- und Familienplanung eröffnen. Details sind in den Richtlinien zur prädiktiven genetischen Diagnostik der Bundesärztekammer festgelegt.) Die humangenetische Beratung wird im Zeitalter einer stetig wachsenden Zahl genetischer Tests wichtig und verhindert unsinnige und kostspielige Diagnostik. Sie nimmt eine zentrale Schlüsselstellung für die verantwortungsvolle Anwendung genetischen Wissens in der klinischen Praxis ein. 4

5 Literatur zu Humangenetische Beratung: o Wissenschaftlicher Beirat der Bundesärztekammer: Richtlinien zur pränatalen Diagnostik von Krankheiten und Krankheitsdispositionen. Dtsch Ärztebl 1998, 95: A o Wissenschaftlicher Beirat der Bundesärztekammer: Richtlinie zur prädiktiven genetischen Diagnostik. Dtsch Ärztebl 2003; 100: A o Zerres K: Humangenetische Beratung, Dtsch Ärztebl 2003, 100: A o Symbole für die Stammbaumskizze Definitionen Fehlbildung (Malformation) Früher: Missbildung (Obsolet!) Morphologischer Defekt eines Organs /Organteils Ergebnis abnormer embryonaler Entwicklung Beispiele: Vitium cordis; LKG-spalte, Syndaktylie Dysmorphie (Minor anomaly; Minoranomalie ;geringe Anomalie; kleiner morphogenetischer Fehler Ebenfalls Ausdruck abnormer, nicht optimaler embryonaler Entwicklung Typischerweise nicht therapiebedürftig, wohl aber diagnostische Bedeutung, besonders bei multiplen Dysmorphien! Beispiele: Epikanthus, Hypertelorismus, Vierfingerfurche, Schalskrotum 5

6 Dysplasie Deformation Abnorme Gewebsdifferenzierung ( Dyshistogenese ) Ergebnis: Form und/oder Größenänderung d. Organs Abnorme Form/Größe oder auch Position eines Teils des Körpers Ursache: Einwirkung mechanischer Kräfte Disruption ( Sekundäre Fehlbildung ) Assoziation Sequenz Syndrom Morphologischer Defekt eines Organs oder Organteils oder einer Körperregion Ursache: exogene Störung eines ursprünglich normalen Entwicklungsprozesses Statistisch gehäufte, über den Zufall hinausgehende, mehr oder weniger konstante Kombination von Entwicklungsanomalien Typisch auch: ätiologische (kausale) Heterogenität Beispiele: VACTERL-Assoziation; MURCS-Assoziation Eine Reihe ( Kaskade ) von Anomalien, die sich auf eine einzige bekannte (oder wahrscheinliche) primäre Anomalie oder einen mechanischen Faktor zurückführen lassen Beispiele: Robin-Sequenz; Oligohydramnion-Sequenz Definiertes Muster multipler Anomalien, häufig bekannte Ätiologie. Anomalien pathogenetisch wahrscheinlich korreliert, Zusammenhang aber weniger geklärt als bei der Sequenz Beispiele: Hunderte! 6

7 2. GRUNDLAGEN DER ZYTOGENETISCHEN DIAGNOSTIK Chromosomengruppen Bänderungstechniken Diagnostische Möglichkeiten in der Zytogenetik o Chromosomenanalyse o Fluoreszenz in situ-hybridisierung (FISH) o Subtelomeruntersuchung o CGH-Array (comparative genomic hybridization) Indikationen zur zytogenetischen Diagnostik o Multiple Aborte o Wachstumsverzögerung o Niedriges Geburtsgewicht und Entwicklungsverzögerung o Dysmorphien und Fehlbildungen o Mentale Retardierung 7

8 Chromosomenaberrationen o Numerische Veränderungen o Strukturelle Veränderungen Deletion Duplikation Inversion (parazentrisch, perizentrisch) Ringchromosom Isochromosom Translokation (reziprok, zentrische Fusion) Chromosomenbrüchigkeit (fragile Stellen) o (Uniparentale Disomien) Beispiele für numerische Chromosomenaberrationen 47,XX/XY,+21 (Trisomie 21, Down-Syndrom) o Häufigkeit abhängig vom mütterlichen Alter, o durchschnittlich ca. 1 : 650, Geschlechterverteilung 1 : 1 o nach außen oben ansteigende Lidachse o groß erscheinende Zunge o Muskelhypotonie o mentale Retardierung (IQ zwischen 20 und 50) o Niedriges geburtsgewicht, Kleinwuchs o Herzfehler (gehäuft AV-Kanal) o Fehlbildungen des Magen-Darm-Traktes (Duodenalatresie, M. Hirschsprung) o Leukämien 47,XX/XY,+13 (Trisomie 13, Pätau-Syndrom) o -Häufigkeit abhängig vom mütterlichen Alter (1 : 10000/20000) o Normales Geburtsgewicht o Fehlbildungen des Gehirns (Holoprosenzephalie), Gesichts, Herzens, o Magen-Darm-Traktes und der Nieren o - Postaxiale Hexadaktylie o -Lippen-Kiefer-Gaumen-Spalte o -Skalpdefekte 47,XX/XY,+18 (Trisomie 18, Edwards-Syndrom) o - Häufigkeit abhängig vom mütterlichen Alter (1 : 6000) o - bei Geburt zu klein und dystroph o - Mikrozephalus o - Fehlbildungen des Herzens, Gehirns, Magen-Darm-Traktes und der Nieren o - geistige Behinderung o - Muskelhypotonie o - ausgeprägte Ernährungsprobleme, vor allem bei Kleinkindern o - schwere Entwicklungsstörungen 8

9 45,X (Monosomie X, Turner-Syndrom, Ullrich-Turner-Syndrom) o Häufigkeit 1 : 3000 o Niedriges Geburtsgewicht o - Kleinwuchs o - fehlende Pubertätsentwicklung o - Pterygium colli (Flügelfell) o tiefer Haaransatz, Ptosis, tief angesetzte Ohren, o weiter Mamillenabstand, Nagelauffälligkeiten o - Teilleistungsschwächen o - keine Eierstöcke angelegt => Hormonsubstitution notwendig Mikrodeletionssyndrome Phänotypbeschreibung erfolgte vor chromosomaler Charakterisierung Verlust eines kleinen Chromosomensegments Verlust einer kleinen Zahl benachbarter Gene Beispiele für Mikrodeletionssyndrome Wolf-Hirschhorn-Syndrom, del(4)(p16.3) o Prä- und postnatale Dystrophie o Charakteristisches Gesicht mit Hypertelorismus, kurzem betonten Philtrum, herabgezogenen Mundwinkeln o Herzfehler o Mikrozephalie o Schwere mentale Retardierung, Krampfanfälle Williams-Beuren-Syndrom, del (7) (q11.23) o Charakteristisches Gesicht mit Strabismus, und kurzer Nasenspitze o Herzfehler (supravalvuläre Aortenstenose) o Kleinwuchs o Mentale Retardierung o Infantile Hyperkalzämie o Spezifischer Verhaltensphänotyp Del 22q11.2, (Velo-kardio-faziales-Syndrom, Shprintzen-Syndrom, Di George-Syndrom) o Herzfehler (typisch: unterbrochener Aortenbogen, Pulmonalatresie/-stenose, VSD, Fallot sche Tetralogie) o Gaumenspalte-nasale Sprache o rechteckige Nase hypoplastische Nasenflügel o schwere Immundefekte o - Störungen des Kalziumhaushaltes o - Kleinwuchs o - Entwicklungsverzögerung 9

10 3. PRÄNATALDIAGNOSTIK, GENETISCHE BERATUNG Methoden der Pränataldiagnostik: invasiv vs. nicht invasiv Nicht invasive Diagnostik o Ultraschalluntersuchung o Biochemische Parameter (z.b. Triple-Test) Invasive Diagnostik: o Chorionzottenbiopsie (CVS) o Amniozentese (AC) o Fetalblutentnahme (FBS) Biochemische Parameter Erst-Trimester-Screening: o Ultraschall, PAPP-A, HCG (im Serum der Mutter) o Schwangerschaftswoche (SSW) Triple-Test: o AFP, HCG, Östriol (im Serum der Mutter) o SSW Ultraschalluntersuchungen SSW: o Messung der Nackentransparenz o Darstellung des Nasenknochens SSW: o Fehlbildungsultraschall SSW: o Beurteilung der weiteren Entwicklung des Kindes Spezifische Ultraschallbefunde Trisomie 21 o Nackentransparenz (NT) o verzögerte Ausbildung des Nasenknochens o Herzfehler (besonders AVSD) Trisomie 18 o NT o Handfehlstellung o IUGR o Herzfehler o Omphalozele Trisomie 13 o IUGR o Lippen-Kiefer-Gaumenspalte o Herzfehler Triploidie (z.b. 69,XXX; 69, XXY) o ausgeprägte frühe IUGR o Plazentaveränderungen Turner-Syndrom (45,X) o Zystisches Hygroma colli, NT 10

11 Indikationen für invasive Diagnostik o Altersindikation der Schwangeren o Ultraschallauffälligkeiten beim Kind o Genetisch bedingte familiäre Grunderkrankungen (monogen vererbte Erkrankungen) o Familiäre Chromosomentranslokationen Chorionzottenbiopsie Direktpräparation aus Chorionzotten o Vorläufiges Ergebnis nach Stunden o Beurteilung von Fehlverteilungen o DNA-Isolierung direkt möglich o Niedrige Strukturauflösung der Chromosomen o Risiko Mosaik (ca. 1-2%) Langzeitkultur o Endgültiges Ergebnis nach ca. 14 Tagen o Gute Strukturauflösung Amniozentese (Fruchtwasseruntersuchung) o Zeitpunkt: SSW, Frühamniozentese SSW o Fehlgeburtsrisiko: 0,5-1% o Ergebnis der zytogenetischen Analyse nach 2-3 Wochen o Interphase-FISH-Diagnostik nach 1-2 Tagen o DNA-Diagnostik aus kultivierten Amnionzellen Fetalblutentnahme o Chromosomenanalyse innerhalb von 3-5 Tagen o Übliche Lymphozytenkultur o Hohe Strukturauflösung o Direktes kindliches Gewebe, selten gewebsspezifische Mosaike Schwangerschaftsabbruch nach 218 / 218a 218. Schwangerschaftsabbruch: (1) Wer eine Schwangerschaft abbricht, wird mit Freiheitsstrafe bis zu drei Jahren oder mit Geldstrafe bestraft. 218a. Straflosigkeit eines Schwangerschaftsabbruches: (1) Der Tatbestand des 218 ist nicht verwirklicht, wenn o die Schwangere den Schwangerschaftsabbruch verlangt und dem Arzt durch eine Bescheinigung nach 219 Abs. 2 Satz 2 nachgewiesen hat, daß sie sich mindestens drei Tage vor dem Eingriff hat beraten lassen, o der Schwangerschaftsabbruch von einem Arzt vorgenommen wird und o seit der Empfängnis nicht mehr als zwölf Wochen vergangen sind. 11

12 (2) Der mit Einwilligung der Schwangeren von einem Arzt vorgenommene Schwangerschaftsabbruch ist nicht rechtswidrig, wenn o der Abbruch der Schwangerschaft unter Berücksichtigung der gegenwärtigen und zukünftigen Lebensverhältnisse der Schwangeren nach ärztlicher Erkenntnis angezeigt ist, o um eine Gefahr für das Leben oder die Gefahr einer schwerwiegenden Beeinträchtigung des körperlichen oder seelischen Gesundheitszustandes der Schwangeren abzuwenden, o und die Gefahr nicht auf eine andere für sie zumutbare Weise abgewendet werden kann. Präimplantationsdiagnostik (PID) o Europa: PID mittels Biopsie von Blastomeren: gezielte Untersuchung auf chromosomale Fehlverteilungen oder schwerwiegende genetisch bedingte familiäre Erkrankungen o Frühe Diagnostik o Vermeidung eines Schwangerschaftsabbruches o Notwendigkeit der künstlichen Befruchtung Polkörperdiagnostik (PKD) o Untersuchung des Embryos in Deutschland durch das Embryonenschutzgesetz nicht erlaubt o Entstehung des Embryos nach der Verschmelzung der Vorkerne o Frühere Untersuchung mittels Polkörper möglich Indikationen PKD o Untersuchung chromosomaler Fehlverteilungen (Aneuploidien): Polkörper (PB) o Mütterliche Chromosomentranslokationen: 1. PB o Schwerwiegende erblich bedingte familiäre Erkrankungen (Mutter als Anlageträgerin): PB Einschränkungen und Fehlerquellen der PKD o Nur Aussage über mütterlichen Chromosomensatz o In Einzelfällen nur Aussage über den ersten Polkörper o Keine Aussage über Reparaturmechanismen der Eizelle im 2. Polkörper Verwerfen von Eizellen, die evtl. zu einem gesunden Embryo führen würden o Eingeschränkter Zeitrahmen Vorteile Präimplantationsdiagnostik: o Gezielte Beurteilung des kindlichen Chromosomensatzes o Bessere Aussage über den Zustand des Embryos bei monogenen Veränderungen o Höhere Sicherheit durch Untersuchung mütterlicher und väterlicher Erbanlagen und die Untersuchung zweier embryonaler Zellen 12

13 4. GRUNDLAGEN DER MOLEKULARGENETISCHEN DIAGNOSTIK Mutationen Je nach Art der Veränderung lassen sich Mutationen in drei Gruppen unterteilen: o Genommutation Veränderungen der Chromosomenzahl (Aneuploidien). o Chromosomenmutation Veränderungen der Chromosomenstruktur. Strukturveränderungen entstehen durch Deletionen, Duplikationen, Insertionen, Inversionen oder Translokationen chromosomaler Fragmente. o Genmutation Kleine molekulare Änderungen, die mikroskopisch nicht sichtbar sind. Auf molekularer Ebene findet man Substitutionen, Deletionen und Insertionen. Darüber hinaus können Trinukleotid-Repeat-Expansionen auftreten. Dieser Mutationstyp besteht in der Amplifikation eines Motivs, das sich aus drei Basenpaaren zusammensetzt. Überschreitet das Trinukleotid-Repeat eine gewisse Länge, so wird es instabil. Instabilität bedeutet, dass sich die Trinukelotid-Anzahl bei der Vererbung verändert. Erkrankungsalter und Verlauf können mit der Anzahl der Trinukleotid-Wiederholungen korrelieren. Nimmt die Anzahl der Trinukleotide von Generation zu Generation zu, so kann die Erkrankung bei den Nachkommen früher auftreten und schwerer verlaufen (Antizipation). Folgen von Genmutationen Die Substitution eines Nukleotids kann zu einer Missense- oder Nonsense-Mutation führen, die Deletion oder Insertion von ein oder zwei Nukleotiden führt zu einer frame shift - Mutation, die Deletion oder Insertion drei benachbarten Nukleotiden zum Verlust oder Gewinn einer Aminosäure im Protein. Mutationen im Promotor eines Gens verändern die Expression, Mutationen in Splice-Stellen können zum Verlust von Exons in der reifen RNA führen. Polymorphismen Die häufigsten DNA-Veränderungen betreffen einzelne Nukleotide: Substitutionen, Insertionen und Deletionen. Sofern sie nicht eine kodierende oder regulatorische Sequenz verändern, sind sie in der Regel nicht mit einem Phänotyp assoziiert. Das Auftreten von DNA-Varianten bezeichnet man dann als Polymorphismus, wenn sie in einer Population weit verbreitet sind. Die Frequenz eines Polymorphismus liegt bei >1 %. Seltene Veränderungen mit einer Frequenz <1 % werden als Variation bezeichnet. Von den DNA-Polymorphismen sind die Einzelnukleotid-Polymorhismen (single nucleotide polymorphism, SNP) von Bedeutung. Da die kodierende DNA nur etwa 1,5 % des menschlichen Genoms ausmacht, liegen die meisten SNPs in nicht kodierender DNA, z. B. innerhalb von Introns oder in Sequenzen zwischen einzelnen Genen. SNPs werden für Kopplungsanalysen verwendet. Bei seltenen Substitutionen innerhalb von Kodierregionen ist die Differenzierung schwierig, ob es sich um eine Mutation oder einen Polymorphismus handelt. 13

14 Definitionen o Allel: verschiedene Formen desselben Gens o Antizipation: Tendenz der zunehmenden Schwere einer Erkrankung in aufeinander folgenden Generationen, Beispiel Chorea Huntington o cdna (komplementäre DNA): DNA, die durch reverse Transkription einer mrna als Matrize synthetisiert wird. o Exon: Abschnitt eines Gens, der in der reifen RNA vertreten ist. Einzelne Exons können kodierende und nicht kodierende DNA enthalten (untranslatierte Regionen, 5 UTR, 3 UTR). o Frame shift-mutation (Leseraster-Mutation): Mutation, die das normale Translationsleseraster einer mrna verschiebt, in dem eine Anzahl von Basen, die nicht durch 3 teilbar ist, eingefügt oder deletiert wird. o Genom: vollständige DNA einer Zelle oder eines Organismus. Das humane Genom besteht aus 24 verschiedenen Chromosomen (22 Autosomen, X und Y Chromosom) sowie der mitochondrialen DNA. o Genotyp: genetische Ausstattung eines Individuums, z. B. an einem bestimmten Locus. o Haploid: Bezeichnung einer Zelle typischerweise eine Gametenzelle die von jedem Chromosom nur eine einzige Kopie besitzt. Im Gegensatz dazu bedeutet diploid, dass die Zelle von jedem Chromosom zwei Kopien besitzt. o Haplotyp: Reihe von Allelen an gekoppeltem Loci auf einem einzigen Chromosom. o Hemizygotie: Es ist jeweils nur eine einzige Kopie eines Gens oder einer DNA- Sequenz in einer diploiden Zelle vorhanden. Beispiel: Männer sind für die meisten Gene auf den Geschlechtschromosomen hemizygot. Die Deletion eines Gens in einem Autosom führt jedoch bei Männern und Frauen zur Hemizygotie. o Heterozygotie: Eine Zelle ist heterozygot, wenn sie für einen spezifischen Locus des Genoms zwei unterscheidbare Allele besitzt. o Homozygotie: Eine Zelle ist homozygot, wenn sie für einen spezifischen Locus zwei identische Allele besitzt. o Intron: Nicht-kodierende DNA, die in einem Gen benachbarte Exons voneinander trennt. Die Introns werden transkribiert, aber durch den so genannten Splicevorgang aus der Prä-mRNA herausgeschnitten. o Locus: Eine spezifische chromosomale Position, an der ein einzelnes Gen liegt. o Phänotyp: Wahrnehmbare Merkmale einer Zelle oder eines Organismus. o Punktmutation: Mutation eines einzelnen Nukleotids an einem Locus, d. h. Substitution, Insertion oder Deletion. 14

15 Beispiele und Übung Triplett ATG TCA AGA CAG CTG TAA CTA GGG Aminosäure Met Ser Arg Gln Leu - X stille M. ATG TCA CGA CAG CTG TAA CTA GGG Met Ser Arg Gln Leu -X Missense M. ATG TCA AGA CAT CTG TAA CTA GGG Met Ser Arg His Leu -X Nonsense M. Deletion ATG TGA AGA CAG CTG TAA CTA GGG Met -Xdel G ATG TCA AGA CAC TGT AAC TAG GG Met Ser Arg His Cys Asn -X- Insertion ATG TCA AAG ACA GCT GTA ACT AGG G Met Ser Lys Thr Ala Val Thr Arg... -X- 15

16 Testfragen Richtig oder Falsch? Gene tragen keine Introns. Der reifen mrna fehlen die Exons. Das humane Genom beinhaltet ca Exons. Das humane Genom beinhaltet ca Gene. Das humane Genom besteht aus den Chromosomen, die im Zellkern lokalisiert sind. Das humane Genom enthält nur nukleäres Material. Die cdna ist eine Kopie der genomischen DNA. Als Locus wird bezeichnet... A B C D die Gesamtheit aller Gene in einem Organismus. Ein spezifischer Ort auf einem Chromosom, der die Position eines einzelnen Gens definiert. Unterschiedliche Formen eines Gens oder einer DNA-Sequenz an einer bestimmten Position im Genom. eine Reihe polymorpher Marker, die sich auf gekoppelten Loci eines einzelnen Chromosoms befinden. Der Ausdruck c.13c>a beschreibt... A B C eine Punktmutation in der genomischen DNA. eine Substitution in der cdna. den Aminosäureaustausch Cystein (C) zu Alanin (A) an Position 13 des Proteins. D eine Translokation im Zentromer von Chromosom 13. E Keine Antwort ist richtig. 16

17 5. METHODENSPEKTRUM IN DER MOLEKULARGENETIK Begriffsbestimmung und Abkürzungen: Qualitative Sequenzveränderung: Veränderungen der DNA-Basenfolge. Hierzu zählen der Austausch einzelner Nukleotide (Substitution), der Wegfall (Deletion) oder Gewinn (Insertion) einzelner oder weniger Nukleotide. Quantitative Sequenzveränderungen: Veränderungen der Kopienzahl der DNA. Alle autosomalen DNA-Abschnitte liegen als zwei Kopien vor. Kommt es zum Wegfall (Deletion) oder zum Gewinn (Duplikation, Triplikation) großer genomischer Regionen (ganze Exons, ganze Gene oder Chromosomenabschnitte), dann spricht man von Gendosisveränderungen. PCR: polymerase chain reaction dhplc: denaturating high performance liquid chromatography WAVE MLPA: multiplex ligation-dependent probe amplification qpcr : qunatitative PCR ; TaqMan, Lightcycler Sequenzierung : Kettenabbruch-Methode nach Sanger ; Pyro-Sequencing ; Next Generation Sequencing Zu testendes Gen Qualitative Untersuchung Quantitative Untersuchung Screening-Verfahren, für Forschungszwecke, z. B. SSCP dhplc DGGE HRM Sequenzierung (semiquantitative PCR) (long-range PCR) (Southern Blot-Analyse) quantitative (Echtzeit) PCR MLPA 17

18 DNA-Extraktion Um genetische Fragestellungen zu beantworten, muss in der Regel in einem ersten Schritt die Erbinformation (genomische DNA) der Patienten extrahiert werden. Die Präparation genomischer DNA erfolgt meist aus Leukozyten des Blutes nach der Aussalzmethode (Miller et al. 1988). Die Zellen wurden zunächst abzentrifugiert, lysiert, Proteine durch Proteinase K verdaut, und die DNA durch Präzipitation isoliert. In der Praxis kommen häufig Kits zum Einsatz, bei denen die DNA an eine Säule gebunden wird und durch verschiedene Puffer nach dem genannten Prinzip extrahiert wird. Polymerase Kettenreaktion (PCR) Die Polymerase-Kettenreaktion (Saiki et al., 1985) ist eine enzymatische Methode zur invitro-amplifikation von DNA. Die Spezifität der Amplifikation wird durch Verwendung zweier chemisch synthetisierter sequenzspezifischer Primer erreicht. Diese sind zu den Randbereichen der Zielsequenz komplementär und flankieren einen Bereich, der durch eine thermostabile Polymerase dupliziert wird. Der Prozess der PCR wird in drei sich wiederholende Schritte unterteilt: Zunächst findet eine Auftrennung der doppelsträngigen DNA in die beiden komplementären Einzelstränge statt (Denaturierung). An diese Einzelstränge können sich die komplementären Primer anlagern (Annealing). Im dritten Schritt sind die 3 -Enden der Primer Startpunkte der Polymerase, die entsprechend der Matrize eine komplementäre Kopie jedes Stranges synthetisiert (Extension). Dadurch wird eine exponentielle Vermehrung des gewünschten DNA-Fragments erreicht. Gelelektrophorese Nukleinsäurefragmente können nach ihrer Größe im elektrischen Feld aufgrund der negativen Ladung des Zucker-Phosphat-Rückgrates aufgetrennt werden. Ihre Wanderungsgeschwindigkeit nimmt logarithmisch mit steigender Basenzahl wegen der Netzstruktur des Gels ab. Prinzipiell gibt es zwei Gelmatrizen, die in der Molekulargenetik wichtig sind: Die Agarose- Gelelektrophorese wird angewendet, um z. B. die Qualität genomischer DNA zu prüfen oder die Spezifität und Ausbeute einer PCR-Reaktion zu beurteilen. Die Polyacrylamid- Gelelektrophorese kam bei Sequenzierreaktionen sowie bei SSCP und DGGE zum Einsatz (s. u.). Das Auflösungsvermögen von Agarosegelen ist im Vergleich zu Polyacrylamid- (PAA-) Gelen zwar geringer, doch sind sie einfacher in der Anwendung. Um die DNA sichtbar zu machen, verwendet man den interkalierenden Farbstoff Ethidiumbromid bei der Agarose-Gelelektrophorese. Die DNA wird so unter UV-Licht (365 nm) als rot-orange Bande sichtbar. Bei der Polyacrylamidgelelektrophorese bedient man sich einer Silberfärbung oder fluoreszenzmarkierter Farbstoffe und eines entsprechenden Lasers. PCR-Produkte im Agarosegel und Größenstandard 18

19 Denaturierende Hochdurchsatz-Flüssigchromatographie (dhplc) WAVE Das Mutationsscreening mittels dhplc am WAVE-System (Transgenomics) verbreitet sich seit Anfang des Jahrtausends (Hecker et al. 2000; Xiao und Oefner 2001). DNA-Moleküle binden an eine Säule und werden durch einen Puffergradienten ausgewaschen. Der Zeitpunkt der Elution wird gemessen und hängt vom Gehalt an Einzelsträngen ab, wobei doppelsträngige DNA fester mit der Matrix verknüpft ist. Bei der Denaturierung und anschließenden langsamen Renaturierung von DNA mit einer heterozygoten Mutation kommt es zur Bildung von Heteroduplex-DNA. Diese ist an einer Stelle ungepaart, d. h. liegt als Einzelstrang vor und zeigt dadurch eine weniger stabile Bindung an die Säule. Die Detektion homozygoter Mutationen ist wegen des Fehlens der Heteroduplices nicht direkt möglich, daher wird die DNA für eine Identifizierung von homozygoten Mutationen mit dem Wildtyp vermischt, so dass sich ebenfalls Heteroduplex-DNA bildet. Für Details: DNA-Sequenzierung Es gibt heute mehrere Verfahren zum Ablesen der Sequenzinformation von einem DNA- Molekül, noch finden aber überwiegend Weiterentwicklungen der Methode nach Sanger Verwendung. Didesoxy-Verfahren nach Sanger (1975) Diese Methode (auch Kettenabbruch- oder Terminatorverfahren) basiert auf einer enzymatisch katalysierten Synthese von DNA-Fragmenten, die nach ihrer Größe getrennt werden können. Ausgehend von einer bekannten Startsequenz wird durch Zugabe eines Sequenzierungsprimers (kurzes Oligonukleotid), eines Oligonukleotidgemisches (Desoxynukleosidtriphosphate, dntps) und einer DNA-Polymerase die Synthese eines komplementären DNA-Stranges initiiert. Zusätzlich zu den dntps sind Didesoxynukleosidtriphoshaten (ddntps) im Ansatz enthalten, bei deren Einbau es zum Abbruch der Synthese kommt, weil sie keine 3 -Hydroxygruppe aufweisen. Um die Reaktionsprodukte nachweisen zu können, müssen diese markiert werden (klassisch: radioaktiv, heute: fluoreszierend). Mutant Wild-type Sequenzierung mit vier verschieden fluoreszenzmarkierten ddntps Sequenzierung mit fluoreszenzmarkierten Primer 19

20 Quantitative Echtzeit PCR Zur Detektion von Deletionen oder Duplikationen von einem oder mehreren Exons auf DNA- Ebene (Gendosisveränderungen) ist die quantitative Echtzeit-PCR, z. B. am LightCycler geeignet. Dabei können jeweils ein Exon des Zielgens und ein Referenzgen ko-amplifiziert werden. Die ursprüngliche DNA-Menge beider Sequenzabschnitte wird während der loglinearen Phase der PCR bestimmt und ins Verhältnis gesetzt. Dabei entspricht ein Quotient von etwa 0,5 einer heterozygoten Deletion und von 1,5 einer heterozygoten Duplikation, wobei ein Wert von etwa 1 den Normalbefund darstellt. A B Beispiel für eine quantitative PCR-Analyse am LightCycler. Zwei Gene wurden co-amplifiziert, das Gen von Interesse (oben) und das Referenzgen (unten). Teil 1 zeigt die PCR-Produktmenge im Verlauf der PCR, Teil 2 die Standardgerade mit bekannten Konzentrationen, Teil 3 die Konzentrationen der Probe(n). Für die Auswertung werden die Werte des Gens von Interesse und des Referenzgens ins Verhältnis gesetzt. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplifikation (MLPA) Die MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) ist ein neueres Verfahren zur Detektion von Gendosisveränderungen (Schouten et al. 2002). Dabei werden bis zu 40 Amplikons parallel mittels relativer Quantifizierung analysiert. Die Ziel-DNA wird zunächst denaturiert und mit spezifischen Sondenpaaren hybridisiert (genspezifische Kits, MRC Holland). Danach verbindet eine Ligase die nebeneinander hybridisierten Sonden. Durch PCR 20

21 werden die ligierten Sequenzen anschließend amplifiziert. Aufgrund einer Auffüll (stuffer)- Sequenz hat jedes PCR-Produkt eine unterschiedliche Länge und wird der Größe nach, z. B. mittels Polyacrylamidgelelektrophorese aufgetrennt. Die Intensität der erhaltenen Gel-Banden wird bioinformatisch bestimmt und untereinander verglichen. Die Interpretation des Quotienten ist vergleichbar dem bei der Echtzeit-PCR. Details: unter MLPA technology Beispiel einer MLPA-Analyse, links ein Polyacrylamid-Gel mit den spezifischen Banden; rechts die graphische Darstellung der normierten Bandenintensitäten Next generation sequencing Dauerte die erste Sequenzierung eines kompletten menschlichen Genoms noch mehrere Jahre und kostete Milliarden US-Dollar, wäre das gleiche Projekt heute in wenigen Tagen für nur wenige Tausend Dollar durchführbar. Ursächlich dafür sind neue Sequenziertechniken; sogenannte Next-Generation-Sequenzer (NGS). Dabei werden einzelne DNA-Fragmente klonal amplifiziert und dann in einem hochautomatisierten Prozess sequenziert. Eine PCR- Amplifikation interessierender DNA-Bereiche findet nicht statt. Es werden Mikroarraybasierte Verfahren angewendet, um bestimmte DNA-Abschnitte anzureichern. Ein Gerät für das next generation sequencing ist z. B. IonTorrent -PGM. Bei einem Lauf werden dabei mehr als 100 Millionen Sequenzen mit einer Länge von 200 oder mehr Basen erzeugt. Dies liefert Rohdaten von > 1Giga-Basen pro Lauf. Zur Auswertung der Daten sind moderne bioinformatischeverfahren von besonderer Bedeutung. 21

22 6. DYSMORPHOLOGIE Definitionen Umschriebene Anomalien: Fehlbildung, Dysmorphie, Dysplasie, Deformation und Disruption Komplexe Anomalien: Assoziation, Sequenz und Syndrom Zur Definition der Begriffe s. KAPITEL 1. EINFÜHRUNG. Phänotypanalyse am Beispiel der Fazies Die Analyse des Phänotyps ist mehr als die gründliche Untersuchung eines Patienten nach klinisch-genetischen Gesichtspunkten. Vielmehr kann man diese Analyse als Anfangsphase des diagnostischen Prozesses definieren, in der versucht wird, die erhobenen Befunde zu gewichten, Zusammenhänge ("Muster") zu erkennen, um auf dieser Grundlage diagnostische Hypothesen zu entwickeln. Das Gesicht in seiner Gesamtheit, die "Fazies", kann diagnostisch von hervorstechender Bedeutung sein. Als einfaches Beispiel hierfür lässt sich die Fazies des Patienten mit Down- Syndrom anführen. Durchaus vergleichbar ist aber die Spezifität der Fazies bei zahlreichen anderen Dysmorphie-bzw. Fehlbildungssyndromen. Typische Beispiele sind das Cornelia de Lange-Syndrom, das Williams-Beuren-Syndrom, das Kabuki-Syndrom oder das Wolf- Hirschhorn-Syndrom. Für das rasche Wiedererkennen eines Gesichts benötigen wir ein Engramm in unserem Gehirn. Häufiges Sehen bestimmter Gesichter fördert diese Engrammbildung, die uns befähigt, ein Gesicht in seiner Gesamtheit ("Gestaltserkennung") zu erfassen. Aus diesem Grunde ist das Einüben von "bewusstem" Sehen sehr wichtig. Eine differenzierte Analyse der Gesichtsmerkmale sollte mit der Beschreibung des Gesamteindrucks beginnen, entsprechende Eindrücke wie "voll", "oval", "dreieckförmig" oder "quadratisch" werden ergänzt durch noch stärker dem Subjektiven unterliegende wie "wach", "myopathisch" oder "grob". Zu diesem Gesamteindruck gehört auch eine Beurteilung der Größenrelation Hirnschädel zu Gesichtsschädel. Wichtig ist auch die Größe und die Form des Hirnschädels (z.b. "mikrozephal", "makrozephal", "brachyzephal" und "dolichozephal ), weil für manche Syndrome eine bestimmte Schädelform sehr charakteristisch sein kann (z.b. Brachyzephalie bei Down-Syndrom oder Dolichozephalie bei Sotos-Syndrom). Kommentieren lassen sich hier auch Besonderheiten des Haaransatzes, die von diagnostischer Bedeutung sein können. Beispiele wären der spitze Haaransatz in der Mittellinie ("widows peak") beim Hypertelorismus oder der Stirnhaarwirbel ("frontal upsweep") als Hinweis auf das FG-Syndrom. Zu erwähnen ist hier auch der wie zurückversetzt wirkende Haaransatz ("Geheimratsecken") bei Patienten mit Sotos-Syndrom. Die gesamte Augenpartie ist für den diagnostischen Gesamteindruck oft von großer Bedeutung. Kommentiert wird hier der Augenabstand (Hypertelorismus/Hypotelorismus), die horizontale Lidspaltenweite ("große Augen" bzw. "kleine Augen"), der Lidspaltenverlauf (horizontal; von medial nach lateral abfallend/ansteigend/abfallend). Auch die Form und Fülle der Brauen und Wimpern sind von Bedeutung. Der mittlere Abschnitt des Gesichts, das Mittelgesicht, wird entscheidend geprägt durch seine Gesamtentwicklung, eine Hypoplasie des Mittelgesichts lässt das Gesicht flächig erscheinen. Der Eindruck eines prominenten Mittelgesichts wird oft erst hervorgerufen oder noch verstärkt durch eine begleitende Mikrozephalie und Mikrogenie ("fliehende Stirn" bzw. 22

23 "fliehendes Kinn"). Auch umschriebene Hypoplasien z.b. der Jochbeine (Wangenknochen) oder vorwiegend der Maxilla (mit dem Effekt einer relativen Progenie) können die Fazies wesentlich prägen. Gesondert zu beschreiben sind die Merkmale der Nase (Breite der Nasenwurzel; flache/prominente Nasenwurzel, Breite des Nasenrückens, Form und Position der Nasenbodenebene mit den Nasenlöchern, Formbesonderheiten des Septums usw.). Auch die Mundpartie ist eine komplexe Struktur, ihre Beschreibung beginnt mit einer Beurteilung (lang/kurz, vorgewölbt) der häutigen Oberlippe, kommt dann zum eigentlichen Philtrum, bestehend aus den Philtrumleisten und der dadurch gebildeten Philtrumrinne. Die Philtrumleisten können erhaben sein, oder auch verstrichen (wie bei Alkoholembryopathie und auch beim Cornelia de Lange-Syndrom), dagegen auch deutlich ausgeprägt wie z. B. beim Weaver-Syndrom. Wichtige Messwerte zur Beurteilung fazialer Dysmorphie:: Interpupillarabstand Äußerer Kanthalabstand Philtrumlänge Höhe der Unterlippe Innerer Kanthalabstand Interalarabstand Höhe der Oberlippe Mundspaltenbreite Das Kinn ist bei vielen Dysmorphiesyndromen als Folge der Mandibulahypoplasie gering entwickelt und zurückweichend (Retrogenie). Eine geringe Kinnhöhe (Distanz zwischen Unterlippe und Kinnspitze) wird als "Mikrogenie" beschrieben. Charakteristisch ist auch das lange Kinn bei Patienten mit Sotos-Syndrom oder dem fragilen (X)-Syndrom. Die Inspektion der Mundhöhle erlaubt eine Beurteilung der Zähne (Zahnstatus, Form der Zähne), der Zunge und insbesondere des Gaumens einschließlich der Uvula. Zahnunterzahl (Hypodontie oder Oligondontie ), insbesondere in Kombination mit einer Fehlform ("konisch", wie "zugespitzt") wäre typisch für eine ektodermale Dysplasie; relativ kleine Zähne mit zu großen Zahnlücken (Diasteme) gehören zu den typischen Merkmalen bei Patienten mit Williams-Beuren-Syndrom oder Angelman-Syndrom, während große, breite Schneidezähne u.a. das KBG-Syndrom kennzeichnen. Auch Größenanomalien der Zunge können ein wichtiges Merkmal darstellen, ein Beispiel wäre die Makroglossie beim Wiedemann-Beckwith-Syndrom. Am harten Gaumen unterscheidet man zwischen der physiologischen, flachen Wölbung und der hohen, spitzbogigen (gotischer Gaumen). Ebenso von Bedeutung sind die geringeren Ausprägungen einer Spaltbildung in Form der oft nur tastbaren submukösen Gaumenspalte, die typischerweise mit einer funktionellen Beeinträchtigung der Gaumensegelfunktion einhergeht, erkennbar als offenes Näseln (Rhinolalia aperta). Für die Beschreibung der Ohren sind zunächst Merkmale wie Position (Ohransatz in Relation zum Hirn- und Gesichtsschädel, Rotation der Ohrlängsachse nach hinten) von Bedeutung, bevor Formbesonderheiten der Einzelmerkmale erfasst und beschrieben werden. Ermöglicht wird dies durch die Kenntnis der wesentlichen anatomischen Gegebenheiten wie Helix, Anthelix, usw.. Literatur Aase JM: Diagnostic Dysmorphology. Plenum Medical Book Company. New York and London, 1990 Cohen MJR: The Child with Multiple Birth Defects, Raven Press,

24 Beispiele für Syndrome Sotos-Syndrom Typische Fazies o Fronto-parietal spärliches Haar o Hypertelorismus o Betontes kleines Kinn o Aufwärts gerichtete Nasenspitze o Makrodolichocephalie o Frontal bossing Weitere klinische Zeichen o Prä-und postnatale Makrosomie o Akzeleriertes Knochenalter o Muskuläre Hypotonie o Entwicklungsverzögerung o Krampfanfälle Waardenburg Syndrom Typ 1 o Klinische Merkmale: o Weiße Stirnlocke o Innenohrschwerhörigkeit o Primärer Telecanthus o Weitere faziale Dysmorphien o Heterochromie der Iris o Partieller Albinismus der Haut o Autosomal dominant erblich (PAX3-Gen) Kabuki-Syndrom o Lange Lidspalten o Große Ohren o Kleinwuchs o Organfehlbildungen o Ätiologie nicht geklärt Cornelia de Lange Syndrom (CdLS) Brachmann de Lange Syndrom (BDLS) Sichtbare Auffälligkeiten o Prä-und postnatale Wachstumsverzögerung (Verzögerte Skelettreifung) o Initial muskuläre Hypertonie o Hypertrichosis o Cutis marmorata o Tiefe, heisere Stimme o Krampfanfälle o Mentale Retardierung 24

25 Innere Fehlbildungen o Herzfehler (oft VSD) o Brachyösophagus (ösoph.-reflux) o Zwerchfellhernie/Hiatushernie o Pylorusstenose o Malrotation des Kolon o Leistenbrüche o Mikrokornea o Opticusatrophie o Choanalatresie o Gaumenspalte Rubinstein Taybi-Syndrom o Niedriges Geburtsgewicht o Stirnbehaarung o Hypoplastische Nasenflügel o Breite Daumen und Großzehen o 16p13.3 CBP-Gen o 22q13.2 p300-gen Beispiel für Assoziationen VACTERL - Assoziation o Vertebral defects o Anal atresia o Cardiac anomalies o Tracheo-Esophageal fistula o Radial and/or Renal defects o Limb anomalies Beispiele für Sequenzen (Pierre) Robin - Sequenz anatomisch: Mikro/Retrogenie + Gaumenspalte funktionell: Glossoptose mit Atemwegsobstruktion o Fütterungsprobleme, Gedeihstörung o Schallleitungsstörung häufig Ätiologie der Robin - Sequenz o sporadisch (Ursache unklar) o autosomal dominant o autosomal rezessiv o X-chromosomal rezessiv? 25

26 o chromosomal o exogen (teratogen) Oligohydramnion-Sequenz anatomisch: Lungenhypoplasie, flaches Gesicht, Fehlstellung der Hände und Füße funktionell: Nieren-Agenesie > kein Urin in die Fruchrhöhle > relativer Mangel an Fruchtwasser 26

27 7. NEUROGENETIK Beispiel: Chorea Huntington Stichworte: o autosomal dominanter Erbgang o CAG-Repeat-Expansion im Exon o gain of function Mutation o Instabilität o intermediäre Allele o reduzierte Penetranz o Neumutation o Antizipation o Paternale Transmission o prädiktive DNA-Diagnostik Klinik der Chorea Huntington. Die Chorea Huntington ist eine schwere neurodegenerative Erkrankung, die in der Regel zwischen dem 30. und 50. Lebensjahr beginnt, in Ausnahmen aber auch in der Jugend oder erst im höheren Erwachsenenalter auftreten kann. Die Symptome beinhalten schwere Persönlichkeitsveränderungen, Demenz und choreatische Bewegungsstörungen. Die Krankheit verläuft progredient und führt in der Regel nach Jahren zum Tode. In fortgeschrittenen Stadien wird neuronaler Zelluntergang im Gehirn, besonders im Putamen und Caudatum sichtbar. Eine kausale Therapie steht z. Zt. nicht zur Verfügung. Erbgang und Frequenz Die Erkrankung folgt einem autosomal dominanten Erbgang mit nahezu vollständiger Penetranz. Die Penetranz eines Merkmals in einem bestimmten Genotyp ist definiert als die Wahrscheinlichkeit, dass sich bei einer Person mit diesem Genotyp das Merkmal ausprägt (Definition). Vollständige Penetranz bedeutet daher, dass jede Person, die die Mutation trägt, auch erkranken wird. Entsprechend dem dominanten Erbgang tragen Nachkommen eines Elternteils mit Chorea Huntington ein 50%iges Risiko, das veränderte Gen zu erben und ebenfalls sicher zu erkranken. Die Expressivität der Chorea Huntington ist variabel. So ist die juvenile Form der Erkrankung, die bereits im Kindesalter beginnen kann, durch einen besonders schweren Verlauf gekennzeichnet. Der klinische Verlauf, die Progredienz und das Erkrankungsalter variieren sowohl intrafamiliär als auch interfamiliär. Dies wird als variable Expressivität bezeichnet (Definition). In der kaukastischen Bevölkerung tritt die Chorea Huntington mit einer Häufigkeit von etwa 1: auf. Gen und Mutation Das bei Betroffenen und Anlageträgern für die Chorea Huntington veränderte Gen liegt auf dem kurzen Arm des Chromosoms 4 im Bereich 4p16.3. Das Gen erstreckt sich über ca. 210 kb und kodiert für ein Protein, genannt Huntingtin, dessen Funktion noch nicht aufgeklärt ist. Als krankheitsverursachende Mutation wurde eine Expansion der Trinukleotid-Sequenz CAG identifiziert. Bei Kontrollpersonen werden CAG-Tripletts gefunden. Ca. 85 % der Kontrollpersonen sind heterozygot für zwei Normalallele, d. h. sie zeigen zwei Banden in der molekulargenetischen Analyse (Definition). Betroffene der Chorea Huntington weisen auf dem mutierten Allel mehr als 39 CAG-Repeats auf. Die Anzahl der CAG-Tripletts korreliert umgekehrt proportional mit dem Erkrankungsalter, das bedeutet: je länger die CAG-Sequenz 27

28 ist, desto früher können die Symptome beobachtet werden. Dementsprechend weisen juvenile Patienten in der Regel mehr als 65 CAG-Tripletts auf. Juvenile Fälle treten überproportional häufig nach paternaler Vererbung der Mutation auf. In seltenen Fällen tragen Personen CAG-Repeats im Huntingtin-Gen. Bei diesen so genannten intermediären Allelen kann nicht vorhergesagt werden, ob der Träger erkranken wird oder nicht (Definition). Diese intermediären Allele sind dementsprechend mit reduzierter Penetranz assoziiert. Normalallele mit CAG-Repeats werden in der Regel stabil vererbt. Es tritt also keine Veränderung der Repeatanzahl auf. Expandierte Allele mit mehr als 39 CAG-Repeats sind dagegen hoch instabil, das bedeutet, die Anzahl die Tripletts kann bei der Weitergabe von Eltern auf Kind reduziert, aber auch verlängert werden. Diese Instabilität wird auch bei intermediären Allelen beobachtet. Es sind zahlreiche Beispiele bekannt, in denen ein Allel des Normalbereichs (bevorzugt bei paternaler Transmission) während der Meiose bis in den pathologischen Bereich expandiert. In diesen Fällen kommt es zu so genannten Neumutationen. Die repetitive CAG-Sequenz liegt in der Kodierregion des Huntingtin-Gens. Das Triplett- CAG kodiert für die Aminosäure Glutamin. Dementsprechend trägt das Huntingtin eine Polyglutamin-Sequenz. Die Expansion von Glutamin-Domänen, die für eine größere Zahl genetisch unterscheidbarer neurodegenerativer Erkrankungen beschrieben ist, steht in engem Zusammenhang mit der Pathophysiologie. Bei der Chorea Huntington wird neben dem Wildtyp-Protein auch die mutierte Variante exprimiert. Als Ursache der Erkrankung wird ein so genannter gain of function postuliert. Durchführung der Diagnostik Zur molekulargenetischen Diagnostik wird eine EDTA-Blutprobe der Betroffenen bzw. Risikopersonen benötigt. Nach Isolierung der genomischen DNA aus den Lymphozyten wird eine PCR durchgeführt, die spezifisch für das CAG-Triplett im Huntingtin-Gen ist. Die PCR- Produkte werden z. B. auf Acrylamid-Gelen aufgetrennt. Durch Vergleich mit geeigneten Standards wird die Länge der PCR-Produkte bestimmt und die darin enthaltene Repeatzahl errechnet. 28

29 8. AUTOSOMAL DOMINANTE UND REZESSIVE ERBGÄNGE, RISIKOBERECHNUNG Autosomal dominante Vererbung Merkmale autosomal dominanter Vererbung: o Heterozygote sind oder werden auffällig. o In der Regel sind aufeinander folgende Generationen betroffen. o Die Wiederholungswahrscheinlichkeit beträgt für Kinder von Betroffenen 50% (1:2). o Söhne und Töchter sind gleich häufig betroffen. Krankheitsbilder mit autosomal dominantem Erbgang: Beispiel: Polyzystische Nierenerkrankung (adulter Typ) o Symptome: Nierenzysten, Leberzysten und andere; Aneurysmen der Hirnarterien o Penetranz sehr hoch, aber altersabhängig o Expressivität variabel (inter- und intrafamiliär) o Neumutationsrate gering (bei 1 v. 100 Patienten) Beispiel: Marfan-Syndrom o Erkrankung des Bindegewebes o dysproportionierter Hochwuchs, Linsenluxation, Aortendilatation bis -dissektion u.a.m.) o Häufigkeit 1:4.000 o verursacht durch Mutationen im FBN1-Gen (Fibrillin) oder in anderen Genen o im TGFBR2-Gen (Loeys-Dietz Syndrom) o Neumutationen bei ~ 25 von 100 Indexpatienten o Penetranz sehr hoch o Expressivität variabel (innerhalb derselben betroffenen Familie nicht vorhersagbar) Beispiel: Achondroplasie o Skelettdysplasie mit dysproportioniertem Kleinwuchs o Häufigkeit ~ 1: o verursacht fast ausschließlich durch zwei Mutationen im FGFR3-Gen: p.gly380arg (Fibroblast Growth Factor Receptor 3) o (- andere Mutationen in FGFR1, -2 und -3 verursachen verwandte aber abgrenzbare Wachstumsstörungen) o Neumutationen bei mehr als 80 von 100 Betroffenen, überwiegend Mutation des väterlichen Allels o vollständige Penetranz und konstante Expressivität Stichworte zu autosomal dominanter Vererbung: o Neumutationsrate o Keimzellmosaik o Reduzierte Penetranz und Spätmanifestation o Variable Expressivität 29

30 Autosomal rezessive Vererbung Merkmale autosomal rezessiver Vererbung: o Heterozygote sind weitgehend unauffällig. o In der Regel sind Geschwisterreihen betroffen und die Eltern hetrozygote Anlageträger. o Die Wiederholungswahrscheinlichkeit beträgt für Geschwister von Betroffenen 25% (1:4). o Brüder und Schwestern sind gleich häufig betroffen. Krankheitsbilder mit autosomal rezessivem Erbgang Beispiel: Cystische Fibrose (CF, Mukoviszidose) o Funktionsstörung exokriner Drüsen (Lunge, Pankreas, Schweißdrüsen) o verursacht durch Mutationen im CFTR-Gen (Chromosom 7q31) (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) o in Europa und in von dort ausgewanderten Populationen ist die Mutation delta F508 die mit Abstand häufigste o Häufigkeit ~1:2.500 (in Deutschland) Beispiel: Spinale Muskelatrophie (SMA) Typ I o fortschreitender Muskelschwund (A-trophie) o postnatal hypoton bis schlaffe Lähmung (floppy infant) o Todesursache respiratorische Insuffizienz, Lungenentzündungen o Häufigkeit ~ 1:10.000, o 96 v. 100 Patienten sind homozygot für SMN1 Deletion Blutsverwandtschaft 30

31 Risikoberechnung bei der humangenetischen Familienberatung Ein wichtiger Punkt bei vielen humangenetischen Beratungsgesprächen ist die Abschätzung der Wiederholungswahrscheinlichkeit (WW) bei eigenen Nachkommen für eine in der Familie vorkommende genetisch (mit)bedingte Erkrankung. Bei klinischer Diagnose ohne molekulargenetische Befund wird die WW aus dem bekannten Erbgang abgeleitet. Bei autosomal rezessiv erblichen Erkrankungen ist es oft notwendig, die Heterozygoten-Frequenz in der Gesamtbevölkerung zu kennen. Diese Frequenz wird über das HARDY-WEINBERG-GESETZ aus der Häufigkeit der Erkrankung abgeleitet (Beispiel 1). Hardy-Weinberg-Gesetz (1908) zum Verhältnis von Genotypen und Allelfrequenzen A1A1 A1A2 A2A2 nicht erkrankt nicht erkrankt erkrankt homozygot A1 Anlageträger homozygot A2 Häufigkeit (Allelfrequenz) von A1 = p Häufigkeit (Allelfrequenz) von A2 = q p 2 + 2pq + q 2 = 1 Vereinfachung für den praktischen Gebrauch: Allelfrequenz von A1 = p = sehr häufig = ~ 1 Allelfrequenz von A2 = q = Wurzel aus A2A2 Häufigkeit von Anlageträgern (Heterozygotenfrequenz) 2pq ~ 2 x WURZEL AUS DER HÄUFIGKEIT DER ERKRANKUNG Übung: Errechnen Sie die Häufigkeit von Anlageträgern Erkrankte Anlageträger Beispiel 1 : : 10 Hämochromatose 1 : Adrenogenitales Syndrom 1 : Cystische Fibrose 1 : Phenylketonurie 1 : Smith-Lemli-Opitz-Syndrom 1 : Zellweger-Syndrom 1 :